This work benefited from the networking activities coordinated within the EU-funded COST ACTION FA1106 "An integrated systems approach to determine the developmental mechanisms controlling fleshy fruit quality in tomato and grapevine". This work was supported by the 'Completamento del Centro di Genomica Funzionale Vegetale' project funded by the CARIVERONA Bank Foundation and by the 'Valorizzazione dei Principali Vitigni Autoctoni Italiani e dei loro Terroir (Vigneto)' project funded by the Italian Ministry of Agricultural and Forestry Policies. SDS was financed by the Italian Ministry of University and Research FIRB RBFR13GHC5 project "The Epigenomic Plasticity of Grapevine in Genotype per Environment Interactions".

<ol>
	<li>Jessome, L. L., Volmer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+suppression:+A+major+concern+in+mass+spectrometry.">Ion suppression: A major concern in mass spectrometry.</a> Lc Gc N Am. 24 (5), 498-510 (2006).</li><li>Kim, H. K., Choi, Y. H., Verpoorte, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR-based+plant+metabolomics:+where+do+we+stand,+where+do+we+go?.">NMR-based plant metabolomics: where do we stand, where do we go?.</a> Trends Biotech. 29 (6), 267-275 (2011).</li><li>Sumner, L. W., Mendes, P., Dixon, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+metabolomics:+large-scale+phytochemistry+in+the+functional+genomics+era.">Plant metabolomics: large-scale phytochemistry in the functional genomics era.</a> Phytochem. 62 (6), 817-836 (2003).</li><li>Bottcher, C., von Roepenack-Lahaye, E., Willscher, E., Scheel, D., Clemens, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+matrix+effects+in+metabolite+profiling+based+on+capillary+liquid+chromatography+electrospray+ionization+quadrupole+time-of-flight+mass+spectrometry.">Evaluation of matrix effects in metabolite profiling based on capillary liquid chromatography electrospray ionization quadrupole time-of-flight mass spectrometry.</a> Anal Chem. 79 (4), 1507-1513 (2007).</li><li>Toffali, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+aspects+of+grape+berry+ripening+and+post-harvest+withering+revealed+by+untargeted+LC-ESI-MS+metabolomics+analysis.">Novel aspects of grape berry ripening and post-harvest withering revealed by untargeted LC-ESI-MS metabolomics analysis.</a> Metabolomics. 7 (3), 424-436 (2011).</li><li>Martin, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+we+trust+untargeted+metabolomics?+Results+of+the+metabo-ring+initiative,+a+large-scale,+multi-instrument+inter-laboratory+study.">Can we trust untargeted metabolomics? Results of the metabo-ring initiative, a large-scale, multi-instrument inter-laboratory study.</a> Metabolomics. 11 (4), 807-821 (2015).</li><li>Jaillon, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+grapevine+genome+sequence+suggests+ancestral+hexaploidization+in+major+angiosperm+phyla.">The grapevine genome sequence suggests ancestral hexaploidization in major angiosperm phyla.</a> Nature. 449 (7161), 463-467 (2007).</li><li>Velasco, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+quality+draft+consensus+sequence+of+the+genome+of+a+heterozygous+grapevine+variety.">A high quality draft consensus sequence of the genome of a heterozygous grapevine variety.</a> Plos One. 2 (12), (2007).</li><li>Tornielli, G. B., Zamboni, A., Zenoni, S., Delledonne, M., Pezzotti, M., Ger&#243;s, H., Chaves, M., Delrot, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+11.">Ch. 11.</a> The Biochemestry of the Grape Berry. 11, (2012).</li><li>Anesi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+scientific+interpretation+of+the+terroir+concept:+plasticity+of+the+grape+berry+metabolome.">Towards a scientific interpretation of the terroir concept: plasticity of the grape berry metabolome.</a> BMC Plant Biol. 15, 1-17 (2015).</li><li>Berdeja, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water+limitation+and+rootstock+genotype+interact+to+alter+grape+berry+metabolism+through+transcriptome+reprogramming.">Water limitation and rootstock genotype interact to alter grape berry metabolism through transcriptome reprogramming.</a> Hort Res. 2, 1-13 (2015).</li><li>Carbonell-Bejerano, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solar+ultraviolet+radiation+is+necessary+to+enhance+grapevine+fruit+ripening+transcriptional+and+phenolic+responses.">Solar ultraviolet radiation is necessary to enhance grapevine fruit ripening transcriptional and phenolic responses.</a> BMC Plant Biol. 14, 1-16 (2014).</li><li>Carbonell-Bejerano, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+sampling+bias+in+molecular+studies+of+grapevine+fruit+ripening:+transcriptomic+assessment+of+the+density+sorting+method.">Reducing sampling bias in molecular studies of grapevine fruit ripening: transcriptomic assessment of the density sorting method.</a> Theor Exp Plant Phys. 28 (1), 109-129 (2016).</li><li>Carbonell-Bejerano, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+oscillatory+transcriptional+programs+in+grapevine+ripening+fruits.">Circadian oscillatory transcriptional programs in grapevine ripening fruits.</a> BMC Plant Biol. 14, 1-15 (2014).</li><li>Cavallini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+diversification+of+grapevine+MYB5a+and+MYB5b+in+the+control+of+flavonoid+biosynthesis+in+a+petunia+anthocyanin+regulatory+mutant.">Functional diversification of grapevine MYB5a and MYB5b in the control of flavonoid biosynthesis in a petunia anthocyanin regulatory mutant.</a> Plant &amp; Cell Physiol. 55 (3), 517-534 (2014).</li><li>Cramer, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+analysis+of+the+late+stages+of+grapevine+(Vitis+vinifera+cv.+Cabernet+Sauvignon)+berry+ripening+reveals+significant+induction+of+ethylene+signaling+and+flavor+pathways+in+the+skin.">Transcriptomic analysis of the late stages of grapevine (Vitis vinifera cv. Cabernet Sauvignon) berry ripening reveals significant induction of ethylene signaling and flavor pathways in the skin.</a> BMC Plant Biol. 14, 1-21 (2014).</li><li>Dal Santo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plasticity+of+the+grapevine+berry+transcriptome.">The plasticity of the grapevine berry transcriptome.</a> Genome Biol. 14 (6), 1-17 (2013).</li><li>Fasoli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Grapevine+Expression+Atlas+Reveals+a+Deep+Transcriptome+Shift+Driving+the+Entire+Plant+into+a+Maturation+Program.">The Grapevine Expression Atlas Reveals a Deep Transcriptome Shift Driving the Entire Plant into a Maturation Program.</a> Plant Cell. 24 (9), 3489-3505 (2012).</li><li>Gambino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-evolution+between+Grapevine+rupestris+stem+pitting-associated+virus+and+Vitis+vinifera+L.+leads+to+decreased+defence+responses+and+increased+transcription+of+genes+related+to+photosynthesis.">Co-evolution between Grapevine rupestris stem pitting-associated virus and Vitis vinifera L. leads to decreased defence responses and increased transcription of genes related to photosynthesis.</a> J Exp Bot. 63 (16), 5919-5933 (2012).</li><li>Ghan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Five+omic+technologies+are+concordant+in+differentiating+the+biochemical+characteristics+of+the+berries+of+five+grapevine+(Vitis+vinifera+L.)+cultivars.">Five omic technologies are concordant in differentiating the biochemical characteristics of the berries of five grapevine (Vitis vinifera L.) cultivars.</a> BMC Genomics. 16 (1), 1-26 (2015).</li><li>Pastore, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+defoliation+affects+plant+growth,+fruit+transcriptional+ripening+program+and+flavonoid+metabolism+in+grapevine.">Selective defoliation affects plant growth, fruit transcriptional ripening program and flavonoid metabolism in grapevine.</a> BMC Plant Biol. 13, 1-13 (2013).</li><li>Pastore, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+the+source/sink+ratio+in+Vitis+vinifera+(cv+Sangiovese)+induces+extensive+transcriptome+reprogramming+and+modifies+berry+ripening.">Increasing the source/sink ratio in Vitis vinifera (cv Sangiovese) induces extensive transcriptome reprogramming and modifies berry ripening.</a> BMC Genomics. 12, 1-23 (2011).</li><li>Rinaldo, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Grapevine+Anthocyanin+Acyltransferase,+Transcriptionally+Regulated+by+VvMYBA,+Can+Produce+Most+Acylated+Anthocyanins+Present+in+Grape+Skins.">A Grapevine Anthocyanin Acyltransferase, Transcriptionally Regulated by VvMYBA, Can Produce Most Acylated Anthocyanins Present in Grape Skins.</a> Plant Physiol. 169 (3), 1897-1916 (2015).</li><li>Royo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental,+transcriptome,+and+genetic+alterations+associated+with+parthenocarpy+in+the+grapevine+seedless+somatic+variant+Corinto+bianco.">Developmental, transcriptome, and genetic alterations associated with parthenocarpy in the grapevine seedless somatic variant Corinto bianco.</a> J Exp Bot. , 259-273 (2015).</li><li>Venturini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+transcriptome+characterization+of+Vitis+vinifera+cv.+Corvina+unveils+varietal+diversity.">De novo transcriptome characterization of Vitis vinifera cv. Corvina unveils varietal diversity.</a> BMC Genomics. 14, 1-13 (2013).</li><li>Commisso, M., Strazzer, P., Toffali, K., Stocchero, M., Guzzo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Untargeted+metabolomics:+an+emerging+approach+to+determine+the+composition+of+herbal+products.">Untargeted metabolomics: an emerging approach to determine the composition of herbal products.</a> Comput Struct Biotechnol J. 4, 1-7 (2013).</li><li>Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Oresic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MZmine+2:+Modular+framework+for+processing,+visualizing,+and+analyzing+mass+spectrometry-based+molecular+profile+data.">MZmine 2: Modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data.</a> BMC Bioinformatics. 11, 1-11 (2010).</li><li>Ashburner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Ontology:+tool+for+the+unification+of+biology.">Gene Ontology: tool for the unification of biology.</a> Nat Genet. 25 (1), 25-29 (2000).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

