이 작품은 MLB, BCM에서 당뇨병 연구 센터 (P30-DK079638)의 파일럿 / 타당성 프로그램, JDRF 1-FAC-2014-243-APF, ADA에 NIH (5K22A1119151-01 및 1R56DK104903-01)에서 보조금에 의해 지원되었다 1-15-JF-07, 면역학 MB에 친목, 그리고 로버트와 제니스 맥 네어 재단 AAI 채용.

윤리 정책 : 모든 노력이 조사와 꼬리 정맥 주사시 최소한으로 동물의 불편이나 스트레스를 유지한다. 마우스는 실험에서 세포의 공급원으로서 사용된다; 같은 어떠한 절차 나 조작은 안락사 따로 없습니다. 마우스는 죽음을 확인하기 위해 자궁 경부 전위 다음 CO 2 흡입에 의해 안락사됩니다. 이 절차는 미국 수의학 협회의 안락사에 대한 패널의 권고와 일치한다. 1. 레트로 바이러스가 구축 준비 <ol><li> 서브 클론 T 세포 수용체 (TCR) 알파 및 베타 사슬하는 MSCV 계 11 레트로 바이러스 벡터 (예 pMIAII 또는 pMIGII) (11)로하는 2A 링커에 의해 분리된다. 참고 : 2A 링커는 단일 오픈 리딩 프레임의 알파와 베타 TCR 체인의 화학 양론과 조화 된 표현이 가능합니다. 벡터는 사용하는 IRES 형광 단백질 카세트 (ametrine 또는 GFP)을 포함형질 도입 된 세포 및 형질 도입 효율을 추적. 자세한 프로토콜에 대한 홀스트 등을 참조하시기 바랍니다. (11) </li><li> 상업적으로 얻은 플라즈마 준비 키트 또는 유사한 제품을 사용하여 플라스미드 DNA를 분리합니다. 하나의 작업 농도 사용 - 2 μg의 μl를 -1. </li></ol> 레트로 바이러스 생산자 세포주의 2 세대 <ol><li> 레트로 바이러스 생산 세포주를 생성하기 위하여 두 단계의 과정을 이용한다. 참고 :. 자세한 프로토콜은, 홀스트 등 (11)을 참조하시기 바랍니다. <ol><li> 세 플라스미드 (pVSVG, PEQ-Pam3 (-E) 및이자 (11)의 벡터) 293T 세포의 과도 형질 전환에 의해 레트로 바이러스를 생성하고, GP + E86 ecotropic 레트로 바이러스 생산 세포주를 형질 도입 할 293T 세포에서 레트로 바이러스 상등액을. </li><li> FACS에 의해 형광 발현 GP + E86 프로듀서 세포의 상위 40 %를 분리하고 바이러스의 소스로 transdcuced-GP + E86 생산 세포를 전파. 참고 : 생성고역가의 생산자들은 골수 세포의 효율적인 형질 도입 중요하다. 완전한 프로토콜 홀스트 등을 참조하시기 바랍니다. (11) </li></ol></li></ol> 3. 레트로 바이러스 매개 줄기 세포 유전자 전송 (일 -5) <ol><li> 10 % (부피 / 권) FBS이 프로토콜의 일 0으로이 합류 150 mm 플레이트 충분한 성장을 할 수 있도록 밖으로 해동하고 완전한 DMEM의 각 GP + E86 생산 세포주의 배양 0.5 -1.0 × 10 (6). 참고 : 해동 0.5 - 또한 GP + E86를 확장하기 위해 문화의 오일을 허용이 날 5에서 50 % 컨 플루 - 10cm의 플레이트의 각 GP + E86 생산 세포주의 1.0 × 10 6 30 수 일 0으로이 합류 150 mm 플레이트에 생산​​ 세포주. <ol><li> 5 % 태아 송아지 혈청 및 마이코 플라스마 오염을 방지 할 시프로플록사신 (10 μg의 / ㎖)을 포함하는 전체 조직 배양 배지에서 배양 레트로 바이러스 생산 세포주. 참고 : generatin 때 시프로플록사신의 사용을 중지g 골수 전달의 바이러스 상층 액. 이 부정적인 골수 전달 효율에 영향 바와 같이, 생산자 세포주의 과다 성장을 피한다. </li></ol></li></ol> 5- 플루오로 우라실 (5-FU) (주 -3) 4.를 주입 기증자 마우스 <ol><li> 요구되는 5-FU의 양을 결정하기 위해 - (12 주 이전 5) 도너 마우스 무게. 낮은 골수 수율 나이 결과 오주 미만의 마우스를 사용. 단일 TCR의 발현을 보장하기 위해, 같은 SCID, RAG 또는 TCR 알파 골수 기증자로 결핍 마우스로 T 세포 결핍 마우스의 피로를 사용합니다. </li><li> 조직 배양 후드에서 작동하는 10 밀리그램 ml의 충분한 양 -1 체중 g 당 0.15 mg의 5-FU를 전달하는 5-FU의 작업 용액을 만들기 위해 멸균 PBS로 5-FU 스톡을 희석. </li><li> 37 G 바늘 1 mL를 주사기를 사용하여, 복강 공여자 마우스 당 체중 g 당 0.15 mg의 5-FU를 주입. 참고 :받는 사람 당 사용 1 기증자 마우스 시작하고 조정셀 수율에 따라 기증자 마우스의 수. 골수 전구 세포의 농축 및 분리에 대한 5-FU 처리하는 다른 방법은 Viret 등의 알에 기재된 리니지 양성 세포의 네거티브 선택이다. </li></ol> 5. 골수 추출 절차 (일 0) <ol><li> 뼈 격리를 위해 해부 가위와 집게를 가져옵니다. 50 ML 원뿔 튜브에 뼈를 수집 미디어 (HBSS 5 % FCS (부피 /의 부피와 보충)) 준비합니다. 얼음에 미디어를 포함하는 50 ML 원뿔을 유지합니다. CO에 의해 죽음을 확인하기 위해 자궁 경부 전위 다음 2 흡입 쥐를 안락사. 더 반사가 감지되지 보장하기 위해 발을 꼬집어. </li><li> 수술 부위와 에탄올 또는 메탄올과 수술 도구를 소독. 먼저 절단 및 골반 거들에 따라 신중하게 대퇴골, 경골, 상완골, 골반 거들을 제거합니다. 다시 아래 경골의 대퇴골을 따라 잘라. 깨끗한 뼈를 얻기 위해 가위와 집게를 사용하여 모든 주변 조직을 제거합니다. 유지HBSS + 5 % (부피 / 부피의) FBS 수화 뼈. </li><li> 모두 각각의 뼈를 종료 잘라 확인하고, 관절에서 절단하여 뼈를 분리합니다. HBSS + 5 % (부피 / 부피)를 포함하는 10 ML의 주사기 FBS에 부착 된 25 게이지 바늘을 삽입합니다. 압력을 적용하고 50 ML 원뿔에서 70 μm의 여과기 휴식을 통해 모든 골수를 세척합니다. </li><li> 주기적으로, 1 mL의 3 mL의 주사기의 플런저를 사용하여 70 ㎛의 필터를 통해 골수를 누른다. HBSS + 5 % (부피 / 권) FBS와 스트레이너를 씻어. 이것은 뼈 조각 및 조직이 없도록 단일 세포 현탁액을 보장한다. 멸균 후드의 절차를 수행하여 무균 세포를 유지합니다. </li><li> 4 ℃에서 10 분 동안 300 XG에 원심 분리기 골수 세포. </li></ol> 6. 골수 문화 (0 일) <ol><li> 캔트 또는 흡인 미디어 50 ML 원뿔 튜브 당 1 ml의 염화 암모늄을 기반으로 적혈구 용해 버퍼 (또는 RBC 용해 버퍼 상당)에 재현 탁 세포 펠렛. 룸에서 1 분 배양 후온도는 완전 DMEM 20 % (부피 / 부피) 10 ml의 FBS를 첨가하여 적혈구 용해 완충액을 해소. </li><li> 4 ℃에서 10 분 동안 300 XG에 원심 분리기 세포. </li><li> 가만히 따르다 5 ml의 완전한 DMEM 20 % (부피 / 부피) FBS의 대기음 뜨는 및 재현 탁 골수. 노이 바 우어 계산 챔버와 세포를 계산합니다. 참고 : 일반 수율이 있어야합니다 약 5 - 마우스 당 × 10 6 셀 (10); 그러나, 수율은 쥐의 다른 변종에 따라 다를 수 있습니다. </li><li> IL-3이 보충 된 완전 DMEM 20 % (부피 / 부피) FBS 30 mL를 150-mm 플레이트 당 4 × 107 세포의 밀도로 접시의 골수 세포 (20g 용액 1), IL-6 (50 g ml의 1) 및 SCF (50g ml의 1). 참고 : 갓 해동-분주 사이토 카인을 사용합니다. 2 주 이상 4 ° C에서 냉동 번 이상 해동 또는 보관 된 사이토 카인을 사용하지 마십시오. </li><li> 5 % CO 2, 37 ℃에서 밤새 골수 (약 24 시간)을 인큐베이션. </li></ol><ol><li> 플레이트 18 ml의 완전한 DMEM 20 % (부피 / 권) FBS에서 150 mm 플레이트 당 3 × 10 6 레트로 바이러스 생산 세포. </li><li> 하룻밤 37 ° C에서 레트로 바이러스 생산 세포를 품어. (- 3 기증자 마우스 약 2) 15000000 골수 세포에 대해 하나의 150-mm 판을 기대하고 있습니다. </li></ol> 8. 