독일 연구 협회 (DFG, 1386 / 17-1 워싱턴)에 의해 재정 지원 연구 교육 그룹 (DFG에 의해 자금) GRK 2039 및 KIT는 기꺼이 인정한다.

주의 : 사용하기 전에 모든 관련 물질 안전 보건 자료 (MSDS)를 참조하십시오. 이 합성에 사용 된 화학 물질 중 일부는 독성 및 발암 성이다. 일반적으로, 실험실 코트를 입고 안전 안경, 장갑 등의 유기 화학 실험실에 필요한 모든 적절한 안전 방법을 사용하십시오. 염료의 1. 합성 . 두 염료가 반응 동일한 유형으로 합성 할 수있다 (2) 이러한 반응의 개요를 보여줍니다 :합니다. <ol><li> 1- (3- 아지도 프로필)의 합성 -4- (2- (1- 메틸 -1H- 인돌 -3- 일) 비닐) 피리딘 -1- 윰 아이오다 이드 (염료 1) <ol><li> 1- (3- 아이오도 프로필) -4- 메틸 -1- 윰 아이오다 이드의 합성 (도 2a는, 단계 a) <ol><li> 녹여 466 mg의 4- 피 콜린 및 5.91 g 20 ML의 헤드 스페이스 바이알에 아세토 니트릴 10 ㎖에 1,3- diiodopropane 및 격벽 캡으로 단단히 밀봉. </li><li> 16 시간 동안 85 ° C까지 가열한다. </li><li> 그 후, RT로 냉각 회전 증발기를 사용하여 감압하에 용매를 제거 할 수있다. </li><li> 잔류 오일을 에틸 아세테이트 20 ㎖를 첨가하고 3 분 동안 120 W의 초음파 욕에서 혼합물을 처리한다. </li><li> 여과하여 형성된 침전물을 수집하고, 에틸 아세테이트로 5 회 세척 하였다. 진공 O의 /의 N에서 고체 제품을 건조시킵니다. </li></ol></li><li> 1- (3- 아지도 프로필) -4- 메틸 -1- 이움의 합성 (도 2a, b) 단계 <ol><li> 900 mg의 1- (3- 아이오도 프로필)을 20 ㎖ 헤드 스페이스 바이알에서 아세토 니트릴 12 ㎖ 중의 -4- 메틸 -1- 윰 아이오다 이드를 용해 나트륨 아 지드 376 ㎎을 추가하고, 격벽 캡으로 밀​​봉한다. </li><li> 16 시간 동안 85 ° C까지 가열한다. </li><li> 그 후, RT로 냉각 감압하에 회전 증발기를 사용하여 용매를 제거 할 수있다. </li><li> 잔류 물에 디클로로 메탄 15 ML을 추가합니다. </li><li> 여과 제거하고, 생성 된 침전물을 버린다. </li><li> 썩어을 사용하여 감압하에 용매를 제거진 증발기 갈색 오일로서 생성물을 얻었다. </li></ol></li><li> 1- 메틸 -1H- 인돌 -3- 카르 브 알데히드의 합성 (도 2a를 참조하면, 단계 c) <ol><li> 불활성 기체 (아르곤) 하에서, 환류 응축기가 장착 된 플라스크 둥근 바닥 50 ml를 10 ml의 절대 디메틸 포름 아미드 1.45 g 인돌 -3- 카르 브 알데히드, 1.52 g의 탄산 칼륨 및 2.70 g의 디메틸 카보네이트를 녹인다. </li><li> 19 시간 동안 130 ℃에서 혼합물을 교반한다. </li><li> 다음, 실온으로 냉각 얼음의 혼합물을 부어 할 수 있습니다. </li><li> 수성 층을 150 ㎖의 에틸 아세테이트로 3 회 추출한다. </li><li> 유기 층을 합하여 물로 세척하고 황산나트륨상에서 건조하고이를 감압하에 회전 증발기를 사용하여 50 ℃에서 용매를 제거한다. </li></ol></li><li> 커플 링 1- (3- 아지도 프로필) -4- (2- (1- 메틸 -1H- 인돌 -3- 일) 비닐) 피리딘 -1- 윰 아이오다 이드 (염료 1) (도 2a, 단계 d) <ol><li> 아르곤 하에서 수분의 배제에 따라 작업 할 수 있습니다. Dissol환류 응축기를 갖춘 플라스크 둥근 바닥 20 ㎖에 4 ㎖의 에탄올 중의 90 mg의 1- (3- 아지도 프로필) -4- 메틸 -1- 이움 및 48 mg의 1- 메틸 -1H- 인돌 -3- 카르 브 알데히드를했습니다. </li><li> 4 시간 동안 80 ° C로 0.07 ㎖의 피 페리 딘과 열을 추가합니다. </li><li> RT로 냉각 할 수 있습니다. </li><li> 여과하여 생성 된 침전물을 수집하고, 디 에틸 에테르로 3 회 세척 하였다. </li><li> 상층 액에 디 에틸 에테르를 추가하고 여과에 의해 생성 된 침전물을 수집합니다. 디 에틸 에테르로 3 회 씻는다. </li><li> 침전물을 결합합니다. </li></ol></li></ol></li><li> 1- (3- 아지도 프로필)의 합성 -4- (2- (1- 메틸 -2- 페닐 -1H- 인돌 -3- 일) 비닐) 퀴놀린 -1- 윰 아이오다 이드 (염료 2) <ol><li> 1- (3- 아이오도 프로필) -4- 메틸 퀴놀린 -1- 윰 아이오다 이드의 합성 (도 2b는, 단계 a) <ol><li> 녹여 715 mg의 4- 메틸 퀴놀린 및 5.91 g 20 ML의 헤드 스페이스 바이알에 아세토 니트릴 10 ㎖에 1,3- diiodopropane 및 격벽 캡으로 단단히 밀봉. </li><li> 열16 시간 동안 85 ° C이다. </li><li> 그 후, RT로 냉각 감압하에 회전 증발기를 사용하여 용매를 제거 할 수있다. </li><li> 남은 오일을 에틸 아세테이트 20 ㎖를 첨가하고 3 분 동안 120 W의 초음파 욕에서 혼합물을 처리한다. </li><li> 여과하여 형성된 침전물을 수집하고, 에틸 아세테이트로 5 회 세척 하였다. 