This study was financially supported by the Korean Ministry of Science, ICT and Future Planning (Intelligent Synthetic Biology Center program 2012M3A6A8054887). P. Kim was supported by a fellowship from the Catholic University of Korea (2015).

1. 장비 준비 <ol><li> chemostat 항아리 (150-250 ml)로 또는 유입구를 함유하는 삼각 플라스크 (250 mL) 및 출구 포트를 얻었다. 실리콘 튜브는 10 ~ 100 ㎖ / hr의 유량을 허용하여 포트를 연결합니다. 선택적으로 통기, 공기 출구, 및 온도 조절 물 입구 및 출구 포트를 사용한다. </li><li> 교반 및 온도 제어를 제공하는 chemostat 항아리에 적합한 장치를 취득 (또는 회전 진탕 배양기를 사용). </li><li> 문화를 새로운 배지를 전달하고 수집하기 위해 두 개의 연동 펌프를 얻습니다. </li><li> 매체 출구 포트 및 공기 입구 포트를 포함하는 저장 용기 (10 ~ 20 L)을 얻었다. </li><li> (; L / S (13) 튜브 즉, ID 0.8 mm, 유량 범위 0.06-36 ml / 분) 희석 비율에 적합한 실리콘 튜브를 얻습니다. </li></ol> 2. 중간 준비 및 살균 <ol><li> 초기 중간 <ol><li> 0.3 g 포도당, 0.08 g NH 4를 녹여CL, 0.05 g의 NaCl, 0.75 g 나 2 HPO 4 · 2H 2 O, 0.3 g의 KH 2 PO 4 90 ml의 증류수 chemostat 항아리 (DW). </li><li> 클램프를 사용하여 튜브와 함께 chemostat 항아리를 밀봉합니다. 통풍구를 밀봉하지 마십시오. </li><li> 15 분 동안 121 ℃에서 오토 클레이브에서 chemostat 항아리 소독. 살균 한 후, 실온에서 chemostat 항아리를 저장합니다. </li><li> 녹인 0.02 g 황산 · 7H 2 O, 0.01 g의 CaCl2를, 10 ml의 DW (용액 A) 0.1 mg의 티아민. </li><li> 주사기 및 미리 멸균 주사기 필터 (0.45 ㎛의 세공 필터)를 사용하여 용액 A 필터. </li><li> A는 chemostat 항아리에 여과하는 솔루션을 추가합니다. </li></ol></li><li> 스트레스 중간 <ol><li> 30g 글루코스 8g NH 4 CL, 5g의 NaCl, 75g이 나 HPO 4 · 용해 2H 2 O, 30g의 KH 2 PO 4, 300g 나트륨 숙시 네이트 수화물 (NA 2 · 숙신산 · 6H &lt;서브&gt; 2 O; 저수지 항아리에 9.9 L DW에서이 실험에 사용 된 스트레스). </li><li> 클램프를 사용하여 튜브와 함께 저장 항아리를 밀봉합니다. 통풍구를 밀봉하지 마십시오. </li><li> 15 분 동안 121 ℃에서 오토 클레이브 저류 용기 살균. 멸균 후, 실온에서 보관 용기. </li><li> 2g 황산 4 · 7H 2 O, 1g의 염화칼슘 2, 100 ㎖ DW (용액 A) 10 mg을 티아민을 녹인다. </li><li> 주사기 및 미리 멸균 주사기 필터 (0.45 ㎛의 세공 필터)와 필터 A 액. </li><li> A는 저장 항아리에 여과하는 솔루션을 추가합니다. </li><li> 무균는 저장 항아리에 살균 실리콘 튜브를 연결하고 연동 펌프를 연결합니다. </li></ol></li><li> 스트레스가 높은 중간 <ol><li> 2.2 절에서와 같이 매체를 준비하지만, 스트레스의 큰 농도 (즉, 숙시 네이트 적응에 3~5g / L 이상). 참고 :이 프로토콜은 스트레스 일에 적응입니다AT는 매체를 통해 전달 될 수있다. 온도, 교반이나 조명과 같은 물리적 스트레스의 경우, 배양이 적절하게 설계되어야한다. </li></ol></li></ol> 3. 초기 재배 <ol><li> 야생형 E.의 단일 식민지의 예방 초기 배지 4 mL를 함유하는 15 ㎖의 시험관에 대장균. </li><li> 37 ° C에서 12 시간, 220 rpm으로의 진탕 배양기에서 테스트 튜브를 품어. </li><li> 무균 전송 chemostat 항아리에 예비 배양 1 ㎖. </li><li> 6 시간 동안 37 ° C에서, 폭기 (공기 50 ml / 분)와 교반 (200 rpm으로)에 대해 제공하는 chemostat 항아리를 품어. </li></ol> 4. 스트레스 적응 <ol><li> 무균는 chemostat 항아리에 펌프 실리콘 튜브의 끝을 연결합니다. </li><li> 배출 펌프 (10 ㎖ / 시간 이상)을 시작하고 문화를 수집합니다. 참고 : 문화는 일반적으로 4-8 시간 초기 배양 한 후, 지수 상에 있어야합니다. </li><li> 장출구 관에서 문화의 광학 밀도 (600 nm의) 에크. </li><li> 입구 펌프 (0.1 시간-1의 희석 비율에 해당하는 10 ㎖ / 시간 등)를 시작합니다. </li><li> 매 24 시간을 튜브 콘센트에서 600 nm에서 문화의 광학 밀도를 확인합니다. </li><li> 96 시간 (9.6 배 매출) 이상에 대한 chemostat을 운영하고 있습니다. 광학 농도가 안정되면, 높은 스트레스 매체를 함유하는 저장 용기를 교환한다. 광학 밀도가 0.2보다 낮 으면, 6 시간에 대한 공급 흡입 펌프를 멈춘다. 입구 펌프를 다시 시작하고 광학 밀도가 0.2 이상인지 확인합니다. </li><li> 점차 높은 스트레스 농도를 함유하는 저장조로 변경하여 스트레스의 농도를 증가시킨다. </li><li> 이 이정표에 도달 할 때마다 적응 문화의 샘플을 채취 (예를 들어, 100g / L 숙시 네이트 스트레스에 적응 주) 더 게놈 분석 및 저장. </li><li> 샘플 수납하는 멸균 80 % 글리세롤 soluti 함께 배양 시료 (0.5 ml)에 혼합상 (0.5 ml)에 용해시키고 -80 ℃에서 보관. 주 : 상기 미생물은 ALE 과정에서 스트레스를 저하시키는 능력을 취득하는 경우, 발효 용기에서 스트레스 농도는 신선한 저장조와 동일하지 않다. </li></ol> 스트레스 적응 변형 5. 단일 콜로니 분리 <ol><li> 한천 평판 배지 (1.6 % 한천) 같은 스트레스를 함유 매체의 동일한 농도를 준비합니다. </li><li> chemostat에서 출구 배양 (0.1 ㎖) 플레이트, 16 시간 동안 37 ℃에서 배양한다. </li><li> 멸균 된 이쑤시개를 이용하여 플레이트로부터 단일 콜로니를 선택하고, 동일한 스트레스를 함유하는 15 ㎖의 시험관에 상기 chemostat와 동일한 중간 농도 그들을 접종하고, 6 시간 동안 배양한다. </li><li> 전사 배지 50 ㎖를 포함하는 250 ㎖의 삼각 플라스크에 배양액 1 ㎖. 수확 배양액 0.5ml를 각 1 시간, 600 nm에서의 OD를 측정한다. 적응 strai의 성장 속도를 비교하여스트레스 요인 특정 야생형 균주의 것과 N. </li></ol>