레트로 바이러스 상층 액 (1 일) <ol><li> 다음날 (약 24 시간 이상), 10 ml의 주사기와 필터는 0.45를 이용하여 150 mm 플레이트에서 직접 레트로 바이러스 상등액을 그림으로써 (7 단계에서 설정) 생산자 판에서 레트로 바이러스 뜨는을 수확 -μm 주사기 필터. </li><li> 조심스럽게 신선한 완전한 DMEM 20 % (부피 / 부피) FBS 18 ㎖로 제거 된 레트로 바이러스 뜨는을 교체합니다. </li><li> (g ml의 -1 20) IL-6 (50g ml의 1), MSCF (50g ml의 1) 및 Hexadimethrine 브로마이드 (폴리 브렌) (6을 IL-3 필터링 된 레트로 바이러스 상층 액을 보충# 956; g ml의 1). 주 : Hexadimethrine 브로마이드 레트로 바이러스 형질 도입의 효율의 저하를 방지하기 위해 2 개월마다 신선한하여야한다. </li></ol> 9. 골수 수확 (1 일) <ol><li> 단계 8.3를 완료 한 후, 단계 6.4로부터의 골수 세포를 수확하고 멸균 된 50 ㎖의 튜브에 비 부착 세포를 포함하는 미디어 전송. </li><li> 10 ml의 PBS에 적극적으로 접시를 씻으 단계 9.1에서 50 ML 원뿔에서 수집합니다. 필요한 경우, 세척 공정을 반복한다. </li><li> 원심 분리기는 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG에 세포가 뜨는을 가만히 따르다, 작은 볼륨에 resuspend 세포 (1-3 ml)을 완료 DMEM 20 % (부피 / 부피) FBS, 그리고 계산합니다. 사이토 카인 및 Hexadimethrine 브로마이드를 함유하는 레트로 바이러스 상층 액 1 ㎖ 당 1 × 106 세포로 재현 탁 0 일 골수 75 % 복구 - 50 예상된다. </li></ol> 10. 골수 형질 도입 (1 일) <ol><li> 레트로 바이러스 상등액 / 뼈 엄마 플레이트여섯 웰 조직 배양 플레이트에 웰 당 3 ㎖의 부피에서 rrow 혼합물. 단계 10.2에서 원심 분리 동안 가스 교환을 최소화하기 위해 플라스틱 포장의 판을 바꿈. </li><li> 60 분 37 ° C 1,000 XG에서 랩 여섯 웰 플레이트 스핀. </li><li> 스핀가 완료되면 플라스틱 포장을 제거하고 24 시간 동안 37 ° C CO 2 배양기에서 접시를 놓습니다. </li></ol> (11) 레트로 바이러스 뜨는 및 형질 도입 (2 일) <ol><li> 24 시간 후, 바이러스 생산 세포주에서 신선한 바이러스 상층 액을 수집합니다. 10 mL의 주사기와 0.45 μm의 주사기 필터를 사용하여 레트로 바이러스 상등액을 필터. IL-3 필터링 된 레트로 바이러스 상층 액 (용액 20g-1), IL-6 (50g 용액 -1) 및 SCF 보충 (50g 용액 -1) 및 Hexadimethrine 브로마이드 (6g 용액 1). </li><li> 다음, 조심스럽게 피펫으로 제거하거나 골수 세포를 포함하는 6 웰 플레이트의 각 웰로부터 매체의 상단이 용액을 흡인. 주 : 작업은 신중 보통 웰의 중앙에 집중되어 골수를 대기음 없다. 이와 달리, 제거 된 상등액을 어떤 손실 골수 세포를 회수하기 위해 스핀 다운된다. </li><li> 잘 골수 6 웰 플레이트의 각에 신선한 바이러스 상층 액을 포함하는 사이토 카인 및 Hexadimethrine 브로마이드 3 ㎖를 추가합니다. 플라스틱 접시를 감싸, 60 분, 37 ° C를 1,000 XG에서 스핀 전달을 반복합니다. 접시를 풀다, 37 ° C, 5 % CO 2 밤새 (약 24 시간)에서 세포를 배양한다. </li></ol> 신선한 보충 DMEM의 12 추가 (3 일) <ol><li> 24 시간 후, 단계 11.2에서와 골수 세포를 포함하는 6 웰 플레이트의 각 웰로부터 매체의 상단이 용액을 제거한다. (g ml의 -1 50) IL-3의 최종 농도로 보충 신선한 DMEM 20 % (부피 / 부피) FBS와 (20g ml의 -1) 제거 된 미디어를 교체, IL-6 (50 g ml의 1) 및 SCF . </li><li> 골수를 품어또 다른 24 시간 동안 37 ° C CO 2 배양기에서 접시. </li></ol> 13. 수확 형질 골수 (4 일) <ol><li> 24 시간 후에, 6- 웰 플레이트에서 골수 세포를 수집한다. 모든 비 부착 세포를 제거하기 위해 PBS에 격렬 판을 씻는다. <ol><li> 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG에 세포를 원심 분리기와 뜨는을 가만히 따르다. </li><li> PBS + 0.5 % (부피 / 부피)의 소량 (1 mL) 중 골수 열 - 불 활성화 FBS를 재현 탁. 얼음에 세포를 유지합니다. </li></ol></li><li> 각 골수 조건의 10 μL 샘플을 채취하고 노이 바 우어 계산 챔버를 사용하여 세포를 계산합니다. 1 가정 -받는 사람 당 2 기증자, 수율은받는 사람 마우스 당 최소 4 × 10 6 세포를 전송하기에 충분합니다. 마우스 당 300 μL - 200에 주입하는 PBS + 0.5 % (vol / vol) 열 활성화 된 FBS 충분한 양의 골수 재현 탁. <ol><li> 전달 효율을 갖는 적어도 2 × 106 세포를 주입25 %의 정맥 마우스 당 (8 X10 6 셀을 삽입 할 수 있습니다). 참고 : 우리는 일상적으로 골수 세포의 두 6 웰 플레이트에 5받는 사람 쥐를 주입. 수율이 실질적으로 낮은 경우 충분한 골수 수가 얻어 질 때까지 더 공여 마우스는 사용되어야한다. 최적의 재구성을 달성하기 위해, 적어도 5 × 5는 형질 도입 (양의 형광체)를 각 수신자에 주입한다. </li></ol></li><li> 마이크로 피펫으로, 각각의 골수 조건의 10 μl의 샘플을 채취하여 형광 마커 (그림 1A) (11)의 발현에 따라 유동 세포 계측법에 의해 전달 효율을 분석 할 수 있습니다. 주 : 일반적으로, 형광 양성 세포의 비율은 구조 및 레트로 바이러스 역가에 따라 25 %에서 70 % 사이이다. 필요한 형질 도입 골수 세포의 수는 서브 - 치명적 조사하는 마우스 전달 효율에 따라 달라질 수 재구성. 트란 낮은sduction 효율이보다 골수 세포를 요구하고, 반대로 골수 전달 효율이 높아 세포의 낮은 숫자는 재구성에 필요한. 25 % 아래의 전달 효율이 최적이며, 부족 재구성과 생존의 원인이 될 수 있습니다. 최적 골수 회복 전달 효율을 확보하기 위해, 새로 제조 된 조직 배양 배지 및 사이토 카인을 사용한다. retrogenic 체계를 이용하여 새로운 TCR을 발현 할 때, 생체 내에서 그 TCR의 선택은 알려져 있지 않다. 개별 TCR의 친화도에 따라 흉선 및 말초 T 세포 발현 TCR 선택 17 달라진다. </li></ol> 14. 마우스 조사, 골수 주입 및 관리 <ol><li> 쥐에게 골수 주입 전날 (13 단계로 당일)을 조사. 다음 용량 사용 C57BL / 6 마우스 (및 기타 야생형 균주), 900 래드, Rag1을 - / - 마우스, 500 래드; SCID 마우스, 300 래드). <ol><li> 아목시실린에 배치받는 사람 마우스 (50 ㎎ / ㎏ / 일) 또는 조사 전에 다른 항생제 물 처리, 골수 주입 후 첫 2 주 동안 항생제를 계속. 주 : 최적의 조사량은 경험적으로 결정될 수있다. </li></ol></li><li> 주사를 들어, 바로 주입하기 전에, 다음, 주사 27 게이지에 바늘을 변경 공기 색전증을 방지하기 위해 모든 공기를 추방 무딘 바늘을 사용하여 1 ML의 주사기에 단계 13.1에서 세포를로드합니다. 가열 램프 아래에서 열 및 마우스 당 정맥 마우스 골수 0.2 ml를 주입. 참고 : 세포가 시간의 길이 또는 정착 할 셀의 주사기에 앉아 않도록하십시오. </li><li> 그들이 건강을 유지하도록 주간 생쥐를 모니터링합니다. </li><li> 오 후 - 육주, GFP + / ametrine + 및 TCR 공동 식 (그림 1B) (11)에 기초하여 재구성을 확인하기 위해 쥐를 피. </li></ol>