진공 O의 /의 N에서 고체 제품을 건조시킵니다. </li></ol></li><li> 1- (3- 아지도 프로필) -4- 메틸 퀴놀린 -1- 이움의 합성 (도 2b를 참조하면, 단계 b) <ol><li> 900 mg의 1- (3- 아이오도 프로필)을 20 ㎖ 헤드 스페이스 바이알에서 아세토 니트릴 12 ㎖ 중의 -4- 메틸 퀴놀린 -1- 윰 아이오다 이드를 용해 나트륨 아 지드 333 ㎎을 추가하고, 격벽 캡으로 밀​​봉한다. </li><li> 16 시간 동안 85 ° C까지 가열한다. </li><li> 그 후, RT로 냉각 감압하에 회전 증발기를 사용하여 용매를 제거 할 수있다. </li><li> 잔류 물에 디클로로 메탄 15 ML을 추가합니다. </li><li> 여과 제거하고, 생성 된 침전물을 버린다. </li><li> 용매 유를 제거파인더 갈색 오일로서 생성물을 수득하는 회전 증발기를 사용하여 압력을 감소시켰다. </li></ol></li><li> 1- 메틸 -2- 페닐 -1H- 인돌 -3- 카르 브 알데히드의 합성 (도 2b를 참조하면, 단계 c) <ol><li> 불활성 기체 (아르곤) 하에서, 환류 응축기가 장착 된 플라스크 둥근 바닥 50 ml를 10 ml의 절대 디메틸 포름 아미드 1.45 g -2- 페닐 -1H- 인돌 -3- 카르 브 알데히드, 0.996 g의 탄산 칼륨 및 1.77 g의 디메틸 카보네이트를 녹인다. </li><li> 19 시간 동안 130 ℃에서 혼합물을 교반한다. </li><li> 다음, 실온으로 냉각 얼음의 혼합물을 부어 할 수 있습니다. </li><li> 수성 층을 150 ㎖의 에틸 아세테이트로 3 회 추출한다. </li><li> 유기 층을 합하여 물로 세척하고 황산나트륨상에서 건조하고이를 회전 증발기를 사용하여 감압하에 용매를 제거한다. </li></ol></li><li> 1- (3- 아지도 프로필)에 커플 링 -4- (2- (1- 메틸 -2- 프 피닐 -1H- 인돌 -3- 일) 비닐) 퀴놀린 -1- 윰 아이오다 이드 (도 2b를 참조하면, 단계 d) <ol><li> 인수에서 작업에 수분의 배제 아래. 플라스크 둥근 바닥 구비 한 20ml에 90 mg의 1- (3- 아지도 프로필) -4- 메틸 퀴놀린 -1- 이움 및 59.7 mg을 1- 메틸 -2- 페닐 -1H- 인돌 -3- 카브 알데하이드 4 ml의 에탄올에 녹여 환류 응축기. </li><li> 4 시간 동안 80 ° C로 0.06 ㎖의 피 페리 딘과 열을 추가합니다. </li><li> RT로 냉각 할 수 있습니다. </li><li> 여과에 의해 생성 된 침전물을 수집하고 디 에틸 에테르로 3 회 세척한다. </li><li> 상층 액에 디 에틸 에테르를 추가하고 여과에 의해 생성 된 침전물을 수집합니다. 디 에틸 에테르로 3 회 씻는다. </li><li> 침전물을 결합합니다. </li></ol></li></ol></li></ol> DNA의 가닥 2. 합성 주 : DNA 합성기에서 M. Caruthers (11)에 의해 설명 된 것처럼 DNA 가닥의 합성은 고체상에서 포스 방법을 사용하여 수행된다. 신디사이저의 기능은 합성 절차 전에 테스트하고, 시약 경우 갱신됩니다필요한. <ol><li> Prearrangements <ol><li> amidite 희석제 (추가 건조 아세토 니트릴) 1.2 ㎖에 시판되는 2&#39;-O-프로 파르 길 - deoxyuridinephosphoramidite (CU)를 녹인다. 신디사이저의 유리 병에 유리 병에 솔루션을 이동 신디사이저로 조입니다. </li><li> 더 아르곤 가스 누출이 없음을 확인 (제조업체의 지침에 따라)는 &quot;누설 테스트&quot;를 수행합니다. 은 &quot;누설 테스트가&quot;실패하면 더 단단히 유리 병에 나사. </li><li> 고상 합성 챔버에 연결 튜브를 작성하여 프라임 구리 용액. </li><li> 아세토 니트릴로 모든 라인을 씻으십시오. </li></ol></li><li> DNA 가닥의 합성 <ol><li> 제조 업체의 프로토콜의 지시에 따라 DNA 서열과 결합 방법을 입력 연결된 컴퓨터를 사용합니다. CU를 빌딩 블록의 커플 링 공정은 통상 7 펄스를 40 초에 비해 (각 펄스가 16 μL 임) (7) 펄스 168 초 소요빌딩 블록으로서 포스. </li><li> 제 1베이스 1 μmol으로 수정 고상과 CPG (제어 세​​공 유리)를 포함하는 열을 탑재 신디사이저로 (DNA 합성은 &#39;5&#39;3에서 수행된다). </li><li> DNA의 합성 (11)의 합성을 시작합니다. </li></ol></li><li> 합성 된 DNA 가닥의 정밀 검사 <ol><li> 진공 O의 /의 N에서 합성 된 DNA 가닥과 열을 건조시킵니다. </li><li> 열을 열고 반응 유리 병에 CPG를 해제하기 위해 협공을 사용합니다. 올리고 뉴클레오티드를 탈 보호 및 CPG에서 DNA 가닥을 해제 농축 암모니아 수용액의 700 μl를 추가합니다. </li><li> 18 시간 동안 50 ° C까지 바이알을 닫고 붕괴되는 것을 방지하기 위해, 반응 용기에 보안 덮개를 적용하고, 가열. </li><li> 30 분 동안 30 ° C에서 감압 (100 밀리바)에서 원심 분리하여 암모니아를 제거합니다. </li><li> CPG에서 여과를 시작 원심 분리기 용기를 11,000 XG FO에R 3 분. 상등액을 취하여 0.45 ㎛의 세공 크기를 갖는 원심 분리 장치로 옮긴다. 4 분 동안 1,000 XG에 원심 분리기. </li><li> 한편 3 분 동안 11,000 XG에 20 초 원심 분리기의 CPG, 소용돌이에 두 번 증류수 300 μl를 추가합니다. 4 분 동안 1,000 XG에서 원심 장치와 원심 분리기에 뜨는을 전송합니다. 두 번이 세척 절차를 반복합니다. </li><li> 0.1 밀리바 25 ° CO / N에서 원심 분리하여 결합 된 수용액에서 물을 제거합니다. </li></ol></li></ol> 3. &quot;클릭&quot;절차 <ol><li> (0.1 [(1- 벤질 -1H- 1,2,3- 트리아 졸 -4- 일) 메틸] 아민 - 50 μL 이중 증류수, 나트륨 아스 코르 베이트 용액을 25 μL (물 중 0.4 M), 34 ㎕의 트리스 추가 DMSO의 M /을 tBuOH 3 : 아 지드의 1) 114 μL (0.01 DMSO에서 M /을 tBuOH 3 : 1) 및 테트라 키스 17 μL (아세토 니트릴), 구리 (I) 헥사 플루오로 포스페이트 용액 (0.1 DMSO에서 M /을 tBuOH 3 : 1) 동결 건조 된 알킨 변성 DNA 샘플이다. </l난&gt; <li> 1.5 시간 동안 60 ℃에서 샘플을 인큐베이션. </li><li> 실온으로 냉각. </li><li> 150 μL 나 2 EDTA (물에 0.05 M) 및 10 ML 튜브에 DNA 샘플 및 전송에 450 ㎕의 아세트산 나트륨 (물에 0.3 M)를 추가합니다. </li><li> 10 ml의 에탄올 (100 %)를 추가하고 16 시간 동안 -32 ℃에서 보관하십시오. </li><li> (15) 1000 XG에 분, 상층 액을 제거하기위한 원심 분리기 용기. </li><li> 2 ml의 차가운 에탄올 (80 %)와 DNA-펠렛을 씻으십시오. </li><li> 감압 건조 펠렛. </li></ol> 4. HPLC 정제 참고 : 분리하기 전에 DNA 가닥이 HPLC가 제대로 작동하는지 확인, 충분한 용매를 사용할 수 있으며 열은 깨끗합니다. 