We are grateful to Hannah Kleinschmidt for excellent technical support. This paper was funded by the Open Access support program of the Deutsche Forschungsgemeinschaft and the publication fund of the Georg August Universita&#776;t Go&#776;ttingen.

<ol>
	<li>Seng, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ongoing+revolution+in+bacteriology:+routine+identification+of+bacteria+by+matrix-assisted+laser+desorption+ionization+time-of-flight+mass+spectrometry.">Ongoing revolution in bacteriology: routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> Clin Infect Dis. 49 (4), 543-551 (2009).</li><li>Bader, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI-TOF-MS-based+species+identification+and+typing+approaches+in+medical+mycology.">MALDI-TOF-MS-based species identification and typing approaches in medical mycology.</a> Proteomics. 13 (5), 788-799 (2013).</li><li>Sandrin, T. R., Goldstein, J. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+discrimination+of+Salmonella+enterica+serovar+Typhi+from+other+serovars+by+MALDI-TOF+mass+spectrometry.">Rapid discrimination of Salmonella enterica serovar Typhi from other serovars by MALDI-TOF mass spectrometry.</a> PLoS One. 7 (6), e40004 (2012).</li><li>Wolters, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI-TOF+MS+fingerprinting+allows+for+discrimination+of+major+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+lineages.">MALDI-TOF MS fingerprinting allows for discrimination of major methicillin-resistant Staphylococcus aureus lineages.</a> Int J Med Microbiol. 301 (1), 64-68 (2011).</li><li>Josten, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+matrix-assisted+laser+desorption+ionization-time+of+flight+mass+spectrum+of+Staphylococcus+aureus+identifies+mutations+that+allow+differentiation+of+the+main+clonal+lineages.">Analysis of the matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrum of Staphylococcus aureus identifies mutations that allow differentiation of the main clonal lineages.</a> J Clin Microbiol. 51 (6), 1809-1817 (2013).</li><li>Lu, J. J., Tsai, F. J., Ho, C. M., Liu, Y. C., Chen, C. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BioEdit:+a+user-friendly+biological+sequence+alignment+editor+and+analysis+program+for+Windows+95/98/NT.">BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT.</a> Nucleic Acids Symposium Series. 41, 95-98 (1999).</li><li>Jolley, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosomal+multilocus+sequence+typing:+universal+characterization+of+bacteria+from+domain+to+strain.">Ribosomal multilocus sequence typing: universal characterization of bacteria from domain to strain.</a> Microbiology. 158, 1005-1015 (2012).</li><li>Suarez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosomal+proteins+as+biomarkers+for+bacterial+identification+by+mass+spectrometry+in+the+clinical+microbiology+laboratory.">Ribosomal proteins as biomarkers for bacterial identification by mass spectrometry in the clinical microbiology laboratory.</a> J Microbiol Methods. 94 (3), 390-396 (2013).</li><li>Teramoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+classification+of+Pseudomonas+putida+strains+by+MALDI-MS+using+ribosomal+subunit+proteins+as+biomarkers.">Phylogenetic classification of Pseudomonas putida strains by MALDI-MS using ribosomal subunit proteins as biomarkers.</a> Anal Chem. 79 (22), 8712-8719 (2007).</li><li>Teramoto, K., Kitagawa, W., Sato, H., Torimura, M., Tamura, T., Tao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+analysis+of+Rhodococcus+erythropolis+based+on+the+variation+of+ribosomal+proteins+as+observed+by+matrix-assisted+laser+desorption+ionization-mass+spectrometry+without+using+genome+information.">Phylogenetic analysis of Rhodococcus erythropolis based on the variation of ribosomal proteins as observed by matrix-assisted laser desorption ionization-mass spectrometry without using genome information.</a> J Biosci Bioeng. 108 (4), 348-353 (2009).</li><li>Bernhard, M., Weig, M., Zautner, A. E., Gross, U., Bader, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+on-target+lysis+(YOTL),+a+procedure+for+making+auxiliary+mass+spectrum+data+sets+for+clinical+routine+identification+of+yeasts.">Yeast on-target lysis (YOTL), a procedure for making auxiliary mass spectrum data sets for clinical routine identification of yeasts.</a> J Clin Microbiol. 52 (12), 4163-4167 (2014).</li><li>Stark, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+profiling+of+Bacillus+cereus+strains+and+quantitation+of+the+emetic+toxin+cereulide+by+means+of+stable+isotope+dilution+analysis+and+HEp-2+bioassay.">Mass spectrometric profiling of Bacillus cereus strains and quantitation of the emetic toxin cereulide by means of stable isotope dilution analysis and HEp-2 bioassay.</a> Anal Bioanal Chem. 405 (1), 191-201 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

