This research is supported by the National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism, award K99/R00 AA021264. Additional lab support as part of startup package has been received from the Department of Immunology, Institute of NeuroImmune Pharmacology, Herbert Wertheim College of Medicine, and FIU- Office of Research and Economic Development. Gianna Casteleiro was supported by NIH/NIGMS R25 GM061347. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.

전체 인간의 혈액 연구를 검토하고, IRB 프로토콜 승인 번호의 IRB-13-0440 FIU의 임상 시험 심사위원회 (IRB)에 의해 승인되었습니다. 인간 leukopaks 마이애미, 플로리다의 지역 사회 혈액 은행에서 구입 하였다. 표준 밀도 그라데이션 기법에 의해 PBMC를 1. 분리 <ol><li> T75 플라스크에 1 배 - 인산 완충 생리 식염수와 혈액의 1 희석 : 1을 수행합니다. </li><li> 피펫 (15) 50 ㎖ 원심 분리 튜브에 밀도 구배 용액의 ml를 조심스럽게 층 -이 그라데이션을 통해 희석 된 혈액 (25 ~ 30 ㎖ / 튜브). </li><li> 1의 가속과 0의 감속 1,200 XG에서 20 분 동안 원심 분리기. </li><li> 원심 분리 후, 새로운 50 ㎖ 원심 분리 튜브에 계면 층 (백혈구)를 수집하여 PBS로 두 번 (1080 XG에서 3 분) 세포를 세척 하였다. 때마다 뜨는 폐기하십시오. </li><li> 암모늄, 염화 칼륨, 용균 (ACK) 완충액으로 세포를 치료 (적혈구를 용해시키기 위해). 버퍼와 10 ML을 추가4 ℃에서 15 분 동안 cubate. </li><li> 1,080 XG에서 3 분 동안, PBS로 두 번 원심 분리기 세포를 씻고마다 상층 액을 버린다. </li><li> PBMC를을 포함하는 펠렛을 저장합니다. </li><li> 선택의 단핵 세포 정제 방법으로 진행합니다. </li></ol> 준수 방법 2. 단핵구 정화 <ol><li> L 글루타민 하였다 (300 mg / ㎖)을 포함한 전체 세포 배양 배지를 준비 페니실린 (50 U / ㎖) -streptomycin (50 μg의 / ml) 및 10 % 소 태아 혈청. </li><li> 이 PBMC를 가습 인큐베이터에서 37 ° C, 5 % CO 2에서 완전 배지 10 ㎖ 당 5 × 107 세포의 농도에서 T75 플라스크에 이들을 배양하여 약 2 시간 동안 부착 할 수있다. </li><li> 배양 후, 배양 플라스크에서 비 부착 떠있는 세포를 제거하고 부드럽게 PBS로 두 번 부착 세포를 씻는다. </li><li> 인간 과립구 macr 2 μL / mL로 보충 된 완전 세포 배양 배지에서 부착 세포를 부화ophage 콜로니 자극 인자 (GM-CSF) 및 인터루킨 4 (IL-4)를 10 μg의 / ㎖ 스톡 농도로 저장된다. </li><li> 매체의 절반을 변경하고 사이토 카인마다 48 시간을 보충. </li><li> MDDCs에 단핵 세포의 분화 7 일 - 5 허용합니다. </li></ol> 자기 분리 방법 3. 단핵구 정화 <ol><li> 5 ml의 폴리스티렌 튜브에 붓고 세포 / ml의 농도로 PBS 버퍼에 일시 중지 다시 표준 밀도 구배 기법으로부터 PBMC를 수집. </li><li> 50 μL / ㎖의 세포를 사용하여 인간 단핵 세포 농축 칵테일을 추가 잘 혼합하고 10 분 동안 4 ° C에서 품어. </li><li> 배양 후, 50 μL / ml의 세포를 사용하여 자성 입자를 추가 잘 혼합하여 4 ℃에서 5 분간 배양한다. </li><li> , PBS 완충액을 첨가하여 2.5 ml의 총 부피까지 세포 현탁액을 가지고 다운이 닫 피펫 팅하여 잘 혼합하고 - 3 회. </li><li> 자기 장치에 캡없이 폴리스티렌 튜브를 삽입하고이 동안 실온에서 방치0.5 분. </li><li> 배양 후와 하나의 연속 동작으로, 자석을 선택하고 깨끗한 50 ㎖ 원심 분리 튜브에 원하는 정제 단핵 세포 분획을 붓는다. </li><li> 전체 세포 배양 인간 과립구 - 대 식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF)을 2 μL / mL로 보충 된 배지 4 인터루킨에 부착 세포를 부화 (IL-4)를 10 μg의 / ㎖ 스톡 농도로 저장된다. </li><li> 모든 48 시간은 매체의 절반을 변경 5 분 동안 1,080 XG에 스핀 다운 및 새로운 미디어 (CRPMI) 및 사이토 카인과 펠렛을 다시 일시 중지합니다. </li><li> MDDCs에 단핵 세포의 분화 7 일 - 5 허용합니다. </li></ol> 4. 트리 판 블루 제외 생존 분석 참고 : PBMC를, 단핵구 및 MDDCs의 세포 수율과 생존을 얻기 위해이 기술을 사용합니다. <ol><li> 표준 트립신 EDTA를 사용하여 플라스크하고 PBS를 이용하여 세포 펠렛의 세척을 수행 수확 세포. 펠렛의 크기에 따라 재펠렛을 용해 PBS 5 내지 10 ml의 정지. </li><li> 희석 된 세포 펠렛과 트리 판 블루 시약 1 희석 마이크로 원심 분리 튜브에 1을 수행한다. </li><li> 이 믹스에서 셀에 나누어지는 10 μl의 슬라이드를 계산하고 제조 업체의 프로토콜에 따라 자동 세포 계수기를 사용하여 결과를 참조하십시오. 자동 세포 계수기를 사용할 수없는 경우 유사한 세포 수는 혈구 또는 수동 계수기를 사용하여 가능하다. </li></ol> 5. MTT 분석 <ol><li> 웰 96 웰 플레이트의 각으로 완전한 미디어 4 × 10 100분의 4 μL의 농도로 플레이트 세포. 세포는 문화에 적응하기위한 24 시간을 허용합니다. </li><li> 품어 각각 0 (0 일), 36 (3 일), 84 (7 일) 시간에 측정을 수행합니다. </li><li> 원하는 배양 완료시, 미디어를 제거하고 혼자 PBS 100 ㎕로 교체합니다. </li><li> 준비 3- (4,5- 디메틸 티아 졸 -2- 일) - 다이 메틸 10 ㎖를 첨가하여 -2,5- 디 페닐 테트라 졸륨 브로마이드 용액 (MTT) (5 ㎎ / ㎖)도데 실 황산나트륨 1g을 (SDS)에 일 설폭 사이드 (DMSO). </li><li> 각 웰에 MTT 용액 10 μL (5 ㎎ / ㎖)를 첨가하고, 추가 2 시간 동안 37 ℃에서 배양한다. </li><li> 부화 후, PBS와 회심 MTT 혼합물 (노란색 컬러 솔루션)를 포함 상층 액을 제거합니다. </li><li> 각 웰에 SDS-DMSO 용액 100 μl를 추가하고 하나의 추가 시간 동안 배양한다. </li><li> 마이크로 플레이트 리더를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 참조하십시오. </li></ol> 6. 세포 표면 이미징 유동 세포 계측법에 의해 염색 분석 <ol><li> 정제 단핵 세포에서 분화 7 일 후, 1.5 ml의 튜브의 해당 번호로 단핵구 유래 수지상 세포의 1 × 6 전지 씩 분배. </li><li> 불 활성화 열 50 μL (HI) 인간 혈청을 사용하여 차단하는 세포에 의해 세포 표면의 얼룩을 시작, 10 분 동안 4 ° C에서 품어. </li><li> 배양 후, 원심 분리기 세포 5 분 720 XG에는, 상층 액을 버린다. </li><li> PELLE 셀t는 각각의 형광 색소 - 컨쥬 게이트 된 항체 (예, 항 중 CD11c 또는 항 CD14)를 첨가하고, 빛으로부터 보호 된 20 분 동안 4 ℃에서 배양한다. 그들은 보상을 위해 필요하기 때문에 별도의 튜브에서) 하나의 형광 색소 묻은 샘플 / ㎖를 준비합니다. </li><li> 배양 후, 5 분 동안 720 XG에서 PBS 버퍼와 원심 분리기 1 ㎖ 때마다 두 번 세포를 씻으십시오. </li><li> 빛으로부터 보호 셀을 유지하는 유동 세포 계측법 분석을위한 세포 / 100 ㎕의 농도로 PBS 완충액에 재현 정지. </li><li> 생존 세포의 게이트하기 위해, 종래 제조업체의 지시에 따라 악기 계측법 단세포 촬상 흐름 세포를 취득하여 각 튜브에 DAPI 1 μL를 추가한다. </li></ol> 7. 통계 분석 <ol><li> 입력 스프레드 시트에있는 모든 데이터. </li><li> 학생의 t-시험 및 / 또는 편도 적절한 ANOVA를 사용하여 결과를 비교한다. </li><li> 페이지의 경우 &lt;0.05 통계적으로 유의 한 것으로 차이를 고려한다. </리&gt; </ol>