버퍼 / 아세토 니트릴의 시작 농도 열을 씻어. <ol><li> HPLC 바이알에 이중 증류수 및 전송의 250 μL의 원유 DNA-펠렛을 녹인다. </li><li> 염료 1 및 GRADI 대한 아세토 니트릴의 15 % 0 % 아세토 니트릴 구배로 45 분 HPLC 실행 시작<html> 염료 2의 아세토 니트릴 17 % 0 % 아세토 니트릴의 엔트는 260 나노 미터 (DNA 흡수) 및 459 nm의 (염료 1) 또는 542 nm의 (염료 2)를 확인하여 실행을 모니터링합니다. 두 파장 채널에서 흡수를 보여 그 분수를 수집합니다. </li><li> 3- 하이드 록시피 콜린 산 (3HPA) 및 diammoniumhydrogencitrate로 구성된 행렬을 이용하여 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 (MALDI) 질량 분석에 의해 오른쪽 대량의 수집 분수를 확인합니다. <ol><li> 물에 diammoniumhydrogencitrate 용액 (100g / L)를 100 ㎕의 아세토 니트릴과 물의 혼합물을 1 : 1 포화 3-HPA 용액 900 μL를 혼합하여 매트릭스를 준비한다. </li><li> 대상의 DNA 프로브의 1-2 μl를 피펫 공기에 건조 할 수 있습니다. </li><li> 샘플로 3 HPA는 / diammoniumhydrogencitrate 행렬의 0.2 μl를 추가하고 결정화 될 때까지 섞는다. </li><li> MALDI 질량 분석을 수행합니다. </li><li> 오른쪽 질량을 전시하는 HPLC의 분수를 결합합니다. </li></ol></li></ol>농도의 _title &quot;&gt; 5. 결​​정 주 : 농도는 DNA 염기와 염료의 흡광 계수 (ε 260)에 근거하여 UV / 비스 분광하여 260 nm에서 흡광도를 측정함으로써 결정된다. <ol><li> 이중 증류수 200 μL - 100의 DNA를 녹여. </li><li> 자외선은 / 마주 분광 광도계에 DNA 용액 1 μL를 적용합니다. </li><li> 260 nm에서 흡광도를 측정한다. 세 번 반복합니다. </li><li> 용액의 농도를 계산하는 평균값을 가지고. 흡광 계수의 계산, 전체 DNA 가닥의 ε의 260 나노 미터를 얻기 위해 네 천연베이스 (12)의 ε 260 나노 미터 및 (천연 딘으로 간주) 구입 빌딩 블록 CU의 ε의 260 나노 미터 (12)를 사용한다. 염료 1, 사용 ε의 260 나노 미터 = 10,200 L를 들어 * 몰 -1 * cm -1 염료 2를 사용 ε의 260 나노 미터 = 13,100 L의 * 몰 &lt;SUP&gt; -1 * cm -1. 흡광 계수 측정 한 흡광도에 기초 램버트 - 맥주의 법칙 다음, 용액의 농도를 계산한다. 13 </li></ol> 6. 샘플 준비 및 분광학 <ol><li> 단일 가닥 샘플의 제조 <ol><li> 200 mM의 염화나트륨, 50 mM의 낮잠 내가 버퍼에서 수정 된 DNA1 및 DNA2 각각 2.5 μm의 솔루션을 개별적으로 1 ml의 pH는 7을 준비합니다. </li></ol></li><li> 이중 가닥 샘플의 제조 <ol><li> 반응 용기에 200 mM의 염화나트륨, 50 mM의 NAP 나 버퍼, pH가 7 DNA2 2.5 DNA1의 μM 2.5 μM을 함유 한 용액 1 ㎖를 준비한다. </li><li> 10 분 동안 90 ° C에 안전 캡과 열로 뚜껑을 고정합니다. 그리고 난방을 끄고 RT O / N로 냉각 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 흡광 주 : 형광 스펙 대 여기 파장을 결정하려면troscopy 흡수​​ 스펙트럼이 기록됩니다. <ol><li> 단일 가닥 측정 <ol><li> 200 mM의 염화나트륨, 50 mM의 낮잠 내가 버퍼, pH는 7이 포함 된 빈 측정을 기록합니다. </li><li> 1cm 석영 유리 큐벳에 DNA1 준비된 용액을 전송하고 흡수를 기록한다. 빈 데이터에 대한 측정을 수정합니다. 염료의 흡수 최대 값을 결정한다. </li><li> DNA2에 대해 반복합니다. </li></ol></li></ol></li><li> 형광 분광법 <ol><li> 단일 가닥 측정 <ol><li> 200 mM의 NaCl을, 내가 버퍼 50 mM의 낮잠을 포함하는 빈 측정을 기록, 산도 = 7; 염료 (1)의 여기 파장을 사용. </li><li> 1cm 석영 유리 큐벳에 DNA1 용액을 전송. </li><li> 형광 스펙트럼을 기록합니다. </li></ol></li><li> 두 가닥 측정 <ol><li> 석영 유리 큐벳에 이중 가닥 용액을 전송. </l난&gt; <li> 염료 (1)의 여기 파장을 이용한 형광 스펙트럼을 기록한다. </li></ol></li></ol></li><li> 시각화 실험 주의 : 적절한 눈 보호는 눈에 자외선 손상을 방지하기 위해 착용한다! <ol><li> , 기록 된 스펙트럼이 표시 무엇의 더 나은 이해를 얻을 휴대용 자외선 램프 (그림 5)와 큐벳을 조사합니다. 이중 가닥 DNA에 하나의 형광 색상의 변화를 관찰한다. </li></ol></li></ol>