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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+interleukin-12+as+a+self-processing+2A+polypeptide.">Production of interleukin-12 as a self-processing 2A polypeptide.</a> J Interferon Cytokine Res. 19, 235-241 (1999).</li><li>Collison, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inhibitory+cytokine+IL-35+contributes+to+regulatory+T-cell+function.">The inhibitory cytokine IL-35 contributes to regulatory T-cell function.</a> Nature. 450, 566-569 (2007).</li><li>Holst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+signaling+mediated+by+T+cell+antigen+receptor-CD3+ITAMs+ensures+effective+negative+selection+and+prevents+autoimmunity.">Scalable signaling mediated by T cell antigen receptor-CD3 ITAMs ensures effective negative selection and prevents autoimmunity.</a> Nature immunology. 9, 658-666 (2008).</li><li>Kalos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+with+chimeric+antigen+receptors+have+potent+antitumor+effects+and+can+establish+memory+in+patients+with+advanced+leukemia.">T cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establish memory in patients with advanced leukemia.</a> Sci Transl Med. 3, 95ra73 (2011).</li><li>VanSeggelen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+Cells+Engineered+With+Chimeric+Antigen+Receptors+Targeting+NKG2D+Ligands+Display+Lethal+Toxicity+in+Mice.">T Cells Engineered With Chimeric Antigen Receptors Targeting NKG2D Ligands Display Lethal Toxicity in Mice.</a> Mol Ther. 23, 1600-1610 (2015).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

