This work benefited from the networking activities coordinated within the EU-funded COST ACTION FA1106 "An integrated systems approach to determine the developmental mechanisms controlling fleshy fruit quality in tomato and grapevine". This work was supported by the 'Completamento del Centro di Genomica Funzionale Vegetale' project funded by the CARIVERONA Bank Foundation and by the 'Valorizzazione dei Principali Vitigni Autoctoni Italiani e dei loro Terroir (Vigneto)' project funded by the Italian Ministry of Agricultural and Forestry Policies. SDS was financed by the Italian Ministry of University and Research FIRB RBFR13GHC5 project "The Epigenomic Plasticity of Grapevine in Genotype per Environment Interactions".

<ol>
	<li>Jessome, L. L., Volmer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+suppression:+A+major+concern+in+mass+spectrometry.">Ion suppression: A major concern in mass spectrometry.</a> Lc Gc N Am. 24 (5), 498-510 (2006).</li><li>Kim, H. K., Choi, Y. H., Verpoorte, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR-based+plant+metabolomics:+where+do+we+stand,+where+do+we+go?.">NMR-based plant metabolomics: where do we stand, where do we go?.</a> Trends Biotech. 29 (6), 267-275 (2011).</li><li>Sumner, L. W., Mendes, P., Dixon, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+metabolomics:+large-scale+phytochemistry+in+the+functional+genomics+era.">Plant metabolomics: large-scale phytochemistry in the functional genomics era.</a> Phytochem. 62 (6), 817-836 (2003).</li><li>Bottcher, C., von Roepenack-Lahaye, E., Willscher, E., Scheel, D., Clemens, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+matrix+effects+in+metabolite+profiling+based+on+capillary+liquid+chromatography+electrospray+ionization+quadrupole+time-of-flight+mass+spectrometry.">Evaluation of matrix effects in metabolite profiling based on capillary liquid chromatography electrospray ionization quadrupole time-of-flight mass spectrometry.</a> Anal Chem. 79 (4), 1507-1513 (2007).</li><li>Toffali, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+aspects+of+grape+berry+ripening+and+post-harvest+withering+revealed+by+untargeted+LC-ESI-MS+metabolomics+analysis.">Novel aspects of grape berry ripening and post-harvest withering revealed by untargeted LC-ESI-MS metabolomics analysis.</a> Metabolomics. 7 (3), 424-436 (2011).</li><li>Martin, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+we+trust+untargeted+metabolomics?+Results+of+the+metabo-ring+initiative,+a+large-scale,+multi-instrument+inter-laboratory+study.">Can we trust untargeted metabolomics? Results of the metabo-ring initiative, a large-scale, multi-instrument inter-laboratory study.</a> Metabolomics. 11 (4), 807-821 (2015).</li><li>Jaillon, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+grapevine+genome+sequence+suggests+ancestral+hexaploidization+in+major+angiosperm+phyla.">The grapevine genome sequence suggests ancestral hexaploidization in major angiosperm phyla.</a> Nature. 449 (7161), 463-467 (2007).</li><li>Velasco, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+quality+draft+consensus+sequence+of+the+genome+of+a+heterozygous+grapevine+variety.">A high quality draft consensus sequence of the genome of a heterozygous grapevine variety.</a> Plos One. 2 (12), (2007).</li><li>Tornielli, G. B., Zamboni, A., Zenoni, S., Delledonne, M., Pezzotti, M., Ger&#243;s, H., Chaves, M., Delrot, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+11.">Ch. 11.</a> The Biochemestry of the Grape Berry. 11, (2012).</li><li>Anesi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+scientific+interpretation+of+the+terroir+concept:+plasticity+of+the+grape+berry+metabolome.">Towards a scientific interpretation of the terroir concept: plasticity of the grape berry metabolome.</a> BMC Plant Biol. 15, 1-17 (2015).</li><li>Berdeja, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water+limitation+and+rootstock+genotype+interact+to+alter+grape+berry+metabolism+through+transcriptome+reprogramming.">Water limitation and rootstock genotype interact to alter grape berry metabolism through transcriptome reprogramming.</a> Hort Res. 2, 1-13 (2015).</li><li>Carbonell-Bejerano, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solar+ultraviolet+radiation+is+necessary+to+enhance+grapevine+fruit+ripening+transcriptional+and+phenolic+responses.">Solar ultraviolet radiation is necessary to enhance grapevine fruit ripening transcriptional and phenolic responses.</a> BMC Plant Biol. 14, 1-16 (2014).</li><li>Carbonell-Bejerano, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+sampling+bias+in+molecular+studies+of+grapevine+fruit+ripening:+transcriptomic+assessment+of+the+density+sorting+method.">Reducing sampling bias in molecular studies of grapevine fruit ripening: transcriptomic assessment of the density sorting method.</a> Theor Exp Plant Phys. 28 (1), 109-129 (2016).</li><li>Carbonell-Bejerano, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+oscillatory+transcriptional+programs+in+grapevine+ripening+fruits.">Circadian oscillatory transcriptional programs in grapevine ripening fruits.</a> BMC Plant Biol. 14, 1-15 (2014).</li><li>Cavallini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+diversification+of+grapevine+MYB5a+and+MYB5b+in+the+control+of+flavonoid+biosynthesis+in+a+petunia+anthocyanin+regulatory+mutant.">Functional diversification of grapevine MYB5a and MYB5b in the control of flavonoid biosynthesis in a petunia anthocyanin regulatory mutant.</a> Plant &amp; Cell Physiol. 55 (3), 517-534 (2014).</li><li>Cramer, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+analysis+of+the+late+stages+of+grapevine+(Vitis+vinifera+cv.+Cabernet+Sauvignon)+berry+ripening+reveals+significant+induction+of+ethylene+signaling+and+flavor+pathways+in+the+skin.">Transcriptomic analysis of the late stages of grapevine (Vitis vinifera cv. Cabernet Sauvignon) berry ripening reveals significant induction of ethylene signaling and flavor pathways in the skin.</a> BMC Plant Biol. 14, 1-21 (2014).</li><li>Dal Santo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plasticity+of+the+grapevine+berry+transcriptome.">The plasticity of the grapevine berry transcriptome.</a> Genome Biol. 14 (6), 1-17 (2013).</li><li>Fasoli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Grapevine+Expression+Atlas+Reveals+a+Deep+Transcriptome+Shift+Driving+the+Entire+Plant+into+a+Maturation+Program.">The Grapevine Expression Atlas Reveals a Deep Transcriptome Shift Driving the Entire Plant into a Maturation Program.</a> Plant Cell. 24 (9), 3489-3505 (2012).</li><li>Gambino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-evolution+between+Grapevine+rupestris+stem+pitting-associated+virus+and+Vitis+vinifera+L.+leads+to+decreased+defence+responses+and+increased+transcription+of+genes+related+to+photosynthesis.">Co-evolution between Grapevine rupestris stem pitting-associated virus and Vitis vinifera L. leads to decreased defence responses and increased transcription of genes related to photosynthesis.</a> J Exp Bot. 63 (16), 5919-5933 (2012).</li><li>Ghan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Five+omic+technologies+are+concordant+in+differentiating+the+biochemical+characteristics+of+the+berries+of+five+grapevine+(Vitis+vinifera+L.)+cultivars.">Five omic technologies are concordant in differentiating the biochemical characteristics of the berries of five grapevine (Vitis vinifera L.) cultivars.</a> BMC Genomics. 16 (1), 1-26 (2015).</li><li>Pastore, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+defoliation+affects+plant+growth,+fruit+transcriptional+ripening+program+and+flavonoid+metabolism+in+grapevine.">Selective defoliation affects plant growth, fruit transcriptional ripening program and flavonoid metabolism in grapevine.</a> BMC Plant Biol. 13, 1-13 (2013).</li><li>Pastore, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+the+source/sink+ratio+in+Vitis+vinifera+(cv+Sangiovese)+induces+extensive+transcriptome+reprogramming+and+modifies+berry+ripening.">Increasing the source/sink ratio in Vitis vinifera (cv Sangiovese) induces extensive transcriptome reprogramming and modifies berry ripening.</a> BMC Genomics. 12, 1-23 (2011).</li><li>Rinaldo, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Grapevine+Anthocyanin+Acyltransferase,+Transcriptionally+Regulated+by+VvMYBA,+Can+Produce+Most+Acylated+Anthocyanins+Present+in+Grape+Skins.">A Grapevine Anthocyanin Acyltransferase, Transcriptionally Regulated by VvMYBA, Can Produce Most Acylated Anthocyanins Present in Grape Skins.</a> Plant Physiol. 169 (3), 1897-1916 (2015).</li><li>Royo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental,+transcriptome,+and+genetic+alterations+associated+with+parthenocarpy+in+the+grapevine+seedless+somatic+variant+Corinto+bianco.">Developmental, transcriptome, and genetic alterations associated with parthenocarpy in the grapevine seedless somatic variant Corinto bianco.</a> J Exp Bot. , 259-273 (2015).</li><li>Venturini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+transcriptome+characterization+of+Vitis+vinifera+cv.+Corvina+unveils+varietal+diversity.">De novo transcriptome characterization of Vitis vinifera cv. Corvina unveils varietal diversity.</a> BMC Genomics. 14, 1-13 (2013).</li><li>Commisso, M., Strazzer, P., Toffali, K., Stocchero, M., Guzzo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Untargeted+metabolomics:+an+emerging+approach+to+determine+the+composition+of+herbal+products.">Untargeted metabolomics: an emerging approach to determine the composition of herbal products.</a> Comput Struct Biotechnol J. 4, 1-7 (2013).</li><li>Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Oresic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MZmine+2:+Modular+framework+for+processing,+visualizing,+and+analyzing+mass+spectrometry-based+molecular+profile+data.">MZmine 2: Modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data.</a> BMC Bioinformatics. 11, 1-11 (2010).</li><li>Ashburner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Ontology:+tool+for+the+unification+of+biology.">Gene Ontology: tool for the unification of biology.</a> Nat Genet. 25 (1), 25-29 (2000).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