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intramolecular+Dimers:+A+New+Strategy+to+Fluorescence+Quenching+in+Dual-Labeled+Oligonucleotide+Probes.">Intramolecular Dimers: A New Strategy to Fluorescence Quenching in Dual-Labeled Oligonucleotide Probes.</a> J. Am. Chem. Soc. 124, 6950-6956 (2002).</li><li>Barrois, S., W&#246;rner, S., Wagenknecht, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Duplex+Stability+for+Wavelength-Shifting+Fluorescent+DNA+Probes:+Energy+Transfer+vs+Excition+Interactions+in+DNA+&amp;#34;Traffic+Lights&amp;#34;,+Photochem.">The Role of Duplex Stability for Wavelength-Shifting Fluorescent DNA Probes: Energy Transfer vs Excition Interactions in DNA &amp;#34;Traffic Lights&amp;#34;, Photochem.</a> Photobiol. Sci. 13, 1126-1129 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

이 프로토콜은 아 지드 수정 형광 염료에 의해 CuAAC 통해 DNA 후 합성 레이블의 전체 과정을 보여줍니다. 이 염료 및 알킨 변성 DNA의 합성뿐만 아니라, 표시 순서를 포함한다. 염료의 합성은 네 단계를 따른다. 모든 제품은 그들의 양전하로 비교적 간단 침전에 의해 수득 할 수 있고 시간 소모적 컬럼 크로마토 그래피는 필요하지 않다. 중앙 커플 링 단계 이전에 아 지드 기능의 도입은 네 대신 5 개의 연속 반응 단계에 염료의 합성을 단축. 1,3- diiodopropane 대신 알킬화 공정은 아펠 반응 및 요오 작용기로 수산기 함수 변환 다음 Finkelstein 반응을위한 3 iodopropanol의 적용을 회피 하였다. 게시 된 절차에 비해 이러한 변화는 우리가 더 큰 규모와 시간의 짧은 기간에 염료를 합성 할 수 있습니다. <p클래스 = &quot;jove_content&quot;&gt;인가 염료는 우수한 광 안정성 아니라 고상 DNA 합성 및 후 처리시 필요한 안정성을 나타낸다. 따라서, 후 합성 라벨링 전략이 선택되었다. 대안 적으로, DNA 합성 동안 같은 귀금속 염료 라벨링 나타내는 매우 약한 커플 링 및 탈 보호 조건 (예를 들면, 탄산 칼륨으로 탈 보호). 이것은 훨씬 더 저렴한 대안을 나타내고, 고체 지지체 (온 비드)의 DNA 빌딩 블록 또는 라벨로 대응 색소 변성 포스 포르의 합성을 필요로한다. DNA1 염료는 2 셉터 염료로 염색 한 도너 염료 및 DNA2별로 표시된다. DNA1 및 DNA2는 열처리하면 모두 염료는 가까이에 얻을. 염료가 여기 한 때 효율적인 에너지 전달이 관찰된다. 원칙적으로, 모두 염료 사이의 엑시톤 상호 작용은 후자의 프로세스가 비 결합을 필요로하기 때문에 효율적인 에너지 전달을 방해하고 여기있다결합 된 염료의 D 염료 1 비결 염료 2 여기는 다른 광 물리 경로를 개시한다. 14 우리의 이전 연구 9,15 염료의 도포 3&#39;-5&#39;- 대각선 배열 사이에만 작은 엑시톤의 상호 작용에 대한 구조 기준을 제공하는 것이 밝혀 염료 및 효율적인 에너지 전달. 입증 된 에너지 전달의 높은 효율 시험 관내 및 생체 내 실험에서 정확한 형광 판독 할 수 있습니다. 이 균체 내에 핵산 계 앱 타머뿐만 아니라, 작은 간섭 RNA (siRNA와)의 무결성의 시각화 표적 분자의 결합은 분자 표지의 DNA 혼성화의 시각화를 포함한 다양한 애플리케이션을 제공한다. 주요 제한은 모두 DNA 가닥 레이블을 할 수있는 요구 사항입니다. 앞으로 우리는 한 가닥 모두 염료가 부착 된 이중 표지 된 올리고 뉴클레오티드 프로브의 개발에 우리의 일을 집중하는 것을 목표로하고 있습니다.