<ol><li>Rando, O. J., Verstrepen, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timescales+of+genetic+and+epigenetic+inheritance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Timescales of genetic and epigenetic inheritance.</a> Cell. 128, 655-668 (2007).</li>
<li>Kim, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+differential+adaptation+to+anaerobic+stress+via+genomic+mutations+by+Escherichia+coli+strains+K-12+and+B+lacking+alcohol+dehydrogenase%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Short-term differential adaptation to anaerobic stress via genomic mutations by Escherichia coli strains K-12 and B lacking alcohol dehydrogenase.</a> Front Microbiol. 5, 476(2014).</li>
<li>Mendizabal, I., Keller, T. E., Zeng, J., Yi, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Comp+Biol%22%5BJournal%5D)">Epigenetics and evolution.</a> Integr Comp Biol. 54, 31-42 (2014).</li>
<li>Lee, J. Y., Seo, J., Kim, E. S., Lee, H. S., Kim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+evolution+of+Corynebacterium+glutamicum+resistant+to+oxidative+stress+and+its+global+gene+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Lett%22%5BJournal%5D)">Adaptive evolution of Corynebacterium glutamicum resistant to oxidative stress and its global gene expression profiling.</a> Biotechnol Lett. 35, 709-717 (2013).</li>
<li>Lee, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+oxidative+stress-tolerant+Corynebacterium+glutamicum%5BTitle%5D)+AND+%22AMB+Express%22%5BJournal%5D)">Artificial oxidative stress-tolerant Corynebacterium glutamicum.</a> AMB Express. 4, 15(2014).</li>
<li>Narang, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+steady+states+of+microbial+growth+on+mixtures+of+substitutable+substrates+in+a+chemostat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Theor+Biol%22%5BJournal%5D)">The steady states of microbial growth on mixtures of substitutable substrates in a chemostat.</a> J Theor Biol. 190, 241-261 (1998).</li>
<li>Kwon, Y. D., Kim, S., Lee, S. Y., Kim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+continuous+adaptation+of+Escherichia+coli+to+high+succinate+stress+and+transcriptome+analysis+of+the+tolerant+strain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosci+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Long-term continuous adaptation of Escherichia coli to high succinate stress and transcriptome analysis of the tolerant strain.</a> J Biosci Bioeng. 111, 26-30 (2011).</li>
<li>Barrick, J. E., Lenski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+dynamics+during+experimental+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome dynamics during experimental evolution.</a> Nat Rev Genet. 14, 827-839 (2013).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sequence+Alignment%2FMap+format+and+SAMtools%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).</li>
<li>McKenna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Genome+Analysis+Toolkit%3A+a+MapReduce+framework+for+analyzing+next-generation+DNA+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data.</a> Genome Res. 20, 1297-1303 (2010).</li>
<li>Deatherage, D. E., Barrick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+mutations+in+laboratory-evolved+microbes+from+next-generation+sequencing+data+using+breseq%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of mutations in laboratory-evolved microbes from next-generation sequencing data using breseq.</a> Methods Mol Biol. 1151, 165-188 (2014).</li>
</ol>

The authors have nothing to disclose.

