Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal NIH (5K22A1119151-01 e 1R56DK104903-01) per MLB, Pilot / fattibilità del programma del Diabetes Research Center (P30-DK079638) al BCM, JDRF 1-FAC-2014-243-AN APF, ADA 1-15-JF-07, Carriere AAI in Immunologia Fellowship a MB, e The Robert e Janice McNair Fondazione.

Etica Dichiarazione: Ogni sforzo è fatto per mantenere il disagio degli animali o di stress al minimo durante l&#39;irradiazione e la coda vena iniezioni. I topi sono utilizzati come fonte di cellule in questi esperimenti; in quanto tale, non ci sono procedure o manipolazioni a parte l&#39;eutanasia. I topi saranno sacrificati da CO 2 inalazione seguita da dislocazione cervicale per confermare la morte. Questa procedura è coerente con le raccomandazioni del gruppo sull&#39;eutanasia della American Veterinary Medical Association. 1. Preparare retrovirale Construct <ol><li> Sotto-clone catene del recettore delle cellule T (TCR) alfa e beta, separati da un linker 2A, in un MSCV basata retrovirale 11 vettore (ad esempio, pMIAII o pMIGII) 11. NOTA: Il linker 2A permette di espressione stechiometrica e concorde delle catene alfa e beta TCR da un singolo fotogramma open reading. Il vettore comprende una cassetta IRES fluorescent proteina (ametrine o GFP) che viene utilizzato permonitorare le cellule trasdotte e efficienza di trasduzione. Per un protocollo dettagliato si rimanda Holst et al. 11 </li><li> Isolare plasmidi DNA utilizzando commercialmente ottenuto kit di preparazione al plasma o un prodotto simile. Utilizzare una concentrazione di lavoro di 1 - 2 mg ml -1. </li></ol> 2. Generazione di retrovirali produttrice di celle Lines <ol><li> Utilizzare un processo in due fasi per produrre linee cellulari produttore retrovirali. NOTA: Per un protocollo dettagliato, si prega di consultare Holst et al 11.. <ol><li> Genera retrovirus per trasfezione transiente di cellule 293T con tre plasmidi (pVSVG, PEQ-Pam3 (-E) e vettore di interessi 11) e prendere il surnatante retrovirale dalle cellule 293T di trasdurre la ecotropic linea cellulare produttore retrovirale GP + E86. </li><li> Isolare i primi 40% delle cellule che esprimono produttori fluorescenti GP + E86 da FACS e propagare le cellule produttrici + E86-GP transdcuced come fonte di virus. NOTA: La generazionedi produttori di alto titolo è fondamentale per un efficiente trasduzione di cellule del midollo osseo. Per un protocollo completo si prega di consultare Holst et al. 11 </li></ol></li></ol> 3. Retrovirus-mediata Stem Cell Gene Transfer (Giorno -5) <ol><li> Scongelare e cultura 0.5 -1.0 x 10 6 di ciascuna linea cellulare produttore GP + E86 in completo DMEM 10% (vol / vol) FBS per consentire una crescita sufficiente per due confluenti piastre da 150 mm per giorno 0 di questo protocollo. NOTA: Scongelamento 0,5-1,0 x 10 6 di ciascuna linea cellulare produttore GP + E86 in un piatto 10 centimetri consentirà di 30 - 50% di confluenza in occasione della Giornata 5. Ciò consente anche di 5 giorni di coltura al fine di espandere il GP + E86 linee cellulari di produttori alle due piastre confluenti 150 mm per giorno 0. <ol><li> Cultura linea cellulare produttore retrovirale nei media completa coltura tissutale contenente il 5% di siero di vitello feta, e la ciprofloxacina (10 mg / ml) per evitare la contaminazione da micoplasma. NOTA: Interrompere l&#39;uso della ciprofloxacina quando generating il surnatante virale per la trasduzione del midollo osseo. Evitare un eccesso di crescita della linea cellulare produttore, in quanto questo avrà un impatto negativo del midollo osseo efficienza di trasduzione. </li></ol></li></ol> 4. I topi donatori Iniettare con 5-fluorouracile (5-FU) (Giorno -3) <ol><li> Pesare il topo donatore (5 - 12 settimane) per determinare la quantità di 5-FU richiesto. Utilizzando topi di età inferiore a 5 settimane di risultati d&#39;età in bassa resa del midollo osseo. Per garantire l&#39;espressione di un singolo TCR, utilizzare un ceppo di topi carenti di cellule T, come SCID, straccio o TCR alfa topi deficienti come donatori di midollo osseo. </li><li> Lavorando in cappa coltura tissutale, diluire il magazzino 5-FU con PBS sterile per fare una sufficiente quantità di 10 mg ml -1 soluzione di lavoro di 5-FU per fornire 0,15 mg 5-FU per grammo di peso corporeo. </li><li> Usando una siringa da 1 ml con un ago 37 G, intraperitoneale iniettare 0,15 mg 5-FU per grammo di peso corporeo per topo donatore. NOTA: Usa il mouse 1 donatore per un destinatario per avviare e regolareil numero di topi donatori secondo il rendimento cella. Un metodo alternativo per il trattamento 5-FU per l&#39;arricchimento e l&#39;isolamento di progenitori midollari è selezione negativa di cellule positive lineage come descritto in Viret et al. </li></ol> 5. Bone Marrow Procedura di estrazione (giorno 0) <ol><li> Ottenere forbici dissezione e pinze per l&#39;isolamento delle ossa. Preparare supporti (HBSS integrata con 5% FCS (vol / vol)) per raccogliere le ossa in un tubo conico da 50 ml. Mantenere 50 ml conica contenente media su ghiaccio. Euthanize topi da CO 2 inalazione seguita da dislocazione cervicale per confermare la morte. Pinch zampa al fine di garantire non vengono rilevati riflessi. </li><li> Sterilizzare il