분자 이미징은 살아있는 세포 내에서 생물학적 과정을 이해하기위한 기본적인 기술을 나타냅니다. 1-3 화학적 생물학적 응용 프로그램에 대한 형광 핵산 ​​기반 프로브의 개발이 확대 연구 분야가되고있다. 이 형광 프로브는 세포 이미징에 적합한 도구가 될 몇 가지 요구 사항을 충족해야합니다. 첫째, 적용 염료가 높은 양자 수율과 형광을 전시한다, 큰 스톡스 &#39;변화는, 그리고 가장 중요한 것은, 높은 photostabilities는 생체 내 이미징의 장기를 허용합니다. 그리고 둘째로, 그들은 신뢰할 수있는 형광 판독을 표시해야합니다. 종래 발색단 소광-시스템은 형광 농도의 간단한 변경에 의해 하나의 형광 색의 판독에 기초한다. (4)이 접근법으로 인해 세포 내 성분 또는 낮은 신호대 잡음비의 형광도에 위양성 혹은 위음성 결과의 위험을 부담 때문에 다른 COM에 의해 원치 않는 담금질에ponents. 4 최근 개의 상이한 발색단을 사용하여 이중 형광 색 판독을 표시 &quot;DNA 신호등&quot;의 개념을보고 하였다. 5-6 개념은 형광 변화 셉터 염료 도너 염료의 에너지 전달 (ET)에 기초 컬러 (도 1 참조). 이는보다 안정적인 판독이 가능하여 형광 이미징 프로브를위한 강력한 도구를 제공합니다. 형광 염료를 가진 올리고 뉴클레오티드 라벨링 두 가지 방법에 의해 달성 될 수있다. 염료는 상응하는 개질 된 포스 빌딩 블록을 사용하여 고상에서 화학적 DNA 합성 동안 혼입 될 수있다. (7)이 메소드는 표준 포스 탈 보호 조건 하에서 안정한 염료로 제한된다. 대안으로, 사후 합성 수정 방법은 올리고 뉴클레오티드 화학에 설립되었다. 여기, 우리는 우리의 새로운 사진 중 하나의 합성을 보여테이블 에너지 전달 쌍 8,9 및 아 지드와 알킨 (CuAAC) 사이의 구리 촉매 1,3- 사이클로을 사용하여 DNA의 후 합성 라벨. (10)

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="885">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:409px;">synthesis</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4-Picoline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>239615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1,3-Diiodopropane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>238414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetonitrile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10660131</td>
			<td>HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethyl acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10456870</td>
			<td>technical grade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium azide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71290</td>
			<td>p.a. grade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dichloromethane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10626642</td>
			<td>technical grade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Indole-3-carboxaldehyde; 98%</td>
			<td>ABCR</td>
			<td>AB112969</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Potassium carbonate, 99+%</td>
			<td>Acros</td>
			<td>424081000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dimethylcarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>517127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">N,N-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry over Molecular Sieve</td>
			<td>Acros</td>
			<td>348435000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium sulfate</td>
			<td>Bernd Kraft</td>
			<td>12623.46</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol, 99.5%</td>
			<td>Acros</td>
			<td>397690010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Piperidine, 99%</td>
			<td>Acros</td>
			<td>147181000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Diethylether</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10407830</td>
			<td>technical grade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2-Phenylindole-3-carboxaldehyde; 97%</td>
			<td>ABCR</td>
			<td>AB125050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4-Methylquinoline</td>
			<td>ABCR</td>
			<td>AB117222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DNA synthesis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Expedite 8909 Nucleic Acid Synthesizer</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMT-dA(bz) Phosphoramidite</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A111081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMT-dT Phosphoramidite</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T111081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMT-dG(dmf) Phosphoramidite</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G11508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMT-dC(bz) Phosphoramidite</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C11108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Amidite Diluent for DNA synthesis</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L010010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ultrapure Acetonitrile for DNA synthesis</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L010400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cap A</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L840000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cap B</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L850000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CPG dT Column 1.0 &#181;mole</td>
			<td>Proligo Reagents</td>
			<td>T461010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CPG dA(bz) Column 1.0 &#181;mole</td>
			<td>Proligo Reagents</td>
			<td>A461010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CPG dG(ib) Column 1.0 &#181;mole</td>
			<td>Proligo Reagents</td>
			<td>G461010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CPG dC(bz) Column 1.0 &#181;mole</td>
			<td>Proligo Reagents</td>
			<td>C461010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ammonia (aqueous solution)&#160;</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>318612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">centrifugal devices nanosep 0.45 &#181;m</td>
			<td>Pall</td>
			<td>ODGHPC34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5-(Benzylthio)-1H-tetrazole (Activator)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>75666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2&#39;-O-propargyl deoxyuridinephosphoramidite</td>
			<td>Chem Genes</td>
			<td>ANP-7754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">workup</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">vacuum concentrator</td>
			<td>Christ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">clicking procedure</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tetrakis(acetonitrile)copper(I) hexafluorophosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>346276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">(+)-Sodium L-ascorbate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA disodium salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TBTA-ligand</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td>synthesized according to a literature procedure [1]</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HPLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HPLC-system</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MALDI-Biflex-IV spectrometer</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LC-318 C18 column</td>
			<td>Supelcosil via Sigma Aldrich</td>
			<td>58368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">determination of concentration</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ND 1000 Spectrophotometer</td>
			<td>nanodrop</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">sample preparation and spectroscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cary 100 Bio</td>
			<td>Varian</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluoromax-3 fluorimeter</td>
			<td>Jobin-Yvon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:409px;">[1] R. Chan Timothy, R. Hilgraf, K. B. Sharpless, V. Fokin Valery, Org Lett 2004, 6, 2853-2855.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis of wavelength-shifting dna hybridization probes by using photostable cyanine dyes

이 프로토콜에서는 2&#39;- 알킨의 합성 방법은 포스 표준 화학을 사용하여 자동화 고상 합성에 의해 디옥시리보 핵산 (DNA) 가닥을 변성 보여준다. 올리고 뉴클레오티드 후 합성 구리 촉매 클릭 화학 제를 사용하여 두 개의 새로운 광 안정성 시아닌 염료로 표시되어 있습니다. 모두 도너와 억 셉터 염료의 합성을 설명하고, 세 개의 연속 단계로 수행된다. 이들은 혼성화에 접할 때 주변 구조와 같은 DNA,이 두 염료의 에너지 전달을 겪는다. 따라서, 두 개의 단일 가닥의 DNA 가닥의 어닐링 형광 색의 변화에​​ 의해 가시화된다. 이 색상 변화는 형광 분광 특징뿐만 아니라, 직접적으로 휴대용 자외선 (UV) 램프를 이용하여 관찰 할 수있다. 이중 색상 형광 판독 값의 개념은 이러한 올리고 뉴클레오티드 프로브를 분자 이미징 특히 기재된 포위한 우수한 툴을 만든다tostable 염료가 사용된다. 이에 따라, 이미징 프로브 광표백은 방지되고, 생물학적 과정은 긴 시간주기 동안 실시간으로 관찰 할 수있다.