프로토콜에서, 최적의 골수 건강, 전달 효율 및 재구성을 보장하기 위해 여러 세부 중요한 단계를 우리. 첫 번째 중요한 단계는 생성 및 GP + E86 바이러스 생산자 세포의 적절한 유지된다. 초기 통로 생산 세포주를 사용하여 80 % 컨 플루 이하 사용하기 전에에서 유지한다. 48 시간 - 신선한 GP + E86 바이러스 생산 세포를 만드는 경우, 293T 세포가 초기 통로 (24)에 대한 문화에서 성장되어 있는지 확인합니다. 형질 도입 단계에서 너무 많은 GP + E86 셀을 도금하는 바이러스 역가를 낮출 것이다. GP + E86 강력한 바이러스 생산자 보장하기 위해 홀스트 등. (11)에 기술 된 바와 같이 바이러스 역가를 결정합니다. 또한, 수확 된 골수에서 적혈구의 제거는 형질 도입 효율을 향상시킨다. 골수 전구 세포의 상태를 보장하는 프로토콜의 성공에 매우 중요하다. 이를 위해, 항상 신선한 미디어 (후 FCS로 보충 4 ° C에서 4 주 이하) 및 신선한 사이토 카인 (이하 사용이주보다) 4 ° C로 유지하는 경우. 이 솔루션되면 Hexadimethrine 브로마이드, 2 개월마다 또한 저하에 민감하고 신선한해야한다. 최적의 골수 건강과 전달을 보장 기타​​ 세부 사항은 스핀 전달하기 전에 원심 분리기를 미리 예열 등이 있습니다. 37 ° C에서 스핀 형질 도입과 가능한 한 많은 가스 교환을 줄이기 위해 플라스틱 포장으로 접시를 포장. 또한, 골수는 37 ° C 배양기의 외부 또는 세포 사멸을 증가시키고 골수 전달 및 재구성을 감소이 같은 장시간 얼음에 앉아 할 수 없습니다. 골수 세포는 4 일 (13 단계)에서 수확 한 후에 만​​ 즉시 마우스를 주입하기 전에 주사기를로드합니다. 마지막으로, 마우스는 조사 당일 또는 그 이전에 항생제에 하루를 배치되어 있는지 확인합니다. 이러한 레트로 바이러스 매개 된 전달 프로토콜의 이용은 발생 골수 전구 세포의 형질 도입을 허용T 세포 수용체 retrogenic 마우스의 생성. Retrogenic 마우스는 TCR 유전자 변형 마우스와 하나의 TCR의 형질 전환을 발생보다 훨씬 적은 비용으로보다 생성 할 빠릅니다. 그러나 retrogenic 마우스는 사육 할 수 없으며 반드시 각 실험 (10)과 새롭게 생성합니다. 말초 T 세포의 숫자는하지만 TCR의 조절은 TCR retrogenic 및 TCR 형질 10 내지 필적 TCR 형질 전환 마우스에서 보이는 것보다 retrogenic 마우스 낮다. TCR에 retrogenic 시스템은 같은 식민지 내에서, 심지어 같은 실험에서 여러 TCR도의 표현이 가능합니다. 여기에 설명 된 TCR retrogenic 프로토콜을 활용하여 테스트하고 수많은 새로 확인 된 MHC 클래스 I 또는 II 제한 TCR도의 개발과 기능을 선별하는 연구자 수 있습니다. 은 &quot;인간화 마우스&quot;모델 (18, 19)의 개발에 의해, TCR의 retrogenic 더 클로닝 인간 TCR도를 이용하여 확장 될 수있다. 또한,도 2a는 구조체의 C 연결된도 CD3 쇄, 인터루킨 및 키메라 항원 수용체 (20-24)를 포함하는 다른 다중 단백질을 연구하기 위해 이용 될 수있다.