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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD14++blood+monocytes+can+differentiate+into+functionally+mature+CD83++dendritic+cells.">CD14+ blood monocytes can differentiate into functionally mature CD83+ dendritic cells.</a> Proc Natl Acad Sci. 93, 2588-2592 (1996).</li><li>Caux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B70/B7-2+is+identical+to+CD86+and+is+the+major+functional+ligand+for+CD28+expressed+on+human+dendritic+cells.">B70/B7-2 is identical to CD86 and is the major functional ligand for CD28 expressed on human dendritic cells.</a> J Exp Med. 180, 1841-1847 (1994).</li><li>Caux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+human+dendritic+cells+through+CD40+cross-linking.">Activation of human dendritic cells through CD40 cross-linking.</a> J Exp Med. 180, 1263-1272 (1994).</li><li>Fujii, S. i., Liu, K., Smith, C., Bonito, A. J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Linkage+of+Innate+to+Adaptive+Immunity+via+Maturing+Dendritic+Cells+In+Vivo+Requires+CD40+Ligation+in+Addition+to+Antigen+Presentation+and+CD80/86+Costimulation.">The Linkage of Innate to Adaptive Immunity via Maturing Dendritic Cells In Vivo Requires CD40 Ligation in Addition to Antigen Presentation and CD80/86 Costimulation.</a> J Exp Med. 199, 1607-1618 (2004).</li><li>Mohammadi, A., Mehrzad, J., Mahmoudi, M., Schneider, M., Haghparast, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+culture+and+maturation+on+human+monocyte-derived+dendritic+cell+surface+markers,+necrosis+and+antigen+binding.">Effect of culture and maturation on human monocyte-derived dendritic cell surface markers, necrosis and antigen binding.</a> Biotech Histochem. 90, 445-452 (2015).</li></ol>

All authors disclose no competing financial interests.