이 문서에서는 포도 베리 떼루아 개념을 해석하는 데 사용되는 대사 체학, transcriptomics 및 통계 분석 프로토콜을 설명합니다. HPLC-ESI-MS에 의해 대사 체학 분석 동시에 대사 산물을 대량을 검출하기에 충분히 민감하지만, 상대적 정량은 매트릭스 효과 이온 억제 / 강화에 의해 영향을 받는다. 그러나 유사한 접근 방식은 이미 조기는 열매의 숙성 및 수확 후 고사를 설명하는 데 사용되었으며, 매트릭스 효과의 보정 결과 5에 제한된 영향을 미쳤다. 또한, 동일한 샘플을 사용하여 타겟이 불분명 한 대사 체학에 대한 NMR 및 LC-MS의 비교 견고성을 결정하기 위해 최근 대규모 멀티 기기 간 실험실 연구는 다른 악기 및 기술 일관된 결과 6 굴복 것으로 나타났습니다. 여기에 설명 된 사례 연구는 세 가지 매크로-Z에 일곱 포도원에서 세 숙성 단계에서 시료의 수집 및 분석을 포함세 가지 성장 시즌 동안 것. 여기서, 떼루아 서명은 PCA와 O2PLS-DA 다변량 통계를 사용하여 매크로 영역 수준에서 조사 (가르다 호수와 Soave의 두 포도원으로 표시되는 각 및 Valpolicella는 3 개의 포도원으로 표시) 하였다. 개별 포도밭 사이의 차이는 더 미묘한 더 정교하고 민감한 통계 방법 (10)을 필요로한다. 제안 된 프로토콜의 다양한 단계가 중요 성공적 포도 품질 떼루아 영향에 대한 생체의 질문에 대답하기 위해 고려되어야한다. 첫째, 적절한 샘플링 계획은 중요하다 : 하나의 특정 클론의 선택은 유전 적 차이 샘플링의 다중 년 기간이 다양한 TERROIRS 간의 실제 소리의 차이를 강조 할 수를 최소화. 다른 측면에서, 제안 된 연구는 포도 재배에 특히 적합한 떼루아 내에서 수행하고,이 미니있을포도 품질에 떼루아-차이 마이즈. 따라서, 분명하게, 덜 최적의 영역에서 재배 동일한 품종을 비교하지만 매우 흥미로운 일이 될 것이다,이 포도원은 단순히 사용할 수 없습니다 수 있습니다. 기술적 인 관점에서 볼 때 HPLC를 통해 높은 재현성 대사 분리가 양호한 데이터 행렬을 획득하는 것이 중요 최종 데이터 세트에서 최대 정렬 실수 횟수가 높을수록 다양한 분석에서 체류 시간의 차이 높은 사람. 따라서, 적절한 재 평형화 시간을 설정하기 위해 이들 사이의 크로마토 그래피 컬럼 세척 사이클 9-10 시료의 일괄로 샘플들을 분할하고, 각 배치의 첫 번째 샘플로 빈 샘플을 사용하는 것이 매우 중요하다. LC-MS는 악기 구동 샘플간에 차이가 발생할 수 불안정성 어느 정도 영향을 받는다. 이 논문에 도시 된 바와 같이,이 문제는 부분적으로, 시료 분석의 무작위 화에 의해 해결 될 수있다. 메신저방법의 provement은 플랫폼 상태를 알릴 수있는 각 배치의 적절한 품질 관리 샘플의 사용이다. 적절한 기준 화합물 혼합물 (즉, m / z 값과 유지 시간 전체 m / z 및 머무름 시간 범위에 걸친 표준 화합물) 및 플랫폼에 대해 알릴 수있다 모든 샘플에서 분말의 동일한 부분을 혼합 한 새로운 제어 샘플 영향 및 결국 후천적 데이터 정규화에 이용 될 수있다. 대사 체학 transcriptomics과 결과를 비교하기 위해 또 다른 중요한 점은 두 분석을 위해 동일 재료 (즉, 동일한 분쇄 시료)을 사용 하였다. 데이터 분석에서, 예컨대 PCA 등의 방법에 대하여 유전자 발현 및 대사 산물의 축적의 조건의 차이로 쉽게 해석을 허용 OPLS-DA 등의 적절한 통계 방법을 사용하는 것이 중요하다. 이런 종류의 접근법의 주요 제한 사항 중 하나 인transcriptomics와 대사 체학 데이터 통합을위한 강력한 방법의 부재. 상관 데이터의 종류에 적합한 방법의 개발 transcriptomics 및 대사 체학 데이터간에 강한 상관 신뢰성을 구축하기 위해 필요하다. 이 문서에서 설명하는 기술은 분명히 베리 대사 체의 숙성 빈티지 효과를 보여,하지만 세 가지 거시 영역을 나타내는 특정 화학 물질 서명도 널리 빈티지 효과 아래 잘 익은 열매에서 확인되었다. 흥미롭게도, veraison 열매의 분석은 떼루아의 개념은 주로 미성숙 한 열매에 이미 존재하는 것보다 (예를 들어, 안토시아닌과 스틸 벤)를 숙성하는 동안 축적 대사에 의해 명시되어있는 것을 나타내는, 통계적으로 유효한 모델을 산출하지 않았다.