sito chirurgico e strumenti chirurgici con etanolo o metanolo. Rimuovere il femore, tibia, omero, e cingolo pelvico con cura dal primo taglio e sotto la cintura pelvica. Tagliare lungo il femore alla tibia. Rimuovere tutti i tessuti circostanti con le forbici e pinze per ottenere ossa pulite. Tenereossa idratata in HBSS + 5% (vol / vol) FBS. </li><li> Separare le ossa tagliando a livello delle articolazioni, avendo cura di tagliare entrambe le estremità fuori di ogni osso. Inserire un ago 25-gauge collegato a una siringa da 10 ml contenente HBSS + 5% (vol / vol) FBS. Applicare una pressione e lavare tutto il midollo osseo attraverso un 70-micron filtro di riposo in una conica da 50 ml. </li><li> Periodicamente, spingere il midollo osseo attraverso il filtro 70 micron utilizzando lo stantuffo di una siringa da 1 ml e 3 ml. Risciacquare il filtro con HBSS + 5% (vol / vol) FBS. Ciò garantirà una sospensione singola cella che è libero di frammenti ossei e dei tessuti. Mantenere le cellule sterili eseguendo la procedura in una cappa sterile. </li><li> cellule del midollo osseo centrifugare a 300 xg per 10 min a 4 ° C. </li></ol> 6. midollo osseo Cultura (Giorno 0) <ol><li> supporti Decantare o aspirare e pellet cellulare risospendere in 1 ml di ammonio tampone a base di cloruro di lisi dei globuli rossi (RBC o tampone di lisi equivalente) per tubo da 50 ml. Dopo 1 min di incubazione a cameratemperatura, spegnere il tampone di lisi dei globuli rossi aggiungendo 10 ml di DMEM completo 20% (vol / vol) FBS. </li><li> cellule centrifugare a 300 xg per 10 minuti a 4 ° C. </li><li> Decantare o aspirare il surnatante e risospendere midollo osseo in 5 ml completo DMEM 20% (vol / vol) FBS. Contare le cellule con una camera di conta Neubauer. NOTA: la resa generale dovrebbe essere di circa 5 - 10 x 10 6 cellule per il mouse; Tuttavia, la resa può variare tra i diversi ceppi di topi. </li><li> Piatto cellule del midollo osseo con una densità di 4 x 10 7 cellule per piastra da 150 mm in 30 ml di DMEM completo 20% (vol / vol) supplementato con FBS IL-3 (20 g ml -1), IL-6 (50 g ml -1) e SCF (50 g ml -1). NOTA: utilizzare citochine appena scongelati-aliquotati. Non utilizzare citochine che sono stati congelati e scongelati più di una o conservati a 4 ° C per più di 2 settimane. </li><li> Incubare midollo osseo durante la notte (circa 24 ore) a 37 ° C con 5% di CO 2. </li></ol><ol><li> Piastra 3 x 10 cellule produttrici 6 retrovirali per piastra da 150 mm in 18 ml completo DMEM 20% (vol / vol) FBS. </li><li> Incubare cellule produttrici retrovirali a 37 ° C durante la notte. Anticipare una piastra da 150 mm per 15 milioni di cellule del midollo osseo (circa 2 - 3 topi donatore). </li></ol> 8. Retroviral Surnatante (1 ° giorno) <ol><li> Il giorno successivo (circa 24 ore più tardi), raccogliere il surnatante retrovirale dalle piastre di produttori (istituito nel passo 7) elaborando il surnatante retrovirale direttamente fuori della piastra di 150 mm con una siringa da 10 ml e filtro con un 0,45 Filtro siringa -μm. </li><li> Ricollocare accuratamente il surnatante retrovirale rimosso con 18 ml di DMEM fresco completa al 20% (vol / vol) FBS. </li><li> Supplemento il surnatante retrovirale filtrata con IL-3 (20 g ml -1), IL-6 (50 g ml -1), MSCF (50 g ml -1) e Hexadimethrine bromuro (Polybrene) (6 &amp;# 956; g ml -1). NOTA: Hexadimethrine bromuro deve essere fatta fresca ogni 2 mesi per evitare un calo di efficacia di trasduzione retrovirale. </li></ol> 9. midollo osseo Harvest (1 ° giorno) <ol><li> Dopo aver completato la fase 8.3, raccogliere le cellule del midollo osseo a partire dal punto 6.4 e trasferire i supporti contenenti le cellule non aderenti in sterili tubi da 50 ml. </li><li> Lavare le piastre vigorosamente con 10 ml di PBS e raccogliere nel conica da 50 ml a partire dal punto 9.1. Se necessario, ripetere la fase di lavaggio. </li><li> Centrifugare le cellule a 300 xg per 10 minuti a 4 ° C, decantare il surnatante, risospendere le cellule in un piccolo volume (1 - 3 ml) completo DMEM 20% (vol / vol) FBS, e contano. Prevedere 50 - recupero 75% dal giorno 0. Risospendere midollo osseo a 1 x 10 6 cellule per 1 ml di surnatante retrovirale contenente citochine e Hexadimethrine bromuro. </li></ol> 10. midollo osseo trasduzione (1 ° giorno) <ol><li> Piatto il retrovirale surnatante ma / ossomiscela rrow ad un volume di 3 ml per pozzetto in una piastra di coltura tissutale sei pozzetti. Avvolgere le piastre in involucro di plastica per ridurre al minimo lo scambio di gas durante la centrifugazione al punto 10.2. </li><li> Spin le piastre a sei pozzetti avvolti a 1000 xg per 60 min a 37 ° C. </li><li> Dopo lo spin, rimuovere la pellicola trasparente e mettere le piastre in un incubatore a 37 ° C di CO 2 per 24 ore. </li></ol> 11. retrovirale surnatante e trasduzione (2 ° giorno) <ol><li> Dopo 24 ore, raccogliere il surnatante virale fresco dalla linea cellulare produttore virale. Filtrare il surnatante retrovirale utilizzando una siringa da 10 ml e un filtro a siringa da 0,45 micron. Supplemento surnatante filtrato retrovirale con IL-3 (20 g ml -1), IL-6 (50 g ml -1) e SCF (50 g ml -1) e Hexadimethrine bromuro (6 g ml -1). </li><li> Quindi, rimuovere delicatamente con pipetta o aspirare i