この記事では、メタボロミクス、トランスクリプトミクスとブドウ果実のテロワールの概念を解釈するために使用される統計解析プロトコルについて説明します。 HPLC-ESI-MSによるメタボロミクス解析を同時に代謝産物の多くを検出するのに十分な感度であるが、相対的な定量は、マトリックス効果とイオン抑制/増強に影響されます。しかし、同様のアプローチが既にコルビナ果実の熟成及び収穫後の枯死を記述するために使用されており、マトリクス効果の補正が結果5への影響は限定的でした。さらに、同じ試料を用いて、非標的メタボロミクスのためのNMRおよびLC-MSの比較堅牢性を決定するために、最近の大規模なマルチインストゥルメント研究室間の研究では、さまざまな楽器や技術を6一貫した結果が得られたことを明らかにしました。本明細書中に記載のケーススタディでは、3マクロ-Zで7ブドウ園から3熟成の段階でサンプルの収集と分析を関与しました3生育期を超えるもの。ここで、テロワールの署名がPCAとO2PLS-DAの多変量統計を用いて、（3ブドウ畑で表さガルダ湖とソアーヴェ、2ブドウ畑によって表される各、およびヴァルポリチェッラ、）マクロゾーンレベルで調査しました。個々のブドウ畑の間の違いはより微妙であり、より高度で敏感な統計的アプローチ10が必要です。提案されたプロトコルの種々のステップは重要であり、成功したブドウの品質上のテロワールの影響に関する生物学の質問に答えるために考慮されなければなりません。 まず、適切なサンプリング計画は重要である：遺伝的差異を最小限にするためにある特定のクローンの選択とサンプリングの複数年の期間は、様々なテロワール間の実、音の違いを強調することができます。他の面では、提案された研究は、ブドウ栽培のために特に適しているテロワール内に行い、これはミニ可能性ブドウの品質上のテロワール-違いをマイズ。したがって、これらのブドウ畑は、単に利用できない可能性があり、明らかに、より少ない最適なゾーンに成長した同じ品種を比較することは非常に興味深いものになるだろうが。 技術的な観点から、HPLCを介して、再現性の高い代謝物の分離は、最終的なデータセット内のピーク位置合わせミスの数が高ければ高いほど、様々な分析において保持時間の違いが高いので、良好なデータ行列を得るために重要です。したがって、それは、適切な再平衡化時間を設定し、それらの間にクロマトグラフィーカラムの洗浄​​のサイクルの9-10サンプルのバッチにサンプルを分割し、各バッチの最初のサンプルとブランク試料を使用することが非常に重要です。 LC-MSは、機器主導されたサンプル間の差異をもたらし得る不安定ある程度、によって影響されます。この論文に示されるように、この問題は部分的に、サンプル分析のランダム化することによって解決することができます。イム方法のprovementは、プラットフォームの状態に知らせることができ、各バッチにおける適切な品質管理サンプルの使用です。適切な標準化合物の混合物（ すなわち 、m / z値および保持時間全体のm / zおよび保持時間範囲にわたって及ぶと標準化合物）およびプラットフォームについて知らせることができ、すべての試料からの粉末を等量混合して得られる新しいコントロールサンプル効果も、最終的に、事後データの正規化のために使用されます。 メタボロミクスとトランスクリプトミクスの結果を比較するために、もう一つの重要な点は、分析の両方に全く同じ材料（ すなわち、同じ破砕サンプル）を使用することでした。データ解析では、このような遺伝子発現や、PCAなどのメソッドに対する代謝産物の蓄積の点で相違の容易な解釈を可能にOPLS-DA、などの適切な統計方法を用いることが重要です。この種のアプローチの主要な制限の一つでありますトランスクリプトミクスとメタボロミクスデータ統合のための強力な方法が存在しません。データ相関異なるタイプのための適切な方法の開発は、トランスクリプトミクスおよびメタボロミクスのデータとの間の強力かつ信頼性の高い相関関係を構築するために必要です。 この記事に記載された技術は、明らかに熟成やベリーのメタボロームにヴィンテージの影響を明らかにしたが、3マクロのゾーンを表す特定の化学署名はまた、流行のヴィンテージ影響下に熟した果実で同定されました。興味深いことに、veraisonベリーの分析は、テロワールの概念は、主に未成熟の果実中にすでに存在するものよりも（ 例えば 、アントシアニンおよびスチルベン）を熟成中に蓄積する代謝産物により明らかにされていることを示す、統計的に有効なモデルが得られませんでした。