식물 게놈 전 사체, 프로테옴 및 metabolomes에 기초하여 대규모 데이터 분석은 포도 식물과 그 환경 사이의 상호 작용을 반영하는 와인 떼루아 특성과 같은 복잡한 시스템의 작동에 대한 새로운 통찰력을 제공한다. 동일한 포도 나무의 클론이 다른 포도원에서 재배하는 경우에도 와인의 떼루아 구별 할 수 있기 때문에 클론 게놈이 동일하기 때문에, 게놈 분석은 거의 사용이다. 대신 유전자 발현 와인의 품질 특성을 결정하는 열매의 대사 특성 간의 상관 관계를 볼 필요가있다. 마이크로 어레이에 고정 된 프로브와 같은 하이브리드와 같은 보편적 인 특성을 이용하여 정량 분석을 용이하게 모든 성적 증명서의 유사한 화학적 성질,의 사체 혜택의 수준에서 유전자 발현의 분석. 프로테오믹스 A의 대조적으로, 보편적 인 분석 방법차 대사 체학 때문에 개별 단백질 및 대사 산물의 거대한 물리적, 화학적 다양성을 더 도전입니다. 대사 체학의 경우 개별 대사 산물의 크기, 극성, 풍부하고 변동성에 크게 다르기 때문에 이러한 다양성은 훨씬 더 극단적이다, 그래서 하나의 추출 과정이나 분석 방법 론적 접근 방식을 제공합니다. 비 휘발성 대사 적합한 분석 플랫폼 중, 고성능 액체 크로마토 그래피에 기초하여 그 질량 분석계에 연결된 (HPLC-MS)는 훨씬 더 민감 자외선 또는 다이오드 배열 검출기를 가진 HPLC (HPLC-UV, HPLC-DAD 같은 대안보다 ) 또는 HPLC-MS에 의해 핵 자기 공명 (NMR) 분광법 있지만 정량 분석은 이러한 매트릭스 효과 이온 진압 / 인핸스 1-3 현상에 의해 영향을받을 수있다. (HPLC-E를 전기 분무 이온화 소스를 사용하여 HPLC-MS에 의한 조기는 포도 열매의 분석시 이러한 영향의 조사SI-MS)은 가장 낮은 체류 시간과 당 및 다른 분자 강하게 아마도이 영역에서 분자의 다수를 반영 과소 것으로 나타났다 및 다른 분자의 존재 량 매트릭스 효과에 의해 과대 또는받지 과소 평가 될 수 있다는 하지만, 매트릭스 효과에 대한 데이터 정규화는 전체 결과 4,5에 제한된 영향을 미칠 것 같았다. 본원에 기재된 방법은 숙성 중에 포도 열매에서 높은 수준으로 축적 매체 극성 대사 산물의 분석을 위해 최적화되고, 이는 상당히 떼루아의 영향. 그들은 함께 색상, 맛과 와인의 건강 관련 특성을 결정 안토시아닌, 플라 보놀, flavan-3-OLS, 프로시아니딘, 다른 플라보노이드, 레스베라트롤, 스틸 벤, 히드 록시 산, 하이드 록시 산을 포함한다. HPLC-MS에 의한 정량은 신뢰할 수 있기 때문에 같은 당 및 지방족 유기산과 같은 다른 대사는, 때문에 effec 행렬에 무시됩니다t 이온 억제 현상 (5). 이 방법에 의해 선택된 극성의 범위 내에서 접근 가능 6만큼 다른 대사 물질을 검출하는 것을 목적으로 불특정이다. 포도 나무의 성적 증명서의 수천을 동시에 모니터링 할 수 Transcriptomics 방법은 전체 포도 게놈 서열 7,8의 가용성에 의해 촉진된다. 높은 처리량의 cDNA 서열에 기초하여 조기 transcriptomics 방법 일괄 RNA-SEQ 기술로 설명한 절차의 집합으로 차세대 서열의 출현으로 발전해왔다. 이 방법은 빠르게 transcriptomics 연구에 대한 선택의 방법이되고있다. 그러나, 성적 증명서의 수천 하이브리드에 의해 병렬로 정량화 할 수 있도록 마이크로 어레이를 기반으로 문학의 큰 몸은 포도 나무에 대한 축적하고있다. RNA-서열이 주류 기술이되기 전에 실제로, 많은 전용 상용 마이크로 어레이 플랫폼은 있었다개발 허용 포도 나무의 사체는 훌륭한 세부 사항에 검사합니다. 플랫폼의 광대 한 다양한 가운데, 두 개의 게놈 전체의 전 사체 분석 (9)을 허용했다. 가장 진화 배열 따라서 각 실험의 비용을 절감하는 하나의 장치에서 최대 12 개의 독립적 인 샘플의 혼성화시켰다. 12 서브 어레이는 각각 29,549 포도 나무의 성적을 나타내는 135,000 60 머 프로브를 구성. 이 장치는 시험 10-24의 다수에 사용되고있다. 이 두 플랫폼은 이제 중단되었지만 새 사용자 정의 마이크로 어레이는 최근 설계되고있어 추가 새로 발견 된 포도 나무의 유전자 (25)를 나타내는 프로브의 더 큰 수를 포함로 최근 개발을 나타냅니다. transcriptomics와 대사 체학 분석에 의해 생성 된 대형 판매 데이터 세트는 다른 형태 사이의 상관 관계를 결정하기 위해 다변량 기법을 포함한 데이터 분석에 적합한 통계 방법을 필요로데이터의. 가장 널리 사용되는 변수 기술들은 투영에 기초하여 해당하며, 여기에는 주성분 분석 (PCA), 또는, 자율 될 수있는 잠재적 인 구조 판별 분석 (O2PLS-DA) (26)에 양방향 정사영 같은 감독. 이 문서에 제시된 프로토콜은 샘플 그룹 간의 차이를 식별하기 위해 탐색 적 데이터 분석 및 O2PLS-DA에 대한 PCA를 사용합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mill Grinder</td>
			<td>IKA</td>
			<td>IKA A11 basic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Autosampler</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td>System Gold 508 Autosampler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC System</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td>System Gold 127 Solvent Module HPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 Guard Column</td>
			<td>Grace</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td>Alltima HP C18 (7.5x2.1mm; 5&#956;m) Guard Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 Column</td>
			<td>Grace</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td>Alltima HP C18 (150x2.1mm; 3&#956;m) Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass Spectometer</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td>Bruker Esquire 6000; The mass spectometer was equipped with an ESI source and the analyzer was an ion trap.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">Extraction solvents and HPLC buffers</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>34966</td>
			<td>Methanol LC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma</td>
			<td>94318</td>
			<td>Formic acid LC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma</td>
			<td>34967</td>
			<td>Acetonitrile LC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma</td>
			<td>39253</td>
			<td>Water&#160; LC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minisart RC 4 Syringe filters (0.2 &#956;m)</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>17764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Softwares for data collection (a) and processing (b)</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td>-</td>
			<td>Bruker Daltonics Esquire 5.2 Control (a); Esquire 3.2 Data Analysis and MzMine 2.2 softwares (b)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrum Plant Total RNA kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>STRN250-1KT</td>
			<td>For total RNA extractino from grape pericarps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 1000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioAnalyzer 2100</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2939A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 6000 Nano Reagents</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-1511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Chips</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-1511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Gene Expression Wash Buffer 1</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5188-5325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Gene Expression Wash Buffer 2</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5188-5326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LowInput QuickAmp Labeling kit One-Color</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5190-2305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kit RNA Spike In - One-Color</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5188-5282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Expression Hybridization Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5188-5242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>For cRNA Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent SurePrint HD 4X44K 60-mer Microarray</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2514F-048771&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eArray</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>-</td>
			<td><a href="https://earray.chem.agilent.com/earray/">https://earray.chem.agilent.com/earray/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gasket slides</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2534-60012</td>
			<td>Enable Agilent SurePrint Microarray 4-array Hybridization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostatic bath</td>
			<td>Julabo</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization Chamber</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2534-60001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray Hybridization Oven</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2545A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization Oven Rotator Rack</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2530-60029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator Rack Conversion Rod</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2530-60030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining kit</td>
			<td>Bio-Optica</td>
			<td>10-2000</td>
			<td>Slide-staining dish and Slide rack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer device</td>
			<td>AREX Heating Magnetic Stirrer</td>
			<td>F20540163&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostatic Oven</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Heraeus - 6030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Microarray Scanner</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2565CA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanner Carousel, 48-position</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2505-60502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide Holders</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2505-60525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feature extraction software v11.5</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>-</td>
			<td>inside the Agilent Microarray Scanner G2565CA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SIMCA + V13 Software</td>
			<td>Umetrics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the terroir concept interpreted through grape berry metabolomics and transcriptomics