미생물 때문에 빠른 성장 속도와 유전 적 다양성의 거의 모든 환경에 적응시킬 수있다. 적응 진화 실험은 주어진 조건 하에서 유용 자연 돌연변이를 보유하는 개개의 유기체를 선택하는 방법을 제공하는 설계 조건 하에서 미생물 발전을 가능하게한다. chemostat 기술은 다음과 같은 이유로 이전 기법보다 인위적 구동 발전을 달성하기위한 더 강력 : (a) 정상 환경 - 전송 기술들은 고체 또는 액체 매질 중 회분식 배양 기반으로하기 때문에, 세포의 환경을 배치하는 동안 변화 문화 chemostat의 환경 스트레스가 정상 상태에서; (b) 더 큰 모집단과 연속 선택 - chemostat의 큰 모집단은 전사 기술의 작은 집단 이상의 유전 적 다양성을 제공한다. 은 ch 연속 선정emostat 기술은 전사 기술 간헐적 선택보다 발전을 달성하기위한 빠른 방법이다. chemostat 문화가 ALE 과정에서 다른 미생물에 의해 오염되지 않는 것이 중요하며, 무균 조건은 chemostat 문화 전반에 걸쳐 필요합니다. 에일 맥주 절차는 이러한 산화 스트레스, 삼투압 스트레스, 독성 제품 스트레스로 스트레스를 변경, 수정할 수 있습니다. chemostat 문화에 의해 ALE에 대한 몇 가지 기술적 인 제한이 있습니다. 진화는 우연히 일어난다; 돌연변이의 결과가 관련 될 수도 있지만 따라서, 다른 연구자들은 동일한 진화 결과를 얻을 수없는 경우가 있습니다. 스트레스의 농도가 너무 빨리 증가 할 때 다른 제한 chemostat 문화에 워시 아웃이다. 바이오 매스는 일정 금액 (예 : OD =이 절차 0.2)로 감소되면 스트레스의 농도가 증가 후 스트레스의 관리는 적어도 몇 세대를 중단해야한다적응 변형 시간을 제공합니다. 게놈 시퀀싱 기술의 최근 발전은 특정 스트레스 조건에 따라 돌연변이 발전의 이해를 도왔다. 예를 들어, DNA 돌연변이는 주어진 환경 (독성 스트레스에, 즉 허용 오차)에 유익한 특정 전신 효과를 변화시킨다. 따라서, ALE는 유전자 기능이나 네트워크 조절 또는 &#39;가속 진화&#39;원료 등을 연구하는데 이용 될 수있다. ALE 연구는 항생제 내성균의 개발을 시뮬레이션 위험한 약제 내성 균주가 발생하는 메커니즘을 표시하는데 유용하다. 진화의 궤적이 (예 : 스트레스 내성 등) 원하는 표현형으로 이어질 유전 변경을 발굴, 게놈에 새겨 져으로 한 번 진화 균주 8 얻어 다음 장애물이다. 현재 이용 가능한 차세대 시퀀싱 기술 중, Illumina 사 이온 런트 말하형태는 염기 치환 또는 진화 계통에서 발생하는 작은 삽입과 삭제의 검출에 적합하고, 모두가 적당하다. 변형 검출 보통 레퍼런스 시퀀스의 짧은 판독 매핑을 포함하므로, 선조 균주의 게놈 서열의 이용은 매우 중요하다. 설립자 균주의 게놈 서열이 공개 데이터베이스에서 사용할 경우에도 실제 시작 변형에 몇 가지 추가 차이가있을 수 있기 때문에, 진화 한 동시에 그것을 순서에 종종 바람직하다. 돌연변이 식별을위한 프로토콜은 웹 또는 문헌 검색 9,10 통해 쉽게 사용할 수 있습니다. 예를 들어, BRESEQ 차세대 시퀀싱 데이터 (11)를 사용하여 실험실 진화 미생물의 게놈 분석을 위해 특별히 디자인 된 파이프 라인이다. (예를 들어,이 대표 데이터, 야생형, DST50, DST100 및 DST160에서) 특정 이정표에서 진화 계통의 비교는 진화 변형의 순서를 제공 할 수 있습니다s와 주어진 스트레스의 결과에 대한 통찰력을 제공합니다. 따라서, 기술 및 시스템 생물학 전신 교란 변수들의 식별과 결합 ALE 실험의 애플리케이션은 가까운 장래에 기대된다.