MSPP 방식의 설립에서 가장 중요한 단계는 바이오 마커 이온 정체성의 명확한 유전 적 결정이다. 그것은 틀림없이 바이오 마커를 식별 할 수 없다면, 이것은 반응식 13에서 제외한다. C. jejuni와의 SSP. doylei 방식은 14 개 바이오 마커 이온을 포함한다. 이 5 이하 C. 비교입니다 검출 가능한 C. 사이 jejuni와의 SSP. jejuni와 MSPP 방식 (13) 국지적 가장 큰 차이 jejuni와 SSP. jejuni와와 C. jejuni와의 SSP. doylei 바이오 마커는 L31 (-M) 및 L35 (-M) (13)의 경우에는 아미노 - 말단 메티오닌의 번역 후 제거했다. C. 시험에 도시 된 바와 같이 jejuni와 SSP. doylei 모음을 분리, MSPP는 모두 일곱 가지 MLST 시퀀스 유형을 구별 할 수 있었다. 이 모든 테스트를 분리 특정 MSPP의 sequ를 지배한다는 것을 의미줬어 유형입니다. 또한, MSPP는 C. 사이의 종 분화 할 수 있습니다 jejuni와 SSP. jejuni와와 C. jejuni와의 SSP. doylei. 일반적으로 판별 할 가능성이 낮은 MLST 같은 DNA 서열 기반의 방법에 비교하여 MSPP 이하 균주 수준에서 분리. 잘 확립 이성체 데이터베이스 가정 세균 균주의 하위 유형은 DNA 서열 분석 방법 (4) (13)에 비해 훨씬 더 빠르고 훨씬 더 저렴하다. 이러한 주성분 분석 (PCA) 4, 10, 28 또는 이진 피크의 매칭의 비교 결과 수학 행렬 UPGMA 분석 프로파일 (29) (30)를 사용하는 것과 ICMS - 스펙트럼 계층 클러스터링 방법에 비해 MSPP의 가장 큰 장점 높은 고유 재현성이다. 동안 서로 다른 cultur 등 다양한 문화 조건E 매질 다른 한천 전하 상이한 배양 온도 및 다른 배양 기간이 크게 PCA에 의해 계산 된 관계에 영향을 phyloproteomic 그들은 MSPP 관계 추론 6,13- 영향을 미치지 않는다. 재현성이 주된 이유는 일반적으로 (13)의 피크 강도와 질량 스펙트럼의 품질의 독립이다. 분리의 질량 스펙트럼의 피크 MSPP 관련 의심 할 나위 식별 할 수없는 경우, 다시 개별 분리의 질량 스펙트럼을 기록 할 필요가있다. MSPP 방법은 모든 미생물 종 원칙적으로 적응 될 수있다. 특히, 클로스 트리 디움 디피, 대장균, 황색 포도상 구균, 살모넬라 엔테 SSP. 엔테 같은 임상 관련 미생물 종의 하위 유형은 미래의 잠재적 응용 프로그램입니다. 독성 인자 또는 저항성 유전자의 발현이 phyl과 연관 있다면oproteomic 관계, MSPP는 일상적인 임상 진단에서 혁신적인 도구가 될 수 있습니다. 이에 피크 검출 및 MSPP 방식에 포함되는 바이오 마커 이온의 수의 수는 잠재적 특히 진균 (31)의 경우에는, 특정 추출 및 / 또는 용해 프로토콜을 사용함으로써 증가 될 수있다. 최근에 사용 MALDI-TOF 기술은 주로 만 매우 풍부한 리보솜 단백질을 검출 할 수있다. 이 매우 풍부한 단백질은 질량 스펙트럼에서 독성 요인으로 거의 모든 다른 작은 단백질을 방해. 작은 단백질 ESI-TOF-MS (비행 질량 분석의 전자 분무 이온화 시간) 및 HPLC (고성능 액체 크로마토 그래피) (32)을 연결함으로써 검출 될 수있다. 그러나 현재이 방법은 너무 노동과 큰 분리 집단의 특성에 집중 비용이다.

