JHN is supported by the Swiss National Foundation (SNSF 310030_146290).

The authors have nothing to disclose.

다른 모든 모델과 같이, 상술 한 항원 구동 대장염 모델 기술을 수행하는 연구자는 유의해야 할 몇 가지 문제점을 제시 할 수있다. 구약-II 호스트에서 / 레드 + CD4 + T CD62L + 세포를 주입 할 때, 연구자는 복강에 주사 바늘을 ​​삽입하는 것은 매우 온화하고주의해야합니다. 그렇게하지 ​​않으면 사망에이를 수있는 마우스 또는 질병을 유발하지 않습니다 세포의 피하 투여의 소장의 파열 될 수 있습니다. 일반적으로 마우스는 셀 전송 후 첫 주 동안 체중이 증가 할 것이다. 연구자는 각각 중량 시점에서 동시에 마우스 무게 및 전체 공정에 걸쳐 동일한 무게 저울을 사용한다. 때로는 실험 쥐 실험의 시작에서 그 무게가 18g 이하이며, 특히 낭비 증후군의 징후를 개발하지 않는다. 그러나 이러한 동물 might는 여전히 거시적 평가에서 중요한 장내 염증을 개발한다. 유전자 변형 박테리아로 작업 할 때, 오염이 발생할 수 있습니다. 가 높은 박테리아가 막대 모양 (전형적인 대장균 모양) 형광하고 있는지 분석하기 위해 형광 현미경을 이용하여 CFP-OVA를 발현하는 대장균을 확인하는 것이 좋습니다 이러한 문제를 방지 할 수 있습니다. 제안 된 항원 피구 대장염 관찰에 의존하는 정상 상태 및 염증성 질환 (36, 37) 중 3 CR1 CX + 의원 샘플 내강 공생 박테리아. 항원 구동 대장염 모델에서 T 세포 반응의 유도는 CX 3 CR1 GFP의 콜론에서 OT-II CD4 + T 세포의 고도로 활성화 된 표현형에 의해 입증되었다 / + X RAG - / - 항원과 도전 생쥐 CX는 3 CR1 GFP / + X RAG에서 격리 T 세포에 비해 <s- / - 항원 (37)와 도전을하지 않은 쥐&gt;입니다. - / - 마우스, 호스트는 OVA - 표현 E.에 도전했을 때 대장염 만 유도이의 이전 연구, RAG에서 OT-II T 세포의 입양 전송 후와 일치 대장균 51. 공 촛점 영상은 E.를 샘플링 할 수 있도록 CX (3) CR1 + 식세포가 장 상피 세포에 가까이 위치하고 있습니다 제안 대장균 pCFP-OVA는 및 OT-II / 레드 + CD4 + T 세포와 상호 작용합니다. CX (3) CR1 + 식세포는 E. 샘플링 한 후 대장균 pCFP-OVA 내강 항원 CX (3) CR1 + 식세포에 의해 CD103 + 수지상 세포 (DC가)에 전달된다. CD103 + 수지상 프라임 CD4 T 세포 37,52에 장간막 림프절 (MLN)로 마이그레이션 할 수 있습니다. 프라임 T 세포는 CX (3) CR1 + 식세포가 전자하기 위해 OVA 항원을 보여 CLP에서 조립ffector T 세포가 염증을 유도한다. CX에 의한 항원의 전달 및 프리젠 테이션 3 CR1 + 식세포는 대장염의 개발에서 중요한 이벤트가 될 수있다. 특정 항원을 발현 정의 된 박테리아로 대장염을 유발하는 능력은 대장염 (24)의 발전에 필요한 조건을 연구 할 수있는 기회를 제공한다. T 세포는 장내 미생물의 특이 적 항원에 반응 할 수 있음을 시사 호스트 - / -이 모델은 항원 성 펩티드 (E. coli에 의해 표현 OVA)에 대한 특정 응답 RAG 장내 염증을 유도하기에 충분한 것으로 나타났다. 단일 항원은 동물 모델에서 장내 염증을 유도 할 수 있지만, 단일 항원 인간 IBD의 원인이라고 가정 할 수 없다. 또한, 전사 성 대장염 모델에서 아직 미확인 된 항원과 같은 여러 반응성 일 수있다 따라서, 미지의 특이성을 갖고 나이브 CD4 + T 세포에서 존재미생물. 주요 분석과 연구가 잘 점막 염증 병인에서 특정 항원의 역할을 규명하기 위해 필요하다. 최근 대장염의 다른 동물 모델의 사용은 IBD (53)의 발병 기전의 지식을 확장하게되었다. 복잡성과 질병의 병인에 기인하지만, 최종 경화 (54)이 없다. 상술 한 모델을 이용하여, 이러한 단핵구와 수상 세포 사이의 (I)의 상호 작용뿐만 아니라 아직 명확하지 IBD의 여러 측면을 해결하는 것이 가능하다은 MLN에 장내 수지상 (II)의 이동, (ⅲ) 항원 제시, CX + 3 CR1 식세포에 의한 점막 고유 층의 고유 판 및 이펙터 T 세포 (V) 활성화에 MLN에서 이펙터 T 세포 (IV) 원점. 그러나 추가 연구는 CX (3) CR1 +의 식세포가 / CD4 + T 세포의 상호 작용이 중요한 역할을 담당하는 경우 확인 필요IBD의 발병 기전. 마우스는 인간의 진정으로 대표 할 수 없으며 마우스 모델 인간 IBD이 연구하는 데 사용하는 경우이 염두에 보관해야합니다.