떼루아 특히 서식지 및 관리 방법에 따라 같은 포도 (유럽 종 포도)로 작물의 특성에 영향을 미치는 환경 요인의 조합을 의미합니다. 이 문서에서는 특정 떼루아 서명이 다변량 통계 분석을 사용하여 포도의 품종, 조기의 베리 대사 체 및 사체에서 검출 할 수있는 방법을 보여줍니다. 이 방법은 먼저 적절한 샘플링 계획이 필요합니다. 이 사례에서, 조기 품종의 특정 클론 유전 적 차이를 최소화하도록 선택되고, 샘플은 세 가지 성장 계절 동안 세 가지 매크로 영역을 나타내는 일곱 포도에서 수집 하였다. 타겟팅되지 않은 LC-MS의 대사 체학 접근 MZmine 소프트웨어 및 단편화 트리 분석을 기초 대사 식별 전략을 사용하여 효율적으로 데이터 처리를 수반 높은 민감도 때문에 권장된다. 종합 사체 분석은 마이크로 어레이를 사용하여 달성 될 수있다함유 프로브 다른 TERROIRS의 컨텍스트에서 모든 차등 유전자 발현의 동시 분석을 가능 ~ 모든 예측 리세 유전자의 99 %를 커버. 마지막으로, 투영 방법에 기초하여 다변량 데이터 분석은 대사 체학 및 transcriptomics 데이터 통합 ​​정보의 상관 관계를 식별하기 위해 상세하게 분석 될 수 있도록 강력한 빈티지 특정 효과를 극복하기 위해 사용될 수있다.