인간 및 마우스의 T 세포 수용체 (TCR) 레파토리는 1 × 108, 2 × 106 고유 TCR도 각각 1.2로 추정되었다. 이 넓은 다양성은 T 세포는자가 펩티드에서뿐만 아니라 항원 제시 세포 (APC를)의 주 조직 적합성 복합체 (MHC)에 의해 제공 병원체 유래의 항원 에피토프의 광대 한 배열을 인식 할 수있다. 독특한 펩타이드 MHC 단지와 TCR도의 상호 작용의 미묘한 차이는 T 세포가 사멸, 아네 르기, 활성화, 분화, 사이토 카인 생산 세포 독성을 받아야할지 여부를 지시. 그러나, 큰 TCR 레퍼토리 특정 TCR 특정 항원에 응답하는 방법의 분석은 하나의 TCR 시스템의 사용을 필요로한다. 다양한 TCR 유전자 변형 마우스를 생체 내 모델 3-9 단일 TCR의 기능을 연구하기 위해 생성되었다. 그러나, 포함하는 형질 전환 마우스를 TCR 할주의 사항이있다선정 된 하나의 트랜스 제닉 마우스 생식선 DNA (10)에 임의의 형질 전환 유전자 삽입 소위 창시자 효과를 생성하는 시간의 길이. 따라서, 비교적 적은 TCR 형질 전환 마우스는 임의의 주어진 항원에 대해 생성 된 동일한 에피토프에 대한 고 및 저 TCR 친화력의 기능적 의미는 거의 언급하지 않는다. 화면 빠른 접근을위한 필요성을 해결 개별적으로 또는 조합하여 복수의 TCR도 공부 (레트로 바이러스 &#39;레트로&#39;형질 전환에서 &#39;제닉&#39;) retrogenic 마우스는 형질 전환 마우스 11-13 TCR의 대안으로 이용되어왔다. 여러 바이러스에서 발견 된 2A 펩타이드 합의 모티브 분열은 2A의 글리신과 2B의 프롤린 사이에 발생하는에서, 2A-ASP를-발 / 일드 - 공급 과잉-X-ASN-프로의 Gly-2B-프로 구성 시스 -acting 가수 분해 효소 활동에서 번역 10,14-16 동안 리보솜 건너 뛰기 결과. 은 C를 나타내는 상세한 다이어그램이러한 방식으로, 하나의 벡터 화학 양론 번역의 결과로 연결될 수 2 시스 트론 (TCR 알파와 TCR 베타) (12) -를 다양한 2A 펩티드 (F2A, E2A, T2A 및 P2A)의 leavage 참고 문헌 10를 참조하십시오. 이 방법을 활용하여, 우리는 표현하고 직접 생체 내에서 여러 항원 특정 TCR도 비교 할 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose + glutamine</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>Dulbecco&#39;s Modification of Eagle&#39;s Medium with 4.5 g/L glucose, L-glutamine &#38; sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Atlanta Biological</td>
			<td>S11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-Versene</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-161F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 um syringe filter</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>194-2545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polybrene</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9268-10G</td>
			<td>Sterile Filtered in dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>AAJ61970-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-fluorouracil (5-FU)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>AAA13456-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>25-000-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM nonessential Amino Acids</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>25-025-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1M solution</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>25-060-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strept</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>25-005-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm tissue culture dishes</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>639160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tisue culture-treated 6-well flat plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 um nylon cell strainers</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-3</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PMC0033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-6</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;PHC0063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Stem Cell Factor</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PMC2113L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>46-D13-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HANKS Buffer</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>21020147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 10 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>300912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 1 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G x 1/2 BD Precision Glide Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30G x 1/2 BD Precision Glide Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retroviral transduction of bone marrow progenitor cells to generate t-cell receptor retrogenic mice