대장은 외부 환경에 노출되어 상기 몸체의 큰 표면이다. 상주 균의 광대 한 배열 장내 미생물 (또는 미생물)를 형성하는 인간의 장내 정착. 이는 최대 100 조 미생물 세포로 구성되어 것으로 추정 생물학 1-3에 알려진 가장 인구 밀도가 세균의 서식지 중 하나 구성된다. 망할 놈의 박테리아는 생존과 4를 곱 장내 틈새 시장을 식민지화. 반환에서, 미생물은 유전자 1 인코딩되지 않은 추가 기능 기능 호스트를 부여한다. 예를 들어, 미생물은 상피 세포의 증식을 자극 스스로 호스트가 생성 할 수없는 비타민을 생산하고, 신진 대사를 조절하고 병원균 4-6을 방지합니다. 이 유익한 관계를 감안할 때, 몇몇 저자는 인간이 박테리아와 인간의 유전자 7,8의 혼합이다 &quot;슈퍼 유기체&quot;또는 &quot;holobionts&quot;것을 제안했다. 제 (인간) 호스트에있는 미생물의 수익에 미치는 영향을 감안할 때, 장내 면역 시스템은 루멘에서 자신의 존재를 가능하게뿐만 아니라 내강 측 9-11에서 침입 병원균을 죽일 공생 미생물을 허용 할 필요가있다. 장내 면역 시스템은 무해하고 잠재적으로 유해한 내강 미생물을 구별하는 메커니즘을 개발했다; 그러나 이러한 메커니즘은 아직 잘 (12)을 이해하지 않습니다. 장 무결성을 유지하는 것은 관용과 면역 (13) 사이의 균형을 유지하기 위해 엄격하게 규제 면역 항상성을 필요로한다. 면역 항상성의 불균형은 염증성 장 질환 (IBD) 3,14로 장 질환의 유도에 기여한다. 크론 병 (CD)과 궤양 성 대장염 (UC) : 두 가지 주요 IBD의 유형이있다. 이러한 질병을 가진 환자는 일반적으로 직장 출혈, 심한 설사와 복통 15, 16 겪는다. IBD의 하나의 원인은 아직유전 적 요인, 환경 적 영향 및 조절 이상 면역 반응의 알 수없는,하지만 조합이 질병 개발 (15)의 키 이벤트가 될 수 있습니다. IBD에 대한 동물 모델은 50 년 이상 사용되어왔다. 지난 수십 년에 새로운 IBD 모델 시스템은 IBD (17, 18)의 발병 기전에 관련된 여러 가지 가설을 테스트하기 위해 개발되었다. 만성 대장염의 가장 특징으로하는 모델은 T 세포의 항상성 (19, 20)의 붕괴를 유도 T 세포 전달 모델이다. 16,21이 모델은 T 및 - (- / SCID 마우스와 같은 RAG 같은) B 세포가 부족 호스트로 면역 된 마우스에서 나이브 T 세포 전사 포함한다. 이 모델에서 질병의 발달은 체중 설사 존재 감소 신체 활동과 손실을 평가 3-10 주 동안 모니터링된다. 이 때문에 낭비 증후군 (16)이라고합니다. 건강한 쥐에 비해 이식 호스트의 대장 조직 thicke입니다R, 짧고 (16) 무거운. T 개의 셀의 전송 모델을 사용하면, T 세포 개체군은 22 IBD의 병인에 기여할 수있는 다른 방법을 이해할 수있다. T 개의 셀 전송 모델은 항원 특이 적 방식으로 질병 과정에 장갑차 및 T 세포 사이의 상호 작용을 분석하지 않는다. 또한 골수 세포 및 림프구 세포 간의 상호 작용은 염증 창자 (23)의 개발을 담당 할 수 있음을 보여왔다. IBD의 많은 부분이 밝혀져 있지만, 질환의 개발로 이어질 초기 사건은 여전히​​ 명확하게 이해되어야한다. 이는 미생물 전송 대장염이없는 것을 도시하고있다 (24)를 확립 할 수 없다. 최근 몇 이론 IBD는 공생 세균 (25)에 대한 면역 반응의 결과 일 수 있음을 시사한다. 저자는 공생 박테리아 말단 부위에 염증을 유발하는 데 필수적인 것이 제안26. 세균 무연 (GF) 동물 장 면역 체계는 일반적으로 (27, 28)을 손상되지만 완전 권한 장 면역계 (29)의 발전에 관련되는 무균 박테리아 결과의 혼합물이 마우스의 집락. 따라서, 미생물은에 걸리기 또는 장내 염증 30, 31의 개발에 대해 보호하는 메커니즘으로 하나, IBD의 발병 기전에 중요한 요소가 될 것으로 보인다. 현재의 이론에서는 유전 적 소인이 IBD 환자 32, dysbiosis 불리는 미생물 불균형의 결과임을 암시하지만, 분명하지 아직 dysbiosis가 원인 또는 병 (12)의 결과 인 경우. IBD의 개발 미생물의 역할을 고려하여, 시험 관내 실험에서 CD4 + T 세포는 장내 세균 (33, 34)와 펄스 장갑차에 의해 활성화 될 수 있음을 보여 주었다. 또한, 항원은 그 도시 된같은 E. 등 다양한 공생 박테리아 종, 대장균, 박 테로이드, Eubacterium 및 테우스는 CD4 + T 세포 (35)를 활성화 할 수 있습니다. 이 세포를 T로 세균의 항원 제시는 IBD의 개발에 대한 중요성을 나타냅니다. 질병 과정에서 미생물에 의해 도출 된 여러 항원의 복잡성을 줄이기 위하여, 대장균 균주은 OVA 항원을 생성하는 생성되었다. - / - 전송 대장염은 RAG에 OVA 특이 적 T 세포를 주입하여 유도 하였다 OVA 동물 발현 E. 집락 대장균. 이 모델은 3 CR1 CX + 의원, 대장 점막 고유 층 (CLP) (36)의 주요 세포 서브 세트가 전송 중에 CD4 + T 세포와 상호 작용하는 것을 암시하는 최근 증거에 기초 37 대장염. 의원은 돌기 (36), (38, 39)를 이용하여 박테리아 등의 미립자 항원 창자 내강, 샘플링. 이전의 연구의원도 40, 41 루멘 장 도입 등의 OVA와 같은 수용성 항원을, 걸릴 수 있음을 보여 주었다. CLP를에 CX (3) CR1 + 의원의 풍요 로움을 감안할 때, 이러한 세포 내강 박테리아를 샘플링하고 CD4 T 세포와 상호 작용할 수있는 가능성이있다. E. 집락 OVA 특이 적 CD4 + T 세포를 이식 한 생쥐의 공 초점 화상 대장균 CFP-OVA는, CX (3) CR1 + 의원은 항원 중심 대장염의 개발 과정 OT-II CD4 + T 세포와 접촉하는 것을 보여준다. 이 모델은 장내 장갑차 만 장내 루멘에 특정 항원을 발현하는 박테리아에 특이적인 T 세포의 항원 제시 공정을 연구 할 수있다.