이 문서에서 설명하는 사례 연구는 상대적으로 189 샘플 중 정량 분자 이온 플러스 자신의 동위 원소, 부가 물 및 일부 조각을 포함하여 552 신호 (m / Z 기능), (7 포도원 × 3 숙성 단계 × 3 성장 계절 X를 포함하는 최종 데이터 매트릭스를 산출 3 생물 복제). 데이터 포인트의 총 수는 따라서 104,328이었다. 분할 트리 분석은 대사 플러스 부가 물, 동위 원소 및 조각에 해당하는 282m / Z 기능의 주석 결과. PCA에 의해 전체 데이터 매트릭스의 탐색 적 분석은 성숙 단계에 따라 샘플 클러스터 된 것으로 나타났다 (veraison, 중간 숙성과 잘 익은) 제 1 및 제 2 주성분 (T1-T2, 그림 2A)을 따라하고, 함께 성장시기에 따라 세 번째 주성분 (T1-T3, 그림 2B). <img alt="그림 2"<html> SRC = &quot;/ 파일 / ftp_upload / 54410 / 54410fig2.jpg&quot;/&gt; 그림 2 :. 전체 대사 체학 데이터 매트릭스의 PCA 자율 PCA-X 단계를 세 가지 다른 성장 계절 (2006, 2007 및 2008) 동안 수집 된 포도 샘플의 클러스터링을 보여주는 숙성 점수 산포도 (veraison, 중간 숙성과 잘 익은 열매 ). 첫 번째 플롯 (A) 두 번째 (B)에있는 반면, 숙성 단계에 따라 클러스터 샘플에서 그들은 성장시기에 따라 클러스터. 색상은 녹색 (veraison)와 숙성 단계, 핑크 (중간 숙성)과 보라색 (잘 익은 열매)를 강조 표시합니다. 원 (2006), 사각형 (2007) 및 삼각형 (2008) .Component의 T1 : Q2 : 기호는 성장하는 계절 나타내는 0.34을; R2X : 0.331; Q2cum : 0.304; 구성 요소 T2 : Q2 : 0.185; R2X : 0.155; Q2cum : 0.433; 구성 요소 T3 : Q2 : 0.145; R2X : 0.0924; Q2cum : 0.515.JPG &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 자율 PCA는 널리 빈티지 효과에서 숨겨진 특정 떼루아 기능을 공개 할 수 없습니다, 그래서 감독 O2PLS-DA 방식은 두 개의 분리 된 데이터 세트, 즉, 딸기 veraison에서 완전히 익은 열매에 적용 하였다. 이것은 이러한 숙성 단계에서 이러한 영역을 나타내는 특정 떼루아 서명을 식별하기 위해, 숙성의 두 가지 핵심 단계에있는 3 개의 매크로 영역 (가르다 호수, Valpolicella 및 Soave의)를 대표하는 대사 차이의 탐사를 할 수 있습니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54410/54410fig3.jpg" /> 그림 3 : veraison 잘 익은 포도 열매의 O2PLS-DA. 호수 가르다에서 수집 된 포도 샘플의 클러스터링을 보여주는 O2PLS-DA 점수 산포도 (<html> 파란색), 소아베 (녹색) 및 Valpolicella (핑크) veraison (A)와 열매가 익은 하였다 (B에서 매크로 영역). 제 (A)에서 관찰 클러스터링 및 (B)에 대한 책임 대사 각각 상관 로딩 플롯 (C) 및 (D)에서 볼 수있다. 삼각형으로 표시 대사, 그룹은 flavan-3-OLS / 프로시아니딘과 노란색 다른 플라보노이드에 대한 위해, 레스베라트롤 및 스틸 벤, 안토시아닌 핑크 블루 히드 록시 및 하이드 록시 산 녹색, 보라색입니다. A : 구성 요소 P1 : Q2 : 0.278; R2X : 0.0529; Q2cum : 0.278; 구성 요소 P2 : Q2 : 0.33; R2X : 0.0394; Q2cum : 0.608. B : 구성 요소 P1 : Q2 : 0.353; R2X : 0.0639; Q2cum : 0.353; 구성 요소 P2 : Q2 : 0.188; R2X : 0.0374; Q2cum :. 0.541 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54410/54410fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 1 &quot;&gt; :&quot;유지 - together.within 페이지 = FO &quot;_content <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54410/54410fig4.jpg" /> 그림 4 : 세 개의 매크로 영역 중 대사 마커의 배급 :. 가르다 호수, 소아베 및 Valpolicella 대사 수준이 표준 오차 ± 평균을 반영 (N = 르다와 Soave의, Valpolicella 매크로 존 27 18) 다른 당화와 세 가지 성장 계절 (2006, 2007 및 2008)에 잘 익은, 조기 열매의 실화 안토시아닌, 레스베라트롤 / 스틸 벤과 플라보노이드. 다른 문자는 t-test를 하였다 (p &lt;0.05)의 결정에 따라 유의 한 차이가 있었다 그룹을 나타냅니다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54410/54410fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 일곱 개별 포도원의 특정 서명은 특별한을 사용하여 확인 하였다통계적인 방법 (10)화된. 두 O2PLS-DA 모델은 하나의 성숙한 열매 중 세 가지 매크로 영역의 차이를 탐험 다른 veraison에 세 개의 매크로 지역에서 재배 장과의 차이점을 탐험하고, 건설되었다. 모델 교차 검증 만 호수 사는 샘플 veraison의 다른 샘플을 구별 하였다 반면, 세 개의 매크로 영역에 걸쳐 성숙한 열매를 설명하는 모델이 유효한 것을 나타내는 순열 테스트 (200 순열)를 사용 하였다 (미도시). veraison 및 만기 세 매크로 구역에서 샘플을 대사 산물의 분포에 따른 분리 방법을 보여 두 모형의 플롯 점은,도 3a 및도 3b에 도시된다. 즉 PQ (CORR), P (시료의 종류) 및 Q (대사)의 상관 관계로 표현이 모델의 로딩 플롯은도에 나타내었다의 3C 및 3D. 로딩 플롯 적색 사각형 샘플 클래스 (매크로 영역)을 나타내는 착색 삼각형 각 대사를 나타낸다. 대사와 샘플 사이의 거리의 관계를 반영한다. 대사는 색으로 구분 화학적 클래스에 따라 있습니다. 퍼뮤 테이션 시험에 의해 나타낸 바와 같이 veraison 모델의 통계적 낮은 유효성을 감안할 때 overfitting 겪을 가능성이있다. 따라서, 다음과 같은 관측은 그 모델 통계적으로 유효 성숙한 베리 샘플에 전적으로 참조하십시오. 플라보노이드는 소아베와 Valpolicella 매크로 영역으로 이동되는 반면 그림 3D에 표시된로드 플롯에서, 스틸 벤은 가르다 호수 매크로 영역으로 이동합니다. 개별 대사를 자세히 보면 호수 갈치에 더 널리 peonidin 및 그 유도체로, 안토시아닌의 비대칭 분포를 보여다 매크로 영역과 Valpolicella 매크로-영역에서 더 널리 다른 안토시아닌 (그림 4). 간단한 안토시아닌-3-O-글루코사이드는 실화 및 coumarated 파생 상품은 Soave의 매크로 영역에서 더 널리 퍼진 반면 Valpolicella 매크로 존에서 더 유행이다. 이 사례 연구의 transcriptomics 구성 요소는 더 이상 지원되는 transcriptomics 플랫폼을 사용하여 원래이었다. 결과적으로, 우리는 계속 사용할 플랫폼, 대안 절차를 설정; 새로운 플랫폼은 성적 증명서, 4392 새로 확인 된 피노 궤적과 179 조기는 개인의 유전자 (25)을 예측 249 더 피노 누아를 포함하여 이전보다 더 많은 프로브를 포함하고 있습니다.