primi 2 ml di media da ciascun pozzetto della piastra di sei pozzetti contenenti le cellule del midollo osseo. NOTA: Work attenzione a non aspirare il midollo osseo, che di solito è concentrata nel centro del pozzo. In alternativa, il surnatante eliminato può essere centrifugata per recuperare eventuali cellule del midollo osseo persi. </li><li> Per ogni bene nel midollo osseo 6 pozzetti aggiungere 3 ml di surnatante contenente citochine virali freschi e Hexadimethrine bromuro. Avvolgere le piastre in plastica, e ripetere la trasduzione centrifugare a 1000 xg per 60 min a 37 ° C. Scartare le piastre e incubare le cellule a 37 ° C e 5% CO 2 durante la notte (circa 24 ore). </li></ol> 12. L&#39;aggiunta di fresco Integrata DMEM (3 ° giorno) <ol><li> Dopo 24 ore, rimuovere la parte superiore 2 ml di media da ciascun pozzetto della piastra di sei pozzetti contenenti le cellule del midollo osseo, come al punto 11.2. Sostituire il supporto rimosso con DMEM fresco 20% (vol / vol) FBS supplementato con concentrazioni finali di IL-3 (20 g ml -1), IL-6 (50 g ml -1) e SCF (50 g ml -1) . </li><li> Incubare midollo osseopiastre a 37 ° C CO 2 incubatore per un altro 24 ore. </li></ol> 13. Harvest trasduzione del midollo osseo (4 ° giorno) <ol><li> Dopo 24 ore, raccogliere le cellule del midollo osseo dalle piastre a sei pozzetti. Lavare le piastre energicamente con PBS per rimuovere tutte le cellule non aderenti. <ol><li> Centrifugare le cellule a 300 xg per 10 min a 4 ° C e decantare il surnatante. </li><li> Risospendere il midollo osseo in un piccolo volume (1 ml) di PBS + 0,5% (vol / vol) inattivato al calore FBS. Mantenere le cellule in ghiaccio. </li></ol></li><li> Prelevare un campione di 10 ml di ogni condizione di midollo osseo e contare le cellule utilizzando una camera di conta Neubauer. Supponendo 1 - 2 donatore al ricevente, il rendimento sarà sufficiente a trasferire almeno 4 x 10 6 cellule per topo ricevente. Risospendere il midollo osseo in un sufficiente volume di PBS + 0,5% (vol / vol) inattivato al calore FBS per iniettare 200 - 300 ml per topo. <ol><li> Iniettare almeno 2 x 10 6 cellule con una efficienza di trasduzionedel 25% (può iniettare fino a 8 x10 6 celle) per topo per via endovenosa. NOTA: Noi abitualmente iniettare cinque topi riceventi per due 6 pozzetti di cellule del midollo osseo. Se la resa è notevolmente inferiore, più topi donatori devono essere utilizzati fino a quando è possibile ottenere il numero di midollo osseo sufficiente. Al fine di raggiungere ricostituzione ottimale, almeno 5 x 10 5 trasdotte (fluorescente positiva) deve essere iniettato in ciascun destinatario. </li></ol></li><li> Con una micro pipetta, prelevare un campione di 10 ml di ogni condizione di midollo osseo e di analizzare l&#39;efficienza di trasduzione mediante citometria a flusso basato sulla espressione del marcatore fluorescente (Figura 1A) 11. NOTA: in generale, la percentuale di cellule positive fluorescenti è tra il 25% e il 70%, a seconda del costrutto e titolo retrovirale. Il numero di cellule del midollo osseo trasdotte necessario ricostituire un mouse sub-letale irradiate può variare a seconda della efficienza di trasduzione. Più basso è il tranefficienza sduction, le cellule del midollo più ossee richiesto e viceversa, maggiore è l&#39;efficienza di trasduzione midollo osseo, il minor numero di cellule nella ricostituzione. efficienza di trasduzione di sotto del 25% è ottimale e può provocare la ricostituzione e la sopravvivenza insufficiente. Al fine di garantire il recupero del midollo osseo ottimale e l&#39;efficienza di trasduzione, utilizzare i media e citochine coltura di tessuti preparati al momento. Quando esprimere una nuova TCR utilizzando il sistema retrogenic, la selezione di tale TCR in vivo è sconosciuta. A seconda ogni singolo affinità TCR, selezione TCR nel timo e di espressione di cellule T periferico varierà 17. </li></ol> 14. mouse irradiazione, midollo osseo iniezione e cura <ol><li> Irradiare topi il giorno prima dell&#39;iniezione di midollo osseo (stesso giorno Fase 13). Utilizzare i seguenti dosaggi: C57BL / 6 topi (e altri ceppi wild type), 900 rad; RAG1 - / - mice, 500 RADS; topi SCID, 300 RADS). <ol><li> topi Luogo destinatario sul amoxicillina (50 mg / kg / giorno) o un altro trattamento dell&#39;acqua antibiotico prima dell&#39;irraggiamento, e mantenere antibiotici per le prime due settimane dopo l&#39;iniezione di midollo osseo. NOTA: la dose di irradiazione ottimale può essere determinato empiricamente. </li></ol></li><li> Per l&#39;iniezione, caricare le cellule a partire dal punto 13.1 in una siringa da 1 ml con aghi smussati immediatamente prima dell&#39;iniezione, quindi cambiare l&#39;ago 27-gauge per l&#39;iniezione, espellere l&#39;aria per evitare embolia gassosa. topi calore sotto una lampada riscaldante e iniettano 0,2 ml di midollo osseo per topo per via endovenosa. NOTA: Non lasciate che le cellule si siedono nella siringa per un certo periodo di tempo o le cellule si accontentano. </li><li> Monitorare i topi settimanale per assicurarsi che rimangano in buona salute. </li><li> Dopo 5 - 6 settimane sfiatare i topi per verificare ricostituzione sulla base di GFP + / + ametrine e co-espressione TCR (Figura 1B) 11. </li></ol>