<table><tbody><tr><td>LB Broth, Miller (Luria-Bertani)</td><td>Difco</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>Rotary Shake</td><td>Reiss Laborbedarf e. K.</td><td>Model 3020 GFL</td><td></td></tr><tr><td>2 mm gap couvettes&amp;nbsp;</td><td>Peqlab Biotechnologie GmbH</td><td>71-2020</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser Xcell system&amp;nbsp;</td><td>BioRad Laboratories GmbH</td><td>1652660</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar, Miller (Luria-Bertani)</td><td>Difco</td><td>244510</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9393-5G</td><td></td></tr><tr><td>SOC Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1797-100ML</td><td></td></tr><tr><td>High Pure Plasmid Isolation Kit</td><td>Roche</td><td>11754777001</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Carl Roth GmbH &amp;amp; Co</td><td>3810.1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>Glacial acetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>537020&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Gel chamber&amp;nbsp;</td><td>PEQLAB Biotechnology GmbH</td><td>40-0708</td><td></td></tr><tr><td>Loading Dye</td><td>Thermo Fisher</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb DNA Ladder&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>SM0312</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium bromide solution</td><td>Carl Roth GmbH &amp;amp; Co. KG</td><td>2218.3</td><td></td></tr><tr><td>Photo-documentation system&amp;nbsp;</td><td>Decon Science Tech GmbH</td><td>DeVision G&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DNA sequencing&amp;nbsp;</td><td>MWG-Biotech GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Biochrom</td><td>L182-50</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent microscope&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>HBO 100</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra System</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH</td><td>1658005</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler Prestained Protein Ladder&amp;nbsp;</td><td>Fermentas, St. Leon-Rot, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IstanBlue Solution</td><td>Expedeon, Cambridgeshire, United Kingdom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulose membrane&amp;nbsp;</td><td>Macherey-Nagel GmbH &amp;amp; Co. KG</td><td>741280</td><td></td></tr><tr><td>Electro blotter&amp;nbsp;</td><td>Biometra GmbH</td><td>846-015-600</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumins (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6003-25G</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ovalbumin antibody&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab181688</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rabbit IgG&amp;nbsp; HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0545&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pierce ECL Plus Western Blotting Substrate</td><td>Pierce Biotechnology, Thermo Fischer Scientific Inc</td><td>32132</td><td></td></tr><tr><td>Forene</td><td>Abbott</td><td>2594.00.00</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10500-064</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Cell Strainers</td><td>Fischer Scientific&amp;nbsp;</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>254134-5G</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; CD62 L&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; T isolation kit&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-227&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MACS LS Columns&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS MS Columns&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>MidiMACS Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>MiniMACS Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Feeding Needle 20G</td><td>SouthPointe Surgical Supply, Inc</td><td>FN-7903</td><td></td></tr><tr><td>Formalin solution, neutral buffered, 10%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1496904</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9627</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230251&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9779&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase type VIII</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-2139</td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium</td><td>AppliChem</td><td>A2044, 9050</td><td></td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>438456</td><td></td></tr><tr><td>Mouse BD Fc Block</td><td>BD Pharmingen</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>FITC-conjugated mAb binding V&amp;szlig; 5.1, 5.2&amp;nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>553189</td><td></td></tr><tr><td>APC-conjugated mAb binding CD4 GK1.5&amp;nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>17-0041-83</td><td></td></tr><tr><td>FACS Calibur&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FCS Express V3 software</td><td>DeNovo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Meta scanning confocal microscope&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>LSM 710&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Workstation</td><td>Zeiss</td><td>LSM 7</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss ZEM software&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>v4.2.0.121</td><td></td></tr><tr><td>Maxisorp immuno plates&amp;nbsp;</td><td>NUNC, Roskilde</td><td>442404</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin conjugated alkaline phosphatase</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>016-050-084</td><td></td></tr><tr><td>Alkaline phosphatase substrate 4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71768-5G</td><td></td></tr><tr><td>mAb R4-6A2</td><td>BD Biosciences</td><td>551216</td><td></td></tr><tr><td>mAb XMG1.2&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>554410</td><td></td></tr><tr><td>TECAN microplate-ELISA reader</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EasyWin software</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNase I recombinant</td><td></td><td>4536282001</td><td></td></tr></tbody></table>