단리 인간 혈액으로부터 MDDCs를 생성하는 알려진 문제에 기초하여, 본 연구는 MDDCs의 생성이 잘 확립 된 방법의 포괄적 인 비교를 제공하는 것을 목표로. 비교 첫 번째 방법은 유리 또는 플라스틱 (접착 방법) 21,22,27에 부착 단구의 능력을 이용하여 MDDCs을 생성하는 잘 정립 된 전통적인 방법이다. 접착력 방법은 빠르고 효과적인 비용 및 복잡한 장비의 사용을 요구하지 않는다. 그러나,이 방법의 단점은 림프구 오염, 낮은 유연성, 단핵구 과도 조작 22,30,31를 포함한다. 비교 2 대안 방법에 의해 음성 선별 된 PBMC로부터 단핵구를 분리하기 위해 디자인 된 인간 단핵구 농축 키트 (26)를 사용하여 전체 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로부터 단핵구를 자기 분리한다. 이 분리 방법의 장점은, 원하지 않는 셀이며표지와 표적 세포를 자유롭게 열 직접 항체로 세포를 표적으로하지 않고도 새로운 튜브 속으로 주입하면서 자석을 이용하여 분리된다. 상관없이 단핵 세포 분리 방법 (자기 분리 대 부착) 두 절차 후, 프로토콜 내의 중요한 단계 중 하나는 과립구 대 식세포 콜로니 자극 인자와 단핵 세포의 시험 관내 자극이다 (GM-CSF) 및 인터루킨 -4 ( MDDCs를 생성하는 데 필요한 IL-4). 이 항원 포획 미숙 MDDCs (32)의 처리 능력의 특성을 손상시키지 않고 혈액 단핵 세포에서 MDDCs를 생성하는 공통의 잘 확립 된 프로토콜이다. 일반적으로 수지상 세포의 시험 관내 생성에 사용 된 기술의 주요 한계들 중 하나는 단핵구와 같은 전구 세포의 낮은 수율이다. 위의보고 된 바와 같이, 부착 방법에 의해 고립 된 단핵구는 총 P의 약 6.2 %를 차지골수는 동안 자기 분리에 의해 격리 된 단핵 세포는 PBMC를 최대 25 %를 차지했다. 총 혈액 단핵 세포 (20)의 1 % - DC가 0.1을 구성하면서 10 % 31 - 문헌에 따르면, 2 내지 단핵구 정상 성인의 차등 백혈구위한 범위이다. 따라서, 자기 분리 후의 단핵 세포의 높은 수율 (~ 25 %) 세포 인구 및 원치 않는 세포에 결합하는 항체 및 / 또는 자성 입자의 부족의 불순물로 인해 수 있습니다. 분리 된 단핵 세포의 높은 수율 및 순도를 달성하기 위해, 프로토콜의 모든 중요한 단계 신중 따라야한다. 표준 밀도 구배 원심 분리에 의해 혈액으로부터 PBMC를 단리하는 동안 몇 가지 중요한 단계가있다. 먼저, 피펫 조심스럽게 50 ㎖ 원심 분리 튜브에 밀도 구배 용액 위에 피 레이어링이 용액과 혈액의 혼합을 야기 할 수 가혹 피펫 때문에 연습을 필요로하는 공정이며,이는 분리하기 어렵다 약한 PBMC 층을 초래할 수 있거나, 한 PBMC와 적혈구의 완전한 혼합이 발생할 수있다. 이 단계에서, 혈액의 잘 정의 된 층과 구별 PBMC 층을 가지고 피펫의 일정하고 상대적으로 느린 흐름을 유지하는 것이 중요하다. 둘째, 가속 및 감속 1 0 다음 단계의 원심 분리는 매우 중요하다. 이러한 설정은 제 원심 분리 단계를 사용하지 않는 경우에는 불규칙 밀도 구배 용액과 혈액의 혼합을 초래할 것이고, 혈액 성분의 나머지로부터 분리 된 PBMC를하지 않을 것이다. 적혈구와 함께 가능한 한 PBMC의 감소로 이어질 수 ACK와 이상 배양 이후 - (15 분 10) 셋째, 최적화 된 시간보다 더 이상 버퍼를 용균 암모늄 - 염화 - 칼륨 (ACK)로 PBMC를 품어하는 것이 중요하다 . 또한, ACK 배양 후 PBS 세척을 실시하는 것도 중요하다. 그러나, 적혈구가 제에 용해되지 않으면ACK 단계 및 그들은 여전히 ​​세척 후 계속 표시는 ACK의 용균의 또 다른 라운드는 것이 좋습니다. 백혈구 분리 한 후, 단핵 세포를 생성하는 준수 방법을 수행 할 때 염두에 두어야 할 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 먼저, PBMC를 배양 2 시간 후에 플로팅 림프구를 세척하는 부동 림프구의 존재가 덜 단핵구가 부착시킬 수 있으며, 하부 MDDC 순도 될 수 있기 때문에 매우 중요하다. 이러한 세척 단계가 중요 과도하고 가혹한 세척 있지만 (이상 권장보다, 즉, 두 번)보다 낮은 단핵구 수율의 결과로, 너무 부착 된 단핵 세포를 세척을 일으킬 수 있습니다. 사이토 카인은 MDDCs에 단핵구의 분화에 대한 책임 때문에 둘째, 완전 배지 및 사이토 카인으로 세포를 배양하는 것이 중요합니다. 게다가, 미디어를 변경하고 사이토 매 48 시간 보급하는 세포의 분화 및 생존에 중요. 미디어를 변화시키면서, 상기 부동 MDDCs 저장 및 분화 과정에서 표면으로부터 분리 할 수있는 MDDCs이 있기 때문에 새로운 미디어 및 사이토 카인과 함께 배양 다시 반납하는 것도 중요하다. 단핵구가 권장 농도로 접종 부착하고 성장하기 위해서는 그들이 세포 접촉에 셀을 필요로하기 때문에 근접하게 이격되어 있는지 또한 중요한 확인합니다. 단핵 세포를 생성하는 자기 분리 방법을 수행 할 때, 고 수율 및 고순도의 단핵구를 얻기 위하여 몇 가지 중요한 단계가있다. 첫째, 제조자가 권장하는 세포 농도를 유지하는 것이 중요하다. 자석에 배치 때 낮은 수율과 낮은 순도로 이어질 수 있으므로, 폴리스티렌 튜브를 방해하지에 중요하다. 위에서 제시된 바와 같이, 이러한 기술은, 다른 (C)의 존재에 관련 될 수있는 부착 방법에 비해 상당히 높은 단구 수율 (도 1), 리드ELL 학생. 세포를 유동 세포 계측법에 의해 특징 될 때 또한, 자성에있어서 인해 MDDC의 다른 단계의 존재를 다른 세포의 존재와 상관 관계가 좋고, 또한 수있다 이중 양성 세포 (중 CD11c + / CD14의 +)의 높은 퍼센트를 나타낸다 분화. 무관 수율 및 순도의 체외 MDDC 발생의 또 다른 중요한 측면은 생존 및 증식 MDDCs을 생성하는 능력이다. 본 연구는 문화 칠일 동안 세포 신진 대사 활동의 증가로 도시 된 바와 같이 두 정제 방법은 MDDCs (그림 3)의 증식을 유도을 입증하는 증거를 제공합니다. 또한, 자기 분리에 의해 정제 된 단핵 세포에서 MDDCs의 발생 증식 상당히 높은 레이트가 접착 (도 3)에 의해 정제하여 단핵구로부터 발생 MDDCs 비교 하였다. 이러한 결과는 g을 보여주는 이전 문헌에 따라 아르CD34 + 세포의 수지상의 eneration 인해 인간의 혈액 (27), (33)의 증식 DC 전구 세포의 존재에 증식 과정이다. 그러나, 단핵 세포는 증식 (34, 35)의 증거없이 수지상 세포로 분화 할 수 있음을 보여 논란이 연구 결과가있다. 이 수지상 세포의 시험 관내 생성에 대한 많은 논쟁이되고 수지상 세포가 증식 전구체 또는 단핵 세포의 분화로부터 생성되는지에 관한 것으로 이는 지적 적합하다. 예를 들어, 접착 성 말초 혈액 세포로부터 DC의 시험 관내 생산은 GM-CSF (27)에 노출 된 후에 증식 할 수 있으며 수지상 수율의 존재하에 유도 된 것을 보여주는 증거가 또한 존재 전구 세포 풍부 나타났다 GM-CSF 및 IL-4는 단핵구 (33)의 개시 번호를 넘어 확장 될 수 없다. 전반적으로, 본 연구는이 월의 증식을 증가 보여줍니다칠일에 의해&gt; 70 %의 CD11c + 표현형과 총 MDDCs 인구가 발생할 문화 ocytic 세포 (준수 = 19 ± = 79 % 자기 대 72 % ± 11). 높은 더블 긍정적 인 표현형 (준수 = 49 %로 더 표현형 분석을 수행 할 때, 중요하지 않지만, 자기 분리 방법에 의해 고립 된 단핵구가 MDDCs으로 이어진 자기 = 73 % 대 ± 7의 CD11c + / CD14 + 지적 관련 ± 15의 CD11c + / CD14 +) 접착에 의해 고립 된 단핵구가 높은 하나의 긍정적 인 표현형 (준수 = 23 % 6 % = 자기 ± 7의 CD11c + / CD14-) 대비 ± 7의 CD11c + / CD14-와 MDDCs 결과있다. 높은 하나의 긍정적 인 표현형과 MDDCs 분화의 후반 단계에서 할 수있는 반면 높은 더블 긍정적 인 표현형 (중 CD11c + / CD14의 +)와 MDDCs는 분화의 초기 단계에서 할 수있다. 요약하면, 본 연구는 음의 선택 자기 분리 procedur 것을 지원하기 위해 증거를 제공부착 방법에 의해 고립 된 단핵구와 비교했을 때 단핵구를 분리하는 전자는 단핵 세포 생존 능력에 유의 한 차이 단핵 세포의 가장 높은 수율을 생성합니다. 차례로, 7 일 후에, 자기 분리에 의해 고립 된 단핵구는 MDDC 생존에 영향을주지 않고 상당히 높은 증식 능력과 더블 플러스 (중 CD11c + / CD14 +) 표현형을 발현하는 세포의 높은 양의 MDDCs로 분화. 두 가지 방법을 비교하면, 결과는 동시에 두 가지 방법이&gt; 70 %의 CD11c + MDDCs을 산출하기 때문에 문화에서 7 일 후에하는 CD11c + MDDCs에 (그림 4) (그림 3) 증식 및 분화 할 수있는 단핵 세포를 생성하는 두 가지 기술의 능력을 증명하고있다 . 그러나 성숙 마커를보고 추가 분석이 완전히 기능 MDDC 인구의 특성을 유용 할 수 있습니다. 결론적으로, 두 방법 중 CD11c + MDDCs과 잠의 분리에 유리 대안은연구의 응용 프로그램에 대한 충분한 수율을 IDE, 심지어 미래의 임상 응용 프로그램에 유용 할 수있다. 이 연구소는 현재 MDDC 표현형과 기능을 수정하는 이러한 물질의 특히 능력, 알코올 남용 및 선천성 면역 시스템의 남용의 다른 물질의 효과를 연구하기 위해 MDDCs의 생성에 초점을 맞추고있다. 따라서, 현재의 연구는 MDDC 특성의 기준을 제공하고, 약물 남용과 관련하여 단핵구 유래 수지상 세포 기능을 매개하는 분자 메커니즘을 규명하기 위해 추가 실험을 진행할 수있는 능력을 향상시킬 것이다.