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively. The vast array of TCRs proves studying a specific antigenic response difficult. Therefore, TCR transgenic mice were made to study positive and negative selection in the thymus as well as peripheral T cell activation, proliferation and tolerance. However, relatively few TCR transgenic mice have been generated specific to any given antigen. Thus, studies involving TCRs of varying affinities for the same antigenic peptide have been lacking. The generation of a new TCR transgenic line can take six or more months. Additionally, any specific backcrosses can take an additional six months. In order to allow faster generation and screening of multiple TCRs, a protocol for retroviral transduction of bone marrow was established with stoichiometric expression of the TCR&#945; and TCR&#946; chains and the generation of retrogenic mice. Each retrogenic mouse is essentially a founder, virtually negating a founder effect, while the length of time to generate a TCR retrogenic is cut from six months to approximately six weeks. Here we present a rapid and flexible alternative to TCR transgenic mice that can be expressed on any chosen background with any particular TCR.

골수 대표 골수 전달도 (도 1a)에있어서 꼬리 정맥에서 정맥 내로 주입되기 전에 골수 전달 효율은 수확 된 골수의 약 10 μL 중 100 ㎕를 첨가하고, 프로토콜의 단계 133에서 판정한다 PBS 및 ametrine 발현을 분석 하였다. 일반적으로 형광 양성 세포의 비율은 구조 및 레트로 바이러스 역가에 따라 25 %에서 70 % 사이이다. 6주 골수 주사 후, 마우스 골수 재구성 (도 1b)를 결정하기 위해 혈액을 채취한다. 약 말초 혈액의 25 μL은 적혈구가 용해 및 안티 TCRβ로 염색했다. 도 2b에 모든 TCR 양성 세포 concordantly ametrine 형광 단백질을 발현. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54196/54196fig1.jpg" /> Figu골수 형질 도입 및 주변 Retrogenic TCR T 세포의 1 예 재. 골수 세포의 A) 형질 도입 효율 골수 전송 당일 형광 마커 (ametrine)에 기초하여 분석된다. 채취 된 골수 약 10 μL의 PBS를 100 ㎕를 첨가하고 ametrine 발현에 대해 분석 하였다. 성공적인 골수 전달 25 % 및 70 %. B) 6- 주 골수 재구성 게시 말초 혈액 retrogenic TCR T 세포의 실시 예 사이의 형광 양성 세포의 백분율을 수득한다. 말초 혈액을 수득하고, 적혈구는 적혈구 용해 완충액으로 용해시켰다. 나머지 세포는 TCRβ에 대한 염색 하였다. ametrine 식 6 주 골수 재구성을 게시 염색 안티 TCRβ에 대한 대표적인 분석. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54196/54196fig1large.jpg" target="_blank">t의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오</a>그의 그림.

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Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

We present a rapid and flexible protocol for a single T cell receptor (TCR) retroviral-based in vivo expression system. Retroviral vectors are used to transduce bone marrow progenitor cells to study T cell development and function of a single TCR in vivo as an alternative to TCR transgenic mice.

골수 전구 세포의 레트로 바이러스 형질 도입은 T 세포 수용체 Retrogenic 마우스를 생성하는

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

retroviral-transduction-bone-marrow-progenitor-cells-to-generate-t

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.5K 조회수.  Baylor College of Medicine. We present a rapid and flexible protocol for a single T cell receptor (TCR) retroviral-based in vivo expression system. Retroviral vectors are used to transduce bone marrow progenitor cells to study T cell development and function of a single TCR in vivo as an alternative to TCR transgenic mice.

비디오: Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged antigen-specific T cell receptor (TCR) have been an indispensable tool to study T cell development and function. However, such TCRs are usually isolated from the relevant T cells after long-term culture often following repeated antigen stimulation, which unavoidably selects for T cells with high affinity. Random genomic integration of the TCR &alpha;- and &beta;-chain and expression from non-endogenous promoters can lead to variations in expression level and kinetics.
Epigenetic reprogramming via somatic cell nuclear transfer provides a tool to generate embryonic stem cells and mice from any cell of interest. Consequently, when SCNT is applied to T cells of known specificity, these genetic V(D)J rearrangements are transferred to the SCNT-embryonic stem cells (ESCs) and the mice derived from them, while epigenetic marks are reset. We have demonstrated that T cells with pre-defined specificities against Toxoplasma gondii can be used to generate mouse models that express the specific TCR from their endogenous loci, without experimentally introduced genetic modification. The relative ease and speed with which such transnuclear models can be obtained holds promise for the construction of other disease models.

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

We demonstrate here that epigenetic reprogramming via Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT) can be used as a tool to generate mouse models with pre-defined T cell receptor (TCR) specificities. These transnuclear mice express the corresponding TCR from their endogenous locus under the control of the endogenous promoter.