미생물이 생존하고 다양한 환​​경에 적응할 수 있습니다. 심한 스트레스, 적응은 임의의 게놈 변이 이후 긍정적 인 선택 1-3으로 도움이 표현형의 인수를 통해 발생할 수 있습니다. 따라서, 균체는 &quot;적응 진화&quot;이라한다 최적 성장을 위해 대사 또는 규제 네트워크를 변경하여 적용 할 수있다. 이러한 슈퍼 박테리아의 발생 및 강력한 미생물 균주의 발생으로 최근 중요한 미생물 경향은 매우 밀접하게 스트레스 조건에서 진화를 적응 적 관련이 있습니다. 정의 실험실 조건에서, 우리는 분자 진화의 메커니즘을 연구에도 다양한 용도 미생물 진화의 방향을 제어 할 수있다. 그들은 큰 개체군을 유지 빠르게 재생하고, 생성 및 혼을 유지하기 쉽다 : 다세포 유기​​체 달리 단세포 유기​​체 이유는 다음 실험실 적응 진화 (ALE)에 적합ogeneous 환경. DNA 시퀀싱 기술과 높은 처리량 기술의 최근 발전과 결합, ALE는 전신 규제 변화로 이어질 게놈의 변화를 직접 관찰 할 수 있습니다. 돌연변이 역학 및 인구의 다양성도 관찰 할 수 있습니다. 유전 공학 전략 ALE 균주 4,5의 분석으로부터 결정될 수있다. Chemostat 배양 정상 세포를 얻는 발효 공정 6의 생산성을 향상하기 위해 사용하는 방법이다. 신선한 배지를 첨가하고, 배양액의 처리 (후자는 중간 및 바이오 매스를 포함한다) 중에 수확된다. 장기 배양 chemostat 그러나 배양 정상 생산성을 변경하여 배양 (도 1a) 중 자발적인 돌연변이 및 선택의 축적을 초래한다. 다양한 선택 압력 (스트레스)에서 돌연변이의 축적이 향상된다. 장기 응력 점진적 증가<html> chemostat는 반복 액체 매질에서 고체 배지 및 시리얼 전송 (에서 온도, pH, 삼투압, 영양 결핍, 산화, 독성 최종 제품 등 식민지 전송으로 지정된 스트레스에 반대 돌연변이의 연속 선택을 제공합니다 배치 배양)도 연구 진화 미생물 (도 1B 및 1C)을 수득 할 수있다. chemostat 배양 복잡한 방법이 필요하지만, 다이버 시티 풀 (복제 인구 크기의 수) 콜로니 전송과 시리얼 전송 기술에 의해 얻어진 것보다 높다. 각각의 세포에 안정 스트레스 노출과는 chemostat 문화 (정상 상태) 일괄 문화 기반 기술에 비해 ALE의 다른 혜택입니다 동안 세포 상태의 변화를 감소. 높은 숙시 네이트 조건에 적용 대장균의 스트레스 유발 ALE는이 문서에서 소개된다. 세틸 / ftp_upload / 54446 / 54446fig1.jpg &quot;/&gt; 그림 1 : 적응 형 실험실 진화의 방법 (A) Chemostat;. (B) 시리얼 전송하는 단계; (C) 식민지 전송. 상단 그림은 ALE에 대한 방법의 개념을 설명하고, 아래 그림은 ALE 동안 성장 세포의 수를 보여줍니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54446/54446fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>Mini-chemostat fermentor</td><td>Biotron Inc.</td><td>-</td><td>manufactured by special order</td></tr><tr><td>silicon tubing</td><td>Cole-Parmer</td><td>Masterflex L/S 13</td><td>tubing size can be varied depending on the dilution rate and the size of fermentor jar.</td></tr><tr><td>reservoir jar</td><td>Bellco</td><td>Media storage bottle</td><td>20 L</td></tr><tr><td>chemicals</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>-</td><td>reagent grade</td></tr><tr><td>glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td>ACS reagent</td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9434</td><td>for molecular biology, suitable for cell culture, &amp;ge;99.5%</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746398</td><td>ACS reagent, &amp;ge;99%</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4272</td><td>98.5-101%</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>795488</td><td>ACS reagent, &amp;ge;99%</td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td>ACS reagent, &amp;ge;98%</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>793639</td><td>ACS reagent, &amp;ge;96%</td></tr><tr><td>thiamine&amp;middot;HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4625</td><td>reagent grade, &amp;ge;99%</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;succinate&amp;middot;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2378</td><td>ReagentPlus, &amp;ge;99%</td></tr></tbody></table>

procedure for adaptive laboratory evolution of microorganisms using a chemostat

Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) refers to the experimental situation in which evolution is observed using living organisms under controlled conditions and stressors; organisms are thereby artificially forced to make evolutionary changes. Microorganisms are subject to a variety of stressors in the environment and are capable of regulating certain stress-inducible proteins to increase their chances of survival. Naturally occurring spontaneous mutations bring about changes in a microorganism's genome that affect its chances of survival. Long-term exposure to chemostat culture provokes an accumulation of spontaneous mutations and renders the most adaptable strain dominant. Compared to the colony transfer and serial transfer methods, chemostat culture entails the highest number of cell divisions and, therefore, the highest number of diverse populations. Although chemostat culture for ALE requires more complicated culture devices, it is less labor intensive once the operation begins. Comparative genomic and transcriptome analyses of the adapted strain provide evolutionary clues as to how the stressors contribute to mutations that overcome the stress. The goal of the current paper is to bring about accelerated evolution of microorganisms under controlled laboratory conditions.