수지상 세포 (DC가)는 타고난 및 적응 면역 시스템의 중요한 매개체이다. 이들은 차 면역 반응을 유도하는 면역 학적 기억의 개발을 용이하게하는 기능을한다. 이러한 세포는 항원을 포획, 마이그레이션 및 T 세포 자극을 주로 담당하므로 수지상 .Manipulation 다른 치료 연구의 다양한 분야에 걸쳐 상기 임상 환경에서 이용 될 수있는 한 같은 전문 항원 제시 세포 (APC를)라고 이러한 HIV 6,7 암 (8)과 같은 염증성 질환,자가 면역 질환 9 및 알레르기 반응 (10). 수지상은 또한 알코올 의존 11-14, 13, 15, 약물 의존성, 및 HIV 감염 및 약물 남용 16-19의 조합과 관련된 것과 같은 미지의 메커니즘 경로를 해결하기 위해 약물 남용 연구에 이용되고있다. 이러한 지속적인 연구와 미래 연구 조사 전n은 면역학 분야의 연구에 매우 중요한 수지상 세포의 체외 세대합니다. 총 혈액 단핵 세포 (20)의 1 % - 그러나, 이들이 0.1를 구성하는 인간 혈액 수지상 세포 분리와 연관된 여러 가지 어려움이있다. 지금까지 DC가 체외의 생성에 대한 확립 된 방법 중 일부는 (22) 자기 활성 셀 정렬, 형광 활성화 된 셀 정렬로 단핵 세포 (21, 22)의 플라스틱이나 유리 준수, 밀도 기울기 원심 분리 (23), 특정 마커 기반의 분리 구성 24, 덱스 트란 코팅 자성 나노 입자 (25), 및 완전 자동화 된 음의 셀 선택 (26)를 사용하여 고순도 단핵 세포의 신속한 분리를 사용하여 CD14 +의 단핵 세포의 긍정적 인 선택. 그러나 선택의 가장 좋은 방법은 논란이 남아있다. 따라서, DC 생성 기술을 개선하기 위해 다양한 방법이있는 개발되어왔다이러한 세포의 순도가 크게 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로부터 단리 정제하여 27 CD34 + 조상 세포 및 단핵 세포의 분화에 의해 증가 될 수있다. 앞서 언급 한 바와 같이, 단핵구 유래 수지상 세포 (MDDCs)을 생성하는 광범위하게 사용되는 대중적인 방법은 유리 또는 플라스틱 (접착 방법) 21,22,27에 부착 단구의 능력을 조사하는 것이다. 접착력 방법은 복잡한 장비의 사용을 요구하지 않고 신속하고 간단한 방법이다. 그러나,이 방법의 단점은 림프구 오염, 낮은 유연성, 단핵구 과도 조작 (28)를 포함한다. 접착력 방법의 대체 방법은 특별히 음성 선별 (26)에 의해 한 PBMC로부터 단핵구를 분리하기 위해 디자인 된 인간 단핵구 보충 키트를 사용하여, 총 한 PBMC로부터 단핵구를 자기 분리한다. 이 절차를 수행하는 동안, 원치 않는 세포는 테트라와 제거를 대상으로항체 복합체 및 덱스 트란 코팅 된 자성 입자. 이 분리 방법의 장점은 원치 않는 표지화 된 세포가 표적 세포를 자유롭게 열 필요없이 새로운 튜브 속으로 주입 될 수 있지만 자석을 이용하여 분리되어 있다는 것이다. 지금까지 고유 한 세포 인구 레이블을 수있는 특정 단일 클론 항체의 가용성, 자기 분리 기술은 추가 방법,하지만 면역학 분야의 희귀 세포의 분리에 대한 필요성 단순히되고있다. 예를 들면, 자기 셀과 같은 기술 연구 및 임상 응용 22,29 새로운 방법의 개발을 용이 한 시판 상자성 나노 입자-MACS 선별. 또한, 단핵구의 부착 및 MACS 기술 방법에서 DC 생성을 비교하는 최근의 연구 조사는 단핵 세포 22,30 분리 MACS를 사용하여 더 높은 DC 순도 및 생존 능력을 증명하고있다. 본 연구의 선물상업용 인간 단핵구 보충 키트를 사용하여 접착 한) 단핵 세포 분리 및 2) 단핵 세포 분리 음성 선별 기준 : PBMC를 분리 인간 단핵구로부터 수지상 세포의 생성에 대한 두 가지 방법의 비교. 이 연구는 부착 방법에 의해 고립 된 단핵구와 비교했을 때 단핵구를 분리 할 수있는 음의 선택 자기 분리 절차는 단핵 세포 생존 능력에 유의 한 차이 단핵 세포의 가장 높은 수율을 생성하는 보여주는 증거를 제공합니다. 차례로, 7 일 후에, 자기 분리에 의해 고립 된 단핵구는 MDDC 생존에 영향을주지 않고 상당히 높은 증식 능력과 더블 플러스 (중 CD11c + / CD14 +) 표현형을 발현하는 세포의 높은 양의 MDDCs로 분화. 그것은 동시에 증식과의 CD11c로 분화 할 수있는 단핵 세포를 생성하는 두 가지 기술의 능력을 입증 때문에 전체적으로 현재 연구 + 위에서 언급 한 선행 연구와 다르다자신의 가능성을 손상시키지 않고 문화 7 일 후에 MDDCs (&gt; 70 %). 또한, 현재의 방법은 유동 세포 계측법 촬상 다를은 CD11c / CD14 MDDCs는 인구의 처음 특성을 제공한다. 수지상은 면역학 분야의 연구에 관한 초점 역할 때문에 이들이 유도 된 어떤 방법은 시험관 내에서 이들을 분리하고 배양하기 위해 사용되는 방법을 고려하면 요약하면, 다른 파라미터가 고려되어야한다. 따라서 본 연구는 두 가지 단핵구 분리 방법 및 방법이 방법은 차등 결국 수지상 세포 생존, 증식 및 단핵구의 표현형에 영향을 생존 및 수율에 영향을 통찰력을 제공하는 것을 목적으로한다. 이러한 발견은 면역학 분야에 크게 기여하고 DC 분리, 정제 및 특성에 대한 상세한 프로토콜을 제공한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1435">
	<tbody>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:535px;">Ficoll-Paque</td>
			<td style="width:228px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:231px;">17-5442-03</td>
			<td style="width:443px;">Must be used at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">ACK Lysing buffer</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>118-156-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">RPMI 1640 medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>22400-089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">RoboSep buffer</td>
			<td>StemCell</td>
			<td>20104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">EasySep Human monocyte enrichment kit</td>
			<td>StemCell</td>
			<td>19059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">TC20 Automated cell counter</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>145-0101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">FITC-Dextran</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>FD4-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">Trypan blue stain (0.4%)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">Synergy 2 multi-mode reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>7131000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">XTT Sodium salt bioreagent (XTT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X4626-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">Dimethyl sulfoxide bioreagent (DMS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8418-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">Thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>m5655-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">Phenazine Methosulfate (DMSO)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9626-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">Inactivated (HI) Human Serum</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>S1-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">Accuri C6 Flow Cytometer</td>
			<td>BD Accuri</td>
			<td>653119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">FlowSight Amnis Flow Cytometer</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>100300</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of human monocyte-derived dendritic cells by imaging flow cytometry: a comparison between two monocyte isolation protocols

