Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus NIH (5K22A1119151-01 und 1R56DK104903-01) zu MLB, Pilot / Machbarkeits Programm des Diabetes Research Center (P30-DK079638) bei BCM, JDRF 1-FAC-2014-243-AN APF, ADA unterstützt 1-15-JF-07, AAI Karriere in Immunology Fellowship MB und The Robert und Janice McNair-Stiftung.

Ethik - Statement: Es wird alles unternommen Tier Beschwerden oder Stress auf ein Minimum während der Bestrahlung und Schwanzvene Injektionen zu halten. Mäuse werden als Quelle der Zellen in diesen Experimenten verwendet wird; als solche sind keine Verfahren oder Manipulationen abgesehen von Euthanasie. Die Mäuse werden durch CO 2 Inhalation durch Genickbruch folgte eingeschläfert Tod zu bestätigen. Dieses Verfahren ist mit den Empfehlungen des Gremiums für Euthanasie von der American Veterinary Medical Association konsistent. 1. Bereiten Sie Retrovirale Construct <ol><li> Sub-Klon der T-Zell - Rezeptor (TCR) alpha und beta - Ketten, durch ein 2A - Linker getrennt sind , in eine MSCV-basierenden retroviralen Vektor 11 (beispielsweise pMIAII oder pMIGII) 11. HINWEIS: Die 2A Linkers ermöglicht stöchiometrische und konkordant Expression der alpha- und beta-TZR-Ketten von einem einzelnen offenen Leserahmen. Der Vektor enthält eine IRES fluoreszierendes Protein Kassette (ametrine oder GFP), das verwendet wird, umSpur transduzierten Zellen und Transduktionseffizienz. Für eine detaillierte Protokoll finden Sie unter Holst et al. 11 </li><li> Isolieren Plasmid-DNA im Handel erhalten Plasma-Prep-Kit oder ein ähnliches Produkt. Verwenden Sie eine Arbeitskonzentration von 1 bis 2 &amp; mgr; g &amp; mgr; l -1. </li></ol> 2. Erzeugung von Retrovirale Producer-Zelllinien <ol><li> Verwenden einen zweistufigen Prozess die retrovirale Produzentenzelllinien zu erzeugen. HINWEIS: Für ein ausführliches Protokoll, sehen Sie bitte Holst et al . 11. <ol><li> Generieren Retrovirus durch transiente Transfektion von 293T - Zellen mit drei Plasmiden (pVSVG, PEQ-Pam3 (-E) und Vektor von Interesse 11) und nehmen Sie die retrovirale Überstand von den 293T - Zellen die GP + E86 ekotropischen retroviralen Produzentenzelllinie zu transduzieren. </li><li> Isolieren Sie die oberen 40% der fluoreszierenden exprimierenden GP + E86 produzierenden Zellen durch FACS und propagieren die transdcuced-GP + E86 Produzentenzellen als Quelle des Virus. HINWEIS: Die Erzeugungvon hohem Titer Erzeuger ist kritisch für eine effiziente Transduktion von Knochenmarkszellen. Für eine vollständige Protokoll bitte Holst et al anzuzeigen. 11 </li></ol></li></ol> 3. Retrovirus-vermittelte Stem Cell Gene Transfer (Tag -5) <ol><li> Auftauen und Kultur 0,5 -1,0 x 10 6 jedes GP + E86 Produktionszelllinie in komplettem DMEM 10% (vol / vol) FBS ein ausreichendes Wachstum für zwei konfluenten 150-mm - Platten von Tag 0 dieses Protokolls zu ermöglichen. HINWEIS: Thawing 0,5 - 5. 50% Konfluenz am Tag Dies gilt auch für 5 Tage der Kultur, um den GP + E86 zu erweitern ermöglicht - 1,0 x 10 6 jedes GP + E86 Produktionszelllinie in einem 10 - cm - Platte für 30 erlauben Hersteller-Zelllinien zu zwei konfluenten 150-mm-Platten von Tag 0. <ol><li> Kultur retroviralen Producer-Zelllinie in vollständiger Gewebekulturmedien, enthaltend 5% Kälberserum Feta und Ciprofloxacin (10 ug / ml) Mycoplasma-Kontamination zu vermeiden. Hinweis: Die Verwendung von Ciprofloxacin brechen, wenn generating der virale Überstand für Knochenmarkübertragung. Vermeiden Sie über Wachstum der Erzeugerzelllinie, da diese sich negativ auf Knochenmark Transduktionswirksamkeit auswirken wird. </li></ol></li></ol> 4. Inject Spendermäusen mit 5-Fluorouracil (5-FU) (Tag -3) <ol><li> Wiegen Sie die Spendermäuse (5-12 Wochen alt) erforderlich, um die Menge an 5-FU zu bestimmen. Mit Mäuse jünger als 5 Wochen alt Ergebnisse in Ausbeute gering Knochenmark. Um sicherzustellen, dass die Expression eines einzelnen TCR, verwenden Sie eine T-Zell-defizienten Mausstamm wie SCID, RAG oder TCR alpha defizienten Mäusen als Knochenmarkspender. </li><li> Zu liefern , 0,15 mg 5-FU pro Gramm Körpergewicht Arbeiten in der Gewebekultur Haube verdünnen Sie die 5-FU Lager mit sterilem PBS , um eine ausreichende Menge von 10 mg ml -1 Arbeitslösung von 5-FU zu machen. </li><li> Unter Verwendung einer 1 ml Spritze mit einer 37 G Nadel injiziert intraperitoneal 0,15 mg 5-FU pro Gramm Körpergewicht pro Spendermaus. HINWEIS: Verwenden Sie 1 Spendermaus pro Empfänger zu starten und zu justierendie Anzahl von Spendermäusen nach der Zellausbeute. Ein alternatives Verfahren zu den 5-FU - Behandlung zur Anreicherung und Isolierung von Knochenmarksvorläuferzellen ist die negative Selektion von Lineage - positiven Zellen , wie in Viret et al. </li></ol> 5. Knochenmark-Extraktionsverfahren (Tag 0) <ol><li> Erhalten Dissektion Schere und Pinzette für die Knochen Isolation. Bereiten Medien (HBSS, ergänzt mit 5% FCS (vol / vol)) Knochen in einem 50 ml konischen Röhrchen zu sammeln. Halten Sie 50 ml konischen haltigen Medien auf Eis. Euthanize Mäuse durch CO 2 Inhalation durch Genickbruch folgte Tod zu bestätigen. Pinch Pfote um sicherzustellen, dass keine Reflexe erkannt. </li><li> Sterilisieren der Operationsstelle und chirurgische Werkzeuge mit