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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inhibitory+cytokine+IL-35+contributes+to+regulatory+T-cell+function.">The inhibitory cytokine IL-35 contributes to regulatory T-cell function.</a> Nature. 450, 566-569 (2007).</li><li>Holst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+signaling+mediated+by+T+cell+antigen+receptor-CD3+ITAMs+ensures+effective+negative+selection+and+prevents+autoimmunity.">Scalable signaling mediated by T cell antigen receptor-CD3 ITAMs ensures effective negative selection and prevents autoimmunity.</a> Nature immunology. 9, 658-666 (2008).</li><li>Kalos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+with+chimeric+antigen+receptors+have+potent+antitumor+effects+and+can+establish+memory+in+patients+with+advanced+leukemia.">T cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establish memory in patients with advanced leukemia.</a> Sci Transl Med. 3, 95ra73 (2011).</li><li>VanSeggelen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+Cells+Engineered+With+Chimeric+Antigen+Receptors+Targeting+NKG2D+Ligands+Display+Lethal+Toxicity+in+Mice.">T Cells Engineered With Chimeric Antigen Receptors Targeting NKG2D Ligands Display Lethal Toxicity in Mice.</a> Mol Ther. 23, 1600-1610 (2015).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Nel protocollo, abbiamo dettaglio diversi passaggi critici per garantire la salute del midollo osseo ottimale, l&#39;efficienza di trasduzione e la ricostituzione. Il primo passo fondamentale è la generazione e la corretta manutenzione delle cellule produttrici virale GP + E86. Utilizzare linee cellulari produttori di passaggio precoce e mantenere a 80% di confluenza o inferiore prima dell&#39;uso. Quando si effettuano fresche cellule produttrici virale GP + E86, garantire le cellule 293T sono di passaggio precoce e in crescita in coltura per 24 - 48 ore. Placcatura troppe cellule GP + E86 durante la fase di trasduzione abbasserà titolo virale. Determinare titolo virale, come descritto nella Holst et al. 11 al fine di garantire GP + E86 sono robusti produttori virali. Inoltre, la rimozione dei globuli rossi dal midollo osseo raccolte migliora l&#39;efficienza di trasduzione. Garantire la salute dei progenitori del midollo osseo è un fattore critico per il successo del protocollo. A tal fine, utilizzare sempre mezzi freschi (meno di 4 settimane a 4 ° C dopo integrato con FCS) e citochine freschi (menodi 2 settimane, conservato a 4 ° C). bromuro Hexadimethrine è anche sensibile alla degradazione e dovrebbe essere fatta fresca, una volta che è in soluzione, ogni 2 mesi. Altri dettagli che garantiranno la salute del midollo osseo ottimale e la trasduzione comprendono pre-riscaldamento della centrifuga prima della trasduzione di spin. Spin-trasdurre a 37 ° C e avvolgere piastre con pellicola trasparente per diminuire lo scambio di gas il più possibile. Inoltre, non lasciare che il midollo osseo sedersi fuori dell&#39;incubatore 37 ° C o in ghiaccio per lunghi periodi di tempo come questo aumenterà la morte delle cellule e diminuire osso trasduzione osseo e la ricostituzione. Dopo che le cellule del midollo osseo sono state raccolte al 4 ° giorno (passo 13), caricare solo le siringhe immediatamente prima di iniettare i topi. Infine, assicurano che i topi sono immessi sul antibiotici il giorno prima o il giorno della irradiazione. Utilizzo di questo retrovirale mediata protocollo trasduzione consente la trasduzione di cellule progenitrici del midollo osseo con conseguentela generazione di T del recettore delle cellule topi retrogenic. topi Retrogenic sono più veloci per generare di TCR topi transgenici e costo notevolmente inferiore a generare un singolo transgenico TCR. Tuttavia, i topi retrogenic non possono essere allevati e mosto generati nuovo con ogni esperimento 10. Il numero di cellule T periferiche sono più bassi nei topi retrogenic di quanto visto in TCR topi transgenici comunque la regolazione del TCR è paragonabile tra il TCR retrogenic e TCR transgenici 10. Il sistema retrogenic TCR permette l&#39;espressione di molteplici TCR all&#39;interno della stessa colonia e anche all&#39;interno dello stesso esperimento. Utilizzando il protocollo retrogenic TCR qui descritto consente un investigatore per testare e schermare lo sviluppo e la funzionalità di numerosi MHC di classe di recente identificazione I o II TCR ristretti. Con lo sviluppo del modello &quot;mouse umanizzato&quot; 18,19, il retrogenic TCR potrebbe essere ulteriormente espansa utilizzando TCR umani clonati. Inoltre, la 2A collegato costrutti cun essere utilizzato anche per studiare altri multi-proteine, tra cui le catene CD3, interleuchine e recettori chimerici antigene 20-24.