植物のゲノム、トランスクリプトーム、プロテオームおよびメタボロームに基づいて、大規模データ解析は、ブドウの植物とその環境との相互作用を反映したワインのテロワールの特性のような複雑なシステムの挙動に前例のない洞察を提供しています。ワインのテロワールが同一のブドウのクローンが異なるブドウ畑で栽培された場合でも明瞭な可能性があるので、クローンのゲノムが同じであるため、ゲノミクス解析はほとんど役に立ちません。その代わりに、遺伝子発現とワインの品質特性を決定ベリーの代謝特性との相関関係を調べることが必要です。マイクロアレイ上に固定化されたプローブに、そのようなハイブリダイゼーションのような普遍的な特性を利用することによって定量分析を容易にする全ての転写物の類似の化学的特性から、トランスクリプトームの利益のレベルでの遺伝子発現の解析。プロテオミクスaの対照的に、ユニバーサル分析方法NDメタボロミクスが原因個々のタンパク質および代謝産物の巨大な物理的および化学的多様性より挑戦です。メタボロミクスの場合、個々の代謝産物がサイズ、極性、豊かさとボラティリティに大幅に異なるため、この多様性はさらに極端なので、単一の抽出方法や分析方法は、全体的なアプローチを提供しています。 不揮発性代謝物のために適切な分析プラットフォームのうち、高速液体クロマトグラフィーに基づくものを質量分析に連結された（HPLC-MS）は、はるかに敏感例えば紫外線またはダイオードアレイ検出器を用いたHPLC（HPLC-UV、HPLC-DADなどの代替よりも）または核磁気共鳴（NMR）分光法が、HPLC-MSによる定量分析は、マトリックス効果とイオン抑制/強化1-3のような現象に影響され得ます。 （HPLC-Eをエレクトロスプレーイオン化源を用いてHPLC-MSによるコルビナブドウ果実の解析中にこのような効果の調査SI-MS）は、最小の保持時間を有する糖および他の分子を強くおそらくこの領域中の分子の多くを反映し、過少報告されたことを示し、他の分子の存在量は、マトリックス効果によって過大評価または影響を受けず、過小評価することができることしかし、マトリックス効果のためのデータの正規化は、全体の結果4,5への影響は限定的を持っているように見えました。本明細書に記載される方法は、熟成中ブドウ果実において高レベルで蓄積媒体極性代謝物の分析のために最適化され、そしてこれはかなりテロワールによって影響を受けます。彼らは一緒にワインの色、味と健康関連の特性を決定する、アントシアニン、フラボノール、フラバン-3-オール、プロシアニジン、他のフラボノイド、レスベラトロール、スチルベン、ヒドロキシ酸およびヒドロキシ安息香酸が含まれます。 HPLC-MSによる定量の信頼性が低いので、そのような糖や脂肪族有機酸などの他の代謝産物は、原因effec行列に無視されますトンとイオン抑制現象5。この方法により、選択された極性の範囲内に、アプローチは、可能な6限り多くの異なった代謝物を検出することを目的とするという点で非標的です。 ブドウの転写産物の数千人が同時に監視できるようにするトランスクリプトーム法は、完全なブドウのゲノム配列7,8の利用可能性によって促進されます。ハイスループットのcDNA塩基配列決定に基づいて、初期のトランスクリプトミクス手法をまとめ、RNAのSeq技術として記載された手順のコレクションに次世代シーケンサーの登場と進化してきました。このアプローチは、急速にトランスクリプトミクス研究のための最適な方法になってきています。しかし、転写産物の数千人は、ハイブリダイゼーションによって並列に定量化することを可能にするマイクロアレイに基づく文学の大きな体は、ブドウのために蓄積してきました。 RNA-seqが主流の技術になる前に実際に、多くの専用の市販のマイクロアレイプラットフォームをしていましたブドウトランスクリプトームは、非常に詳細に検査することを可能にする開発。プラットフォームの多種多様な中で、2つだけは、ゲノムワイドなトランスクリプトーム解析9を可能にしました。最も進化した配列は、このように各実験のコストを削減し、単一のデバイスに最大12の独立したサンプルのハイブリダイゼーションを可能にしました。 12サブアレイはそれぞれ29549ブドウの転写産物を表す135,000 60-merのプローブを含んでいました。この装置は、試験10-24多数のに使用されています。これら2つのプラットフォームは、現在廃止されましたが、新しいカスタムマイクロアレイは、最近設計されていて、それが追加新たに発見されたブドウの遺伝子25を表すプローブのさらに多くが含まれているとして、より多くの最近の発展を表しています。 トランスクリプトミクスとメタボロミクス解析によって生成された大販売データセットは、別のフォームとの間の相関を決定するために、多変量技術を含むデータ分析に適した統計的手法を必要とし、データの秒。最も広く使用されている多変量技術は、投影に基づくものであり、これらは、主成分分析（PCA）、又は、教師なしとすることができるような潜在構造判別分析（O2PLS-DA）26への双方向直交射影として、監督します。この記事で紹介したプロトコルは、サンプルのグループ間の差異を識別するために、探索的データ解析のためのPCAとO2PLS-DAを使用しています。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mill Grinder</td>
			<td>IKA</td>
			<td>IKA A11 basic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Autosampler</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td>System Gold 508 Autosampler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC System</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td>System Gold 127 Solvent Module HPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 Guard Column</td>
			<td>Grace</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td>Alltima HP C18 (7.5x2.1mm; 5&#956;m) Guard Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 Column</td>
			<td>Grace</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td>Alltima HP C18 (150x2.1mm; 3&#956;m) Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass Spectometer</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td>Bruker Esquire 6000; The mass spectometer was equipped with an ESI source and the analyzer was an ion trap.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">Extraction solvents and HPLC buffers</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>34966</td>
			<td>Methanol LC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma</td>
			<td>94318</td>
			<td>Formic acid LC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma</td>
			<td>34967</td>
			<td>Acetonitrile LC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma</td>
			<td>39253</td>
			<td>Water&#160; LC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minisart RC 4 Syringe filters (0.2 &#956;m)</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>17764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Softwares for data collection (a) and processing (b)</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td>-</td>
			<td>Bruker Daltonics Esquire 5.2 Control (a); Esquire 3.2 Data Analysis and MzMine 2.2 softwares (b)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrum Plant Total RNA kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>STRN250-1KT</td>
			<td>For total RNA extractino from grape pericarps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 1000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioAnalyzer 2100</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2939A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 6000 Nano Reagents</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-1511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Chips</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-1511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Gene Expression Wash Buffer 1</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5188-5325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Gene Expression Wash Buffer 2</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5188-5326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LowInput QuickAmp Labeling kit One-Color</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5190-2305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kit RNA Spike In - One-Color</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5188-5282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Expression Hybridization Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5188-5242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit (50)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>For cRNA Purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent SurePrint HD 4X44K 60-mer Microarray</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2514F-048771&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eArray</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>-</td>
			<td><a href="https://earray.chem.agilent.com/earray/">https://earray.chem.agilent.com/earray/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gasket slides</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2534-60012</td>
			<td>Enable Agilent SurePrint Microarray 4-array Hybridization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostatic bath</td>
			<td>Julabo</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization Chamber</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2534-60001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray Hybridization Oven</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2545A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization Oven Rotator Rack</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2530-60029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator Rack Conversion Rod</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2530-60030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining kit</td>
			<td>Bio-Optica</td>
			<td>10-2000</td>
			<td>Slide-staining dish and Slide rack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer device</td>
			<td>AREX Heating Magnetic Stirrer</td>
			<td>F20540163&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostatic Oven</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Heraeus - 6030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Microarray Scanner</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2565CA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanner Carousel, 48-position</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2505-60502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide Holders</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2505-60525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feature extraction software v11.5</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>-</td>
			<td>inside the Agilent Microarray Scanner G2565CA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SIMCA + V13 Software</td>
			<td>Umetrics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the terroir concept interpreted through grape berry metabolomics and transcriptomics