높은 숙시 응력 적응 야생형 E. 대장균 W3110 균주는 D에서 chemostat에서 배양 = 0.1 시간 -1 270일에 대한 (그림 2). <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54446/54446fig2.jpg" /> 그림 2 : E.의 높은 숙시 네이트 스트레스 적응 대장균을 이용하여 배양 chemostat W3110. 얇은 화살표는 스트레스의 농도가 증가하는 시간을 나타내고, 굵은 화살표는 배양 하였다 보존하는 시간을 나타낸다. 화살표 번호는 스트레스, 나트륨 숙시 네이트 육수화물의 농도를 나타낸다. ALE 동안 바이오 매스의 변화와 스트레스의 농도가 표시됩니다. 그림은 J.에서 수정 된 Biosci. Bioeng 7. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54446/54446fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> chemostat 문화가 정상 상태에 도달 할 때마다 스트레스의 농도가 160g / L가 될 때까지의 30g / L의 (나트륨 숙시 네이트 수화물)의 초기 스트레스 농도는 점차적으로 증가 하였다. 적응 E. (나트륨 숙시 응력 160 그램 / L의 내성) DST160 콜라이 균주 270 일 후에 수집 하였다. 조상 균주 (W3110)이 거의없는 성장 (그림 3)을 보여 주었다 동안 DST160 균주는 높은 숙시 네이트 스트레스 (160g / L의 스트레스 요인)에 따라 자유로운 성장을 보였다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54446/54446fig3.jpg" /> 그림 3 : 야생형 (W3110, 흰색 원)의 성장 곡선과 높은 숙시 네이트 스트레스 변형 (DST160, 검은 색 원)을 적용 그림은 적응 변형 야생 동안 높은 숙시 네이트에서 지체없이 스트레스 조건 성장을 보여준다. 유형은하지 않았다. 오류바는 3 개의 독립적 인 실험의 표준 편차를 나타냅니다. 그림은 J.에서 수정 된 Biosci. Bioeng 7. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54446/54446fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat at JoVE.com

Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat

여기서는 chemostat 문화 사용 조건 하에서 미생물 적응 진화 실험을 얻을 프로토콜을 제시한다. 또한, 진화 된 균주의 게놈 분석은 설명한다.

Chemostat를 사용하여 미생물의 적응 연구소 발전을위한 절차

Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) ...

procedure-for-adaptive-laboratory-evolution-microorganisms-using

Nanyang Technological University

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Genetics

Evolution

Evolutionary History

SCIENTISTS IN ACTION

14.3K 조회수.  Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB).  여기서는 chemostat 문화 사용 조건 하에서 미생물 적응 진화 실험을 얻을 프로토콜을 제시한다. 또한, 진화 된 균주의 게놈 분석은 설명한다. 

비디오: Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat

Design and Use of a Low Cost, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution of Bacteria Under Antibiotic Drug Selection

We describe a low cost, configurable morbidostat for characterizing the evolutionary pathway of antibiotic resistance. The morbidostat is a bacterial culture device that continuously monitors bacterial growth and dynamically adjusts the drug concentration to constantly challenge the bacteria as they evolve to acquire drug resistance. The device features a working volume of ~10 ml and is fully automated and equipped with optical density measurement and micro-pumps for medium and drug delivery. To validate the platform, we measured the stepwise acquisition of trimethoprim resistance in Escherichia coli MG 1655, and integrated the device with a multiplexed microfluidic platform to investigate cell morphology and antibiotic susceptibility. The approach can be up-scaled to laboratory studies of antibiotic drug resistance, and is extendible to adaptive evolution for strain improvements in metabolic engineering and other bacterial culture experiments.

We describe a low cost, configurable morbidostat that enables the characterization of antibiotic drug resistance by dynamically adjusting the drug concentration. The device can be integrated with a multiplexed microfluidic platform. The approach can be scaled up for laboratory antibiotic drug resistance studies.

디자인과 낮은 비용의 사용, 자동 Morbidostat 박테리아의 적응 진화에 대한 항생제 약물 선택에서

We describe a low cost, configurable morbidostat for characterizing the evolutionary pathway of antibiotic resistance. The morbidostat is a bacterial ...