Recettore delle cellule T (TCR) repertorio di esseri umani e topi è stato stimato a 1 x 10 8 e 2 x 10 6 TCR unici rispettivamente 1,2. Questa grande diversità permette cellule T di riconoscere una vasta gamma di epitopi antigenici derivati ​​da auto-peptidi e da agenti patogeni presentati dal complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) sulle cellule presentanti l&#39;antigene (APC). Le sottili differenze nelle interazioni dei TCR con unici complessi peptide-MHC determinano se una cellula T subirà apoptosi, anergia, l&#39;attivazione, la differenziazione, la produzione di citochine e citotossicità. Tuttavia, a causa della grande repertorio TCR, analisi di come una determinata TCR risponderà a un particolare antigene richiede l&#39;utilizzo di sistemi singoli TCR. Vari topi transgenici TCR sono state generate per studiare la funzione di un singolo TCR in un modello in vivo 3-9. Tuttavia, ci sono avvertimenti di TCR topi transgenici compresa lacosto, la lunghezza di tempo per generare un singolo topo transgenico e il cosiddetto effetto fondatore di inserimento transgene casuale nel DNA germinale 10. Pertanto, relativamente pochi topi transgenici TCR sono stati generati per un dato antigene e le implicazioni funzionali di alta e bassa affinità TCR per lo stesso epitopo sono raramente affrontati. Per affrontare la necessità di un avvicinamento rapido alla schermata e studiare più TCR singolarmente o in combinazione, topi retrogenic ( &#39;retro&#39; da retrovirus e &#39;geniche&#39; dal transgenici) sono stati utilizzati come alternativa al TCR topi transgenici 11-13. Il motivo di consenso 2A peptide trovato all&#39;interno di diversi virus sono costituiti da un 2A-Asp-Val / Ile-Glut-X-Asn-Pro-Gly-2B-Pro, in cui scissione avviene tra la glicina del 2A e prolina del 2B da cis -acting attività idrolasi, con conseguente salto ribosomiale durante la traduzione 10,14-16. Per uno schema dettagliato raffigurante la cleavage dei vari peptidi 2A (F2A, E2A, T2A e P2A) consultare i riferimenti 10 - 12. In questo modo, 2 cistroni (TCR alfa e beta TCR) possono essere collegati con conseguente traduzione stechiometrica in un singolo vettore. Utilizzando questo approccio, siamo in grado di esprimere e confrontare direttamente più TCR specifici antigeni in vivo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose + glutamine</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>Dulbecco&#39;s Modification of Eagle&#39;s Medium with 4.5 g/L glucose, L-glutamine &#38; sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Atlanta Biological</td>
			<td>S11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-Versene</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-161F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 um syringe filter</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>194-2545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polybrene</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9268-10G</td>
			<td>Sterile Filtered in dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>AAJ61970-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-fluorouracil (5-FU)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>AAA13456-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>25-000-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM nonessential Amino Acids</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>25-025-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES 1M solution</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>25-060-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strept</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>25-005-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm tissue culture dishes</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>639160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tisue culture-treated 6-well flat plate</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 um nylon cell strainers</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-3</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PMC0033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human IL-6</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>&#160;PHC0063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Stem Cell Factor</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PMC2113L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>46-D13-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HANKS Buffer</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>21020147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 10 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>300912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 1 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G x 1/2 BD Precision Glide Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30G x 1/2 BD Precision Glide Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retroviral transduction of bone marrow progenitor cells to generate t-cell receptor retrogenic mice