도 4에 도시 된 바와 같이, 단일 및 이중 가닥 DNA의 흡수 및 형광 스펙트럼을 기록한다. 기록 된 흡수 스펙트럼 (그림 4 오른쪽) 단일 가닥 DNA1 (염료 1) 및 단일 가닥 DNA2 (염료 2)에 대한 546 nm의 465 nm에서 쇼 흡수 최대의 λ 최대. 어닐링 DNA1_2 (염료 1 염료 2) 469 nm 내지 567 nm의 모두에서 최대 값을 보여줍니다. 모두 최대 흡수는 장파장 이동, 염료 1 4 nm의 이러한 작은 분광 변화가 이중 나선 DNA 구조 내에서 염료 사이의 엑시톤 상호 작용의 결과 염료 2에 대한 21 나노을 보여줍니다. 하나를위한 607 nm에서 해당 형광 스펙트럼 단일 가닥 DNA1 (염료 1, 435 nm에서 여기)에 대한 537 nm에서 (왼쪽 그림 4) 전시 최대 λ 최대,-stranded DNA2 (염료 2, 535 nm에서 여기) 소둔 DNA1_2에 대한 615 nm에서 (염료 1 및 435 nm에서 2, 여기 염료). 염료 1 에너지 전송이 1시 57분의 발광 콘트라스트 비를 제공한다 2. 염색 염료 (1)로부터 효과적으로 발생하는 보이지 않고 선택적으로 여기되어 있지만 DNA1_2 단독 염료 2의 발광 최대 값을 나타낸다. 도 5에 도시 된 바와 같이, 단일 및 이중 가닥의 차이는 표준 UV 램프로 여기시 큐벳의 발광 색을 비교하여 명백하다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54121/54121fig1.jpg" /> DNA의 에너지 전달도 1 기본 개념. 도너 변성 DNA 가닥 (녹색) 435 nm에서의 조사에 의해 535 nm에서 형광을 나타낸다. 그것은 수용체 수정 카운터 가닥 (빨간색) 결과 이​​중 가닥의 혼성화 된 경우610 nm에서의 수용체 염료의 붉은 형광을 가죠. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54121/54121fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54121/54121fig2.jpg" /> 도 2는 합성 염료 1 염료 2 개의 시아닌 염료 1 (A)의 합성 2 (B)의 개요는 세 개의 연속적인 단계에서 수행된다.도 9의 (A) a) 1,3- diiodopropane을 CH 3 CN, 85 ° C, 16 시간, 94 %; b)는 NaN의 3, CH 3 CN, 85 ° C, 16 시간, 87 %; c) K 2 CO 3, 디메틸 카보네이트, DMF, 130 ℃, 19 시간, 89 %; d) 피 페리 딘을 EtOH, 80 ℃, 4 시간, 80 %. (B)가) 1,3- diiodopropane, CH 3 CN, 85 ° C, 16 시간, 49 %; b)는 NaN의 3, CH 3 CN, 85 ° C, 16 시간, 93 %; 기음) K 2 CO 3, 디메틸 카보네이트, DMF, 130 ℃, 19 시간, 98 %; 라) 피 페리 딘, EtOH로, 80 ° C는 4 시간, 44 %. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54121/54121fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54121/54121fig3.jpg" /> CU 빌딩 블록도 3의 구조, 염료 1 및 2와 DNA1 및 DNA2 시퀀스. 1 및 2 DNA1 및 DNA2 주어진 시퀀스 내 트리아 링커 리보스의 2 &#39;위치에 결합하는 염료. 9 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54121/54121fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54121/54121fig4.jpg" /> 그림 4. FLUO단일 및 이중 가닥 DNA 가닥 (왼쪽)와 단일 및 이중 가닥 DNA 가닥 (오른쪽). DNA1의 방출 스펙트럼을 535 nm에서 435 nm에서 464 nm의 DNA2 (적색)에서 흥분 (검정), 흥분 (핑크 흡수 rescence ) 및 435 nm에서 여기 DNA1_DNA2 하이브리드 (파란색) 표시됩니다. 단일 가닥 DNA1 (검정), DNA2 (빨간색) 및 혼성화 된 이중 가닥 DNA1_DNA2 (파란색)의 흡수 스펙트럼은 오른쪽 쇼에 표시됩니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54121/54121fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/54121/54121fig5.jpg" /> 자외선 램프에 의해 여기 동안 기증자 염료 (왼쪽)와 기증자 및 수용체 염료 (오른쪽)와 이중 가닥 DNA와 단일 가닥 DNA의 그림 5. 배출 색상. 단일 가닥 DNA1를 포함하는 큐벳의 이미지 (LEFt 측이) 밝은 녹색 형광을 나타내며, 이중 가닥 DNA1_DNA2 (오른쪽)의 이미지가 366 nm의 휴대용 자외선 램프로 여기시 붉은 형광을 보여줍니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54121/54121fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Synthesis of Wavelength-shifting DNA Hybridization Probes by Using Photostable Cyanine Dyes at JoVE.com

Synthesis of Wavelength-shifting DNA Hybridization Probes by Using Photostable Cyanine Dyes

Photostable cyanine dyes are attached to oligonucleotides to monitor hybridization by energy transfer.

광 안정성 시아닌 염료를 사용하여 파장 변환 DNA 혼성화 프로브의 합성

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase ...

synthesis-wavelength-shifting-dna-hybridization-probes-using

Nanyang Technological University

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Organic Chemistry

Biology

Unit 1

Alkynes

SCIENTISTS IN ACTION

11.0K 조회수.  Karlsruhe Institute of Technology. Photostable cyanine dyes are attached to oligonucleotides to monitor hybridization by energy transfer.