연구

유전학

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration of transgenes. However, due to the low efficiency of homologous recombination (HR) and various indel mutations of non-homologous end joining (NHEJ)-based strategies in non-dividing cells, in vivo genome editing remains a great challenge. Here, we describe a homology-mediated end joining (HMEJ)-based CRISPR/Cas9 system for efficient in vivo precise targeted integration. In this system, the targeted genome and the donor vector containing homology arms (~800 bp) flanked by single guide RNA (sgRNA) target sequences are cleaved by CRISPR/Cas9. This HMEJ-based strategy achieves efficient transgene integration in mouse zygotes, as well as in hepatocytes in vivo. Moreover, a HMEJ-based strategy offers an efficient approach for correction of fumarylacetoacetate hydrolase (Fah) mutation in the hepatocytes and rescues Fah-deficiency induced liver failure mice. Taken together, focusing on targeted integration, this HMEJ-based strategy provides a promising tool for a variety of applications, including generation of genetically modified animal models and targeted gene therapies.

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9 (CRISPR/Cas9) system provides a promising tool for genetic engineering, and opens up the possibility of targeted integration of transgenes. We describe a homology-mediated end joining (HMEJ)-based strategy for efficient DNA targeted integration in vivo and targeted gene therapies using CRISPR/Cas9.

CRISPR/Cas9-중재 대상된 통합에서 Vivo에서 Homology 중재 끝에 합류 기반 전략을 사용 하 여

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that control the fidelity of transcription. To fill this gap in scientific knowledge, we recently optimized the circle-sequencing assay to detect transcription errors throughout the transcriptome of Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster, and Caenorhabditis elegans. This protocol will provide researchers with a powerful new tool to map the landscape of transcription errors in eukaryotic cells so that the mechanisms that control the fidelity of transcription can be elucidated in unprecedented detail.

This protocol provides researchers with a new tool to monitor the fidelity of transcription in multiple model organisms.

진 핵 생물의 전사 오류의 게놈 넓은 감시

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

Designing Automated, High-throughput, Continuous Cell Growth Experiments Using eVOLVER

Continuous culture methods enable cells to be grown under quantitatively controlled environmental conditions, and are thus broadly useful for measuring fitness phenotypes and improving our understanding of how genotypes are shaped by selection. Extensive recent efforts to develop and apply niche continuous culture devices have revealed the benefits of conducting new forms of cell culture control. This includes defining custom selection pressures and increasing throughput for studies ranging from long-term experimental evolution to genome-wide library selections and synthetic gene circuit characterization. The eVOLVER platform was recently developed to meet this growing demand: a continuous culture platform with a high degree of scalability, flexibility, and automation. eVOLVER provides a single standardizing platform that can be (re)-configured and scaled with minimal effort to perform many different types of high-throughput or multi-dimensional growth selection experiments. Here, a protocol is presented to provide users of the eVOLVER framework a description for configuring the system to conduct a custom, large-scale continuous growth experiment. Specifically, the protocol guides users on how to program the system to multiplex two selection pressures &#8212; temperature and osmolarity &#8212; across many eVOLVER vials in order to quantify fitness landscapes of Saccharomyces cerevisiae mutants at fine resolution. We show how the device can be configured both programmatically, through its open-source web-based software, and physically, by arranging fluidic and hardware layouts. The process of physically setting up the device, programming the culture routine, monitoring and interacting with the experiment in real-time over the internet, sampling vials for subsequent offline analysis, and post experiment data analysis are detailed. This should serve as a starting point for researchers across diverse disciplines to apply eVOLVER in the design of their own complex and high-throughput cell growth experiments to study and manipulate biological systems.

The eVOLVER framework enables high-throughput continuous microbial culture with high resolution and dynamic control over experimental parameters. This protocol demonstrates how to apply the system to conduct a complex fitness experiment, guiding users on programming automated control over many individual cultures, measuring, collecting, and interacting with experimental data in real-time.

에 버 버를 사용 하 여 자동화 된 고 처리량, 지속적인 세포 성장 실험 설계

Continuous culture methods enable cells to be grown under quantitatively controlled environmental conditions, and are thus broadly useful for measuring ...

Daily Transfers, Archiving Populations, and Measuring Fitness in the Long-Term Evolution Experiment with Escherichia coli

The Long-Term Evolution Experiment (LTEE) has followed twelve populations of Escherichia coli as they have adapted to a simple laboratory environment for more than 35 years and 77,000 bacterial generations. The setup and procedures used in the LTEE epitomize reliable and reproducible methods for studying microbial evolution. In this protocol, we first describe how the LTEE populations are transferred to fresh medium and cultured each day. Then, we describe how the LTEE populations are regularly checked for possible signs of contamination and archived to provide a permanent frozen "fossil record" for later study. Multiple safeguards included in these procedures are designed to prevent contamination, detect various problems when they occur, and recover from disruptions without appreciably setting back the progress of the experiment. One way that the overall tempo and character of evolutionary changes are monitored in the LTEE is by measuring the competitive fitness of populations and strains from the experiment. We describe how co-culture competition assays are conducted and provide both a spreadsheet and an R package (fitnessR) for calculating relative fitness from the results. Over the course of the LTEE, the behaviors of some populations have changed in interesting ways, and new technologies like whole-genome sequencing have provided additional avenues for investigating how the populations have evolved. We end by discussing how the original LTEE procedures have been updated to accommodate or take advantage of these changes. This protocol will be useful for researchers who use the LTEE as a model system for studying connections between evolution and genetics, molecular biology, systems biology, and ecology. More broadly, the LTEE provides a tried-and-true template for those who are beginning their own evolution experiments with new microbes, environments, and questions.