지난 십년 동안, 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 비행 시간 형 질량 분석계 (MALDI-TOF MS)가 임상 미생물학 1,2 미생물 속과 종의 식별을위한 높은 값의 표준 방법으로 진행 하였다. 종 식별은 그대로 세포 또는 세포 용 해물의 작은 단백질 지문의 기록에 기초한다. 일상적인 임상 미생물에서 사용되는 질량 분석 장치의 일반적인 질량 범위는 2-20 kDa 이상이다. 또한, 결과적인 스펙트럼은 다음 종의 균주 및 아종 이하 레벨 3을 구별하는데 사용될 수있다. 초기 선구적인 연구는 캄 필로 박터 jejuni와 4 균주의 특정 하위 그룹, 클로스 트리 디움 디피 5, 살모넬라 엔테 SSP에 대한 특정 바이오 마커 이온을 확인했다. 엔테의 혈청 형 Typhi (6), 황색 포도상 구균 7-9, 및 E12 - scherichia 10 대장균. 대립 유전자 아형에 해당하는 여러 변수 바이오 마커 대중의 조합은 더 깊은 하위 유형에 대한 옵션을 제공합니다. 이전에, 우리는 성공적으로 C.에 질량 분석 기반 phyloproteomics (MSPP)라는 의미와 재현 phyloproteomic 관계로 대량 프로필에서 이러한 변화를 변환하는 방법을 구현 jejuni와의 SSP. jejuni와 격리 컬렉션 13. MSPP는 multilocus 시퀀스 입력 (MLST)과 같은 DNA 서열을 기초 subtyping이 기술에 질량 분석 당량 사용할 수있다. 캄 필로 박터 종은 세균성 위장염의 주요 원인 전세계 14, 15이다. 캄 필로 박터 감염 후 후유증의 결과, 즉, 길랑 바레 증후군, 반응성 관절염 및 염증성 장 질환 (16)를 발생할 수있다. 감염의 주요 소스는닭, 칠면조, 돼지, 소, 양, 오리, 우유, 표면의 물 (15), (17)로부터 오염 된 가축의 고기. 따라서, 식품 안전의 맥락에서 일정한 역학 감시 연구가 필요하다. MLST는 캄 필로 박터 종 (18)에 대한 분자 입력의 &quot;황금 표준&quot;입니다. MLST 방법을 기반으로 생거 시퀀싱은 노동 집약적, 시간과 상대적으로 고가이기 때문에, MLST 입력은 상대적으로 작은 분리 집단에 제한됩니다. 따라서, 저렴하고 빠른 하위 유형의 방법이 필요하다. 이 필요 MSPP 같은 질량 분석 방법에 의해 충족 될 수있다. 이 논문은 캄 필로 박터 jejuni와 SSP의 컬렉션을 사용하여 MSPP-입력에 대한 자세한 프로토콜을 제시한다. doylei 분리 및 MLST와 잠재력의 비교.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1348">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">acetonitrile</td>
			<td style="width:663px;">Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:119px;">34967</td>
			<td style="width:337px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Autoflex III TOF/TOF 200 system</td>
			<td style="width:663px;">Bruker Daltonics, Bremen, Germany</td>
			<td style="width:119px;">GT02554 G201</td>
			<td>Mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">bacterial test standard BTS</td>
			<td style="width:663px;">Bruker Daltonics, Bremen, Germany</td>
			<td style="width:119px;">604537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">BioTools 3.2 SR1</td>
			<td style="width:663px;">Bruker Daltonics, Bremen, Germany</td>
			<td>263564</td>
			<td>Software Package</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:229px;">Bruker IVD Bakterial Test Standard</td>
			<td style="width:663px;">Bruker Daltonics, Bremen, Germany</td>
			<td style="width:119px;">8290190</td>
			<td>5 tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate&#160;</td>
			<td>Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium</td>
			<td>LMG8843</td>
			<td>ATCC 49349;IMVS 1141;NCTC 11951;strain 093</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate&#160;</td>
			<td>Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium</td>
			<td>LMG9143</td>
			<td>Goossens Z90</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate&#160;</td>
			<td>Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium</td>
			<td>LMG7790</td>
			<td>ATCC 49350;CCUG 18265;Kasper 71;LMG 8219;NCTC 11847</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate&#160;</td>
			<td>Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium</td>
			<td>LMG9243</td>
			<td>Goossens N130</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate&#160;</td>
			<td>Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium</td>
			<td>LMG8871</td>
			<td>NCTC A603/87</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate&#160;</td>
			<td>Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium</td>
			<td>LMG9255</td>
			<td>Goossens B538</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate&#160;</td>
			<td>Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, Belgium</td>
			<td>LMG8870</td>
			<td>NCTC A613/87</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Columbia agar base&#160;</td>
			<td>Merck, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:119px;">1.10455 .0500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Compass for FlexSeries 1.2 SR1</td>
			<td style="width:663px;">Bruker Daltonics, Bremen, Germany</td>
			<td>251419</td>
			<td>Software Package</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">defibrinated sheep blood&#160;</td>
			<td>Oxoid Deutschland GmbH, Wesel, Germany</td>
			<td>SR0051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:119px;">02854 Fluka</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">formic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:119px;">F0507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">HCCA matrix</td>
			<td style="width:663px;">Bruker Daltonics, Bremen, Germany</td>
			<td style="width:119px;">604531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Kimwipes paper tissue</td>
			<td style="width:663px;">Kimtech Science via Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td>Z188956</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">MALDI Biotyper 2.0</td>
			<td style="width:663px;">Bruker Daltonics, Bremen, Germany</td>
			<td>259935</td>
			<td>Software Package</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">Mast Cryobank vials</td>
			<td>Mast Diagnostica, Reinfeld, Germany</td>
			<td style="width:119px;">CRYO/B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">MSP 96 polished steel target</td>
			<td style="width:663px;">Bruker Daltonics, Bremen, Germany</td>
			<td>224989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAamp DNA Mini Kit&#160;</td>
			<td style="width:663px;">Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td style="width:119px;">51304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">recombinant human insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:119px;">I2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:119px;">T6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:229px;">water, molecular biology-grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:119px;">W4502</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subtyping of campylobacter jejuni ssp. doylei isolates using mass spectrometry-based phyloproteomics (mspp)

MALDI-TOF MS는 종 및 아종 수준 그러나 심지어 아래 균주 수준에서뿐만 아니라 일부 박테리아를 차별화 할 수있는 가능성을 제공한다. 검출 가능한 바이오 마커의 대립 이온 이성체 분리는 특정 질량 변화 될. 질량 분석 기반 phyloproteomics (MSPP)를 참조 균주 염기 서열을 게놈에 비해 분리 특정 질량 변화에서 phyloproteomic 관계의 공제를 허용하는 방식으로 질량 분석 검출 바이오 마커의 질량을 결합하는 새로운 기술이다. 추론 된 아미노산 서열은 MSPP 기반 dendrograms을 계산하는 데 사용된다. 여기서 우리는 캄 필로 박터 jejuni와의 SSP를 입력하여 MSPP의 흐름을 설명합니다. 일곱 균주의 분리 수집을 doylei. 모든 일곱 균주는 유전 적 다양성을 보여 인간의 기원과 multilocus 시퀀스 입력 (MLST)의했다. MSPP-입력 충분히 자신의 PHY를 반영 일곱 가지 MSPP 시퀀스 유형의 결과logenetic 관계. C. jejuni와는 SSP. MSPP 방식은 2 ~ 11 kDa의 질량 범위에서 14 개 바이오 마커 이온, 주로 리보솜 단백질을 포함 doylei. MSPP 원칙적으로, 확장 된 질량 범위와 다른 질량 분석 플랫폼에 적용 할 수있다. 따라서,이 기술은 변형 된 미생물 레벨 입력을위한 유용한 도구가 될 가능성이있다.