Watch this Scientific Journal Video about The Terroir Concept Interpreted through Grape Berry Metabolomics and Transcriptomics at JoVE.com

The Terroir Concept Interpreted through Grape Berry Metabolomics and Transcriptomics

이 문서는 즉 떼루아 개념에 대한 통찰력을 얻기 위해 포도 베리 성적 증명서 및 대사에 타겟이 불분명 한 대사 체학, transcriptomics 및 다변량 통계 분석의 응용 프로그램을 설명 베리 품질 특성에 대한 환경의 영향.

포도 베리 대사 체학 및 Transcriptomics을 통해 해석 떼루아 개념

Terroir refers to the combination of environmental factors that affect the characteristics of crops such as grapevine (Vitis vinifera) according to ...

the-terroir-concept-interpreted-through-grape-berry-metabolomics

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

10.3K 조회수.  University of Verona.  이 문서는 즉 떼루아 개념에 대한 통찰력을 얻기 위해 포도 베리 성적 증명서 및 대사에 타겟이 불분명 한 대사 체학, transcriptomics 및 다변량 통계 분석의 응용 프로그램을 설명 베리 품질 특성에 대한 환경의 영향. 

비디오: The Terroir Concept Interpreted through Grape Berry Metabolomics and Transcriptomics

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process requires multi-subunit DNA-dependent RNA polymerase (RNAP) and a series of transcription factors that act to modulate the activity of RNAP during gene expression. Sequencing gel electrophoresis of radiolabeled transcripts is used to provide detailed mechanistic information on how transcription proceeds and what parameters can affect it. In this paper we describe the protocol to study how the essential elongation factor NusA regulates transcriptional pausing, as well as a method to identify an antibacterial agent targeting transcription initiation through inhibition of RNAP holoenzyme formation. These methods can be used a as platform for the development of additional approaches to explore the mechanism of action of the transcription factors which still remain unclear, as well as new antibacterial agents targeting transcription which is an underutilized drug target in antibiotic research and development.

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In this manuscript, we describe a protocol to functionally examine transcription and the inhibitory activity of antibacterial agents targeting bacterial transcription.

시험 관내 전사 분석 실험 및 약물 발견에의 응용

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

연구

유전학

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. This is due to its reproductive behavior: females damage the external surface of fruits and vegetables when they lay eggs and the hatched larvae feed on their pulp. Wild C. capitata populations are traditionally controlled through insecticide spraying and/or eco-friendly approaches, the most successful being the Sterile Insect Technique (SIT). The SIT relies on mass-rearing, radiation-based sterilization and field release of males that retain their capacity to mate but are not able to generate fertile progeny. The advent and the subsequent rapid development of biotechnological tools, together with the availability of the medfly genome sequence, has greatly boosted our understanding of the biology of this species. This favored the proliferation of new strategies for genome manipulation, which can be applied to population control.
In this context, embryo microinjection plays a dual role in expanding the toolbox for medfly control. The ability to interfere with the function of genes that regulate key biological processes, indeed, expands our understanding of the molecular machinery underlying medfly invasiveness. Furthermore, the ability to achieve germ-line transformation facilitates the production of multiple transgenic strains that can be tested for future field applications in novel SIT settings. Indeed, genetic manipulation can be used to confer desirable traits that can, for example, be used to monitor sterile male performance in the field, or that can result in early life-stage lethality. Here we describe a method to microinject nucleic acids into medfly embryos to achieve these two main goals.