テロワールは、特定の生息地や経営慣行に従って、このようなブドウ（ ブドウ ）などの作物の特性に影響を与える環境要因の組み合わせを指します。この記事では、特定のテロワールの署名が多変量統計解析を用いて、ブドウ品種のコルビナのベリーメタボロームとトランスクリプトームで検出することができる方法を示しています。この方法は、まず、適切なサンプリング計画が必要です。このケーススタディでは、コルビナ品種の特定のクローンは遺伝的差異を最小限に抑えるように選択し、試料は、3つの異なる栽培期間中に三つの異なるマクロゾーンを表す7ブドウ畑から収集しました。非標的LC-MSメタボロミクスのアプローチはMZmineソフトウェアおよびフラグメンテーションツリー分析に基づいて、代謝物同定の戦略を使用して効率的なデータ処理を伴う、その高感度のために推奨されます。包括的トランスクリプトーム解析は、マイクロアレイを用いて達成することができますすべての〜99％をカバー含むプローブは異なるテロワールのコンテキスト内のすべての示差的に発現する遺伝子の同時分析を可能にする、ブドウの遺伝子を予測しました。最後に、投影法に基づいて、多変量データ解析は、メタボロミクスとトランスクリプトミクスデータを統合し、有益な相関を同定するために詳細に分析することを可能にする、強力なヴィンテージ特有の効果を克服するために使用することができます。