Ethanol oder Methanol. Entfernen Sie den Femur, Tibia, Humerus, und Beckengürtel sorgfältig indem zuerst nach oben und unter dem Beckengürtel. Schnitt zurück nach unten entlang des Oberschenkels an der Tibia. Entfernen Sie das gesamte umliegende Gewebe Schere und Pinzette sauberen Knochen zu erhalten. BehaltenKnochen in HBSS + 5% (vol / vol) FBS hydratisiert. </li><li> Trennen Sie die Knochen von an den Gelenken schneiden, um sicherzustellen, beide abzuschneiden endet in jedem Knochen. Legen Sie eine 25-Gauge-Nadel in eine 10-ml-Spritze befestigt enthält HBSS + 5% (vol / vol) FBS. Wenden Sie Druck und spülen Sie alle Knochenmark durch einen 70 &amp; mgr; m Sieb ruht in einem 50 ml konischen. </li><li> Von Zeit zu Zeit, drücken Sie die Knochenmark durch die 70-um-Filter den Kolben aus einer 1 ml oder 3 ml Spritze. Spülen Sie das Sieb mit HBSS + 5% (vol / vol) FBS. Dies wird eine Zellsuspension gewährleisten, die frei von Knochenfragmenten und Gewebe. Halten Zellen steril durch das Verfahren in einer sterilen Haube durchgeführt wird. </li><li> Zentrifuge Knochenmarkszellen bei 300 xg für 10 min bei 4 ° C. </li></ol> 6. Knochenmark-Kultur (Tag 0) <ol><li> Dekantieren oder absaugen Medien und resuspendieren Zellpellet in 1 ml Ammoniumchlorid-Basis roten Blut Lysepuffer (oder gleichwertig RBC-Lyse-Puffer) pro 50 ml konischen Röhrchen. Nach 1 min Inkubation bei RaumTemperatur, quenchen die rote Puffer Zelllyse durch 10 ml vollständigem DMEM 20% (Vol / Vol) FBS hinzugefügt wird. </li><li> Zentrifugen Zellen bei 300 xg für 10 min bei 4 ° C. </li><li> Dekantieren oder absaugen Überstand und resuspendieren Knochenmark in 5 ml komplettem DMEM 20% (vol / vol) FBS. Zählen Sie die Zellen mit einer Neubauer-Zählkammer. HINWEIS: Allgemeine Ausbeute sollte ca. 5 - 10 x 10 6 Zellen pro Maus; jedoch kann die Ausbeute bei den verschiedenen Stämmen von Mäusen variieren. </li><li> Platte Knochenmarkzellen in einer Dichte von 4 x 10 7 Zellen pro 150 mm-Platte in 30 ml vollständigem DMEM 20% (Vol / Vol) FBS ergänzt mit IL-3 (20 g ml -1), IL-6 (50 g ml -1) und SCF (50 g ml -1). HINWEIS: Verwenden Sie frisch aufgetauten-aliquotiert Zytokinen. Verwenden Sie keine Cytokine, die eingefroren wurden und aufgetaut als einmal oder bei 4 ° C für mehr als 2 Wochen gehalten. </li><li> Inkubieren über Nacht Knochenmark (ca. 24 h) bei 37 ° C mit 5% CO 2. </li></ol><ol><li> Platte 3 x 10 6 retroviralen Erzeugerzellen pro 150 mm-Platte in 18 ml vollständigem DMEM - 20% (Vol / Vol) FBS. </li><li> Inkubieren retroviralen Erzeugerzellen bei 37 ° C über Nacht. Antizipieren einer 150-mm-Platte für 15 Millionen Knochenmarkzellen (ca. 2 - 3 Donormäusen). </li></ol> 8. Retroviral Supernatant (Tag 1) <ol><li> Am nächsten Tag (etwa 24 Stunden später), ernten den retroviralen Überstand von den Produzenten Platten durch die Erstellung des retroviralen Überstand direkt aus der 150-mm-Platte mit einer 10-ml-Spritze und Filter mit einem 0,45 (in Schritt 7 eingestellt ist) -μm Spritzenfilter. </li><li> ersetzen Sie vorsichtig den entfernten retroviralen Überstand mit 18 ml frischem komplettem DMEM 20% (vol / vol) FBS. </li><li> Ergänzung des gefilterten retroviralen Überstand mit IL-3 (20 g ml -1), IL-6 (50 g ml -1), MSCF (50 g ml -1) und Hexadimethrinbromid (Polybrene) (6 &amp;# 956; g ml -1). HINWEIS: Hexadimethrinbromid sollten frisch alle 2 Monate gemacht werden, um einen Rückgang der Wirksamkeit der retroviralen Transduktion zu vermeiden. </li></ol> 9. Knochenmark-Ernte (Tag 1) <ol><li> Nach Abschluss von Schritt 8.3, ernten die Knochenmarkzellen aus Schritt 6.4 und übertragen Sie die Medien nicht adhärenten Zellen in sterile 50-ml-Röhrchen enthält. </li><li> Waschen Sie die Platten kräftig mit 10 ml PBS und sammeln sich in der 50-ml-Erlen aus Schritt 9.1. Falls erforderlich, wiederholen Sie den Waschschritt. </li><li> Zentrifuge die Zellen bei 300 · g für 10 min bei 4 ° C, dekantiert den Überstand, resuspendiere Zellen in einem kleinen Volumen (1 - 3 ml) komplett DMEM 20% (Vol / Vol) FBS und zählen. Antizipieren von 50 bis 75% Rückgewinnung von Tag 0 Resuspendieren Knochenmark bei 1 x 10 6 Zellen pro 1 ml des retroviralen Überstand Zytokinen und Hexadimethrinbromid enthält. </li></ol> 10. Bone Marrow Transduction (Tag 1) <ol><li> Platte des retroviralen Überstand / Knochen marrow Mischung mit einem Volumen von 3 ml pro Vertiefung in einer Sechs-Well-Gewebekulturplatte. Wickeln Sie die Platten in der Plastikverpackung um einen Gasaustausch während der Zentrifugation in Schritt 10.2 minimieren. </li><li> Dreh die gewickelt Sechs-Well-Platten bei 1.000 xg für 60 min ein 37 ° C. </li><li> Nach dem Spin abgeschlossen ist, entfernen Sie die Plastikfolie und legen Sie die Platten in einem 37 ° C CO 2 Inkubator für 24 Stunden. </li></ol> 11. Retroviral Supernatant und Transduction (Tag 2) <ol><li> Nach 24 Stunden sammeln frische Virusüberstand aus der viralen Hersteller-Zelllinie. Filtriere den retroviralen Überstand unter Verwendung einer 10-ml-Spritze und eine 0,45-um-Spritzenfilter. Ergänzung des gefilterten retroviralen Überstand mit IL-3 (20 g ml -1), IL-6 (50 g ml -1) und SCF (50 g ml -1) und Hexadimethrinbromid (6 g ml -1). </li><li> Als nächstes vorsichtig mit Pipette entfernen oder