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and pathogenesis of inflammation. Isolation and study of DCs have been important in biological research because of their distinctive features. Although they are essential key mediators of the immune system, DCs are very rare in blood, accounting for approximately 0.1 - 1% of total blood mononuclear cells. Therefore, alternatives for isolation methods rely on the differentiation of DCs from monocytes isolated from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The utilization of proper isolation techniques that combine simplicity, affordability, high purity, and high yield of cells is imperative to consider. In the current study, two distinct methods for the generation of DCs will be compared. Monocytes were selected by adherence or negatively enriched using magnetic separation procedure followed by differentiation into DCs with IL-4 and GM-CSF. Monocyte and MDDC viability, proliferation, and phenotype were assessed using viability dyes, MTT assay, and CD11c/ CD14 surface marker analysis by imaging flow cytometry. Although the magnetic separation method yielded a significant higher percentage of monocytes with higher proliferative capacity when compared to the adhesion method, the findings have demonstrated the ability of both techniques to simultaneously generate monocytes that are capable of proliferating and differentiating into viable CD11c+ MDDCs after seven days in culture. Both methods yielded &gt; 70% CD11c+ MDDCs. Therefore, our results provide insights that contribute to the development of reliable methods for isolation and characterization of human DCs.

<html> 자기 분리에 의해 단핵구의 수율은 준수 방법에 의해 단핵구 수익률에 높은를 비교한다 PBMC를하고 단핵 세포의 분리 분리의 날에 트리 판 블루 배제 법에 의해 그림 1 표시 PBMC와 단핵구 세포 수에 제시된 데이터. 자기 분리에 의해 격리 된 단핵 세포는 PBMC를의 최대 25 %를 차지하면서 평균적으로 부착 방법에 의해 고립 된 단핵구는 총 PBMC를 약 6.2 %를 차지했다. 통계 분석은 자기 분리에 의해 산출 단핵 세포의 비율이 상당히 높은 (≥ 4 배)이었다 것으로 나타났습니다. 데이터는 적어도 3 개의 독립적 인 실험의 평균 ± SD로 나타낸다. 두 가지 방법 (0.0005 ≤ p)를 비교했을 때 단핵구 수율의 유의 한 차이를 보였다 -test 학생의 t을 사용하여 통계 분석. 1 &quot;&gt; 단핵구 분리 준수에 의해 자기 분리에 의해 단핵구 생존에 영향을주지 않습니다&quot;유지 - together.within 페이지를 = FO &quot;_content 상술 한 두 가지 다른 기술에 의해 단핵구 분리 후, 생존력 분석법이 사용되는 방법은 세포 독성 및 세포의 생존에 영향을 미치지 않았다되도록 하였다. 이 데이터는도 2에 표시하거나 부착 방식에 의해, 자기 분리에 의해 분리 가능한 단구의 비율의 평균을 제시 하였다. 생존 세포를 분리하는 날에 트리 판 블루 배제 방법을 사용하여 계산 하였다. 두 개의 분리 방법 사이 단핵구의 비교 %의 생존율은 두 그룹 사이의 차이가 통계적으로 유의하지 않았다 것으로 나타났습니다. 또한, 접착에 의해 분리 가능한 단구의 비율의 평균은 1.66 ± 91.75 %이고, 실용적인 단구의 비율의 평균 MAGN 의해 단리etic 분리는 2.75 ± 87.4 %이었다. 이들 생존 데이터는 적어도 3 개의 독립적 인 실험에서 평가되었다. 통계 중요성은 학생의 t-test를 이용하여 측정 하였다. 자기 분리에 의해 격리 된 단핵구 유래 세포는 준수 방법에 의해 획득 단핵구에서 유래 세포에 비해 세포 증식의 상당한 증가를보기 MTT 세포 증식을 측정하는 비색 분석을 사용 하였다. 살아있는 세포에 MTT의 황색 테트라 색상을 쉽게 분광 광도계를 사용하여 측정된다 자주색 포르 마잔으로 환원된다. 0.22 ± 0.02 대 자성 방법 : 0.38 ± 0도 3에 제시된 데이터는 0 일에서의 흡광도 증가 (접착 법에 의해 측정 한 단핵구 분리 모두 처리 7 일의 기간에 걸쳐 높은 세포 증식으로 이어질 것으로 보여0.02), 3 일 (부착 방법 : 0.02 ± 0.28, 자성에있어서 0.55 ± 0.05), 7 일 (부착 방법 : 0.36 ± 0.01, 0.66 ± 자기 = 0.006). 그러나, XTT 분석 달리 (데이터 미도시)에서, MTT 분석은 0 일째 (p = 0.003), 제 3 일에 접착 방식에 의해 취득 된 단핵구로부터 MDDCs에 비해 자기 ​​분리에 의해 단리 단핵구로부터 MDDCs의 세포 증식에 ​​상당한 증가를 보여 (P = 0.006)과 7 일 (p = 0.002). 세포 증식은 일 0, 3 (P = 0.003) 사이의 유의 한 차이 것으로 확인하고, 일 0 단핵 세포에서 MDDCs의 그룹 내 7 (P &lt;0.001) 사이에 자기 분리를 통해 정제 하였다. 