この資料に記載されているケーススタディでは、比較的189サンプル間の定量化分子イオンプラスその同位体、付加物およびいくつかの断片を含む552の信号（ のm / zの機能）、（7ブドウ畑×3熟成段階×3栽培期間xを含む最終データ行列が得られました3生物学的複製）。データポイントの合計数は、したがって、104328でした。断片化ツリー分析は、代謝産物に加えて付加体、同位体およびその断片に対応する282 のm / zの機能注釈をもたらしました。 PCAにより全データ行列の探索的分析は、熟成の段階に応じてサンプルがクラスタ化されたことが示された（veraison、半ば熟成と熟した）は、第1および第2主成分（T1-T2、 図2A）に沿って、かつ沿って成長する季節に応じて第3主成分（T1〜T3、 図2B）。 <img alt="図2"<html> SRC = &quot;/ファイル/ ftp_upload / 54410 / 54410fig2.jpg&quot; /&gt; 図2： 全体のメタボロミクスデータ行列のPCA教師なしPCA-Xステージを三つの異なる生育期（2006年、2007年、および2008）の間に収集ブドウサンプルのクラスタリングを示すと熟成スコア散布図（veraison、半ば熟成と熟した果実）。最初のプロット（A）は、第2の（B）で、一方、熟成段階に応じクラスタ化されたサンプルでは、彼らは成長期に応じてクラスタ化されました。色は緑（veraison）、ピンク（半ば熟成）、紫（熟した果実）として熟成の段階を強調表示します。円（2006年）、四角（2007）と三角（2008）.Component T1：Q2：シンボルは、成長季節表す0.34; R2X：0.331; Q2cum：0.304;コンポーネントT2：Q2：0.185; R2X：0.155; Q2cum：0.433;コンポーネントT3：Q2：0.145; R2X：0.0924; Q2cum：0.515。JPG &quot;ターゲット=&quot; _空白&quot;&gt; この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 教師なしPCAは、流行のヴィンテージの効果の下に隠されている特定のテロワールの特徴を、明らかにすることができませんでしたので、教師O2PLS-DAのアプローチは、2つの別々のデータセット、 すなわち、ベリーveraisonで、完全に熟した果実に適用しました。これは、これらの熟成の段階でこれらのゾーンを表す具体的なテロワールの署名を識別するために、熟成の二つの重要な段階で3マクロのゾーン（ガルダ湖、ヴァルポリチェッラとソアーヴェ）を表す代謝の違いの探査を可能にします。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54410/54410fig3.jpg" /> 図3：veraison と熟したブドウ果実のO2PLS-DA。ガルダ湖に集めブドウサンプルのクラスタリングを示すO2PLS-DAスコア散布図（<html>青）、ソアーヴェ（緑）、ヴァルポリチェッラ（ピンク）veraison（A）と果実が熟した（Bのマクロゾーン）。 （A）で観察されたクラスタリング及び（B）の責任の代謝産物は、それぞれの相関ローディングプロット（C）及び（D）に表示されています。三角形で表さ代謝物のグループは、フラバン-3-オール/プロシアニジン、およびイエローの他のフラボノイドのためのために、レスベラトロールおよびスチルベン、アントシアニンのためのピンクの青ヒドロキシおよびヒドロキシ安息香酸のための緑、紫です。 ：コンポーネントP1：Q2：0.278; R2X：0.0529; Q2cum：0.278;部品P2：Q2：0.33; R2X：0.0394; Q2cum：0.608。 B：成分P1：Q2：0.353; R2X：0.0639; Q2cum：0.353;部品P2：Q2：0.188; R2X：0.0374; Q2cum：0.541 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54410/54410fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 1 &quot;&gt;：&quot; =キープtogether.within-ページFO」_content <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54410/54410fig4.jpg" /> 図4：3 のマクロのゾーン間の代謝マーカーの分布：。ガルダ湖、ソアーヴェ、およびヴァルポリチェッラ代謝物レベルは平均値±標準誤差を反映した（n =ガルダとソアーヴェ、ヴァルポリチェッラのマクロゾーンの27のための18）は、異なるグリコシル化のと三つの異なる生育期で熟したコルビナベリー（2006、2007、および2008）におけるアシル化アントシアニン、レスベラトロール/スチルベンおよびフラボノイド。異なる文字はt検定（P &lt;0.05）によって決定されるように有意に異なった基を示す。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54410/54410fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 7個々のブドウ畑の具体的な署名は、特別なを使用して同定しました統計的手法10を化さ。二O2PLS-DAモデルは、veraisonで3マクロのゾーンで成長した果実の間の違いを探求1を構築し、もう一方は成熟した果実のうち、3マクロのゾーンの違いを模索しました。モデルは交差検定のみガルダ湖サンプルはveraisonで他のサンプルは異なっていたのに対し、3マクロゾーン間で成熟した果実を記述するモデルが有効であったことを示す順列テスト（200順列）を使用していた（図示せず）。 veraisonと満期時3マクロのゾーンからのサンプルは、代謝物の分布に応じて分離されている方法を示す二つのモデル、スコアプロットは、 図3Aおよび3Bに示されています。 すなわちPQ（CORR）、P（サンプルのクラス）とq（代謝物）との相関関係として表さこれらのモデルのローディングプロットは、 図に示されていますS 3Cおよび3D。ローディングプロットでは、赤い四角はサンプル（マクロゾーン）のクラスを表し、色付きの三角形は、個々の代謝物を表します。代謝物とサンプル間の距離は、それらの関係を反映しています。代謝物は、それらの化学的分類に従って色分けされています。 順列試験により示されるようにveraisonモデルの低い統計的な妥当性を考えると、過剰適合苦しむ可能性があります。したがって、以下の観察は、そのモデル、統計的に有効であった、成熟した果実サンプルにのみ参照してください。フラボノイドはソアーヴェとヴァルポリチェッラマクロのゾーンに向かってシフトしているのに対し、 図3Dに示すローディングプロットでは、スチルベンは、ガルダ湖のマクロゾーンに向かってシフトしています。個々の代謝物をよく見湖ガーでより普及ペオニジンおよびその誘導体と、アントシアニンの非対称分布を明らかにダマクロゾーンとヴァルポリチェッラのマクロ域でより普及している他のアントシアニン（ 図4）。シンプルなアントシアニン-3-O-グルコシドは、アシル化とcoumarated誘導体はソアーヴェマクロ域でより普及しているのに対し、ヴァルポリチェッラのマクロ域でより普及しています。 このケーススタディのトランスクリプトミクスコンポーネントはサポートされなくなりましたトランスクリプトミクスプラットフォームを使用して外にもともとありました。結果として、我々はまだ利用可能なプラットフォームで、別の手順を設定します。新しいプラットフォームは、249以上のピノ・ノワールを含む古い1以上のプローブを、含まれている、4392新たに同定されたピノ遺伝子座および179コルビナプライベート遺伝子25の転写産物を予測しました。