development of an antigen-driven colitis model to study presentation of antigens by antigen presenting cells to t cells

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological mechanisms involved during the disease is the T cell transfer model of colitis. In this model, immunodeficient mice (RAG-/- recipients) are reconstituted with naive CD4+ T cells from healthy wild type hosts.
This model allows examination of the earliest immunological events leading to disease and chronic inflammation, when the gut inflammation perpetuates but does not depend on a defined antigen. To study the potential role of antigen presenting cells (APCs) in the disease process, it is helpful to have an antigen-driven disease model, in which a defined commensal-derived antigen leads to colitis. An antigen driven-colitis model has hence been developed. In this model OT-II CD4+ T cells, that can recognize only specific epitopes in the OVA protein, are transferred into RAG-/- hosts challenged with CFP-OVA-expressing E. coli. This model allows the examination of interactions between APCs and T cells in the lamina propria.

항원 중심 대장염 모델 E.을 설정하려면 콜라이 균주 강한 구성 적 프로모터 P 하이퍼 (도 1a)의 제어 하에서 발현되는 CFP 유전자가 닭 오브 알부민 단백질과 융합 구조체에 대한 코딩 서열에 융합 된 플라스미드를 포함하는 구성되었다. 형광 현미경 보여줍니다 재조합 E. 대장균 pCFP-OVA가 아니라 부모의 E. 대장균 DH10B는 CFP (그림 1B)를 표현한다. E.을 생산하는 CFP-OVA- 대장균은 시험 관내 OT-II 세포를 활성화 및 E. 대조적으로 IFN-γ의 생산을 유도 할 수있다 CFP를 표현하는 대장균 균주 만 (그림 2 참조). 그림 3a는 E.가 공급 CX (3) CR1 GFP / + 마우스의 대장 조직의 생체 3D 공 촛점 영상을 보여줍니다 대장균 pCFP-OVA. E. 대장균 pCFP-OVA 수상피 세포 및 장 가까이있는 대장 지하실 내에서 검출 될 CX (3) CR1 + 식세포와 공동-지역화. E.의 상대적 비율을 확인하려면 대장균 pCFP-OVA 3 CR1 + 식세포가, 파란색과 녹색의 형광 강도가 산란 말에 의해 결정되었다 정의 CX에 의해 내면화. 분석은 CX (3) CR1 + 세포가 E.의 11.9 ± 1.5 %를 샘플링 것으로 나타났다 대장균 pCFP-OVA는 콜론. OT-II에서 (그림 3B) / 레드 동물에서 발견, CD4 + T 세포 레드 표현과 Vβ 특징으로 유동 세포 계측법 (그림 4)로 표시 5.1 표현은.도 5a는 일반적인 개요를 보여줍니다 항원 구동 대장염 모델입니다. OT-II / 레드 + CD4 + T CD62L는 + 세포는 적응 적 CX (3)에 전송 된 CR1 GFP / + X RAG - / - 다음 E.으로 매초마다 하루 gavaged 된받는 사람대장균 pCFP-OVA. E.에 도전 할 때 대장균 pCFP-OVA는, CX (3) 전송 CR1 GFP / + X RAG - / - 마우스가 체중을 잃고 대장염 (그림 5B)의 임상 증상을 개발 6은 생체 3D 대장 조직 7 일, 14 일, 21 일 후의 공 초점 이미징 그림. 이형 CX의 재구성은 3 CR1 GFP / + X RAG - / - OT-II와받는 사람 / 레드 + 세포 E.에 도전 대장균 pCFP-OVA. 이레 셀 전송 후 몇 CX (3) CR1 + 식세포는 E. 샘플링 한 대장균 pCFP-OVA 및 OT-II는 / 레드 + 세포는 검출되지 않았다. 셀 전송 후 열네 일, CX E. 샘플링 3 CR1 + 식세포를 대장균 pCFP-OVA는 OT-II에 가까운 / 레드 + 세포에 있었다. 스물 일일 전지 후 E. 샘플링 한 3 CR1 + 세포는 CX의 높은 숫자를 전송 대장균 pCFP-OVA 및 OT-II / R근접 CLP를 통해 분산 에디션 + 세포는 3 CR1 + 식세포를 CX합니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54421/54421fig1.jpg" /> 그림 1 : CFP-OVA을 일으키기 E. 관련 제한 사이트와 pCFP - OVA의 대장균. (A)지도, OVA와 밝은 푸른 형광 단백질 CFP를 코딩하는 유전자. (B) 밝은 필드와 야생형 E.의 형광 현미경 이미지 대장균 DH10B, E. 대장균 DH10B pCFP 및 E. 대장균 DH10B pCFP-OVA. 스케일 바 :. 10 μm의 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54421/54421fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54421/54421fig2.jpg" /> 그림 2 : OTCFP-OVA로 자극 -II 세포는 IFN-γ를 생성합니다. 