또한, (P = 0.008)로 정제 부착 단핵구에서 0 일 및 7 일에 MDDCs 간 세포의 증식에 유의 한 차이가 관찰되었다. MTT 분석은 세 가지 실험으로부터 얻은 MDDCs를 사용하여 수행 하였다. 통계적 유의성 승 0.05 ≤ ANOVA와 학생의 t-test를, 페이지를 사용하여 측정 하였다중요한 고려으로 유의 한 차이가 발견되지 않는 한, 및 P 값은 그래프에 설명되어 있습니다. 중 CD11c 및 CD14 세포 표면 염색에 의한 MDDCs의 특성 IL-4와 GM-CSF와 7 일 동안 단핵 세포를 배양 한 후, MDDCs가 준수 및 자기 분리 방법에 의해 고립 된 단핵 세포에서 얻은 그림 4 특징으로했다. 특성화는 두 가지 방법 낮은 단일 CD14 + / CD11c- 표현형 또는 순수 단핵구 인구를 밝혀, 0.0 높은 총의 CD11c + 표현형, 준수 = 72 % ± 1 = 자기 % 대 1.0 ± 준수는 = ± 1 % (19) 그러나, 총 CD14 + 인구가 추가로 분석했을 때, 높은 수율이 있었다 = 79 % 자기 대비 ± 11 중 CD11c 긍정적 인 더블 CD14의 높은 수를 나타내는 자기 분리와 두 방법에서의 CD11c과 CD14에 대한 이중 양성 세포인구 접착력 방법에 비해, 준수 = 49 % 자기 대 ± 7 = 73 % ±, MDDCs의 자기 분리, 긍정적 중 CD11c 및 CD14 부정적인 인구를 통해 이중 긍정적 인 표현형과 MDDCs의 높은 수율이 높은이었다 15. 있지만 접착력 방법에있어서; 도 4b에서 ± 7, 각각의 마커의 평균 형광 강도 (MFI)가 문이 인구를 보았고, CD14 + 인구에서 CD14의 높은 강도를 보였다 = 6 % 자기 대비 ± 7 준수 = 23 %, 모두 동등한 강도 이중 긍정적 인 인구의 CD11c + 및 CD14- 인구에서 높은하는 CD11c 강도의 CD11c 및 CD14. 요약하면, 자기 분리 아직 단핵구 마커 (CD14)를 적하하지 않은 초기 분화 MDDCs 수있다하는 CD11c + / CD14 + 세포의 높은 비율을 제공에도 부착 방법은 + / CD14-, CD11c 양성의 높은 비율을 제공하는 MDDC 인구 차별화 늦은 단계 일 수있다. 되어온에서이온은 DAPI 염색은 생존 결과를 확인하고 특성이 살아있는 MDDCs에서 수행되었다 있도록 하였다. DAPI 음 / 살아있는 세포의 비율 (준수 = 67 ± 1 = 자기 대 76 ± 7)없는 문화 칠일 후에 MDDCs의 생존에 영향을 미치지 않는 두 가지 방법을 확인하는 두 가지 방법 사이에 유의 한 차이가 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54296/54296fig1.jpg" /> 자기 분리에 의해도 1 단핵구 수율 준수 방법에 의해 단핵구 수득 이상 비교된다. 단핵구의 약 6.2 %가 ~ 단핵구의 25 %는 자기 분리 방법을 사용하여 수득 하였다 동안 부착 방법을 사용하여 PBMC를 분리 하였다. 데이터는 적어도 3 개의 독립적 인 실험의 평균 ± SD로 나타낸다. 두 가지 방법을 비교했을 때 통계 분석을 사용하여 학생의 t-테스트는 단핵 세포 수율의 유의 한 차이를 보였다(P = 0 00005). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54296/54296fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54296/54296fig2.jpg" /> 단핵구 분리 준수에 의해 및 자기 분리에 의해 그림 2. 단핵구 생존에 영향을주지 않습니다. 준수하여 분리 가능한 단핵 세포의 비율의 평균은 1.66 ± 91.75 %이었고 자기 분리에 의해 분리 가능한 단핵 세포의 비율의 평균이었다 87.4 % ± 2.75. 데이터는 적어도 3 개의 독립적 인 실험의 생존 세포의 평균 ± SD 퍼센트로 표현된다. 모두 정제 방법을 비교할 때 유의 한 차이가 세포 생존에 관찰되지 않았다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54296/54296fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <html><img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54296/54296fig3.jpg" /> 자기 분리에 의해 격리 된 단핵구에서 유래 그림 3. 세포 준수 방법에 의해 단핵구 획득 유래 세포에 비해 세포 증식의 상당한 증가를 표시합니다. 흡광도의 상당한 증가는 모두 3 일 및 7 일에 두 방법 모두에서 관찰 된 값을 비교할 때 두 가지 방법 (0.05 ≤ p)를 비교할 때 또한 일 0의 각각의 컨트롤에 대해, ANOVA와 학생의 t 테스트는 MTT 흡수의 흡광도에서 유의 한 차이를 보였다. 데이터는 3 개의 독립적 인 실험의 평균 ± SD로 표현된다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54296/54296fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 96 / 54296fig4.jpg &quot;/&gt; 다른 집단 (단일 세포에서 문 %)을 대표하는 CD11c 및 CD14 세포 표면 염색. A) 막대 그래프로 MDDCs 그림 4. 특성. 첫째, DAPI- (살아) 세포는 총 단일 세포 게이트 하였다. 그런 다음, CD14 + / CD11c-, 중 CD11c +를, 중 CD11c + / CD14 +와의 CD11c + / CD14-는 DAPI- (살아) 인구에서 문이되었다. 중 CD11c + 인구는 라벨이 지역의 CD11c + / CD14 +와의 CD11c + / CD14-. B) 세포의 모든 모집단. C) 세포의 대표 산포도에서의 CD11c과 CD14 모두 평균 형광 강도 (MFI) 값을 보여주는 대표적인 그래프의 요약입니다 자기와 부착 방법 모두 DAPI 마이너스 (살아) 세포 인구에 게이트의 CD11c-APC 및 CD14-APCcy7와. 게이트 셀의 각 하위 집단에 속하는 (캐터 플롯에서 파란색에서 선택) 단일 세포의 대표 이미지 갤러리, 중 CD11c + / CD14- (주황색 문)의 CD11c + / CD14 + (빨간색)과 CD14 + () 보라색 문. 단일 세포의 이미지 갤러리에서 붉은 색의 CD11c이 APC로 표지과 노란색 컬러가 APCcy7으로 표시 CD14를 나타냄. 스 캐터 플롯에서 인구 게이트에 선택한 색상은 랜덤이며, 실제 셀 이미지에 상관하지 않습니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54296/54296fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