die obersten 2 ml Medium aus jeder Vertiefung der Sechs-Well-Platte aspirieren die Knochenmarkszellen enthält,. HINWEIS: Arbeit sorgfältig nicht das Knochenmark anzusaugen, die in der Regel in der Mitte der Vertiefung konzentriert wird. Alternativ kann der abgenommenen versponnen werden Sie sich alle verlorenen Knochenmarkszellen zu erholen. </li><li> Zu jeder Vertiefung im Knochenmark 6-Well-Platte 3 ml frischem viralen Überstand mit Zytokinen und Hexadimethrinbromid. Wickeln Sie die Platten aus Kunststoff, und wiederholen Sie die Spinübertragung bei 1.000 × g für 60 min ein 37 ° C. Auszupacken , die Platten und Inkubieren Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2 über Nacht (etwa 24 h). </li></ol> 12. Zugabe von frischem Ergänzte DMEM (Tag 3) <ol><li> Nach 24 Stunden die Top 2 ml Medium aus jeder Vertiefung der Sechs-Well-Platte entfernen Sie die Knochenmarkzellen, wie in Schritt 11.2 enthält. Ersetzen Sie die entfernt Medien mit frischem DMEM 20% (vol / vol) FBS mit Endkonzentrationen von IL-3 (20 g ml -1), IL-6 (50 g ml -1) und SCF (50 g ml -1) . </li><li> Inkubieren KnochenmarkPlatten bei 37 ° C CO 2 Inkubator für weitere 24 hr. </li></ol> 13. Ernte transduzierten Knochenmark (Tag 4) <ol><li> Nach 24 Stunden, sammeln die Knochenmarkszellen aus den Sechs-Well-Platten. Waschen Sie die Platten kräftig mit PBS alle nicht-adhärente Zellen zu entfernen. <ol><li> Zentrifugieren der Zellen bei 300 xg für 10 min bei 4 ° C und dekantiert den Überstand. </li><li> Resuspendieren des Knochenmarks in einem kleinen Volumen (1 ml) PBS + 0,5% (vol / vol) hitzeinaktiviertem FBS. Halten Sie Zellen auf Eis. </li></ol></li><li> Nehmen Sie eine 10-ul-Probe jeder Knochenmark Zustand und zählen Sie die Zellen, die eine Neubauer-Zählkammer verwendet wird. Unter der Annahme , 1 - mindestens 4 x 10 6 Zellen zu übertragen pro Empfängermaus 2 - Donor pro Empfänger, wird die Ausbeute ausreichend sein. Resuspendieren des Knochenmarks in einem ausreichenden Volumen von PBS + 0,5% (vol / vol) hitzeinaktiviertem FBS 200 einzuspritzen - 300 &amp; mgr; l pro Maus. <ol><li> Injizieren mindestens 2 x 10 6 Zellen mit einer Transduktionseffizienz(injizieren bis zu 8 x10 6 Zellen) pro Maus intravenös von 25%. HINWEIS: Es wird routinemßig fünf Empfängermäuse injizieren pro zwei Platten mit 6 Vertiefungen von Knochenmarkszellen. Wenn die Ausbeute wesentlich geringer, mehr Donormäusen ist, sollte bis kann eine ausreichende Knochenmark verwendet werden Zahl erhalten werden. Um eine optimale Wiederherstellung zu erreichen, von mindestens 5 x 10 5 transduzierte (fluoreszierend positive) sollte in jedem Empfänger injiziert werden. </li></ol></li><li> Mit einem Mikro - Pipette, nehmen Sie eine 10-ul - Probe von jeder Bedingung Knochenmark und Transduktionseffizienz durch Fluss analysieren Zytometrie basierend auf der Expression des fluoreszierenden Marker (Abbildung 1A) 11. HINWEIS: In der Regel ist der Anteil der Fluoreszenz-positiven Zellen liegt zwischen 25% und 70%, abhängig von dem Konstrukt und retrovirale Titer. Die Zahl der transduzierten Knochenmarkzellen erforderlich a subletal bestrahlen Maus zu rekonstituieren kann abhängig von der Transduktionseffizienz variieren. Je niedriger die transduction Effizienz, benötigt die mehr Knochenmarkzellen und umgekehrt, je höher die Knochenmark Transduktionseffizienz, die geringere Anzahl von Zellen für die Rekonstitution benötigt. Transduktionseffizienz unter 25% ist suboptimal und kann zu einer unzureichenden Rekonstitution und Überleben führen. Um eine optimale Knochenmark Erholung und Transduktionseffizienz zu gewährleisten, verwenden Sie frisch zubereitete Gewebekulturmedien und Zytokinen. Wenn ein neues TCR Expression des retrogenic System verwendet wird , ist die Auswahl des TCR in vivo unbekannt. In Abhängigkeit von jedem einzelnen TCR - Affinität, TCR Selektion im Thymus und peripheren T - Zell - Expression wird 17 variieren. </li></ol> 14. Maus-Bestrahlung, Knochenmark-Injection und Pflege <ol><li> Bestrahlen Mäuse am Tag vor der Knochenmark-Injektion (am selben Tag wie Schritt 13). Verwenden Sie die folgenden Dosen: C57BL / 6 - Mäuse (und andere Wildtyp - Stämme), 900 rads; Rag1 - / - Mäuse, 500 Rad; SCID - Mäuse, 300 rad). <ol><li> Platz Empfängermäuse auf Amoxicillin (50 mg / kg / Tag) oder ein anderes Antibiotikum Wasserbehandlung vor der Bestrahlung, und halten Sie auf Antibiotika für die ersten zwei Wochen nach der Knochenmark-Injektion. HINWEIS: Die optimale Bestrahlungsdosis kann empirisch bestimmt werden müssen. </li></ol></li><li> Für die Injektion laden die Zellen aus Schritt 13.1 in eine 1-ml-Spritze mit stumpfen Nadeln unmittelbar vor der Injektion, dann Injektion die Nadel 27er ändern, zu vertreiben jegliche Luft Luftembolie zu vermeiden. Wärme Mäuse unter einer Wärmelampe und 0,2 ml Knochenmark pro Maus intravenös injiziert. HINWEIS: Lassen Sie sich nicht Zellen in der Spritze für längere Zeit oder die Zellen absetzen sitzen. </li><li> Überwachen Sie die Mäuse wöchentlich, um sicherzustellen, dass sie gesund bleiben. </li><li> Nach 5 - 6 Wochen, bluten die Mäuse zur Rekonstitution auf der Grundlage von GFP zu überprüfen + / ametrine + und TCR Co-Expression (Abbildung 1B) 11. </li></ol>