반대 미리 정의된 T 세포 수용체 Specificities와 Transnuclear 쥐 Toxoplasma gondii SCNT 비아 획득

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged ...

연구

면역학 및 감염병학

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

마우스 T - 세포에서 T - 세포 수용체의 Retroviral 전달

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because of their powerful microbicidal activities. Macrophages are widely distributed throughout the body and are present in the lymphoid organs, liver, lungs, gastrointestinal tract, central nervous system, bone, and skin. Because of their repartition, they participate in a wide range of physiological and pathological processes. Macrophages are highly versatile cells that are able to recognize microenvironmental alterations and to maintain tissue homeostasis. Numerous pathogens have evolved mechanisms to use macrophages as Trojan horses to survive, replicate in, and infect both humans and animals and to propagate throughout the body. The recent explosion of interest in evolutionary, genetic, and biochemical aspects of host-pathogen interactions has renewed scientific attention regarding macrophages. Here, we describe a procedure to isolate and cultivate macrophages from murine bone marrow that will provide large numbers of macrophages for studying host-pathogen interactions as well as other processes.

Macrophages have long been recognized as a critical component of the innate and adaptive immune responses. The recent explosion of knowledge pertaining to evolutionary, genetic, and biochemical aspects of the interaction between macrophages and microbes has renewed scientific attention to macrophages. This article describes a method to differentiate macrophages from mouse bone marrow.

뼈 대식 세포 생산에게 골수 유래

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Murine Hind Limb Long Bone Dissection and Bone Marrow Isolation

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, biomechanics, and stem cell biology. Despite the importance of the bone in healthy and pathologic states, however, it is a largely under-researched organ due to lack of specialized knowledge of bone dissection and bone marrow isolation. Mice are a common model organism to study effects on bone and bone marrow, necessitating a standardized and efficient method for long bone dissection and bone marrow isolation for processing of large experimental cohorts. We describe a straightforward dissection procedure for the removal of the femur and tibia that is suitable for downstream applications, including but not limited to histomorphologic analysis and strength testing. In addition, we outline a rapid procedure for isolation of bone marrow from the long bones via centrifugation with limited handling time, ideal for cell sorting, primary cell culture, or DNA, RNA, and protein extraction. The protocol is streamlined for rapid processing of samples to limit experimental error, and is standardized to minimize user-to-user variability.

Here we present a protocol for the dissection of hind limb long bones (femurs and tibiae) from the laboratory mouse. We further describe a rapid technique for bone marrow isolation from these bones that utilizes centrifugation for removal of bone marrow from the bone marrow space.

쥐 뒷다리 긴 뼈 해부 및 골수 격리

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, cloning TCRs specific for various tumor-associated antigens has been the goal of many studies. To elicit an effective T cell response, the TCR must recognize the target antigen with optimal affinity. However, cloning such TCRs has been a challenge and many available TCRs possess sub-optimal affinity for the cognate antigen. In this protocol, we describe a method of cloning de novo high affinity antigen-specific TCRs using existing TCRs by exploiting hemichain centricity. It is known that for some TCRs, each TCR&#945; or TCR&#946; hemichain do not contribute equally to antigen recognition, and the dominant hemichain is referred to as the centric hemichain. We have shown that by pairing the centric hemichain with counter-chains differing from the original counter-chain, we are able to maintain the antigen specificity, while modulating its interaction strength for the cognate antigen. Thus, the therapeutic potential of a given TCR can be improved by optimizing the pairing between the centric and counter hemichains.

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Herein we describe a novel method to generate antigen-specific T cell receptors (TCRs) by pairing the TCR&#945; or TCR&#946; of an existing TCR, possessing the antigen-specificity of interest, with complementary hemichain of the peripheral T cell receptor repertoire. The de novo generated TCRs retain antigen-specificity with varying affinity.

생성<em&gt; 드 노보</em&gt; 중심 Hemichain의 레트로 바이러스 형질 도입에 의해 항원 특이 적 인간 T 세포 수용체

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents autoimmunity. Many approaches involving different model organisms have been utilized to understand the mechanisms controlling helper T cell development and function. However, studies using mouse models have proven to be highly informative due to the availability of genetic, cellular, and biochemical systems. One genetic approach in mice used by many labs involves retroviral transduction of primary helper T cells. This is a powerful approach due to its relative ease, making it accessible to almost any laboratory with basic skills in molecular biology and immunology. Therefore, multiple genes in wild type or mutant forms can readily be tested for function in helper T cells to understand their importance and mechanisms of action. We have optimized this approach and describe here the protocols for production of high titer retroviruses, isolation of primary murine helper T cells, and their transduction by retroviruses and differentiation toward the different helper subsets. Finally, the use of this approach is described in uncovering mechanisms utilized by microRNAs (miRNAs) to regulate pathways controlling helper T cell development and function.

Many experimental systems have been utilized to understand the mechanisms regulating T cell development and function in an immune response. Here a genetic approach using retroviral transduction is described, which is economic, time efficient, and most importantly, highly informative in identifying regulatory pathways.