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively. The vast array of TCRs proves studying a specific antigenic response difficult. Therefore, TCR transgenic mice were made to study positive and negative selection in the thymus as well as peripheral T cell activation, proliferation and tolerance. However, relatively few TCR transgenic mice have been generated specific to any given antigen. Thus, studies involving TCRs of varying affinities for the same antigenic peptide have been lacking. The generation of a new TCR transgenic line can take six or more months. Additionally, any specific backcrosses can take an additional six months. In order to allow faster generation and screening of multiple TCRs, a protocol for retroviral transduction of bone marrow was established with stoichiometric expression of the TCR&#945; and TCR&#946; chains and the generation of retrogenic mice. Each retrogenic mouse is essentially a founder, virtually negating a founder effect, while the length of time to generate a TCR retrogenic is cut from six months to approximately six weeks. Here we present a rapid and flexible alternative to TCR transgenic mice that can be expressed on any chosen background with any particular TCR.

Bone efficienza osseo trasduzione viene controllato nel passo 13.3 del protocollo prima del midollo osseo viene iniettato in vena della coda iv In rappresentante midollo osseo trasduzione figura (Figura 1A), circa 10 ml di midollo osseo raccolto è stato aggiunto a 100 ml di PBS e analizzate per l&#39;espressione ametrino. Generalmente la percentuale di cellule positive fluorescenti è tra il 25% e il 70%, a seconda del costrutto e titolo retrovirale. Dopo 6 settimane iniezione midollo osseo, i topi vengono spurgati per determinare la ricostituzione del midollo osseo (Figura 1B). Circa 25 ml di sangue periferico è stato globuli rossi lisati e colorati con anti-TCRβ. Nella figura 2B tutte le cellule positive TCR concordemente esprimono la proteina fluorescente ametrino. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54196/54196fig1.jpg" /> Figure 1. Esempio di cellule del midollo osseo di trasduzione e periferico TCR Retrogenic T. A) trasduzione efficienza delle cellule del midollo osseo viene analizzato sulla base del marcatore fluorescente (ametrino) il giorno del trasferimento del midollo osseo. Circa 10 ml di midollo osseo raccolto è stato aggiunto a 100 ml di PBS e analizzate per l&#39;espressione ametrino. Un successo trasduzione midollo osseo produrrà una percentuale di cellule positive fluorescenti tra il 25% e il 70%. B) Esempio di cellule T retrogenic TCR nel sangue periferico 6 settimane dopo la ricostituzione del midollo osseo. Il sangue periferico è stata ottenuta e globuli rossi sono state lisate con tampone di lisi RBC. Le cellule rimanenti sono state colorate per TCRβ. Analisi Rappresentante per l&#39;espressione Ametrino e anti-TCRβ colorazione 6 settimane dopo la ricostituzione del midollo osseo. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54196/54196fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di t</a>la sua figura.

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Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

We present a rapid and flexible protocol for a single T cell receptor (TCR) retroviral-based in vivo expression system. Retroviral vectors are used to transduce bone marrow progenitor cells to study T cell development and function of a single TCR in vivo as an alternative to TCR transgenic mice.

Trasduzione retrovirale di cellule progenitrici del midollo osseo per generare cellule T del recettore Retrogenic Mice

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

retroviral-transduction-bone-marrow-progenitor-cells-to-generate-t

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.5K Views.  Baylor College of Medicine. We present a rapid and flexible protocol for a single T cell receptor (TCR) retroviral-based in vivo expression system. Retroviral vectors are used to transduce bone marrow progenitor cells to study T cell development and function of a single TCR in vivo as an alternative to TCR transgenic mice.

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Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged antigen-specific T cell receptor (TCR) have been an indispensable tool to study T cell development and function. However, such TCRs are usually isolated from the relevant T cells after long-term culture often following repeated antigen stimulation, which unavoidably selects for T cells with high affinity. Random genomic integration of the TCR &alpha;- and &beta;-chain and expression from non-endogenous promoters can lead to variations in expression level and kinetics.
Epigenetic reprogramming via somatic cell nuclear transfer provides a tool to generate embryonic stem cells and mice from any cell of interest. Consequently, when SCNT is applied to T cells of known specificity, these genetic V(D)J rearrangements are transferred to the SCNT-embryonic stem cells (ESCs) and the mice derived from them, while epigenetic marks are reset. We have demonstrated that T cells with pre-defined specificities against Toxoplasma gondii can be used to generate mouse models that express the specific TCR from their endogenous loci, without experimentally introduced genetic modification. The relative ease and speed with which such transnuclear models can be obtained holds promise for the construction of other disease models.

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

We demonstrate here that epigenetic reprogramming via Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT) can be used as a tool to generate mouse models with pre-defined T cell receptor (TCR) specificities. These transnuclear mice express the corresponding TCR from their endogenous locus under the control of the endogenous promoter.