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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inhibitory+cytokine+IL-35+contributes+to+regulatory+T-cell+function.">The inhibitory cytokine IL-35 contributes to regulatory T-cell function.</a> Nature. 450, 566-569 (2007).</li><li>Holst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+signaling+mediated+by+T+cell+antigen+receptor-CD3+ITAMs+ensures+effective+negative+selection+and+prevents+autoimmunity.">Scalable signaling mediated by T cell antigen receptor-CD3 ITAMs ensures effective negative selection and prevents autoimmunity.</a> Nature immunology. 9, 658-666 (2008).</li><li>Kalos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+with+chimeric+antigen+receptors+have+potent+antitumor+effects+and+can+establish+memory+in+patients+with+advanced+leukemia.">T cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establish memory in patients with advanced leukemia.</a> Sci Transl Med. 3, 95ra73 (2011).</li><li>VanSeggelen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+Cells+Engineered+With+Chimeric+Antigen+Receptors+Targeting+NKG2D+Ligands+Display+Lethal+Toxicity+in+Mice.">T Cells Engineered With Chimeric Antigen Receptors Targeting NKG2D Ligands Display Lethal Toxicity in Mice.</a> Mol Ther. 23, 1600-1610 (2015).</li></ol>

Keine Interessenkonflikte erklärt.