이전에, 우리는 성공적으로 C.에 대한 MSPP 체계를 확립 jejuni와의 SSP. 13 jejuni와. 여기서, 우리는 C. 형제를 아종하는 방법을 확장하는 목적 jejuni와의 SSP. doylei. 이 특정 설정에서 일곱 C. jejuni와의 SSP. doylei 분리는 / 연구소 미생물학 UGent BCCM / LMG 겐트, 벨기에의 미생물의 벨기에 컬렉션에서 획득 하였다. 우리의 분석에 사용 된 모든 일곱 분리는 인간의 기원이었다. 설사가 기준으로 봉사와 게놈 염기 서열을 변형 ATCC 49349 (8843 LMG)는 원래 2 세의 호주 아이의 대변에서 분리. LMG 9143, LMG 9243 및 LMG 9255 어린이 설사 고통과 벨기에 브뤼셀에 살고의 대변에서 분리; 컬렉션에서 여섯 추가 균주를 사용할 수 있었다 독일에서 개인의 위 생검 샘플에서 분리 LMG 7790 (ATCC 49350); 및 LMG 8870 (NCTC A613 / 87)뿐만 아니라 LMG (8)871 (NCTC A603 / 87), 두 남 아프리카 어린이 그린 다른 혈액 샘플에서 격리. 모든 C. jejuni와 SSP. doylei 균주 cryobank 축적량 갓 호기성 조건 (5 % O하에 37 ℃에서 48 시간 동안 5 % 양 혈액 배양 보충 컬럼비아 아가베이스를 이용하여 각각의 분석을 위해 해동 배양으로서 -80 ° C에서 저장 하였다 이 10 % CO 2, 85 % N 2). C. MSPP위한 기술의 확립 대조적 jejuni와의 SSP. jejuni와 13가 큰 순서 컬렉션에서 파생 된 이소 데이터베이스의 방법을 기반으로 할 수 없었습니다. 단 하나의 C. jejuni와 SSP. rMLST 항목이 데이터베이스에 존재 doylei, 이는 기준 C. 변형에 대응 jejuni와의 SSP. doylei ATCC 49349 (27). 따라서 각 바이오마커 질량 시프트 C. 균주에 비해 검출 jejuni와의 SSP. ATCC 49349 doylei는 새로운 기능 이소 데이터베이스 항목 및 생거 시퀀싱에 의해 재확인 될 필요가 있었다. 얻어진 C.의 다양성을 분석 jejuni와 SSP. doylei 분리, MLST 수행하고 칠을 포함하는 MLST 기반 UPGMA - dendrogram은은 C.를 검토 jejuni와 SSP. doylei 분리 및 C. jejuni와 SSP. 외집단 계산 (그림 1)과 같은 jejuni와 변형 81-176. 각 C. jejuni와의 SSP. doylei 분리는 두 개의 하위 클러스터에 떨어지는 다른 MLST 시퀀스 종류를 지배했습니다. C. 나머지에 비해 변형 LMG7790 최장 거리 계통 있었다 jejuni와 SSP. doylei 분리. C. 기형의 MALDI-TOF 질량 기준 스펙트럼 jejuni와의 SSP. doylei </em&gt;의 ATCC 49349를 기준 스펙트럼 (도 2)을 산출 분자 질량의 비교에 의해 식별 될 수있다 (14) 단독으로 하전 된 이온 바이오 마커를 함유 하였다. 152,939,117, S20-M, 및 S15-M (그림 3) | 컬렉션 내에서 다양한 이성체는 L32-M, L33, 병사에 의해 암호화 된 가상의 단백질을 검출 하였다. 바이오 마커 이온에 할당 된 나머지 대중은 테스트 C에서 불변이었다 jejuni와 SSP. doylei 분리. 질량 변화에 대응하는 아미노산 치환뿐만 아니라 PCR 증폭 및 4에는 모든 바이오 마커 이온의 아미노산 서열은 MSPP 방식에 포함되는 표 3. 표에 표시된 프라이머를 이용하여 특정 유전자의 생거 시퀀싱에 의해 확인되었다 검출 된 대립 유전자 이성체. MSPP 기반 phyloproteomic UPGMA-트리 (도 4)가 동일한 일곱 C. 계산 된 jejuni와 SSP. doylei 분리 및 C. jejuni와의 SSP. 기준 균주에서의 분자량의 순서로 14 개의 바이오 마커 이온 연결된 아미노산 서열을 사용하여 외집단 jejuni와 같은 변형 81-176. 각 분리 개별 MSPP 시퀀스 유형을 나타낸다. 얻어진 phyloproteomic 관계는 MLST의 C.에 의해 얻어진 것과 완전히 동일하지했지만 jejuni와의 SSP. doylei은 다시 두 개의 하위 클러스터에 배치 분리합니다. 첫 번째 서브 클러스터는 LMG 8843, LMG 8870 및 LMG 9243, LMG 9255에 의해 제 2, LMG 9143에 의해 형성되었다, LMG 8871 및 MLST 분석으로 알 수있는 바와 같이 LMG 7790.는 분리 LMG7790는 MSPP-에서 가장 긴 phyloproteomic 거리를 보여 주었다 분석. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54165/54165fig1.jpg" /> 그림 1 : MLST - 바SED 계통 UPGMA 나무. 균형 MLST 기반 UPGMA - dendrogram은 일곱 C.로 구성 jejuni와 SSP. doylei 분리 및 C. jejuni와의 SSP. jejuni와 변형 81-176. 스트레인 색상 코드 : LMG 8843 (검정), (회색) LMG 8870, LMG 9243 (파란색), LMG 9255 (청록색), LMG 9143 (녹색) 및 (핑크) LMG 8871, LMG 7790 (노란색), 및 81- 176 (흰색). MLST - 시퀀스 유형은 각각 분리의 이름 뒤에 설명한다. 모든 C. jejuni와 SSP. doylei는 격리 다른 MLST 시퀀스 유형에 속한다. X 축은 결합 거리를 나타낸다. 스트레인 LMG 7790은 나머지 6 균주에 비해 가장 긴 계통의 거리를 보여줍니다. 균주 LMG 8843, LMG 8870 및 LMG 9243뿐만 아니라 LMG 9255, LMG 9143 및 LMG C. 내 8871 양식 두 개의 서로 다른 하위 클러스터 jejuni와의 SSP. doylei 클러스터입니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54165/54165fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> </A&gt; <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54165/54165fig2.jpg" /> 그림 2 : C.의 게놈 상관 관계의 임시 할당 jejuni와 SSP. doylei 관찰 된 바이오 마커 대중에게 ATCC 49349 (LMG 8843). C의 전체 게놈 시퀀스에서 예측 개의 ORF의 계산 된 질량 (평균 동위 원소 조성)을 바탕으로 jejuni와 SSP. ATCC 49349 균주를 doylei, 바이오 마커 대중은 코딩 서열 해당 단백질에 할당되었다. 그러나, 측정 범위 내에서, 바이오 마커 리보솜 소단위의 L31에 대한 질량 (MW = 7315 다), S17 (MW = 9549 다) 및 S18 (MW = 10,285 다)뿐만 아니라 역 methioninated 이성체 (삽입 m / z = 7,000-7,200 다)를 명확하게 할당 할 수 없습니다. 