I topi con Transnuclear predefiniti Specificità cellule T contro il recettore Toxoplasma gondii Ottenuto Via SCNT

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

Trasduzione retrovirale di recettori delle cellule T nel topo le cellule T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because of their powerful microbicidal activities. Macrophages are widely distributed throughout the body and are present in the lymphoid organs, liver, lungs, gastrointestinal tract, central nervous system, bone, and skin. Because of their repartition, they participate in a wide range of physiological and pathological processes. Macrophages are highly versatile cells that are able to recognize microenvironmental alterations and to maintain tissue homeostasis. Numerous pathogens have evolved mechanisms to use macrophages as Trojan horses to survive, replicate in, and infect both humans and animals and to propagate throughout the body. The recent explosion of interest in evolutionary, genetic, and biochemical aspects of host-pathogen interactions has renewed scientific attention regarding macrophages. Here, we describe a procedure to isolate and cultivate macrophages from murine bone marrow that will provide large numbers of macrophages for studying host-pathogen interactions as well as other processes.

Macrophages have long been recognized as a critical component of the innate and adaptive immune responses. The recent explosion of knowledge pertaining to evolutionary, genetic, and biochemical aspects of the interaction between macrophages and microbes has renewed scientific attention to macrophages. This article describes a method to differentiate macrophages from mouse bone marrow.

Derivate dal midollo osseo macrofagi Production

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Murine Hind Limb Long Bone Dissection and Bone Marrow Isolation

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, biomechanics, and stem cell biology. Despite the importance of the bone in healthy and pathologic states, however, it is a largely under-researched organ due to lack of specialized knowledge of bone dissection and bone marrow isolation. Mice are a common model organism to study effects on bone and bone marrow, necessitating a standardized and efficient method for long bone dissection and bone marrow isolation for processing of large experimental cohorts. We describe a straightforward dissection procedure for the removal of the femur and tibia that is suitable for downstream applications, including but not limited to histomorphologic analysis and strength testing. In addition, we outline a rapid procedure for isolation of bone marrow from the long bones via centrifugation with limited handling time, ideal for cell sorting, primary cell culture, or DNA, RNA, and protein extraction. The protocol is streamlined for rapid processing of samples to limit experimental error, and is standardized to minimize user-to-user variability.

Here we present a protocol for the dissection of hind limb long bones (femurs and tibiae) from the laboratory mouse. We further describe a rapid technique for bone marrow isolation from these bones that utilizes centrifugation for removal of bone marrow from the bone marrow space.

Murino arto posteriore osso lungo dissezione e isolamento di midollo osseo

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, cloning TCRs specific for various tumor-associated antigens has been the goal of many studies. To elicit an effective T cell response, the TCR must recognize the target antigen with optimal affinity. However, cloning such TCRs has been a challenge and many available TCRs possess sub-optimal affinity for the cognate antigen. In this protocol, we describe a method of cloning de novo high affinity antigen-specific TCRs using existing TCRs by exploiting hemichain centricity. It is known that for some TCRs, each TCR&#945; or TCR&#946; hemichain do not contribute equally to antigen recognition, and the dominant hemichain is referred to as the centric hemichain. We have shown that by pairing the centric hemichain with counter-chains differing from the original counter-chain, we are able to maintain the antigen specificity, while modulating its interaction strength for the cognate antigen. Thus, the therapeutic potential of a given TCR can be improved by optimizing the pairing between the centric and counter hemichains.

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Herein we describe a novel method to generate antigen-specific T cell receptors (TCRs) by pairing the TCR&#945; or TCR&#946; of an existing TCR, possessing the antigen-specificity of interest, with complementary hemichain of the peripheral T cell receptor repertoire. The de novo generated TCRs retain antigen-specificity with varying affinity.

Generazione<em&gt; De Novo</em&gt; Antigene-specifici T umana recettori cellulari di trasduzione retrovirale di Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents autoimmunity. Many approaches involving different model organisms have been utilized to understand the mechanisms controlling helper T cell development and function. However, studies using mouse models have proven to be highly informative due to the availability of genetic, cellular, and biochemical systems. One genetic approach in mice used by many labs involves retroviral transduction of primary helper T cells. This is a powerful approach due to its relative ease, making it accessible to almost any laboratory with basic skills in molecular biology and immunology. Therefore, multiple genes in wild type or mutant forms can readily be tested for function in helper T cells to understand their importance and mechanisms of action. We have optimized this approach and describe here the protocols for production of high titer retroviruses, isolation of primary murine helper T cells, and their transduction by retroviruses and differentiation toward the different helper subsets. Finally, the use of this approach is described in uncovering mechanisms utilized by microRNAs (miRNAs) to regulate pathways controlling helper T cell development and function.

Many experimental systems have been utilized to understand the mechanisms regulating T cell development and function in an immune response. Here a genetic approach using retroviral transduction is described, which is economic, time efficient, and most importantly, highly informative in identifying regulatory pathways.

Trasduzione retrovirale di cellule T helper come un approccio genetico per studiare meccanismi che controllano la loro differenziazione e funzione

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

An In Vivo Mouse Model to Measure Na&#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played by T cells in an immune response. This protocol describes the in vitro differentiation of bone marrow (BM) progenitors to obtain granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) derived-dendritic cells (DCs). The protocol also describes the adoptive transfer of ovalbumin peptide (OVAp)-loaded GM-CSF-derived DCs and na&#239;ve CD4 T cells from OTII transgenic mice in order to analyze the in vivo activation, proliferation, and Th1 differentiation of the transferred CD4 T cells. This protocol circumvents the limitation of purely in vivo methods imposed by the inability to specifically manipulate or select the studied cell population. Moreover, this protocol allows studies in an in vivo environment, thus avoiding alterations to functional factors that may occur in vitro and including the influence of cell types and other factors only found in intact organs. The protocol is a useful tool for generating changes in DCs and T cells that modify adaptive immune responses, potentially providing important results to understand the origin or development of numerous immune associated diseases.