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

세계적인 농업 해충 곤충의 배아 미세 주입을 통해 핵산 배달,<em&gt; Ceratitis의 capitata</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

Leveraging CyVerse Resources for De Novo Comparative Transcriptomics of Underserved (Non-model) Organisms

This workflow allows novice researchers to leverage advanced computational resources such as cloud computing to carry out pairwise comparative transcriptomics. It also serves as a primer for biologists to develop data scientist computational skills, e.g. executing bash commands, visualization and management of large data sets. All command line code and further explanations of each command or step can be found on the wiki (<a href="https://wiki.cyverse.org/wiki/x/dgGtAQ">https://wiki.cyverse.org/wiki/x/dgGtAQ</a>). The Discovery Environment and Atmosphere platforms are connected together through the CyVerse Data Store. As such, once the initial raw sequencing data has been uploaded there is no more need to transfer large data files over an Internet connection, minimizing the amount of time needed to conduct analyses. This protocol is designed to analyze only two experimental treatments or conditions. Differential gene expression analysis is conducted through pairwise comparisons, and will not be suitable to test multiple factors. This workflow is also designed to be manual rather than automated. Each step must be executed and investigated by the user, yielding a better understanding of data and analytical outputs, and therefore better results for the user. Once complete, this protocol will yield de novo assembled transcriptome(s) for underserved (non-model) organisms without the need to map to previously assembled reference genomes (which are usually not available in underserved organism). These de novo transcriptomes are further used in pairwise differential gene expression analysis to investigate genes differing between two experimental conditions. Differentially expressed genes are then functionally annotated to understand the genetic response organisms have to experimental conditions. In total, the data derived from this protocol is used to test hypotheses about biological responses of underserved organisms.

Leveraging CyVerse Resources for De Novo Comparative Transcriptomics of Underserved Non-model Organisms

This protocol outlines a comparative de novo transcriptome assembly and annotation workflow for novice bioinformaticians. The workflow is available for free entirely through CyVerse and connected by the Data Store. Command line and graphical user interfaces are used, but all code needed is available to copy and paste.

CyVerse 리소스 활용<em&gt; 드 노보</em&gt; 비포장 (비 모델) 생물의 비교 전이학

This workflow allows novice researchers to leverage advanced computational resources such as cloud computing to carry out pairwise comparative ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be investigated through electrophysiological analysis, biochemical characterization, mutational studies, and their effects on cellular processes. Transient transfections offer a simple protocol in which the protein becomes available for analysis within a few hours to days. Although this method presents a relatively straightforward and time efficient protocol, one of the critical components is calibrating the expression of the gene of interest to physiological relevant levels or levels that are suitable for analysis. To this end, many different approaches that offer the ability to control the expression of the gene of interest have emerged. Several stable cell transfection protocols provide a way to permanently introduce a gene of interest into the cellular genome under the regulation of a tetracycline-controlled transcriptional activation. While this technique produces reliable expression levels, each gene of interest requires a few weeks of skilled work including calibration of a killing curve, selection of cell colonies, and overall more resources. Here we present a protocol that uses transient transfection of the Transient Receptor Potential cation channel subfamily V member 1 (TRPV1) gene in an inducible system as an efficient way to express a protein in a controlled manner which is essential in ion channel analysis. We demonstrate that using this technique, we are able to perform calcium imaging, whole cell, and single channel analysis with controlled channel levels required for each type of data collection with a single transfection. Overall, this provides a replicable technique that can be used to study ion channels structure and function.

Studying ion channels through a heterologously expressing system has become a core technique in biomedical research. In this manuscript, we present a time efficient method to achieve tightly controlled ion channel expression by performing transient transfection under the control of an inducible promoter.

유도 성 과도 형질을 통해 제어 이온 채널 식

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

Next generation sequencing (NGS) technologies have revolutionized the nature of biological investigation. Of these, RNA Sequencing (RNA-Seq) has emerged as a powerful tool for gene-expression analysis and transcriptome mapping. However, handling RNA-Seq datasets requires sophisticated computational expertise and poses inherent challenges for biology researchers. This bottleneck has been mitigated by the open access Galaxy project that allows users without bioinformatics skills to analyze RNA-Seq data, and the Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery (DAVID), a Gene Ontology (GO) term analysis suite that helps derive biological meaning from large data sets. However, for first-time users and bioinformatics' amateurs, self-learning and familiarization with these platforms can be time-consuming and daunting. We describe a straightforward workflow that will help C. elegans researchers to isolate worm RNA, conduct an RNA-Seq experiment and analyze the data using Galaxy and DAVID platforms. This protocol provides stepwise instructions for using the various Galaxy modules for accessing raw NGS data, quality-control checks, alignment, and differential gene expression analysis, guiding the user with parameters at every step to generate a gene list that can be screened for enrichment of gene classes or biological processes using DAVID. Overall, we anticipate that this article will provide information to C. elegans researchers undertaking RNA-Seq experiments for the first time as well as frequent users running a small number of samples.

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

Galaxy and DAVID have emerged as popular tools that allow investigators without bioinformatics training to analyze and interpret RNA-Seq data. We describe a protocol for C. elegans researchers to perform RNA-Seq experiments, access and process the dataset using Galaxy and obtain meaningful biological information from the gene lists using DAVID.

의 Transcriptomic 분석<em&gt; C</em&gt;.<em&gt; 간스</em갤럭시 프로젝트에 턱시도 제품군을 통해&gt; RNA 시퀀싱 데이터

Next generation sequencing (NGS) technologies have revolutionized the nature of biological investigation. Of these, RNA Sequencing (RNA-Seq) has emerged ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with a number of challenges including sample preservation quality, degraded DNA, and destructive sampling of rare specimens. In order to more effectively use herbarium material in large sequencing projects, a dependable and scalable method of DNA isolation and library preparation is needed. This paper demonstrates a robust, beginning-to-end protocol for DNA isolation and high-throughput library construction from herbarium specimens that does not require modification for individual samples. This protocol is tailored for low quality dried plant material and takes advantage of existing methods by optimizing tissue grinding, modifying library size selection, and introducing an optional reamplification step for low yield libraries. Reamplification of low yield DNA libraries can rescue samples derived from irreplaceable and potentially valuable herbarium specimens, negating the need for additional destructive sampling and without introducing discernible sequencing bias for common phylogenetic applications. The protocol has been tested on hundreds of grass species, but is expected to be adaptable for use in other plant lineages after verification. This protocol can be limited by extremely degraded DNA, where fragments do not exist in the desired size range, and by secondary metabolites present in some plant material that inhibit clean DNA isolation. Overall, this protocol introduces a fast and comprehensive method that allows for DNA isolation and library preparation of 24 samples in less than 13 h, with only 8 h of active hands-on time with minimal modifications.