따라서, L31, S17 및 S18은 C.에 포함되지 않았다 jejuni와는 SSP. MSPP 방식을 doylei. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54165/54165fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54165/54165fig3.jpg" /> 그림 3 : C.의 특정 바이오 마커의 질량 피크 jejuni와는 SSP. MSPP 방식을 doylei. 각 패널에서 질량 스펙트럼을 모두 일곱 C. 시험의 . MSPP 특정 유형에 대응 jejuni와는 SSP doylei 균주 (도 1에서 컬러 코드)에 의한 대립 이성체 바이오 마커 질량 변화를 나타 내기 위해 중첩 된 (A) L36 + H +; (B) L34 + H +; (C) L32-M + H +를; (D </strong&gt;) L33 + H +; (E) S14-M + H +; (F) + H + L29, L28-M + H +, 및 L35-M + H +; (G) L24-M + H +; (H) GI | 152,939,117 + H +; (I) L27-M + H +; (J) S20-M + H +; (K) S15-M + H의 +; (L) S19-M + H +; (M) 리보솜 단백질 S18의 변수 잠재적 인 바이오 마커의 피크를 가리는 강렬한 질량; (N) S20-M + 2H +; (O) L15-M + 2H +; X 축 : 질량 [다] · 전하 1의 비율로, 규모 (200) 다. Y 축 : 강도 [임의의 단위는, 스펙트럼은 개별적으로 낮은 강도 피크의 더 나은 시각화를위한 비교 가능한 노이즈 레벨로 조정 하였다. 리보솜 서브 유닛의 이름 뒤에 &quot;-M&quot;이 드 methioninated 이소을 나타냅니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54165/54165fig3large.jpg" target="_blank">그녀를 클릭하세요</a>전자는이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54165/54165fig4.jpg" /> 그림 4 :. MSPP 기반 phyloproteomic UPGMA 나무 도시 된 phyloproteomic UPGMA 나무는 같은 일곱 C. 포함 jejuni와 SSP. doylei 분리 및 C. jejuni와 SSP. 그림 1과 jejuni와 변형 81-176. 착색 자리 (그림 1과 색상 코드)는 각 변형을 나타냅니다. 보다 나은 비교를 위해 분리는 MLST 기반 나무로부터 얻어진 순이었다 입력 순서로 배열된다. dendrogram은 아래 축이 결합 거리를 나타낸다. 얻어진 phyloproteomic 관계가 계통 MLST 기반 트리 완전히 동일하지 않지만, 글로벌 사진 비교입니다. 인구는 두 그룹으로 분할 : 세 가지가 LMG 8843, LMG 8870 및 LMG 9243 양식 한 clust 분리어, LMG 9255 동안, LMG 9143, LMG 8871 및 LMG 7790 양식 두 번째 클러스터. 이 클러스터 LMG 7790이 서브 클러스터의 LMG 내 LMG 9255, LMG 9143 및 LMG 8871. 의해 형성된 서브 클러스터에 비해 긴 phyloproteomic 거리를 나타낸다 내에 9143에도 각각 나타낸다 분리 MSPP-방법을 사용하지만 LMG 9255. 관련 위치 스위치 개인 MSSP 시퀀스 유형. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54165/54165fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 표 1 : C. 모든 주석의 ORF의 계산 된 질량 jejuni와의 SSP는. ATCC 49349 균주를 doylei. 목록을 C로 인코딩 된 각 단백질의 모든 계산 된 모노 이소 토픽 분자량의 jejuni와의 SSP. ATCC 493 doylei49 게놈. ExPASy 정보학 리소스 포털 특정 분자 질량의 계산에 사용 하였다. 열 B는 C가 드 methioninated 이성체를 나열 열 반면 methioninated 이소을 보여줍니다. 바이오 마커의 질량은 C.에 포함 jejuni와의 SSP. doylei MSPP 방식은 빨간색으로 강조 표시됩니다. 주 : 바이오 마커 단백질 L36는 C.의 게놈 서열에 주석되지 jejuni와는 SSP. ATCC49349을 doylei. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54165/Table1_calculated_masses.xlsx" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a> 표 2. 인해 하나의 SNP에 대한 아미노산 변화에 의한 질량 변화는 모든 잠재적 인 단일 염기 다형성은 표준 유전자 코드를 사용하여 생성 된 아미노산 교환을 확인 하였다. 모든 침묵 돌연변이는 폐기하고, nonsynonymous 돌연변이는 resu과 함께 컴파일질량 변화 lting. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54165/Table2_mass_changes.xlsx" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a> 표 3 : C의 순서에 사용되는 올리고 뉴클레오티드 프라이머 jejuni와 SSP. MSPP-계획에 포함 된 유전자를 doylei <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54165/Table3_Cjd_MSPP_Primer02.xlsx" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a> 표 4 : 모든 이성체의 개요는 C.에 포함 jejuni와 SSP. MSPP-방식을 doylei.이 표는 모든 바이오 마커 이온은 C.에 포함 jejuni와의 SSP. MSPP 사우스 캐롤라이나 doylei헴. 참조 균주 ATCC 49349의 아미노산 서열은 완전하게 설명한다. 더 검출 동종를 들어, 특정 아미노산 치환이 나열됩니다. 아미노산 번호는 항상 개시 메티오닌을 포함하고; 질량 분석기가 없음을 표시하는 경우, 그것은 괄호 (M)로 작성되었습니다. 각 이소 분자량의 경우, 질량 차이가 표시되는 이소 데이터 세트 내에서 변형 ATCC에게 49,349 이성체 및 주파수를 참조. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54165/Table4_MSPP_Cjd-isoforms_V03.xlsx" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Subtyping of Campylobacter jejuni ssp. doylei Isolates Using Mass Spectrometry-based PhyloProteomics MSPP