Daily Transfers, Archiving Populations, and Measuring Fitness in the Long-Term Evolution Experiment with Escherichia coli

This protocol describes how to maintain the Escherichia coli Long-Term Evolution Experiment (LTEE) by performing its daily transfers and periodic freeze-downs and how to conduct competition assays to measure fitness improvements in evolved bacteria. These procedures can serve as a template for researchers starting their own microbial evolution experiments.

Daily Transfers, Archiving Populations, and Measuring Fitness in the Long-Term Evolution Experiment with Escherichia coli (대장균을 사용한 장기 진화 실험에서의 일일 이동, 인구 보관 및 적합성 측정)

The Long-Term Evolution Experiment (LTEE) has followed twelve populations of Escherichia coli as they have adapted to a simple laboratory environment for ...

Generating Controlled, Dynamic Chemical Landscapes to Study Microbial Behavior

We demonstrate a method for the generation of controlled, dynamic chemical pulses&#8213;where localized chemoattractant becomes suddenly available at the microscale&#8213;to create micro-environments for microbial chemotaxis experiments. To create chemical pulses, we developed a system to introduce amino acid sources near-instantaneously by photolysis of caged amino acids within a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic chamber containing a bacterial suspension. We applied this method to the chemotactic bacterium, Vibrio ordalii, which can actively climb these dynamic chemical gradients while being tracked by video microscopy. Amino acids, rendered biologically inert (&#39;caged&#39;) by chemical modification with a photoremovable protecting group, are uniformly present in the suspension but not available for consumption until their sudden release, which occurs at user-defined points in time and space by means of a near-UV-A focused LED beam. The number of molecules released in the pulse can be determined by a calibration relationship between exposure time and uncaging fraction, where the absorption spectrum after photolysis is characterized by using UV-Vis spectroscopy. A nanoporous polycarbonate (PCTE) membrane can be integrated into the microfluidic device to allow the continuous removal by flow of the uncaged compounds and the spent media. A strong, irreversible bond between the PCTE membrane and the PDMS microfluidic structure is achieved by coating the membrane with a solution of 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) followed by plasma activation of the surfaces to be bonded. A computer-controlled system can generate user-defined sequences of pulses at different locations and with different intensities, so as to create resource landscapes with prescribed spatial and temporal variability. In each chemical landscape, the dynamics of bacterial movement at the individual scale and their accumulation at the population level can be obtained, thereby allowing the quantification of chemotactic performance and its effects on bacterial aggregations in ecologically relevant environments.

A protocol for the generation of dynamic chemical landscapes by photolysis within microfluidic and millifluidic setups is presented. This methodology is suitable to study diverse biological processes, including the motile behavior, nutrient uptake, or adaptation to chemicals of microorganisms, both at the single cell and population level.

미생물 행동을 연구하기 위한 제어된 동적 화학 적 경관 생성

We demonstrate a method for the generation of controlled, dynamic chemical pulses&#8213;where localized chemoattractant becomes suddenly available at the ...

생체공학

Automated Microbial Cultivation and Adaptive Evolution using Microbial Microdroplet Culture System (MMC)

Conventional microbial cultivation methods usually have cumbersome operations, low throughput, low efficiency, and large consumption of labor and reagents. Moreover, microplate-based high-throughput cultivation methods developed in recent years have poor microbial growth status and experiment parallelization because of their low dissolved oxygen, poor mixture, and severe evaporation and thermal effect. Due to many advantages of micro-droplets, such as small volume, high throughput, and strong controllability, the droplet-based microfluidic technology can overcome these problems, which has been used in many kinds of research of high-throughput microbial cultivation, screening, and evolution. However, most prior studies remain&#160;at the stage of laboratory construction and application. Some key issues, such as high operational requirements, high construction difficulty, and lack of automated integration technology, restrict the wide application of droplet microfluidic technology in microbial research. Here, an automated Microbial Microdroplet Culture system (MMC) was successfully developed based on droplet microfluidic technology, achieving the integration of functions such as inoculation, cultivation, online monitoring, sub-cultivation, sorting, and sampling required by the process of microbial droplet cultivation. In this protocol, wild-type Escherichia coli (E. coli) MG1655 and a methanol-essential E. coli strain (MeSV2.2) were taken as examples to introduce how to use the MMC to conduct automated and relatively high-throughput microbial cultivation and adaptive evolution in detail. This method is easy to operate, consumes less labor and reagents, and has high experimental throughput and good data parallelity, which has great advantages compared with conventional cultivation methods. It provides a low-cost, operation-friendly, and result-reliable experimental platform for scientific researchers to conduct related microbial research.

Automated Microbial Cultivation and Adaptive Evolution using Microbial Microdroplet Culture System MMC

This protocol describes how to use the Microbial Microdroplet Culture system (MMC) to conduct automated microbial cultivation and adaptive evolution. MMC can cultivate and sub-cultivate microorganisms automatically and continuously and monitor online their growth with relatively high throughput and good parallelization, reducing labor and reagent consumption.