Watch this Scientific Journal Video about The Terroir Concept Interpreted through Grape Berry Metabolomics and Transcriptomics at JoVE.com

The Terroir Concept Interpreted through Grape Berry Metabolomics and Transcriptomics

この記事では、 すなわち 、テロワールの概念を洞察するために、ベリー品質形質に対する環境の影響をブドウ果実の転写産物および代謝物への非標的メタボロミクス、トランスクリプトミクスと多変量統計解析のアプリケーションについて説明します。

グレープベリーメタボロミクスとトランスクリプトを通して解釈テロワールコンセプト

Terroir refers to the combination of environmental factors that affect the characteristics of crops such as grapevine (Vitis vinifera) according to ...

the-terroir-concept-interpreted-through-grape-berry-metabolomics

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

10.3K ビュー.  University of Verona. この記事では、 すなわち 、テロワールの概念を洞察するために、ベリー品質形質に対する環境の影響をブドウ果実の転写産物および代謝物への非標的メタボロミクス、トランスクリプトミクスと多変量統計解析のアプリケーションについて説明します。 

ビデオ: The Terroir Concept Interpreted through Grape Berry Metabolomics and Transcriptomics

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process requires multi-subunit DNA-dependent RNA polymerase (RNAP) and a series of transcription factors that act to modulate the activity of RNAP during gene expression. Sequencing gel electrophoresis of radiolabeled transcripts is used to provide detailed mechanistic information on how transcription proceeds and what parameters can affect it. In this paper we describe the protocol to study how the essential elongation factor NusA regulates transcriptional pausing, as well as a method to identify an antibacterial agent targeting transcription initiation through inhibition of RNAP holoenzyme formation. These methods can be used a as platform for the development of additional approaches to explore the mechanism of action of the transcription factors which still remain unclear, as well as new antibacterial agents targeting transcription which is an underutilized drug target in antibiotic research and development.

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In this manuscript, we describe a protocol to functionally examine transcription and the inhibitory activity of antibacterial agents targeting bacterial transcription.

in vitro転写アッセイおよび創薬への応用

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

遺伝学

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. This is due to its reproductive behavior: females damage the external surface of fruits and vegetables when they lay eggs and the hatched larvae feed on their pulp. Wild C. capitata populations are traditionally controlled through insecticide spraying and/or eco-friendly approaches, the most successful being the Sterile Insect Technique (SIT). The SIT relies on mass-rearing, radiation-based sterilization and field release of males that retain their capacity to mate but are not able to generate fertile progeny. The advent and the subsequent rapid development of biotechnological tools, together with the availability of the medfly genome sequence, has greatly boosted our understanding of the biology of this species. This favored the proliferation of new strategies for genome manipulation, which can be applied to population control.
In this context, embryo microinjection plays a dual role in expanding the toolbox for medfly control. The ability to interfere with the function of genes that regulate key biological processes, indeed, expands our understanding of the molecular machinery underlying medfly invasiveness. Furthermore, the ability to achieve germ-line transformation facilitates the production of multiple transgenic strains that can be tested for future field applications in novel SIT settings. Indeed, genetic manipulation can be used to confer desirable traits that can, for example, be used to monitor sterile male performance in the field, or that can result in early life-stage lethality. Here we describe a method to microinject nucleic acids into medfly embryos to achieve these two main goals.

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

世界的な農業害虫昆虫における胚のマイクロインジェクションを介して、核酸の送達、<em&gt;チチュウカイミバエ</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

Leveraging CyVerse Resources for De Novo Comparative Transcriptomics of Underserved (Non-model) Organisms

This workflow allows novice researchers to leverage advanced computational resources such as cloud computing to carry out pairwise comparative transcriptomics. It also serves as a primer for biologists to develop data scientist computational skills, e.g. executing bash commands, visualization and management of large data sets. All command line code and further explanations of each command or step can be found on the wiki (<a href="https://wiki.cyverse.org/wiki/x/dgGtAQ">https://wiki.cyverse.org/wiki/x/dgGtAQ</a>). The Discovery Environment and Atmosphere platforms are connected together through the CyVerse Data Store. As such, once the initial raw sequencing data has been uploaded there is no more need to transfer large data files over an Internet connection, minimizing the amount of time needed to conduct analyses. This protocol is designed to analyze only two experimental treatments or conditions. Differential gene expression analysis is conducted through pairwise comparisons, and will not be suitable to test multiple factors. This workflow is also designed to be manual rather than automated. Each step must be executed and investigated by the user, yielding a better understanding of data and analytical outputs, and therefore better results for the user. Once complete, this protocol will yield de novo assembled transcriptome(s) for underserved (non-model) organisms without the need to map to previously assembled reference genomes (which are usually not available in underserved organism). These de novo transcriptomes are further used in pairwise differential gene expression analysis to investigate genes differing between two experimental conditions. Differentially expressed genes are then functionally annotated to understand the genetic response organisms have to experimental conditions. In total, the data derived from this protocol is used to test hypotheses about biological responses of underserved organisms.