질량 분석 기반 phyloproteomics (MSPP)는 캄 필로 박터 jejuni와 SSP의 모음을 입력하는 데 사용되었다. doylei는 multilocus 시퀀스 입력 (MLST)에 비해 변형 수준에서 분리합니다.

의 하위 유형<em&gt; 캄 필로 박터 jejuni와</em&gt; SSP.<em&gt; doylei</em&gt;은 질량 분석 기반 PhyloProteomics를 사용하여 분리 (MSPP)

MALDI-TOF MS offers the possibility to differentiate some bacteria not only at the species and subspecies level but even below, at the strain level. ...

subtyping-campylobacter-jejuni-ssp-doylei-isolates-using-mass

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

Subtyping of Campylobacter jejuni ssp. doylei Isolates Using Mass Spectrometry-based PhyloProteomics (MSPP)

8.5K 조회수.  Universitätsmedizin Göttingen.  질량 분석 기반 phyloproteomics (MSPP)는 캄 필로 박터 jejuni와 SSP의 모음을 입력하는 데 사용되었다. doylei는 multilocus 시퀀스 입력 (MLST)에 비해 변형 수준에서 분리합니다. 

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Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by liquid chromatography/electrospray ionization mass spectrometry (LC/ESI-MS) is described. DNA extraction is carried out using a silica membrane-based DNA extraction kit. After the PCR amplification using a detergent-free PCR buffer, restriction enzymes are added to the solution without purifying the reaction solution. A reverse-phase silica monolith column and a Fourier transform high resolution mass spectrometer having a modified Kingdon trap analyzer are employed for separation and detection, respectively. The mobile phase, consisting of 400 mM 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol, 15 mM triethylamine (pH 7.9) and methanol, is delivered at a flow rate of 0.4 ml/min. The cycle time for LC/ESI-MS analysis is 8 min including equilibration of the column. Deconvolution software having an isotope distribution model of the oligonucleotide is used to calculate the corresponding monoisotopic mass from the mass spectrum. For analysis of oligonucleotides (range 26-79 nucleotides), mass accuracy was 0.62 &#177; 0.74 ppm (n = 280) and excellent accuracy and precision were sustained for 180 hr without use of a lock mass standard.

An improved polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism method for genotyping pufferfish species by liquid chromatography/mass spectrometry is described. A reverse-phase silica monolith column is employed for separating digested amplicons. This method can elucidate the monoisotopic masses of oligonucleotides, which is useful for identifying base composition.

액체 크로마토 그래피 / 질량 분석 유독 복어의 개선 중합 효소 연쇄 반응 - 제한 조각의 길이 다형성 유전자형

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

연구

유전학

Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat

Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) refers to the experimental situation in which evolution is observed using living organisms under controlled conditions and stressors; organisms are thereby artificially forced to make evolutionary changes. Microorganisms are subject to a variety of stressors in the environment and are capable of regulating certain stress-inducible proteins to increase their chances of survival. Naturally occurring spontaneous mutations bring about changes in a microorganism's genome that affect its chances of survival. Long-term exposure to chemostat culture provokes an accumulation of spontaneous mutations and renders the most adaptable strain dominant. Compared to the colony transfer and serial transfer methods, chemostat culture entails the highest number of cell divisions and, therefore, the highest number of diverse populations. Although chemostat culture for ALE requires more complicated culture devices, it is less labor intensive once the operation begins. Comparative genomic and transcriptome analyses of the adapted strain provide evolutionary clues as to how the stressors contribute to mutations that overcome the stress. The goal of the current paper is to bring about accelerated evolution of microorganisms under controlled laboratory conditions.