비장에서 분리 한 후, OT-II 세포는 E.의 지정된 번호로 자극 하였다 대장균 DH10B pCFP-OVA. 세균 세포는 5 μg의 / ㎖ 겐타 마이신 2 시간 배양 한 다음 불 활성화되었다. 배양 72 시간 후에, 상등액을 수집하고, IFN-γ의 농도는 ELISA에 의해 결정된다. 실험은 SEM ± 평균으로 제시 삼중 데이터에서 수행 하였다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54421/54421fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54421/54421fig3.jpg" /> 그림 3 : CX (3) CR1 + 식세포 샘플 E. 대장균 pCFP-OVA. (A) CX (3) CR1의 CLP 조직GFP / + 마우스는 1 × 8 E.으로 gavaged 대장균 pCFP-OVA 7 일간 및 생체 공 초점 현미경으로 분석 하였다. 배율 40 배 / 1.30. 스케일 바는 30 μm의 =. (B) 내면화 E.의 비율 대장균 pCFP-OVA는 정량 데이터는 SEM ± 평균으로 제시했다. 맨 - 휘트니 테스트 페이지에서 &lt;0.05가 통계적으로 유의 한 것으로 간주 하였다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54421/54421fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54421/54421fig4.jpg" /> 도 4 :. OT-II / 적색 + CD4 + T 세포의 특성 (A) OT-II 유전자 변형 동물 OT-II을 수득하는 적색 형광 단백질을 발현하는 동물과 교배 / 적색 +세포. OT-II는 / 레드 + 세포는 OT-II / 레드의 비장에서 분리 하였다 형질 전환 동물, CD4 및 Vß5.1에 대한 염색 및 유동 세포 계측법에 의해 분석 하였다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54421/54421fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/54421/54421fig5.jpg" /> 그림 5 : OVA 기반 전송 대장염 (A) 항원 구동 대장염 모델의 도식 표현.. E.으로 마우스와 호스트 gavaged 된 모든 둘째 날 - / - OT-II / 레드 + CD4 + T CD62L는 + 세포는 적응 적 3 CR1 GFP / + X RAG는 CX로 옮겨졌다 대장균 pCFP-OVA. 지정된 그룹 (B) 체중은 일주일에 두 번 측정 하였다. ± SEM 체중 감소 (%)을 의미하는 것이 제공된다. 맨 - 휘트니 테스트에서P는 &lt;0.05가 통계적으로 유의 한 것으로 간주 하였다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54421/54421fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/54421/54421fig6.jpg" /> 그림 6 :. CX 3 CR1 + 의원은 OVA 기반 전송 대장염 동안 OT-II 셀과 통신 (A) 대장 조직 샘플 OT-II / 레드의 전송 후 7 일, 14 및 21에서 생체 3D 공 초점 영상으로 조사 하였다 - / -받는 사람 CX (3) CR1 GFP / + X RAG에서 + CD4 + T CD62L는 + 세포. 배율 40 배 / 1.30. 스케일 바는 30 μm의 =.

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Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells

In this antigen-driven colitis model, OT-II CD4+ T cells expressing a red fluorescent protein were adoptively transferred into RAG-/- mice that express a green fluorescent protein in mononuclear phagocytes (MPs). The hosts were challenged with Escherichia coli (E.coli) expressing the ovalbumin protein (OVA) fused to a cyan fluorescent protein (CFP).

항원 중심의 성 대장염 모델의 개발은 항원이 T 세포에 세포를 제시하여 항원의 프리젠 테이션을 공부하기

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological ...

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Nanyang Technological University

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Immunology and Infection

8.9K 조회수.  University College Cork. In this antigen-driven colitis model, OT-II CD4+ T cells expressing a red fluorescent protein were adoptively transferred into RAG-/- mice that express a green fluorescent protein in mononuclear phagocytes (MPs). The hosts were challenged with Escherichia coli (E.coli) expressing the ovalbumin protein (OVA) fused to a cyan fluorescent protein (CFP).