공부하는 유전 적 접근으로 헬퍼 T 세포의 레트로 바이러스 형질 도입은 메커니즘 자신의 차별화 및 기능 제어

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

An In Vivo Mouse Model to Measure Na&#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played by T cells in an immune response. This protocol describes the in vitro differentiation of bone marrow (BM) progenitors to obtain granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) derived-dendritic cells (DCs). The protocol also describes the adoptive transfer of ovalbumin peptide (OVAp)-loaded GM-CSF-derived DCs and na&#239;ve CD4 T cells from OTII transgenic mice in order to analyze the in vivo activation, proliferation, and Th1 differentiation of the transferred CD4 T cells. This protocol circumvents the limitation of purely in vivo methods imposed by the inability to specifically manipulate or select the studied cell population. Moreover, this protocol allows studies in an in vivo environment, thus avoiding alterations to functional factors that may occur in vitro and including the influence of cell types and other factors only found in intact organs. The protocol is a useful tool for generating changes in DCs and T cells that modify adaptive immune responses, potentially providing important results to understand the origin or development of numerous immune associated diseases.

Here, we present a protocol for the in vivo determination of na&#239;ve CD4 T cell (T cell) activation, proliferation, and Th1 differentiation induced by GM-CSF bone marrow (BM)-derived dendritic cells (DCs). In addition, this protocol describes BM and T-cell isolation, DC generation, and DC and T-cell adoptive transfer.

Vivo에서 마우스 모델을 측정 순진한 CD4 T 세포 활성화, 확산 및 골 수 유래 수지상 세포에 의해 유도 된 Th1 차별화

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a myeloid-biased 39-antibody CyTOF panel to evaluate the hematopoietic system with a focus on the neutrophil-lineage cells by using this protocol. The CyTOF result was analyzed with an open-resource dimensional reduction algorithm, viSNE, and the data was presented to demonstrate the outcome of this protocol. We have discovered new neutrophil-lineage cell populations based on this protocol. This protocol of fresh whole BM preparation may be used for 1), CyTOF analysis to discover unidentified cell populations from whole BM, 2), investigating whole BM defects for patients with blood disorders such as leukemia, 3), assisting optimization of fluorescence-activated flow cytometry protocols that utilize fresh whole BM.

Here, we present a protocol to process fresh bone marrow (BM) isolated from mouse or human for high-dimensional mass cytometry (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analysis of neutrophil-lineage cells.

호중구 계보 세포의 질량 세포 분석 분석을위한 전체 골수의 준비

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

Isolation of Lamina Propria Mononuclear Cells from Murine Colon Using Collagenase E

The intestine is the home to the largest number of immune cells in the body. The small and large intestinal immune systems police exposure to exogenous antigens and modulate responses to potent microbially derived immune stimuli. For this reason, the intestine is a major target site of immune dysregulation and inflammation in many diseases including but, not limited to inflammatory bowel diseases such as Crohn&#8217;s disease and ulcerative colitis, graft-versus-host disease (GVHD) after bone marrow transplantation (BMT), and many allergic and infectious conditions. Murine models of gastrointestinal inflammation and colitis are heavily used to study GI complications and to pre-clinically optimize strategies for prevention and treatment. Data gleaned from these models via isolation and phenotypic analysis of immune cells from the intestine is critical to further immune understanding that can be applied to ameliorate gastrointestinal and systemic inflammatory disorders. This report describes a highly effective protocol for the isolation of mononuclear cells (MNC) from the colon using a mixed silica-based density gradient interface. This method reproducibly isolates a significant number of viable leukocytes while minimizing contaminating debris, allowing subsequent immune phenotyping by flow cytometry or other methods.

The goal of this protocol is to isolate mononuclear cells that reside in the lamina propria of the colon by enzymatic digestion of the tissue using collagenase. This protocol allows for the efficient isolation of mononuclear cells resulting in a single cell suspension which in turn can be used for robust immunophenotyping.

콜라게나아제 E를 사용하여 뮤린 결장에서 라미나 프로프리아 단핵 세포의 분리

The intestine is the home to the largest number of immune cells in the body. The small and large intestinal immune systems police exposure to exogenous ...

Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease

Allogeneic bone marrow transplantation (BMT) is an effective therapy for hematological malignancies due to the graft-versus-leukemia (GVL) effect to eradicate tumors. However, its application is limited by the development of graft-versus-host disease (GVHD), a major complication of BMT. GVHD is evoked when T-cells in the donor grafts recognizealloantigen expressed by recipient cells and mount unwanted immunological attacks against recipient healthy tissues. Thus, traditional therapies are designed to suppress donor T-cell alloreactivity. However, these approaches substantially impair the GVL effect so that the recipient&#39;s survival is not improved. Understanding the effects of therapeutic approaches on BMT, GVL, and GVHD, is thus essential. Due to the antigen-presenting and cytokine-secreting capacities to stimulate donor T-cells, recipient dendritic cells (DCs) play a significant role in the induction of GVHD. Therefore, targeting recipient DCs becomes a potential approach for controlling GVHD. This work provides a description of a novel BMT platform to investigate how host DCs regulate GVH and GVL responses after transplantation. Also presented is an effective BMT model to study the biology of GVHD and GVL after transplantation.

Graft-versus-host disease is a major complication after allogeneic bone marrow transplantation. Dendritic cells play a critical role in the pathogenesis of graft-versus-host disease. The current article describes a novel bone marrow transplantation platform to investigate the role of dendritic cells in the development of graft-versus-host disease and the graft-versus-leukemia effect.

이식대 숙주 질환에서 수지상 세포의 역할을 조사하는 골수 이식 플랫폼

Allogeneic bone marrow transplantation (BMT) is an effective therapy for hematological malignancies due to the graft-versus-leukemia (GVL) effect to ...