In dem Protokoll wir ausführlich einige kritische Schritte optimale Knochenmark Gesundheit, Transduktionseffizienz und Rekonstitution zu gewährleisten. Erster wichtiger Schritt ist die Erzeugung und die ordnungsgemäße Wartung der GP + E86 Virusproduzentenzellen. Verwenden frühen Passage Produktionszelllinien und halten bei 80% Konfluenz oder niedriger vor der Verwendung. Wenn frisch machen viralen Produzentenzellen GP + E86, sicherzustellen, sind die 293T-Zellen frühen Passage und wachsen in der Kultur für 24 bis 48 Stunden. Plattieren zu viele GP + E86-Zellen während des Übertragungsschritt wird Virustiter senken. Bestimmen Virustiter wie in Holst et al. 11 beschrieben GP + E86 sind robust viral Hersteller sicherzustellen. Zusätzlich verbessert die Entfernung der roten Blutkörperchen aus der geernteten Knochenmarks Transduktionseffizienz. die Gesundheit der Knochenmark-Vorläufern zu gewährleisten ist für den Erfolg des Protokolls kritisch. Zu diesem Zweck verwenden Sie immer frische Medien (weniger als 4 Wochen bei 4 ° C, nachdem sie mit FCS ergänzt) und frische Zytokine (wenigerals 2 Wochen bei 4 ° C) gehalten. Hexadimethrinbromid ist auch empfindlich gegenüber Abbau und sollte frisch gemacht werden, wenn es in Lösung ist, alle 2 Monate. Weitere Details, die eine optimale Knochenmark Gesundheit sorgen und Übertragung umfassen Vorwärmen der Zentrifuge vor der Spinübertragung. Spin-Transduktion bei 37 ° C und wickeln Platten mit Plastikfolie Gasaustausch so weit wie möglich zu verringern. Auch lassen nicht das Knochenmark außerhalb des 37 ° C-Inkubator sitzen oder auf Eis für längere Zeit, da dies Zelltod erhöhen und Knochenmark-Transduktion und Rekonstitution zu verringern. Nachdem die Knochenmarkzellen an Tag 4 (Schritt 13) geerntet wurden, laden nur die Spritzen unmittelbar vor der Mäuse injiziert wird. Schließlich gewährleisten, dass Mäuse auf Antibiotika am Tag vor oder am Tag der Bestrahlung platziert sind. Die Verwendung dieses Übertragungsprotokoll ermöglicht die Transduktion von Knochenmarksvorläuferzellen retroviralen vermittelt, was zudie Erzeugung von T-Zell-Rezeptor retrogenic Mäusen. Retrogenic Mäuse sind schneller zu generieren als TCR-transgenen Mäusen und Kosten deutlich weniger als ein einziges TCR transgenen erzeugen. Allerdings können retrogenic Mäuse nicht gezüchtet und müssen neu 10 mit jedem Experiment erzeugt werden. Die Anzahl der peripheren T - Zellen niedriger in retrogenic Mäusen als in TCR - transgenen Mäusen gesehen jedoch die Regulation des TCR ist vergleichbar zwischen TCR retrogenic und TCR Transgene 10. Der TCR retrogenic System ermöglicht die Expression mehrerer TCRs innerhalb derselben Kolonie und sogar innerhalb des gleichen Experiments. das TCR retrogenic Protokoll hier ermöglicht einen Ermittler beschrieben Unter Verwendung der Entwicklung und Funktionalität zahlreicher neu identifizierte MHC-Klasse-I oder II beschränkt TZR zu testen und zu screenen. Mit der Entwicklung der &quot;humanisierten Maus&quot; Modell 18,19 könnte der TCR retrogenic weiter ausgebaut werden geklonten menschlichen TCRs verwendet. Darüber hinaus verknüpft die 2A Konstrukte cein ebenfalls zu studieren andere Multi-Proteinen verwendet werden , einschließlich der CD3 - Ketten, Interleukine und chimären Antigenrezeptoren 20-24.

T - Zell - Rezeptor (TCR) Repertoire von Mensch und Maus wurde mit 1 x 10 8 und 2 x 10 6 einzigartige TCRs jeweils 1,2 geschätzt. Diese große Vielfalt ermöglicht T-Zellen eine Vielzahl von Antigen-Epitope aus selbst Peptiden sowie von Pathogenen dargestellt durch den Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) auf Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) abgeleitet zu erkennen. Die feinen Unterschiede in den Wechselwirkungen der TCRs mit einzigartigen Peptid-MHC-Komplexe diktieren, ob eine T-Zell-Apoptose durchlaufen wird, Anergie, Aktivierung, Differenzierung, Zytokinproduktion oder Zytotoxizität. Jedoch aufgrund der großen TCR-Repertoire, Analyse, wie ein spezifischer TCR zu einem bestimmten Antigen zu reagieren erfordert die Verwendung von einzelnen TCR-Systeme. Verschiedene TCR transgene Mäuse wurden erzeugt , um die Funktion eines einzelnen TCR in einem in vivo - Modell 3-9 zu studieren. Es gibt jedoch Einschränkungen transgenen Mäusen einschließlich der TCRKosten, die Länge der Zeit eine einzelne transgene Maus und die so genannte Gründereffekt von zufälligen Transgen - Insertion in die Keimbahn DNA 10 zu erzeugen. Daher relativ wenige TCR transgene Mäuse wurden für jede gegebene Antigen und die funktionellen Auswirkungen von hohen und niedrigen TCR-Affinität für das gleiche Epitop gerichtet werden selten erzeugt. Um die Notwendigkeit für eine schnelle Annäherung an Bildschirm - Adresse und mehrere TZR einzeln oder in Kombination, retrogenic ( &#39;retro&#39; von Retrovirus und &quot;gene&quot; von transgenen) Mäuse wurden als Alternative genutzt studieren 11-13 transgene Mäuse zu TCR. Die 2A Peptid Konsensusmotiv innerhalb von mehreren Viren gefunden bestehen aus einer 2A-Asp-Val / Ile-Glut-X-Asn-Pro-Gly-2B-Pro, bei der Spaltung zwischen dem Glycin der 2A und dem Prolin der 2B auftritt von cis - aktiven Hydrolase - Aktivität, was zu einer ribosomalen Skipping bei der Übersetzung 10,14-16. Für eine detaillierte Darstellung der c darstelltlaub der verschiedenen 2A Peptide (F2A, E2A, T2A und P2A) finden Sie auf Referenzen 10 - 12. Auf diese Weise zwei Cistrons (TCR alpha und TCR beta) können in einem einzigen Vektor was in stöchiometrischen Übersetzung verknüpft werden. Unter Verwendung dieses Ansatzes können wir zum Ausdruck bringen und direkt mehrere Antigen - spezifischen TZR in vivo vergleichen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose + glutamine</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>Dulbecco&#39;s Modification of Eagle&#39;s Medium with 4.5 g/L glucose, L-glutamine &#38; sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Atlanta Biological</td>
			<td>S11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-Versene</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-161F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 um syringe filter</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>194-2545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polybrene</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9268-10G</td>
			<td>Sterile Filtered in dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>AAJ61970-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-fluorouracil (5-FU)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>AAA13456-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>25-000-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM nonessential Amino Acids</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>25-025-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1M solution</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>25-060-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strept</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>25-005-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm tissue culture dishes</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>639160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tisue culture-treated 6-well flat plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 um nylon cell strainers</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-3</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PMC0033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-6</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;PHC0063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Stem Cell Factor</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PMC2113L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>46-D13-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HANKS Buffer</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>21020147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 10 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>300912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 1 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G x 1/2 BD Precision Glide Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30G x 1/2 BD Precision Glide Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retroviral transduction of bone marrow progenitor cells to generate t-cell receptor retrogenic mice