비디오: Synthesis of Wavelength-shifting DNA Hybridization Probes by Using Photostable Cyanine Dyes

Selective Labelling of Cell-surface Proteins using CyDye DIGE Fluor Minimal Dyes

Surface  proteins are central to the cell's ability to react to its environment and to interact with neighboring cells. They are known to be inducers of almost all intracellular signaling. Moreover, they play an important role in environmental adaptation and drug treatment, and are often involved in disease pathogenesis and pathology (1). Protein-protein interactions are intrinsic to signaling pathways, and to gain more insight in these complex biological processes, sensitive and reliable methods are needed for studying cell surface proteins. Two-dimensional (2-D) electrophoresis is used extensively for detection of biomarkers and other targets in complex protein samples to study differential changes. Cell surface proteins, partly due to their low abundance (1 2% of cellular proteins), are difficult to detect in a 2-D gel without fractionation or some other type of enrichment. They are also often poorly represented in 2-D gels due to their hydrophobic nature and high molecular weight (2). In this study, we present a new protocol for intact cells using CyDye  DIGE Fluor minimal dyes for specific labeling and detection of this important group of proteins. The results showed specific labeling of a large number of cell surface proteins with minimal labeling of intracellular proteins. This protocol is rapid, simple to use, and all three CyDye DIGE Fluor minimal dyes (Cy 2, Cy 3 and Cy 5) can be used to label cell-surface proteins. These features allow for multiplexing using the 2-D Fluorescence Difference Gel Electrophoresis (2-D DIGE) with Ettan  DIGE technology and analysis of protein expression changes using DeCyder  2-D Differential Analysis Software. The level of cell-surface proteins was followed during serum starvation of CHO cells for various lengths of time (see Table 1). Small changes in abundance were detected with high accuracy, and results are supported by defined statistical methods.

A simple and specific method was demonstrated for fluorescent labeling and enhanced detection of cell surface proteins without a fractionation step. Differential abundance in cell surface proteins was analyzed using two-dimensional (2-D) electrophoresis and Ettan&#x2122; DIGE technology.

CyDye DIGE 플루어 최소 염료를 사용하여 셀 표면 단백질의 선택적 Labelling

Surface  proteins are central to the cell's ability to react to its environment and to interact with neighboring cells. They are known to be inducers of ...

연구

생물학

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be produced to contain any desired DNA or RNA sequence and can be prepared to include a wide variety of base and sugar modifications. Moreover, oligos can be designed to mimic specific nucleic acid alterations and thus, can serve as important tools to investigate effects of DNA damage and mechanisms of repair. We found that Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos with a length between 50 and 80 nucleotides can be particularly suitable to study, in vivo, functions and consequences of chromosomal RNA/DNA hybrids and of ribonucleotides embedded into DNA. RNA/DNA hybrids can readily form during DNA replication, repair and transcription, however, very little is known about the stability of RNA/DNA hybrids in cells and to which extent these hybrids can affect the genetic integrity of cells. RNA-containing oligos, therefore, represent a perfect vector to introduce ribonucleotides into chromosomal DNA and generate RNA/DNA hybrids of chosen length and base composition. Here we present the protocol for the incorporation of ribonucleotides into the genome of the eukaryotic model system yeast /Saccharomyces cerevisiae/. Yet, our lab has utilized Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos to generate RNA/DNA hybrids at the chromosomal level in different cell systems, from bacteria to human cells.

This work shows how to form an RNA/DNA hybrid at the chromosomal level and reveal transfer of genetic information from RNA to genomic DNA in yeast cells.

RNA 함유 Oligonucleotides를 사용하여 변환하여 게놈 DNA에서 RNA / DNA 하이브리드의 생성

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

DNA Microarrays: Sample Quality Control, Array Hybridization and Scanning

Microarray expression profiling of the nervous system provides a powerful approach to identifying gene activities in different stages of development, different physiological or pathological states, response to therapy, and, in general, any condition that is being experimentally tested1. Expression profiling of neural tissues requires isolation of high quality RNA, amplification of the isolated RNA and hybridization to DNA microarrays. In this article we describe protocols for reproducible microarray experiments from brain tumor tissue2. We will start by performing a quality control analysis of isolated RNA samples with Agilent's 2100 Bioanalyzer "lab-on-a-chip" technology. High quality RNA samples are critical for the success of any microarray experiment, and the 2100 Bioanalyzer provides a quick, quantitative measurement of the sample quality. RNA samples are then amplified and labeled by performing reverse transcription to obtain cDNA, followed by in vitro transcription in the presence of labeled nucleotides to produce labeled cRNA. By using a dual-color labeling kit, we will label our experimental sample with Cy3 and a reference sample with Cy5. Both samples will then be combined and hybridized to Agilent's 4x44 K arrays. Dual-color arrays offer the advantage of a direct comparison between two RNA samples, thereby increasing the accuracy of the measurements, in particular for small changes in expression levels, because the two RNA samples are hybridized competitively to a single microarray. The arrays will be scanned at the two corresponding wavelengths, and the ratio of Cy3 to Cy5 signal for each feature will be used as a direct measurement of the relative abundance of the corresponding mRNA. This analysis identifies genes that are differentially expressed in response to the experimental conditions being tested.

We demonstrate the use of DNA microarrays for expression profiling of the nervous system. We describe RNA quality control, sample labeling, and array hybridization and scanning.

의 DNA Microarrays : 샘플 품질 제어, 배열 하이브 리다이 제이션 및 스캔

Microarray expression profiling of the nervous system provides a powerful approach to identifying gene activities in different stages of development, ...

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)

In the past fifteen years the notion that cell membranes are not homogenous and rely on microdomains to exert their functions has become widely accepted. Lipid rafts are membrane microdomains enriched in cholesterol and sphingolipids. They play a role in cellular physiological processes such as signalling, and trafficking1,2 but are also thought to be key players in several diseases including viral or bacterial infections and neurodegenerative diseases3.
Yet their existence is still a matter of controversy4,5. Indeed, lipid raft size has been estimated to be around 20 nm6, far under the resolution limit of conventional microscopy (around 200 nm), thus precluding their direct imaging. Up to now, the main techniques used to assess the partition of proteins of interest inside lipid rafts were Detergent Resistant Membranes (DRMs) isolation and co-patching with antibodies. Though widely used because of their rather easy implementation, these techniques were prone to artefacts and thus criticized7,8. Technical improvements were therefore necessary to overcome these artefacts and to be able to probe lipid rafts partition in living cells.
Here we present a method for the sensitive analysis of lipid rafts partition of fluorescently-tagged proteins or lipids in the plasma membrane of living cells. This method, termed Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS), relies on the disparity in diffusion times of fluorescent probes located inside or outside of lipid rafts. In fact, as evidenced in both artificial membranes and cell cultures, probes would diffuse much faster outside than inside dense lipid rafts9,10. To determine diffusion times, minute fluorescence fluctuations are measured as a function of time in a focal volume (approximately 1 femtoliter), located at the plasma membrane of cells with a confocal microscope (Fig. 1). The auto-correlation curves can then be drawn from these fluctuations and fitted with appropriate mathematical diffusion models11.
FCS can be used to determine the lipid raft partitioning of various probes, as long as they are fluorescently tagged. Fluorescent tagging can be achieved by expression of fluorescent fusion proteins or by binding of fluorescent ligands. Moreover, FCS can be used not only in artificial membranes and cell lines but also in primary cultures, as described recently12. It can also be used to follow the dynamics of lipid raft partitioning after drug addition or membrane lipid composition change12.