This article demonstrates a detailed protocol for DNA isolation and high-throughput sequencing library construction from herbarium material including rescue of exceptionally poor-quality DNA.

강력한 DNA 고립과 표 본관 표본에 대 한 높은 처리량 시퀀싱 도서관 건축

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, milk and urine. One subset of these RNAs are the posttranscriptional regulators &#8211; microRNAs (miRNAs). To delineate the miRNAs produced by specific cell types, in vitro culture systems can be used to harvest and profile exRNAs derived from one subset of cells. The secreted factors of mesenchymal stem cells are implicated in alleviating numerous diseases and is used as the in vitro model system here. This paper describes the process of collection, purification of small RNA and library generation to sequence extracellular miRNAs. ExRNAs from culture media differ from cellular RNA by being low RNA input samples, which calls for optimized procedures. This protocol provides a comprehensive guide to small exRNA sequencing from culture media, showing quality control checkpoints at each step during exRNA purification and sequencing.

This protocol demonstrates how to purify extracellular microRNAs from cell culture media for small RNA library construction and next generation sequencing. Various quality control checkpoints are described to allow readers to understand what to expect when working with low input samples like exRNAs.

격리, 시퀀싱 및 인간 중간 엽 줄기 세포에서 세포 외 MicroRNAs 분석

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences is desired. We herein provide a detailed in vitro and in-cell selective 2&#39;-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) protocol to study the RNA structural change in the presence of an experimental drug for spinal muscular atrophy (SMA), survival of motor neuron (SMN)-C2, and in exon 7 of the pre-mRNA of the SMN2 gene. In in vitro SHAPE, an RNA sequence of 140 nucleotides containing SMN2 exon 7 is transcribed by T7 RNA polymerase, folded in the presence of SMN-C2, and subsequently modified by a mild 2&#39;-OH acylation reagent, 2-methylnicotinic acid imidazolide (NAI). This 2&#39;-OH-NAI adduct is further probed by a 32P-labeled primer extension and resolved by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Conversely, 2&#39;-OH acylation in in-cell SHAPE takes place in situ with SMN-C2 bound cellular RNA in living cells. The pre-mRNA sequence of exon 7 in the SMN2 gene, along with SHAPE-induced mutations in the primer extension, was then amplified by PCR and subject to next-generation sequencing. Comparing the two methodologies, in vitro SHAPE is a more cost-effective method and does not require computational power to visualize results. However, the in vitro SHAPE-derived RNA model sometimes deviates from the secondary structure in a cellular context, likely due to the loss of all interactions with RNA-binding proteins. In-cell SHAPE does not need a radioactive material workplace and yields a more accurate RNA secondary structure in the cellular context. Furthermore, in-cell SHAPE is usually applicable for a larger range of RNA sequences (~1,000 nucleotides) by utilizing next-generation sequencing, compared to in vitro SHAPE (~200 nucleotides) that usually relies on PAGE analysis. In case of exon 7 in SMN2 pre-mRNA, the in vitro and in-cell SHAPE derived RNA models are similar to each other.

Detailed protocols for both in vitro and in-cell selective 2&#39;-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) experiments to determine the secondary structure of pre-mRNA sequences of interest in the presence of an RNA-targeting small molecule are presented in this article.

작은 분자 조사를 시험관 및 셀 모양을 사용 하 여 사전 mRNA 구조 변화 유도

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the flexible and efficient GreenGate cloning system with the proven and benchmarked LhGR system (here termed GR-LhG4) for the inducible expression, we have generated a set of transgenic Arabidopsis lines that can drive the expression of an effector cassette in a range of specific cell types in the three main plant meristems. To this end, we chose the previously developed GR-LhG4 system based on a chimeric transcription factor and a cognate pOp-type promoter ensuring tight control over a wide range of expression levels. In addition, to visualize the expression domain where the synthetic transcription factor is active, an ER-localized mTurquoise2 fluorescent reporter under control of the pOp4 or pOp6 promoter is encoded in driver lines. Here, we describe the steps necessary to generate a driver or effector line and demonstrate how cell type specific expression can be induced and followed in the shoot apical meristem, the root apical meristem and the cambium of Arabidopsis. By using several or all driver lines, the context specific effect of expressing one or multiple factors (effectors) under control of the synthetic pOp promoter can be assessed rapidly, for example in F1 plants of a cross between one effector and multiple driver lines. This approach is exemplified by the ectopic expression of VND7, a NAC transcription factor capable of inducing ectopic secondary cell wall deposition in a cell autonomous manner.

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Here, we describe the generation and application of a set of transgenic Arabidopsis thaliana lines enabling inducible, tissue-specific expression in the three main meristems, the shoot apical meristem, the root apical meristem, and the cambium.

유도할 수 있는, 애기 thaliana 통해 LhGR 중재 트랜스에 셀 형식 관련 식-활성화

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

Improving Small RNA-seq: Less Bias and Better Detection of 2'-O-Methyl RNAs

The study of small RNAs (sRNAs) by next-generation sequencing (NGS) is challenged by bias issues during library preparation. Several types of sRNA such as plant microRNAs (miRNAs) carry a 2&#39;-O-methyl (2&#39;-OMe) modification at their 3&#39;&#160;terminal nucleotide. This modification adds another difficulty as it inhibits 3&#39;&#160;adapter ligation. We previously demonstrated that modified versions of the &#39;TruSeq (TS)&#39;&#160;protocol have less bias and an improved detection of 2&#39;-OMe RNAs. Here we describe in detail protocol &#39;TS5&#39;, which showed the best overall performance. TS5 can be followed either using homemade reagents or reagents from the TS kit, with equal performance.

We present a detailed small RNA library reparation protocol with less bias than standard methods and an increased sensitivity for 2&#39;-O-methyl RNAs. This protocol can be followed using homemade reagents to save cost or using kits for convenience.

작은 RNA-seq 개선: 2'-O-메틸 RNA의 더 적은 편견 및 더 나은 검출

The study of small RNAs (sRNAs) by next-generation sequencing (NGS) is challenged by bias issues during library preparation. Several types of sRNA such as ...