미생물 마이크로액적 배양 시스템(MMC)을 이용한 자동화된 미생물 배양 및 적응 진화

Conventional microbial cultivation methods usually have cumbersome operations, low throughput, low efficiency, and large consumption of labor and ...

The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated including macromolecular synthesis, metabolism and ultimately, commitment to the cell division cycle. The chemostat, a method of experimentally controlling cell growth rate, provides a powerful means of systematically studying how growth rate impacts cellular processes - including gene expression and metabolism - and the regulatory networks that control the rate of cell growth. When maintained for hundreds of generations chemostats can be used to study adaptive evolution of microbes in environmental conditions that limit cell growth. We describe the principle of chemostat cultures, demonstrate their operation and provide examples of their various applications. Following a period of disuse after their introduction in the middle of the twentieth century, the convergence of genome-scale methodologies with a renewed interest in the regulation of cell growth and the molecular basis of adaptive evolution is stimulating a renaissance in the use of chemostats in biological research.

Cell growth rate is a regulated process and a primary determinant of cell physiology. Continuous culturing using chemostats enables extrinsic control of cell growth rate by nutrient limitation facilitating the study of molecular networks that control cell growth and how those networks evolve to optimize cell growth.

미생물 시스템 생물학의 Chemostats의 사용

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...

생물학

Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays

Chemostats are continuous culture systems in which cells are grown in a tightly controlled, chemically constant environment where culture density is constrained by limiting specific nutrients.1,2 Data from chemostats are highly reproducible for the measurement of quantitative phenotypes as they provide a constant growth rate and environment at steady state. For these reasons, chemostats have become useful tools for fine-scale characterization of physiology through analysis of gene expression3-6 and other characteristics of cultures at steady-state equilibrium.7 Long-term experiments in chemostats can highlight specific trajectories that microbial populations adopt during adaptive evolution in a controlled environment. In fact, chemostats have been used for experimental evolution since their invention.8 A common result in evolution experiments is for each biological replicate to acquire a unique repertoire of mutations.9-13 This diversity suggests that there is much left to be discovered by performing evolution experiments with far greater throughput. 
We present here the design and operation of a relatively simple, low cost array of miniature chemostats&mdash;or ministats&mdash;and validate their use in determination of physiology and in evolution experiments with yeast. This approach entails growth of tens of chemostats run off a single multiplexed peristaltic pump. The cultures are maintained at a 20 ml working volume, which is practical for a variety of applications. It is our hope that increasing throughput, decreasing expense, and providing detailed building and operation instructions may also motivate research and industrial application of this design as a general platform for functionally characterizing large numbers of strains, species, and growth parameters, as well as genetic or drug libraries.

We developed and validated a small-footprint array of miniature chemostats built from readily available parts for low cost. Physiological and experimental evolution results were similar to larger volume chemostats. The ministat array provides a compact, inexpensive, and accessible platform for traditional chemostat experiments, functional genomics, and chemical screening applications.

다중 Chemostat 배열의 설계 및 사용

Chemostats are continuous culture systems in which cells are grown in a tightly controlled, chemically constant environment where culture density is ...

<meta charset="utf8"></head><body>저비용 열혼합기를 사용한 호열성 적응을 위한 실험적 진화 프로토콜

Adaptation at the Extremes of Life: Experimental Evolution with the Extremophile Archaeon Sulfolobus acidocaldarius

The archaeon Sulfolobus acidocaldarius has emerged as a promising thermophilic model system. Investigating how thermophiles adapt to changing temperatures is a key requirement, not only for understanding fundamental evolutionary processes but also for developing S. acidocaldarius as a chassis for bioengineering. One major obstacle to conducting experimental evolution with thermophiles is the expense of equipment maintenance and energy usage of traditional incubators for high-temperature growth. To address this challenge, a comprehensive experimental protocol for conducting experimental evolution in S. acidocaldarius is presented, utilizing low-cost and energy-efficient bench-top thermomixers. The protocol involves a batch culture technique with relatively small volumes (1.5 mL), enabling tracking of adaptation in multiple independent lineages. This method is easily scalable through the use of additional thermomixers. Such an approach increases the accessibility of S. acidocaldarius as a model system by reducing both initial investment and ongoing costs associated with experimental investigations. Moreover, the technique is transferable to other microbial systems for exploring adaptation to diverse environmental conditions.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: 호열성 진화를 탐구하기 위한 혁신적인 기술을 사용한 미생물 적응 이해

Here, we present an experimental evolution protocol for adaptation in thermophiles utilizing low-cost, energy-efficient bench-top thermomixers as incubators. The technique is demonstrated through the characterization of temperature adaptation in Sulfolobus acidocaldarius, an archaeon with an optimal growth temperature of 75 &#176;C.

삶의 극한에서의 적응 : 극한 고령 Archaeon Sulfolobus acidocaldarius를 사용한 실험적 진화

The archaeon Sulfolobus acidocaldarius has emerged as a promising thermophilic model system. Investigating how thermophiles adapt to changing temperatures ...