This study compares two different methods of human monocyte isolation for obtaining in vitro dendritic cells (DCs). Monocytes are selected by adherence or negatively enriched by magnetic separation. Monocyte yield and viability along with MDDC viability, proliferation and CD11c/CD14 surface marker expression will be compared between both methods.

이미징 유동 세포 계측법에 의해 인간 단핵구 유래 수지상 세포의 특성 : 두 단핵구 격리 프로토콜 사이의 비교

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.4K 조회수.  Florida International University. This study compares two different methods of human monocyte isolation for obtaining in vitro dendritic cells (DCs). Monocytes are selected by adherence or negatively enriched by magnetic separation. Monocyte yield and viability along with MDDC viability, proliferation and CD11c/CD14 surface marker expression will be compared between both methods.

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Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue remodeling and repair, and virologic control1,2 . Interleukin-1&#946; is an essential element of the innate immune response and contributes to eliminate invading pathogens while preventing the establishment of persistent infection1-5.
Inflammasomes are the key signaling platform for the activation of interleukin 1 converting enzyme (ICE or Caspase-1). The NLRP3 inflammasome requires at least two signals in DCs to cause IL-1&#946; secretion6. Pro-IL-1&#946; protein expression is limited in resting cells; therefore a priming signal is required for IL-1&#946; transcription and protein expression. A second signal sensed by NLRP3 results in the formation of the multi-protein NLRP3 inflammasome. The ability of dendritic cells to respond to the signals required for IL-1&#946; secretion can be tested using a synthetic purine, R848, which is sensed by TLR8 in human monocyte derived dendritic cells&#160;(moDCs) to prime cells, followed by activation of the NLRP3 inflammasome with the bacterial toxin and potassium ionophore, nigericin.
Monocyte derived DCs&#160;are easily produced in culture and provide significantly more cells than purified human myeloid DCs. The method presented here differs from other inflammasome assays in that it uses in vitro human, instead of mouse derived, DCs thus allowing for the study of the inflammasome in human disease and infection.

Dendritic cells (DCs)&#160;secrete IL-1&#946; in response to TLR8 recognition of synthetic purine, R848, followed by NLRP3 inflammasome activation with nigericin, therefore, IL-1&#946; can be used to measure NLRP3 inflammasome activity. Intracellular cytokine staining, immunoblotting, and ELISA are used to accurately measure NLRP3 inflammasome priming and activation via IL-1&#946; expression.

활성화 및 인간 단핵구 유래 수지상 세포에서 IL-1β를 사용하여 NLRP3 inflammasome을 활동의 측정

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

연구

면역학 및 감염병학

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation of experiments, fresh or frozen monocytes are cultured in flasks for 1 week with M-CSF to induce their differentiation into macrophages. Then, the macrophages can be harvested and seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments. The use of defined numbers of macrophages rather than defined numbers of monocytes to initiate macrophage cultures for experiments yields macrophage cultures in which the desired cell density can be more consistently attained. Use of cryopreserved monocytes reduces dependency on donor availability and produces more homogeneous macrophage cultures.

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. The protocol utilizes cryopreservation of monocytes coupled with their bulk differentiation into macrophages. Then harvested macrophages can then be seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments.

대 식세포 콜로니 자극 인자 차별화 된 인간 단핵구 유래 대 식세포의 문화

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

마우스 골수에서 형질 수지상 세포의 정화를위한 형광 활성화 셀 정렬

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity. 
The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to na&#239;ve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.

Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.

전혈로부터 인간 단핵구 유래 수지상 세포의 생성

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main macrophage populations in the CNS: (i) the microglia, which are the resident macrophages of the CNS and are derived from yolk sac progenitors during embryogenesis, and (ii) the monocyte-derived macrophages (MDM), which can infiltrate the CNS during disease and are derived from bone marrow progenitors. The roles of each macrophage subpopulation differ depending on the pathology being studied. Furthermore, there is no consensus on the histological markers or the distinguishing criteria used for these macrophage subpopulations. However, the analysis of the expression profiles of the CD11b and CD45 markers by flow cytometry allows us to distinguish the microglia (CD11b+CD45med) from the MDM (CD11b+CD45high). In this protocol, we show that the density gradient centrifugation and the flow cytometry analysis can be used to characterize these CNS macrophage subpopulations, and to study several markers of interest expressed by these cells as we recently published. Thus, this technique can further our understanding of the role of macrophages in mouse models of neurological diseases and can also be used to evaluate drug effects on these cells.

This protocol provides an analysis of the macrophage subpopulations in the adult mouse central nervous system by flow cytometry and is helpful for the study of multiple markers expressed by these cells.