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively. The vast array of TCRs proves studying a specific antigenic response difficult. Therefore, TCR transgenic mice were made to study positive and negative selection in the thymus as well as peripheral T cell activation, proliferation and tolerance. However, relatively few TCR transgenic mice have been generated specific to any given antigen. Thus, studies involving TCRs of varying affinities for the same antigenic peptide have been lacking. The generation of a new TCR transgenic line can take six or more months. Additionally, any specific backcrosses can take an additional six months. In order to allow faster generation and screening of multiple TCRs, a protocol for retroviral transduction of bone marrow was established with stoichiometric expression of the TCR&#945; and TCR&#946; chains and the generation of retrogenic mice. Each retrogenic mouse is essentially a founder, virtually negating a founder effect, while the length of time to generate a TCR retrogenic is cut from six months to approximately six weeks. Here we present a rapid and flexible alternative to TCR transgenic mice that can be expressed on any chosen background with any particular TCR.

Knochenmark Transduktionseffizienz bei Schritt 13.3 des Protokolls überprüft , bevor das Knochenmark in Schwanzvene iv In der repräsentativen bone marrow Transduktion Figur (1A) eingespritzt wird, ungefähr 10 &amp; mgr; l der geernteten Knochenmark wurden zu 100-ul PBS und für ametrine Expression analysiert. Im allgemeinen der Prozentsatz der fluoreszierenden positiven Zellen liegt zwischen 25% und 70%, abhängig von dem Konstrukt und retrovirale Titer. Nach 6 Wochen Knochenmark - Injektion werden die Mäuse ausgeblutet bone marrow Rekonstitution (1B) zu bestimmen. Etwa 25 &amp; mgr; l der peripheren Blut wurde von roten Blutkörperchen lysiert und mit anti-TCR &amp; bgr;. In 2B alle TCR - positiven Zellen concordantly das Protein ametrine Fluoreszenz auszudrücken. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54196/54196fig1.jpg" /> FiguRe 1. Beispiel für Knochenmark Transduction and Peripheral TCR Retrogenic T - Zellen. A) Transduktionseffizienz von Knochenmarkzellen auf der Fluoreszenzmarker (ametrine) am Tag der Knochenmarkübertragung analysiert basiert. Ungefähr 10 ul Knochenmark geerntet wurden zu 100 ul PBS zugegeben und ametrine Expression analysiert. Eine erfolgreiche Knochenmarkübertragung einen Prozentsatz von fluoreszierenden positiven Zellen zwischen 25% Ausbeute und 70%. B) Beispiel für TCR retrogenic T - Zellen im peripheren Blut 6 Wochen Knochenmark Rekonstitution stellen. Peripheres Blut wurde erhalten und die roten Blutkörperchen wurden mit RBC-Lyse-Puffer lysiert. Die verbleibenden Zellen wurden TCR &amp; bgr; gefärbt. Repräsentative Analyse für ametrine Expression und anti-TCR &amp; bgr; Anfärben 6 Wochen Knochenmark Rekonstitution schreiben. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54196/54196fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54196/54196fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version von t anzuzeigen</a>seine Figur.

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Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

We present a rapid and flexible protocol for a single T cell receptor (TCR) retroviral-based in vivo expression system. Retroviral vectors are used to transduce bone marrow progenitor cells to study T cell development and function of a single TCR in vivo as an alternative to TCR transgenic mice.

Retrovirale Transduktion von Knochenmark-Progenitorzellen zu generieren T-Zell-Rezeptor Retrogenic Mäuse

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

retroviral-transduction-bone-marrow-progenitor-cells-to-generate-t

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.5K Aufrufe.  Baylor College of Medicine. We present a rapid and flexible protocol for a single T cell receptor (TCR) retroviral-based in vivo expression system. Retroviral vectors are used to transduce bone marrow progenitor cells to study T cell development and function of a single TCR in vivo as an alternative to TCR transgenic mice.

Serie: Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged antigen-specific T cell receptor (TCR) have been an indispensable tool to study T cell development and function. However, such TCRs are usually isolated from the relevant T cells after long-term culture often following repeated antigen stimulation, which unavoidably selects for T cells with high affinity. Random genomic integration of the TCR &alpha;- and &beta;-chain and expression from non-endogenous promoters can lead to variations in expression level and kinetics.
Epigenetic reprogramming via somatic cell nuclear transfer provides a tool to generate embryonic stem cells and mice from any cell of interest. Consequently, when SCNT is applied to T cells of known specificity, these genetic V(D)J rearrangements are transferred to the SCNT-embryonic stem cells (ESCs) and the mice derived from them, while epigenetic marks are reset. We have demonstrated that T cells with pre-defined specificities against Toxoplasma gondii can be used to generate mouse models that express the specific TCR from their endogenous loci, without experimentally introduced genetic modification. The relative ease and speed with which such transnuclear models can be obtained holds promise for the construction of other disease models.