비디오: Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells

Visualization of Estrogen Receptors in Colons of Mice with TNBS-Induced Crohn's Disease using Immunofluorescence

Crohn&#39;s disease is the most diagnosed type of inflammatory bowel disease. Chronic inflammation developing in the intestine leads to peristalsis disorder and damage of intestinal mucosa and seems to be associated with an increased risk of colon neoplastic transformation. Accumulating evidence indicates that estrogens and estrogen receptors affect not only hormone-sensitive tissues, but also other tissues not directly related to estrogens, such as the lungs or colon. Here, we describe the protocol for the successful immunofluorescence staining of estrogen receptors in colon obtained from a murine model of TNBS-induced Crohn&#39;s disease. A detailed protocol for the induction of Crohn&#39;s disease in mice and intestine preparation is provided as well as a step-by-step immunohistochemical procedure using formalin-fixed paraffin-embedded intestine sections. The described methods are not only useful for estrogen receptor detection and estrogen signaling investigation in vivo but can also be applied to for other proteins which may be involved in the development of colitis.

The protocol presents a complete validated TNBS-induced murine model of Crohn&#39;s disease and methods for visualization of estrogen receptors by immunohistochemistry using immunofluorescence of formalin-fixed colon sections embedded in paraffin.

면역 형광을 사용하여 TNBS 유도 크론 병을 가진 마우스의 결장에서 에스트로겐 수용체의 가시화

Crohn&#39;s disease is the most diagnosed type of inflammatory bowel disease. Chronic inflammation developing in the intestine leads to peristalsis ...

연구

생화학

DNBS/TNBS Colitis Models: Providing Insights Into Inflammatory Bowel Disease and Effects of Dietary Fat

Inflammatory Bowel Diseases (IBD), including Crohn&#39;s Disease and Ulcerative Colitis, have long been associated with a genetic basis, and more recently host immune responses to microbial and environmental agents. Dinitrobenzene sulfonic acid (DNBS)-induced colitis allows one to study the pathogenesis of IBD associated environmental triggers such as stress and diet, the effects of potential therapies, and the mechanisms underlying intestinal inflammation and mucosal injury. In this paper, we investigated the effects of dietary n-3 and n-6 fatty acids on the colonic mucosal inflammatory response to DNBS-induced colitis in rats. All rats were fed identical diets with the exception of different types of fatty acids [safflower oil (SO), canola oil (CO), or fish oil (FO)] for three&#160;weeks prior to exposure to intrarectal DNBS. Control rats given intrarectal ethanol continued gaining weight over the 5 day study, whereas, DNBS-treated rats fed lipid diets all lost weight with FO and CO fed rats demonstrating significant weight loss by 48&#160;hr and rats fed SO by 72&#160;hr. Weight gain resumed after 72&#160;hr post DNBS, and by 5 days post DNBS, the FO group had a higher body weight than SO or CO groups. Colonic sections collected 5&#160;days post DNBS-treatment showed focal ulceration, crypt destruction, goblet cell depletion, and mucosal infiltration of both acute and chronic inflammatory cells that differed in severity among diet groups. The SO fed group showed the most severe damage followed by the CO, and FO fed groups that showed the mildest degree of tissue injury. Similarly, colonic myeloperoxidase (MPO) activity, a marker of neutrophil activity was significantly higher in SO followed by CO fed rats, with FO fed rats having significantly lower MPO activity. These results demonstrate the use of DNBS-induced colitis, as outlined in this protocol, to determine the impact of diet in the pathogenesis of IBD.

DNBS/TNBS induced colitis offers an alternative and inexpensive method to study the pathobiology of inflammatory bowel disease. The protocol discussed in this paper outlines the successful application of DNBS to induce colitis in mice and rats and allows one to thoroughly study host-mediated intestinal responses.

DNBS / TNBS 대장염 모델 : 염증성 장 질환에 대한 통찰력과식이 지방의 효과를 제공

Inflammatory Bowel Diseases (IBD), including Crohn&#39;s Disease and Ulcerative Colitis, have long been associated with a genetic basis, and more recently ...

의학

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

이펙터 CD4의 입양 전송하여 쥐과 장내 염증의 유도<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; 높은</sup&gt; 면역 결핍 마우스에게 T 세포

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

면역학 및 감염병학

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral tissues through an as-yet undefined mechanism. The application of multiphoton microscopy to the study of the immune system provides a tool to measure the dynamics of immune responses within intact tissues. Here we present a protocol for non-invasive intravital multiphoton imaging of CD4 T cells in the inflamed mouse ear dermis. Use of a custom imaging platform and a venous catheter allows for the visualization of CD4 T cell dynamics in the dermal interstitium, with the ability to interrogate these cells in real-time via the addition of blocking antibodies to key molecular components involved in motility. This system provides advantages over both in vitro models and surgically invasive imaging procedures. Understanding the pathways used by CD4 T cells for motility may ultimately provide insight into the basic function of CD4 T cells as well as the pathogenesis of both autoimmune diseases and pathology from chronic infections.

The mechanisms that govern the interstitial motility of CD4 effector T cells at sites of inflammation are relatively unknown. We present a non-invasive approach to visualize and manipulate in vitro-primed CD4 T cells in the inflamed ear dermis, allowing for study of the dynamic behavior of these cells in situ.