유동 세포 계측법에 의한 중추 신경계에서 유래 된 대장 세포 및 단구 세포 유래 대 식세포의 분석

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

고립과 Murine 인간과 치경 대 식 세포의 생체 외에서 문화

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can have pathological significance. An ideal method for examining alterations to monocytes is whole blood flow cytometry as the minimal handling of samples by this method limits artifactual cell activation. However, many different approaches are taken to gate the monocyte subsets leading to inconsistent identification of the subsets between studies. Here we demonstrate a method using whole blood flow cytometry to identify and characterize human monocyte subsets (classical, intermediate, and non-classical). We outline how to prepare the blood samples for flow cytometry, gate the subsets (ensure contaminating cells have been removed), and determine monocyte subset expression of surface markers &#8212; in this example M1 and M2 markers. This protocol can be extended to other studies that require a standard gating method for assessing monocyte subset proportions and monocyte subset expression of other functional markers.

Here we present a protocol for characterizing monocyte subsets by whole blood flow cytometry. This includes outlining how to gate the subsets and assess their expression of surface markers and giving an example of the assessment of the expression of M1 (inflammatory) and M2 markers (anti-inflammatory).

전체 혈액에 의해 인간 Monocyte 하위 집합의 Flow Cytometry 분석

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Quantification of Monocyte Chemotactic Activity In Vivo and Characterization of Blood Monocyte Derived Macrophages

Tissue homeostasis and repair are critically dependent on the recruitment of monocyte-derived macrophages. Both under- and over-recruitment of monocyte-derived macrophages can impair wound healing. We showed that high fat and high sugar diets promote monocyte priming and dysfunction, converting healthy blood monocytes into a hyper chemotactic phenotype poised to differentiate into macrophages with dysregulated activation profiles and impaired phenotypic plasticity. The over-recruitment of monocyte-derived macrophages and recruitment of macrophages with dysregulated activation profiles is believed to be a major contributor to the development of chronic inflammatory diseases associated with metabolic disorders, including atherosclerosis and obesity. The goal of this protocol is to quantify the chemotactic activity of blood monocytes as a biomarker for monocyte priming and dysfunction and to characterize the macrophage phenotype blood monocytes are poised to differentiate into in these mouse models. Using single cell Western blot analysis, we show that after 24 h 33%of cells recruited into MCP-1-loaded basement membrane-derived gel plugs injected into mice are monocytes and macrophages; 58% after day 3. However, on day 5, monocyte and macrophage numbers were significantly decreased. Finally, we show that this assays also allows for the isolation of live macrophages from the surgically retrieved basement membrane-derived gel plugs, which can then be subjected to subsequent characterization by single cell Western blot analysis.

Here we present a protocol to quantify the chemotactic activity of blood monocytes in mouse models, to assess the effects of nutritional, pharmacological and genetic interventions on blood monocyte and to characterize the blood monocytes derived macrophages in mouse models using monocyte-chemoattractant protein-1 (MCP-1)-loaded basement membrane-derived gel plugs.

생체 내에서 단핵구 화학 적 활동의 정량화 및 혈액 단핵구 유래 대식세포의 특성화

Tissue homeostasis and repair are critically dependent on the recruitment of monocyte-derived macrophages. Both under- and over-recruitment of ...

siRNA Electroporation to Modulate Autophagy in Herpes Simplex Virus Type 1-Infected Monocyte-Derived Dendritic Cells

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) induces autophagy in both, immature dendritic cells (iDCs) as well as mature dendritic cells (mDCs), whereas autophagic flux is only observed in iDCs. To gain mechanistic insights, we developed efficient strategies to interfere with HSV-1-induced autophagic turnover. An inhibitor-based strategy, to modulate HSV-1-induced autophagy, constitutes the first choice, since it is an easy and fast method. To circumvent potential unspecific off-target effects of such compounds, we developed an alternative siRNA-based strategy, to modulate autophagic turnover in iDCs upon HSV-1 infection. Indeed, electroporation of iDCs with FIP200-specific siRNA prior to HSV-1 infection is a very specific and successful method to ablate FIP200 protein expression and thereby to inhibit autophagic flux. Both presented methods result in the efficient inhibition of HSV-1-induced autophagic turnover in iDCs, whereby the siRNA-based technique is more target specific. An additional siRNA-based approach was developed to selectively silence the protein expression of KIF1B and KIF2A, facilitating autophagic turnover upon HSV-1 infection in mDCs. In conclusion, the technique of siRNA electroporation represents a promising strategy, to selectively ablate the expression of distinct proteins and to analyze their influence upon an HSV-1 infection.

In this study, we present inhibitor- and siRNA-based strategies to interfere with autophagic flux in Herpes simplex virus type-1 (HSV-1)-infected monocyte-derived dendritic cells.

siRNA 전기 포진 포진 심플렉스 바이러스 유형 1-감염 단핵구 파생 수지상 세포에서 자가 포식을 조절

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) induces autophagy in both, immature dendritic cells (iDCs) as well as mature dendritic cells (mDCs), whereas ...

In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

The release of extracellular traps (ETs) by neutrophils has been identified as a contributing factor to the development of diseases related to chronic inflammation. Neutrophil ETs (NETs) consist of a mesh of DNA, histone proteins, and various granule proteins (i.e., myeloperoxidase, elastase, and cathepsin G). Other immune cells, including macrophages, can also produce ETs; however, to what extent this occurs in vivo and whether macrophage extracellular traps (METs) play a role in pathological mechanisms has not been examined in detail. To better understand the role of METs in inflammatory pathologies, a protocol was developed for visualizing MET release from primary human macrophages in vitro, which can also be exploited in immunofluorescence experiments. This allows further characterization of these structures and their comparison to ETs released from neutrophils. Human monocyte-derived macrophages (HMDM) produce METs upon exposure to different inflammatory stimuli following differentiation to the M1 pro-inflammatory phenotype. The release of METs can be visualized by microscopy using a green fluorescent nucleic acid stain that is impermeant to live cells (e.g., SYTOX green). Use of freshly isolated primary macrophages, such as HMDM, is advantageous in modeling in vivo inflammatory events that are relevant to potential clinical applications. This protocol can also be used to study MET release from human monocyte cell lines (e.g., THP-1) following differentiation into macrophages with phorbol myristate acetate or other macrophage cell lines (e.g., the murine macrophage-like J774A.1 cells).

Presented here is a protocol to detect macrophage extracellular trap (MET) production in live cell culture using microscopy and fluorescence staining. This protocol can be further extended to examine specific MET protein markers by immunofluorescence staining.

분화 한 인간 단핵구 유래 대식세포에서 세포 외 트랩 방출의 시험관 내 자극 및 시각화

The release of extracellular traps (ETs) by neutrophils has been identified as a contributing factor to the development of diseases related to chronic ...