Leveraging CyVerse Resources for De Novo Comparative Transcriptomics of Underserved Non-model Organisms

This protocol outlines a comparative de novo transcriptome assembly and annotation workflow for novice bioinformaticians. The workflow is available for free entirely through CyVerse and connected by the Data Store. Command line and graphical user interfaces are used, but all code needed is available to copy and paste.

CyVerseリソースの活用<em&gt;デ・ノヴォ</em&gt;保存されていない（非モデル）生物の比較トランスクリプトーム

This workflow allows novice researchers to leverage advanced computational resources such as cloud computing to carry out pairwise comparative ...

Controllable Ion Channel Expression through Inducible Transient Transfection

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be investigated through electrophysiological analysis, biochemical characterization, mutational studies, and their effects on cellular processes. Transient transfections offer a simple protocol in which the protein becomes available for analysis within a few hours to days. Although this method presents a relatively straightforward and time efficient protocol, one of the critical components is calibrating the expression of the gene of interest to physiological relevant levels or levels that are suitable for analysis. To this end, many different approaches that offer the ability to control the expression of the gene of interest have emerged. Several stable cell transfection protocols provide a way to permanently introduce a gene of interest into the cellular genome under the regulation of a tetracycline-controlled transcriptional activation. While this technique produces reliable expression levels, each gene of interest requires a few weeks of skilled work including calibration of a killing curve, selection of cell colonies, and overall more resources. Here we present a protocol that uses transient transfection of the Transient Receptor Potential cation channel subfamily V member 1 (TRPV1) gene in an inducible system as an efficient way to express a protein in a controlled manner which is essential in ion channel analysis. We demonstrate that using this technique, we are able to perform calcium imaging, whole cell, and single channel analysis with controlled channel levels required for each type of data collection with a single transfection. Overall, this provides a replicable technique that can be used to study ion channels structure and function.

Studying ion channels through a heterologously expressing system has become a core technique in biomedical research. In this manuscript, we present a time efficient method to achieve tightly controlled ion channel expression by performing transient transfection under the control of an inducible promoter.

誘導性一過性トランスフェクションを介して制御可能なイオンチャネルの発現

Transfection, the delivery of foreign nucleic acids into a cell, is a powerful tool in protein research. Through this method, ion channels can be ...

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

Next generation sequencing (NGS) technologies have revolutionized the nature of biological investigation. Of these, RNA Sequencing (RNA-Seq) has emerged as a powerful tool for gene-expression analysis and transcriptome mapping. However, handling RNA-Seq datasets requires sophisticated computational expertise and poses inherent challenges for biology researchers. This bottleneck has been mitigated by the open access Galaxy project that allows users without bioinformatics skills to analyze RNA-Seq data, and the Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery (DAVID), a Gene Ontology (GO) term analysis suite that helps derive biological meaning from large data sets. However, for first-time users and bioinformatics' amateurs, self-learning and familiarization with these platforms can be time-consuming and daunting. We describe a straightforward workflow that will help C. elegans researchers to isolate worm RNA, conduct an RNA-Seq experiment and analyze the data using Galaxy and DAVID platforms. This protocol provides stepwise instructions for using the various Galaxy modules for accessing raw NGS data, quality-control checks, alignment, and differential gene expression analysis, guiding the user with parameters at every step to generate a gene list that can be screened for enrichment of gene classes or biological processes using DAVID. Overall, we anticipate that this article will provide information to C. elegans researchers undertaking RNA-Seq experiments for the first time as well as frequent users running a small number of samples.

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

Galaxy and DAVID have emerged as popular tools that allow investigators without bioinformatics training to analyze and interpret RNA-Seq data. We describe a protocol for C. elegans researchers to perform RNA-Seq experiments, access and process the dataset using Galaxy and obtain meaningful biological information from the gene lists using DAVID.

のトランスクリプトーム解析<em&gt; C</em&gt;。<em&gt;エレガンス</emギャラクシープロジェクトのタキシードスイートを通じて&gt; RNAシーケンスデータ

Next generation sequencing (NGS) technologies have revolutionized the nature of biological investigation. Of these, RNA Sequencing (RNA-Seq) has emerged ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with a number of challenges including sample preservation quality, degraded DNA, and destructive sampling of rare specimens. In order to more effectively use herbarium material in large sequencing projects, a dependable and scalable method of DNA isolation and library preparation is needed. This paper demonstrates a robust, beginning-to-end protocol for DNA isolation and high-throughput library construction from herbarium specimens that does not require modification for individual samples. This protocol is tailored for low quality dried plant material and takes advantage of existing methods by optimizing tissue grinding, modifying library size selection, and introducing an optional reamplification step for low yield libraries. Reamplification of low yield DNA libraries can rescue samples derived from irreplaceable and potentially valuable herbarium specimens, negating the need for additional destructive sampling and without introducing discernible sequencing bias for common phylogenetic applications. The protocol has been tested on hundreds of grass species, but is expected to be adaptable for use in other plant lineages after verification. This protocol can be limited by extremely degraded DNA, where fragments do not exist in the desired size range, and by secondary metabolites present in some plant material that inhibit clean DNA isolation. Overall, this protocol introduces a fast and comprehensive method that allows for DNA isolation and library preparation of 24 samples in less than 13 h, with only 8 h of active hands-on time with minimal modifications.