염증이 진피의 이미징 CD4 T 세포 간질 마이그레이션

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen presenting molecules to initiate T-cell-mediated immunity. Dendritic cells can be separated into several phenotypically and functionally heterogeneous subsets. Three important subsets of splenic dendritic cells are plasmacytoid, CD8&#945;Pos and CD8&#945;Neg cells. The plasmacytoid DCs are natural producers of type I interferon and are important for anti-viral T cell immunity. The CD8&#945;Neg DC subset is specialized for MHC class II antigen presentation and is centrally involved in priming CD4 T cells. The CD8&#945;Pos DCs are primarily responsible for cross-presentation of exogenous antigens and CD8 T cell priming. The CD8&#945;Pos DCs have been demonstrated to be most efficient at the presentation of glycolipid antigens by CD1d molecules to a specialized T cell population known as invariant natural killer T (iNKT) cells. Administration of Flt-3 ligand increases the frequency of migration of dendritic cell progenitors from bone marrow, ultimately resulting in expansion of dendritic cells in peripheral lymphoid organs in murine models. We have adapted this model to purify large numbers of functional dendritic cells for use in cell transfer experiments to compare in vivo proficiency of different DC subsets.

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

마우스 수지상 세포 하위 집합의 분리를위한 효율적이고 높은 수율 방법

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

Purification of the Membrane Compartment for Endoplasmic Reticulum-associated Degradation of Exogenous Antigens in Cross-presentation

Dendritic cells (DCs) are highly capable of processing and presenting internalized exogenous antigens upon major histocompatibility class (MHC) I molecules also known as cross-presentation (CP). CP plays an important role not only in the stimulation of na&#239;ve CD8+ T cells and memory CD8+ T cells for infectious and tumor immunity but also in the inactivation of self-acting na&#239;ve T cells by T cell anergy or T cell deletion. Although the critical molecular mechanism of CP remains to be elucidated, accumulating evidence indicates that exogenous antigens are processed through endoplasmic reticulum-associated degradation (ERAD) after export from non-classical endocytic compartments. Until recently, characterizations of these endocytic compartments were limited because there were no specific molecular markers other than exogenous antigens. The method described here is a new vesicle isolation protocol, which allows for the purification of these endocytic compartments. Using this purified microsome, we reconstituted the ERAD-like transport, ubiquitination, and processing of the exogenous antigen in vitro, suggesting that the ubiquitin-proteasome system processed the exogenous antigen after export from this cellular compartment. This protocol can be further applied to other cell types to clarify the molecular mechanism of CP.

The method described here is a new vesicle isolation protocol, which allows for the purification of the cellular compartments where exogenous antigens are processed by endoplasmic reticulum-associated degradation in cross-presentation.

외 인 항 원 십자가-프레 젠 테이 션에의 바인딩과 그물 관련 성능 저하 막 구획의 정화

Dendritic cells (DCs) are highly capable of processing and presenting internalized exogenous antigens upon major histocompatibility class (MHC) I ...

Murine Distal Colostomy, A Novel Model of Diversion Colitis in C57BL/6 Mice

Diversion colitis (DC) is a frequent clinical condition occurring in patients with bowel segments excluded from the fecal stream as a result of a diverting enterostomy. The etiology of this disease remains ill-defined but appears to differ from that of classical inflammatory bowel diseases such as Crohn's disease and ulcerative colitis. Research aimed to decipher the pathophysiological mechanisms leading to the development of this disease has been severely hampered by the lack of an appropriate murine model. This protocol generates a murine model of DC that facilitates the study of the immune system's role and its interaction with the microbiome in the development of DC. In this model using C57BL/6 animals, distal parts of the colon are excluded from the fecal stream by creating a distal colostomy, triggering the development of mild to moderate inflammation in the excluded bowel segments and reproducing the hallmark lesions of human DC with a moderate systemic inflammatory response. In contrast to the rat model, a large number of genetically-modified murine models on the C57BL/6 background are available. The combination of these animals with our model allows the potential roles of individual cytokines, chemokines, or receptors of bioactive molecules (e.g., interleukin (IL)-17; IL-10, chemokine CXCL13, chemokine receptors CXCR5 and CCR7, and the sphingosine-1-phosphate receptor 4) to be assessed in the pathogenesis of DC. The availability of congenic mouse strains on the C57BL/6 background largely facilitates transfer experiments to establish the roles of distinct cell types involved in the etiology of DC. Finally, the model offers the opportunity to assess the influences of local interventions (e.g., modification of the local microbiome or local anti-inflammatory therapy) on mucosal immunity in affected and non-affected bowel segments and the on systemic immune homeostasis.

Murine distal colostomy provides a murine model for human diversion colitis, a predominantly lymphocytic colitis in colon segment excluded from the fecal stream.

Murine 원심 인공, C57BL/6 마우스에 전환 Colitis의 새로운 모델

Diversion colitis (DC) is a frequent clinical condition occurring in patients with bowel segments excluded from the fecal stream as a result of a ...