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

We demonstrate here that epigenetic reprogramming via Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT) can be used as a tool to generate mouse models with pre-defined T cell receptor (TCR) specificities. These transnuclear mice express the corresponding TCR from their endogenous locus under the control of the endogenous promoter.

Transnuclear Mäuse mit vordefinierten T-Zell-Rezeptor Spezifitäten gegen Toxoplasma gondii Via SCNT Erhalten

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

Retrovirale Transduktion von T-Zell-Rezeptoren in Maus-T-Zellen

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because of their powerful microbicidal activities. Macrophages are widely distributed throughout the body and are present in the lymphoid organs, liver, lungs, gastrointestinal tract, central nervous system, bone, and skin. Because of their repartition, they participate in a wide range of physiological and pathological processes. Macrophages are highly versatile cells that are able to recognize microenvironmental alterations and to maintain tissue homeostasis. Numerous pathogens have evolved mechanisms to use macrophages as Trojan horses to survive, replicate in, and infect both humans and animals and to propagate throughout the body. The recent explosion of interest in evolutionary, genetic, and biochemical aspects of host-pathogen interactions has renewed scientific attention regarding macrophages. Here, we describe a procedure to isolate and cultivate macrophages from murine bone marrow that will provide large numbers of macrophages for studying host-pathogen interactions as well as other processes.

Macrophages have long been recognized as a critical component of the innate and adaptive immune responses. The recent explosion of knowledge pertaining to evolutionary, genetic, and biochemical aspects of the interaction between macrophages and microbes has renewed scientific attention to macrophages. This article describes a method to differentiate macrophages from mouse bone marrow.

Knochenmark-abgeleiteten Makrophagen-Produktion

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Murine Hind Limb Long Bone Dissection and Bone Marrow Isolation

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, biomechanics, and stem cell biology. Despite the importance of the bone in healthy and pathologic states, however, it is a largely under-researched organ due to lack of specialized knowledge of bone dissection and bone marrow isolation. Mice are a common model organism to study effects on bone and bone marrow, necessitating a standardized and efficient method for long bone dissection and bone marrow isolation for processing of large experimental cohorts. We describe a straightforward dissection procedure for the removal of the femur and tibia that is suitable for downstream applications, including but not limited to histomorphologic analysis and strength testing. In addition, we outline a rapid procedure for isolation of bone marrow from the long bones via centrifugation with limited handling time, ideal for cell sorting, primary cell culture, or DNA, RNA, and protein extraction. The protocol is streamlined for rapid processing of samples to limit experimental error, and is standardized to minimize user-to-user variability.

Here we present a protocol for the dissection of hind limb long bones (femurs and tibiae) from the laboratory mouse. We further describe a rapid technique for bone marrow isolation from these bones that utilizes centrifugation for removal of bone marrow from the bone marrow space.

Murine Hind Gliedmaßen langen Knochen Dissection und Knochenmark-Isolation

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, cloning TCRs specific for various tumor-associated antigens has been the goal of many studies. To elicit an effective T cell response, the TCR must recognize the target antigen with optimal affinity. However, cloning such TCRs has been a challenge and many available TCRs possess sub-optimal affinity for the cognate antigen. In this protocol, we describe a method of cloning de novo high affinity antigen-specific TCRs using existing TCRs by exploiting hemichain centricity. It is known that for some TCRs, each TCR&#945; or TCR&#946; hemichain do not contribute equally to antigen recognition, and the dominant hemichain is referred to as the centric hemichain. We have shown that by pairing the centric hemichain with counter-chains differing from the original counter-chain, we are able to maintain the antigen specificity, while modulating its interaction strength for the cognate antigen. Thus, the therapeutic potential of a given TCR can be improved by optimizing the pairing between the centric and counter hemichains.

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Herein we describe a novel method to generate antigen-specific T cell receptors (TCRs) by pairing the TCR&#945; or TCR&#946; of an existing TCR, possessing the antigen-specificity of interest, with complementary hemichain of the peripheral T cell receptor repertoire. The de novo generated TCRs retain antigen-specificity with varying affinity.

Generieren<em&gt; De Novo</em&gt; Antigen-spezifische Zellrezeptoren humanen T von Retrovirale Transduktion von Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents autoimmunity. Many approaches involving different model organisms have been utilized to understand the mechanisms controlling helper T cell development and function. However, studies using mouse models have proven to be highly informative due to the availability of genetic, cellular, and biochemical systems. One genetic approach in mice used by many labs involves retroviral transduction of primary helper T cells. This is a powerful approach due to its relative ease, making it accessible to almost any laboratory with basic skills in molecular biology and immunology. Therefore, multiple genes in wild type or mutant forms can readily be tested for function in helper T cells to understand their importance and mechanisms of action. We have optimized this approach and describe here the protocols for production of high titer retroviruses, isolation of primary murine helper T cells, and their transduction by retroviruses and differentiation toward the different helper subsets. Finally, the use of this approach is described in uncovering mechanisms utilized by microRNAs (miRNAs) to regulate pathways controlling helper T cell development and function.

Many experimental systems have been utilized to understand the mechanisms regulating T cell development and function in an immune response. Here a genetic approach using retroviral transduction is described, which is economic, time efficient, and most importantly, highly informative in identifying regulatory pathways.