Here, we present a protocol to obtain adaptive laboratory evolution of microorganisms under conditions using chemostat culture. Also, genomic analysis of the evolved strain is discussed.

Chemostat를 사용하여 미생물의 적응 연구소 발전을위한 절차

Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and microbial populations. Traditional methods for assessing genetic heterogeneity have been limited by low resolution, low sensitivity, and/or low specificity. Single cell sequencing has emerged as a powerful tool for detecting genetic heterogeneity with high resolution, high sensitivity and, when appropriately analyzed, high specificity. Here we provide a protocol for the isolation, whole genome amplification, sequencing, and analysis of single cells. Our approach allows for the reliable identification of megabase-scale copy number variants in single cells. However, aspects of this protocol can also be applied to investigate other types of genetic alterations in single cells.

Single cell sequencing is an increasingly popular and accessible tool for addressing genomic changes at high resolution. We provide a protocol that uses single cell sequencing to identify copy number alterations in single cells.

단일 셀 시퀀싱을 사용하여 복사 번호 수선의 검출

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Detection of microRNA Expression in Peritoneal Membrane of Rats Using Quantitative Real-time PCR

MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs that regulate messenger RNA expression post-transcriptionally. The miRNA expression profile has been investigated in various organs and tissues in rat. However, standard methods for the purification of miRNAs and detection of their expression in rat peritoneal membrane have not been well established. We have developed an effective and reliable method to purify and quantify miRNAs using quantitative real-time reverse-transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) in rat peritoneal membrane. This protocol consists of four steps: 1) purification of peritoneal membrane sample; 2) purification of total RNA including miRNA from peritoneal membrane sample; 3) reverse transcription of miRNA to produce cDNA; and 4) qRT-PCR to detect miRNA expression. Using this protocol, we successfully determined that the expression of six miRNAs (miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327, and miRNA-34a-5p) increased significantly in the peritoneal membrane of a rat peritoneal fibrosis model compared with those in control groups. This protocol can be used to study the profile of miRNA expression in the peritoneal membrane of rats in many pathological conditions.

Here we present a protocol for the detection of microRNA expression in rat peritoneal membrane using quantitative real-time reverse-transcription polymerase chain reaction. This method is suitable for studying the microRNA expression profile in rat peritoneal membrane in several pathological conditions.

정량 실시간 PCR을 이용한 쥐 복막 막의 microRNA 발현 검출

MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs that regulate messenger RNA expression post-transcriptionally. The miRNA expression profile has been ...

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. Therefore, DNA-protein interactions regulate multiple physiological, pathophysiological, and biological functions, such as cell differentiation, cell proliferation, cell cycle control, chromosome stability, epigenetic gene regulation, and cell transformation. In eukaryotic cells, the DNA interacts with histone and nonhistone proteins and is condensed into chromatin. Several technical tools can be used to analyze DNA-protein interactions, such as the Electrophoresis (gel) Mobility Shift Assay (EMSA) and DNase I footprinting. However, these techniques analyze the protein-DNA interaction in vitro, not within the cellular context. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a technique that captures proteins at their specific DNA binding sites, thereby allowing for the identification of DNA-protein interactions within their chromatin context. It is done by fixation&#160;of the DNA-protein interaction, followed by&#160;immunoprecipitation of the protein of interest. Subsequently, the genomic site that the protein was bound to is characterized. Here, we describe and discuss ChIP and demonstrate its analytical value for the identification of the Transforming Growth Factor-&#946; (TGF-&#946;)-induced binding of the transcription factor SMAD2 to SMAD Binding Elements (SBE) within the promoter region of the tyrosine-protein kinase Kit (c-KIT) receptor ligand Stem Cell Factor (SCF).

DNA-protein interactions are essential for multiple biological processes. During the evaluation of cellular functions, the analysis of DNA-protein interactions is indispensable for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to analyze such interactions in vivo.

Chromatin Immunoprecipitation을 이용한 c-KIT 리간드 프로모터 분석

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for protein synthesis by translating codons in mRNA into amino acid sequences. tRNAs were long considered as house-keeping molecules that lacked regulatory functions. However, a growing body of evidence indicates that cellular tRNA levels fluctuate in correspondence to varying conditions such as cell type, environment, and stress. The fluctuation of tRNA expression directly influences gene translation, favoring or repressing the expression of particular proteins. Ultimately comprehending the dynamic of protein synthesis requires the development of methods able to deliver high-quality tRNA profiles. The method that we present here is named SPOt, which stands for Streamlined Platform for Observing tRNA. SPOt consists of three steps starting with metabolic labeling of cell cultures with radioactive orthophosphate, followed by guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction of radioactive total RNAs and finally hybridization on in-house printed macroarrays. tRNA levels are estimated by quantifying the radioactivity intensities at each probe spot. In the protocol presented here we profile tRNAs in Mycobacterium smegmatis mc2155, a nonpathogenic bacterium often used as a model organism to study tuberculosis.

We describe an original transfer RNA analysis platform named SPOt (Streamlined Platform for Observing tRNA). SPOt simultaneously measures cellular levels of all tRNAs in biological samples, in only three steps, and in less than 24 hours.

신진 대사 라벨 및 Macroarrays를 사용 하 여 전송 RNAs의 프로 파일링

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...