Here, we present a protocol for the in vivo determination of na&#239;ve CD4 T cell (T cell) activation, proliferation, and Th1 differentiation induced by GM-CSF bone marrow (BM)-derived dendritic cells (DCs). In addition, this protocol describes BM and T-cell isolation, DC generation, and DC and T-cell adoptive transfer.

Un modello di topo In Vivo di attivazione delle cellule T Naïve CD4 di misura, la proliferazione e la differenziazione Th1 indotta dalle cellule dendritiche derivate da midollo osseo

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a myeloid-biased 39-antibody CyTOF panel to evaluate the hematopoietic system with a focus on the neutrophil-lineage cells by using this protocol. The CyTOF result was analyzed with an open-resource dimensional reduction algorithm, viSNE, and the data was presented to demonstrate the outcome of this protocol. We have discovered new neutrophil-lineage cell populations based on this protocol. This protocol of fresh whole BM preparation may be used for 1), CyTOF analysis to discover unidentified cell populations from whole BM, 2), investigating whole BM defects for patients with blood disorders such as leukemia, 3), assisting optimization of fluorescence-activated flow cytometry protocols that utilize fresh whole BM.

Here, we present a protocol to process fresh bone marrow (BM) isolated from mouse or human for high-dimensional mass cytometry (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analysis of neutrophil-lineage cells.

Preparazione del midollo osseo intero per l'analisi della citometria di massa delle cellule di lignaggio neutrofilo

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

Isolation of Lamina Propria Mononuclear Cells from Murine Colon Using Collagenase E

The intestine is the home to the largest number of immune cells in the body. The small and large intestinal immune systems police exposure to exogenous antigens and modulate responses to potent microbially derived immune stimuli. For this reason, the intestine is a major target site of immune dysregulation and inflammation in many diseases including but, not limited to inflammatory bowel diseases such as Crohn&#8217;s disease and ulcerative colitis, graft-versus-host disease (GVHD) after bone marrow transplantation (BMT), and many allergic and infectious conditions. Murine models of gastrointestinal inflammation and colitis are heavily used to study GI complications and to pre-clinically optimize strategies for prevention and treatment. Data gleaned from these models via isolation and phenotypic analysis of immune cells from the intestine is critical to further immune understanding that can be applied to ameliorate gastrointestinal and systemic inflammatory disorders. This report describes a highly effective protocol for the isolation of mononuclear cells (MNC) from the colon using a mixed silica-based density gradient interface. This method reproducibly isolates a significant number of viable leukocytes while minimizing contaminating debris, allowing subsequent immune phenotyping by flow cytometry or other methods.

The goal of this protocol is to isolate mononuclear cells that reside in the lamina propria of the colon by enzymatic digestion of the tissue using collagenase. This protocol allows for the efficient isolation of mononuclear cells resulting in a single cell suspension which in turn can be used for robust immunophenotyping.

Isolamento delle cellule mononucleari Di Lamina propria dal colon Murine utilizzando Collagenase E

The intestine is the home to the largest number of immune cells in the body. The small and large intestinal immune systems police exposure to exogenous ...

Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease

Allogeneic bone marrow transplantation (BMT) is an effective therapy for hematological malignancies due to the graft-versus-leukemia (GVL) effect to eradicate tumors. However, its application is limited by the development of graft-versus-host disease (GVHD), a major complication of BMT. GVHD is evoked when T-cells in the donor grafts recognizealloantigen expressed by recipient cells and mount unwanted immunological attacks against recipient healthy tissues. Thus, traditional therapies are designed to suppress donor T-cell alloreactivity. However, these approaches substantially impair the GVL effect so that the recipient&#39;s survival is not improved. Understanding the effects of therapeutic approaches on BMT, GVL, and GVHD, is thus essential. Due to the antigen-presenting and cytokine-secreting capacities to stimulate donor T-cells, recipient dendritic cells (DCs) play a significant role in the induction of GVHD. Therefore, targeting recipient DCs becomes a potential approach for controlling GVHD. This work provides a description of a novel BMT platform to investigate how host DCs regulate GVH and GVL responses after transplantation. Also presented is an effective BMT model to study the biology of GVHD and GVL after transplantation.

Graft-versus-host disease is a major complication after allogeneic bone marrow transplantation. Dendritic cells play a critical role in the pathogenesis of graft-versus-host disease. The current article describes a novel bone marrow transplantation platform to investigate the role of dendritic cells in the development of graft-versus-host disease and the graft-versus-leukemia effect.

Piattaforma di trapianto di midollo osseo per studiare il ruolo delle cellule dendritiche nella malattia di Graft-versus-Host

Allogeneic bone marrow transplantation (BMT) is an effective therapy for hematological malignancies due to the graft-versus-leukemia (GVL) effect to ...