Investigating Target Gene Function in a CD40 Agonistic Antibody-induced Colitis Model using CRISPR/Cas9-based Technologies

The immune system functions to defend humans against foreign invaders such as bacteria and viruses. However, disorders of the immune system may lead to autoimmunity, inflammatory disease, and cancer. The inflammatory bowel diseases (IBD)-Crohn's disease (CD) and ulcerative colitis (UC)-are chronic diseases marked by relapsing intestinal inflammation. Although IBD is most prevalent in Western countries (1 in 1,000), incident rates are increasing around the world. Through association studies, researchers have linked hundreds of genes to the pathology of IBD. However, the elaborate pathology behind IBD and the high number of potential genes pose significant challenges in finding the best therapeutic targets. Additionally, the tools needed to functionally characterize each genetic association introduce many rate-limiting factors such as the generation of genetically modified mice for each gene. To investigate the therapeutic potential of target genes, a model system has been developed using clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated endonuclease (Cas9)-based technologies and a cluster of differentiation 40 (CD40) agonistic antibody. The present study shows that CRISPR/Cas9-mediated editing in the immune system can be used to investigate the impact of genes in vivo. Limited to the hematopoietic compartment, this approach reliably edits the resulting reconstituted immune system. CRISPR/Cas9-edited mice are generated faster and are far less expensive than traditional genetically modified mice. Furthermore, CRISPR/Cas9 editing of mice has significant scientific advantages compared to generating and breeding genetically modified mice such as the ability to evaluate targets that are embryonic lethal. Using CD40 as a model target in the CD40 agonistic antibody-induced colitis model, this study demonstrates the feasibility of this approach.

Here, we describe the methodology to knock out a gene of interest in the immune system using clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated endonuclease (Cas9)-based technologies and the evaluation of these mice in a cluster of differentiation 40 (CD40) agonistic antibody-induced colitis model.

The immune system functions to defend humans against foreign invaders such as bacteria and viruses. However, disorders of the immune system may lead to ...

Analysis of Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor-Producing T Helper Cells in a Mouse Model of Contact Hypersensitivity

Parallel to traditional Th1/Th2/Th17/Treg lineages, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-producing T helper (Th-GM) cells have been identified as a distinct subset of T helper cells (GM-CSF+ IFN-&#947;- IL-17A- IL-22- effector CD4+ T cells) in human and mice. Contact hypersensitivity (CHS) is considered an excellent animal model for allergic contact dermatitis (ACD) in human, manifesting an intact T cell-mediated immune response. To provide a standardized and comprehensive assay to analyze the Th-GM cell subset in the T cell-dependent immune response in vivo, a murine CHS model was induced by sensitization/challenge with a reactive, low-molecular-weight, organic hapten, 2,4-dinitrofluorobenzene (DNFB). The Th-GM subset in effector CD4+ T cells generated upon immunization with the hapten was analyzed by flow cytometry. We found that Th-GM was mainly expanded in lesions and draining lymph nodes in the DNFB-induced CHS mouse model. This method can be applied to further study the biology of Th-GM cells and pharmacological research of therapeutic strategies centered on GM-CSF in various conditions, such as ACD.

Here, we present a simple and standardized method of analyzing the granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-producing T helper subset in vivo.

Parallel to traditional Th1/Th2/Th17/Treg lineages, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-producing T helper (Th-GM) cells have been identified ...

Induction of Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of CBir1 TCR Transgenic CD4+ T Cells to Immunodeficient Mice

With the increase of incidence, inflammatory bowel diseases (IBD), which are chronic diseases affecting the gastrointestinal tract, impose a considerable health and financial burden on individuals and society. Therefore, it is critical to investigate the mechanisms underlying the pathogenesis and development of IBD. Here, a gut microbiota antigen-specific T cell transfer colitis model is described. CBir1 flagellin has been recognized as the immunodominant gut bacterial antigen in experimental colitis and patients with Crohn&#39;s disease. CBir1 TCR transgenic na&#970;ve CD4+ T cells, specific to CBir1 flagellin, can induce chronic colitis after adoptive transfer into immune-deficient Rag1-/- mice. The disease severity is assessed by histopathology. The CD4+ T cell phenotypes in colonic lamina propria are also determined. This model closely resembles the development of IBD, which provides an ideal murine model for investigating the mechanisms driving the pathogenesis of IBD and testing the potential drugs for treating IBD.

Induction of Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of CBir1 TCR Transgenic CD4+ T Cells to Immunodeficient Mice

In this protocol, a gut microbiota antigen-specific T cell adoptive transfer colitis model is described. CD4+ T cells are isolated from CBir1 TCR transgenic mice. These are specific for an immunodominant gut microbiota antigen CBir1 flagellin, which is transferred into recipient Rag1-/- mice, leading to intestinal inflammation.

CBir1 TCR 형질 전환 CD4+ T 세포의 입양 전달에 의한 장 염증유도

With the increase of incidence, inflammatory bowel diseases (IBD), which are chronic diseases affecting the gastrointestinal tract, impose a considerable ...

항원 중심의 성 대장염 모델의 개발은 항원이 T 세포에 세포를 제시하여 항원의 프리젠 테이션을 공부하기

요약

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