Retrovirale Transduktion von T-Helferzellen als genetischer Ansatz zur Untersuchung Mechanismen der Kontrolle ihrer Differenzierung und Funktion

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

An In Vivo Mouse Model to Measure Na&#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played by T cells in an immune response. This protocol describes the in vitro differentiation of bone marrow (BM) progenitors to obtain granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) derived-dendritic cells (DCs). The protocol also describes the adoptive transfer of ovalbumin peptide (OVAp)-loaded GM-CSF-derived DCs and na&#239;ve CD4 T cells from OTII transgenic mice in order to analyze the in vivo activation, proliferation, and Th1 differentiation of the transferred CD4 T cells. This protocol circumvents the limitation of purely in vivo methods imposed by the inability to specifically manipulate or select the studied cell population. Moreover, this protocol allows studies in an in vivo environment, thus avoiding alterations to functional factors that may occur in vitro and including the influence of cell types and other factors only found in intact organs. The protocol is a useful tool for generating changes in DCs and T cells that modify adaptive immune responses, potentially providing important results to understand the origin or development of numerous immune associated diseases.

Here, we present a protocol for the in vivo determination of na&#239;ve CD4 T cell (T cell) activation, proliferation, and Th1 differentiation induced by GM-CSF bone marrow (BM)-derived dendritic cells (DCs). In addition, this protocol describes BM and T-cell isolation, DC generation, and DC and T-cell adoptive transfer.

Eine In Vivo Mausmodell Maßnahme naive CD4-T-Zell-Aktivierung, Proliferation und Th1 Differenzierung induziert durch Knochenmark-abgeleitete Dendritische Zellen

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a myeloid-biased 39-antibody CyTOF panel to evaluate the hematopoietic system with a focus on the neutrophil-lineage cells by using this protocol. The CyTOF result was analyzed with an open-resource dimensional reduction algorithm, viSNE, and the data was presented to demonstrate the outcome of this protocol. We have discovered new neutrophil-lineage cell populations based on this protocol. This protocol of fresh whole BM preparation may be used for 1), CyTOF analysis to discover unidentified cell populations from whole BM, 2), investigating whole BM defects for patients with blood disorders such as leukemia, 3), assisting optimization of fluorescence-activated flow cytometry protocols that utilize fresh whole BM.

Here, we present a protocol to process fresh bone marrow (BM) isolated from mouse or human for high-dimensional mass cytometry (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analysis of neutrophil-lineage cells.

Vorbereitung des ganzen Knochenmarks für die Mass Cytometry Analyse von Neutrophilen-Linienzellen

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

Isolation of Lamina Propria Mononuclear Cells from Murine Colon Using Collagenase E

The intestine is the home to the largest number of immune cells in the body. The small and large intestinal immune systems police exposure to exogenous antigens and modulate responses to potent microbially derived immune stimuli. For this reason, the intestine is a major target site of immune dysregulation and inflammation in many diseases including but, not limited to inflammatory bowel diseases such as Crohn&#8217;s disease and ulcerative colitis, graft-versus-host disease (GVHD) after bone marrow transplantation (BMT), and many allergic and infectious conditions. Murine models of gastrointestinal inflammation and colitis are heavily used to study GI complications and to pre-clinically optimize strategies for prevention and treatment. Data gleaned from these models via isolation and phenotypic analysis of immune cells from the intestine is critical to further immune understanding that can be applied to ameliorate gastrointestinal and systemic inflammatory disorders. This report describes a highly effective protocol for the isolation of mononuclear cells (MNC) from the colon using a mixed silica-based density gradient interface. This method reproducibly isolates a significant number of viable leukocytes while minimizing contaminating debris, allowing subsequent immune phenotyping by flow cytometry or other methods.

The goal of this protocol is to isolate mononuclear cells that reside in the lamina propria of the colon by enzymatic digestion of the tissue using collagenase. This protocol allows for the efficient isolation of mononuclear cells resulting in a single cell suspension which in turn can be used for robust immunophenotyping.

Isolierung von Lamina Propria Mononukleären Zellen aus murine Colon mit Kollagenase E

The intestine is the home to the largest number of immune cells in the body. The small and large intestinal immune systems police exposure to exogenous ...

Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease

Allogeneic bone marrow transplantation (BMT) is an effective therapy for hematological malignancies due to the graft-versus-leukemia (GVL) effect to eradicate tumors. However, its application is limited by the development of graft-versus-host disease (GVHD), a major complication of BMT. GVHD is evoked when T-cells in the donor grafts recognizealloantigen expressed by recipient cells and mount unwanted immunological attacks against recipient healthy tissues. Thus, traditional therapies are designed to suppress donor T-cell alloreactivity. However, these approaches substantially impair the GVL effect so that the recipient&#39;s survival is not improved. Understanding the effects of therapeutic approaches on BMT, GVL, and GVHD, is thus essential. Due to the antigen-presenting and cytokine-secreting capacities to stimulate donor T-cells, recipient dendritic cells (DCs) play a significant role in the induction of GVHD. Therefore, targeting recipient DCs becomes a potential approach for controlling GVHD. This work provides a description of a novel BMT platform to investigate how host DCs regulate GVH and GVL responses after transplantation. Also presented is an effective BMT model to study the biology of GVHD and GVL after transplantation.

Graft-versus-host disease is a major complication after allogeneic bone marrow transplantation. Dendritic cells play a critical role in the pathogenesis of graft-versus-host disease. The current article describes a novel bone marrow transplantation platform to investigate the role of dendritic cells in the development of graft-versus-host disease and the graft-versus-leukemia effect.

Knochenmarktransplantationsplattform zur Untersuchung der Rolle dendritischer Zellen bei Graft-versus-Host-Krankheit

Allogeneic bone marrow transplantation (BMT) is an effective therapy for hematological malignancies due to the graft-versus-leukemia (GVL) effect to ...