Investigation of RNA Synthesis Using 5-Bromouridine Labelling and Immunoprecipitation

When steady state RNA levels are compared between two conditions, it is not possible to distinguish whether changes are caused by alterations in production or degradation of RNA. This protocol describes a method for measurement of RNA production, using 5-Bromouridine labelling of RNA followed by immunoprecipitation, which enables investigation of RNA synthesized within a short timeframe (e.g., 1 h). The advantage of 5-Bromouridine-labelling and immunoprecipitation over the use of toxic transcriptional inhibitors, such as &#945;-amanitin and actinomycin D, is that there are no or very low effects on cell viability during short-term use. However, because 5-Bromouridine-immunoprecipitation only captures RNA produced within the short labelling time, slowly produced as well as rapidly degraded RNA can be difficult to measure by this method. The 5-Bromouridine-labelled RNA captured by 5-Bromouridine-immunoprecipitation can be analyzed by reverse transcription, quantitative polymerase chain reaction, and next generation sequencing. All types of RNA can be investigated, and the method is not limited to measuring mRNA as is presented in this example.

This method can be used to measure RNA synthesis. 5-Bromouridine is added to cells and incorporated into synthesized RNA. RNA synthesis is measured by RNA extraction immediately after labelling, followed by 5-Bromouridine-targeted immunoprecipitation of labelled RNA and analysis by reverse transcription and quantitative polymerase chain reaction.

5-Bromouridine 라벨 및 Immunoprecipitation를 사용 하 여 RNA 합성의 조사

When steady state RNA levels are compared between two conditions, it is not possible to distinguish whether changes are caused by alterations in ...

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective tag single nucleotide polymorphism (SNP) approach using a multiplexed genotyping assay with mass spectrometry, to investigate gene pathway associations in clinical cohorts. We investigate the food allergy candidate locus Interleukin13 (IL13) as an example. This method efficiently maximizes the coverage by taking advantage of shared linkage disequilibrium (LD) within a region. Selected LD SNPs are then designed into a multiplexed assay, enabling up to 40 different SNPs to be analyzed simultaneously, boosting cost-effectiveness. Polymerase chain reaction (PCR) is used to amplify the target loci, followed by single nucleotide extension, and the amplicons are then measured using matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight(MALDI-TOF) mass spectrometry. The raw output is analyzed with the genotype calling software, using stringent quality control definitions and cut-offs, and high probability genotypes are determined and output for data analysis.

Identification of genetic variants contributing to complex human disease allows us to identify novel mechanisms. Here, we demonstrate a multiplex genotyping approach to candidate genes or gene pathway analysis that maximizes the coverage at low cost and is amenable to cohort-based studies.

후보 유전자 다중화 유전형과 질량 분석 임상 코 호트 연구에서 테스트

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

A Fast and Quantitative Method for Post-translational Modification and Variant Enabled Mapping of Peptides to Genomes

Cross-talk between genes, transcripts, and proteins is the key to cellular responses; hence, analysis of molecular levels as distinct entities is slowly being extended to integrative studies to enhance the understanding of molecular dynamics within cells. Current tools for the visualization and integration of proteomics with other omics datasets are inadequate for large-scale studies. Furthermore, they only capture basic sequence identify, discarding post-translational modifications and quantitation. To address these issues, we developed PoGo to map peptides with associated post-translational modifications and quantification to reference genome annotation. In addition, the tool was developed to enable the mapping of peptides identified from customized sequence databases incorporating single amino acid variants. While PoGo is a command line tool, the graphical interface PoGoGUI enables non-bioinformatics researchers to easily map peptides to 25 species supported by Ensembl genome annotation. The generated output borrows file formats from the genomics field and, therefore, visualization is supported in most genome browsers. For large-scale studies, PoGo is supported by TrackHubGenerator to create web-accessible repositories of data mapped to genomes that also enable an easy sharing of proteogenomics data. With little effort, this tool can map millions of peptides to reference genomes within only a few minutes, outperforming other available sequence-identity based tools. This protocol demonstrates the best approaches for proteogenomics mapping through PoGo with publicly available datasets of quantitative and phosphoproteomics, as well as large-scale studies.

Here we present the proteogenomic tool PoGo and protocols for fast, quantitative, post-translational modification and variant enabled mapping of peptides identified through mass spectrometry onto reference genomes. This tool is of use to integrate and visualize proteogenomic and personal proteomic studies interfacing with orthogonal genomics data.

포스트 번역 상 수정 및 변형에 대 한 신속 하 고 양적 방법 사용의 펩 티 드 유전자에 매핑

Cross-talk between genes, transcripts, and proteins is the key to cellular responses; hence, analysis of molecular levels as distinct entities is slowly ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, and was deployed to West Africa during the recent Ebola virus epidemic, highlighting this possibility. In addition to its practical advantages (low cost, ease of equipment transport and use), this technology also provides fundamental advantages over second-generation sequencing approaches, particularly the very long read length, ability to directly sequence RNA, and real-time availability of data. Raw read accuracy is lower than with other sequencing platforms, which represents the main limitation of this technology; however, this can be partially mitigated by the high read depth generated. Here, we present a field-compatible protocol for sequencing of the mRNAs encoding for Niemann-Pick C1, which is the cellular receptor for ebolaviruses. This protocol encompasses extraction of RNA from animal blood samples, followed by RT-PCR for target enrichment, barcoding, library preparation, and the sequencing run itself, and can be easily adapted for use with other DNA or RNA targets.

Nanopore sequencing is a novel technology that allows cost-effective sequencing in remote locations and resource-poor settings. Here, we present a protocol for sequencing of mRNAs from whole blood that is compatible with such conditions.

나노 포어 시퀀싱을 사용 하 여 전 혈에서 mRNA의 시퀀싱

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...