This article demonstrates a detailed protocol for DNA isolation and high-throughput sequencing library construction from herbarium material including rescue of exceptionally poor-quality DNA.

堅牢な DNA の隔離および標本の高スループット シーケンス ライブラリーの構築

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, milk and urine. One subset of these RNAs are the posttranscriptional regulators &#8211; microRNAs (miRNAs). To delineate the miRNAs produced by specific cell types, in vitro culture systems can be used to harvest and profile exRNAs derived from one subset of cells. The secreted factors of mesenchymal stem cells are implicated in alleviating numerous diseases and is used as the in vitro model system here. This paper describes the process of collection, purification of small RNA and library generation to sequence extracellular miRNAs. ExRNAs from culture media differ from cellular RNA by being low RNA input samples, which calls for optimized procedures. This protocol provides a comprehensive guide to small exRNA sequencing from culture media, showing quality control checkpoints at each step during exRNA purification and sequencing.

This protocol demonstrates how to purify extracellular microRNAs from cell culture media for small RNA library construction and next generation sequencing. Various quality control checkpoints are described to allow readers to understand what to expect when working with low input samples like exRNAs.

分離、シーケンスおよびヒト間葉系幹細胞からの細胞のマイクロ Rna を分析

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences is desired. We herein provide a detailed in vitro and in-cell selective 2&#39;-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) protocol to study the RNA structural change in the presence of an experimental drug for spinal muscular atrophy (SMA), survival of motor neuron (SMN)-C2, and in exon 7 of the pre-mRNA of the SMN2 gene. In in vitro SHAPE, an RNA sequence of 140 nucleotides containing SMN2 exon 7 is transcribed by T7 RNA polymerase, folded in the presence of SMN-C2, and subsequently modified by a mild 2&#39;-OH acylation reagent, 2-methylnicotinic acid imidazolide (NAI). This 2&#39;-OH-NAI adduct is further probed by a 32P-labeled primer extension and resolved by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Conversely, 2&#39;-OH acylation in in-cell SHAPE takes place in situ with SMN-C2 bound cellular RNA in living cells. The pre-mRNA sequence of exon 7 in the SMN2 gene, along with SHAPE-induced mutations in the primer extension, was then amplified by PCR and subject to next-generation sequencing. Comparing the two methodologies, in vitro SHAPE is a more cost-effective method and does not require computational power to visualize results. However, the in vitro SHAPE-derived RNA model sometimes deviates from the secondary structure in a cellular context, likely due to the loss of all interactions with RNA-binding proteins. In-cell SHAPE does not need a radioactive material workplace and yields a more accurate RNA secondary structure in the cellular context. Furthermore, in-cell SHAPE is usually applicable for a larger range of RNA sequences (~1,000 nucleotides) by utilizing next-generation sequencing, compared to in vitro SHAPE (~200 nucleotides) that usually relies on PAGE analysis. In case of exon 7 in SMN2 pre-mRNA, the in vitro and in-cell SHAPE derived RNA models are similar to each other.

Detailed protocols for both in vitro and in-cell selective 2&#39;-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) experiments to determine the secondary structure of pre-mRNA sequences of interest in the presence of an RNA-targeting small molecule are presented in this article.

MRNA の構造変化を誘導培養と細胞の形で使用して小分子を調査するには

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the flexible and efficient GreenGate cloning system with the proven and benchmarked LhGR system (here termed GR-LhG4) for the inducible expression, we have generated a set of transgenic Arabidopsis lines that can drive the expression of an effector cassette in a range of specific cell types in the three main plant meristems. To this end, we chose the previously developed GR-LhG4 system based on a chimeric transcription factor and a cognate pOp-type promoter ensuring tight control over a wide range of expression levels. In addition, to visualize the expression domain where the synthetic transcription factor is active, an ER-localized mTurquoise2 fluorescent reporter under control of the pOp4 or pOp6 promoter is encoded in driver lines. Here, we describe the steps necessary to generate a driver or effector line and demonstrate how cell type specific expression can be induced and followed in the shoot apical meristem, the root apical meristem and the cambium of Arabidopsis. By using several or all driver lines, the context specific effect of expressing one or multiple factors (effectors) under control of the synthetic pOp promoter can be assessed rapidly, for example in F1 plants of a cross between one effector and multiple driver lines. This approach is exemplified by the ectopic expression of VND7, a NAC transcription factor capable of inducing ectopic secondary cell wall deposition in a cell autonomous manner.

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Here, we describe the generation and application of a set of transgenic Arabidopsis thaliana lines enabling inducible, tissue-specific expression in the three main meristems, the shoot apical meristem, the root apical meristem, and the cambium.

誘導、細胞型における発現シロイヌナズナLhGR を介したトランス-活性化

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

Improving Small RNA-seq: Less Bias and Better Detection of 2'-O-Methyl RNAs

The study of small RNAs (sRNAs) by next-generation sequencing (NGS) is challenged by bias issues during library preparation. Several types of sRNA such as plant microRNAs (miRNAs) carry a 2&#39;-O-methyl (2&#39;-OMe) modification at their 3&#39;&#160;terminal nucleotide. This modification adds another difficulty as it inhibits 3&#39;&#160;adapter ligation. We previously demonstrated that modified versions of the &#39;TruSeq (TS)&#39;&#160;protocol have less bias and an improved detection of 2&#39;-OMe RNAs. Here we describe in detail protocol &#39;TS5&#39;, which showed the best overall performance. TS5 can be followed either using homemade reagents or reagents from the TS kit, with equal performance.

We present a detailed small RNA library reparation protocol with less bias than standard methods and an increased sensitivity for 2&#39;-O-methyl RNAs. This protocol can be followed using homemade reagents to save cost or using kits for convenience.

小型RNA-seqの改善:バイアスの減少と2'-O-メチルRNAの検出の改善

The study of small RNAs (sRNAs) by next-generation sequencing (NGS) is challenged by bias issues during library preparation. Several types of sRNA such as ...