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy FCS

A technique to probe the lipid raft partitioning of fluorescent proteins at the plasma membrane of living cells is described. It takes advantage of the disparity in diffusion times of proteins located inside or outside of lipid rafts. Acquisition can be performed dynamically in control conditions or after drug addition.

지질 뗏목의 결정은 형광 상관 분광학 (FCS)에 의해 살아있는 세포에서 Fluorescently 태그가 추가된 프로브의 파티션

In the past fifteen years the notion that cell membranes are not homogenous and rely on microdomains to exert their functions has become widely accepted. ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

형광에 의한 바이러스성 RNA의 탐지<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드화 (물고기)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place over the next 5 years. For example, the sequencing of the genomes for 15 malaria mosquitospecies is currently being done using an Illumina platform3,4. This Anopheles species cluster includes both vectors and non-vectors of malaria. When the genome assemblies become available, researchers will have the unique opportunity to perform comparative analysis for inferring evolutionary changes relevant to vector ability. However, it has proven difficult to use next-generation sequencing reads to generate high-quality de novo genome assemblies5. Moreover, the existing genome assemblies for Anopheles gambiae, although obtained using the Sanger method, are gapped or fragmented4,6.
Success of comparative genomic analyses will be limited if researchers deal with numerous sequencing contigs, rather than with chromosome-based genome assemblies. Fragmented, unmapped sequences create problems for genomic analyses because: (i) unidentified gaps cause incorrect or incomplete annotation of genomic sequences; (ii) unmapped sequences lead to confusion between paralogous genes and genes from different haplotypes; and (iii) the lack of chromosome assignment and orientation of the sequencing contigs does not allow for reconstructing rearrangement phylogeny and studying chromosome evolution. Developing high-resolution physical maps for species with newly sequenced genomes is a timely and cost-effective investment that will facilitate genome annotation, evolutionary analysis, and re-sequencing of individual genomes from natural populations7,8.
Here, we present innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization (FISH), and imaging that facilitate rapid development of physical maps. Using An. gambiae as an example, we demonstrate that the development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies and, thus, the quality of genomic analyses. First, we use a high-pressure method to prepare polytene chromosome spreads. This method, originally developed for Drosophila9, allows the user to visualize more details on chromosomes than the regular squashing technique10. Second, a fully automated, front-end system for FISH is used for high-throughput physical genome mapping. The automated slide staining system runs multiple assays simultaneously and dramatically reduces hands-on time11. Third, an automatic fluorescent imaging system, which includes a motorized slide stage, automatically scans and photographs labeled chromosomes after FISH12. This system is especially useful for identifying and visualizing multiple chromosomal plates on the same slide. In addition, the scanning process captures a more uniform FISH result. Overall, the automated high-throughput physical mapping protocol is more efficient than a standard manual protocol.

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Genome assemblies based on massively parallel DNA sequencing technologies are usually highly fragmented. The development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies. Here, we demonstrate innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization, and imaging that significantly increase throughput of the physical map development.

자동을 사용하여 염색체의 높은 처리량 물리적 매핑<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드화

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

3D DNA FISH has become a major tool for analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations of the technique have been published. In this article we describe a protocol which has been optimized for robustness, reproducibility, and ease of use. Brightly fluorescent directly labeled probes are generated by nick-translation with amino-allyldUTP followed by chemical coupling of the dye. 3D DNA FISH is performed using a freeze-thaw step for cell permeabilization and a heating step for simultaneous denaturation of probe and nuclear DNA. The protocol is applicable to a range of cell types and a variety of probes (BACs, plasmids, fosmids, or Whole Chromosome Paints) and allows for high-throughput automated imaging. With this method we routinely investigate nuclear localization of up to three chromosomal regions.

We describe a robust and versatile protocol for analyzing nuclear architecture by 3D DNA FISH using directly labeled fluorescent probes.

직접 레이블이 프로브를 사용하여 강력한 3D DNA 물고기

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

비례 생체 분자 비콘을 사용하여 살아있는 세포의 단일 엔지니어링 RNA 성적 증명서의 실시간 영상

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into nucleosomes. Thermodynamics of dsDNA bending has been studied by a method called cyclization which relies on DNA ligase to covalently join short sticky ends of a dsDNA. However, ligation efficiency can be affected by many factors that are not related to dsDNA looping such as the DNA structure surrounding the joined sticky ends, and ligase can also affect the apparent looping rate through mechanisms such as nonspecific binding. Here, we show how to measure dsDNA looping kinetics without ligase by detecting transient DNA loop formation by FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). dsDNA molecules are constructed using a simple PCR-based protocol with a FRET pair and a biotin linker. The looping probability density known as the J factor is extracted from the looping rate and the annealing rate between two disconnected sticky ends. By testing two dsDNAs with different intrinsic curvatures, we show that the J factor is sensitive to the intrinsic shape of the dsDNA.

This study presents a detailed experimental procedure to measure looping dynamics of double-stranded DNA using single-molecule Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET). The protocol also describes how to extract the looping probability density called the J factor.

단일 분자 FRET에 의해 DNA 루핑을 공부

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly effective at mapping highly repetitive sequences to heterochromatic regions, where computational approaches face prohibitive challenges. Here we describe a streamlined protocol for DNA ISH that circumvents formamide washes that are standard steps in other DNA ISH protocols. Our protocol is optimized for hybridization with short single strand DNA probes that carry fluorescent dyes, which effectively mark repetitive DNA sequences within heterochromatic chromosomal regions across a number of different insect tissue types. However, applications may be extended to use with larger probes and visualization of single copy (non-repetitive) DNA sequences. We demonstrate this method by mapping several different repetitive sequences to squashed chromosomes from Drosophila melanogaster neural cells and Nasonia vitripennis spermatocytes. We show hybridization patterns for both small, commercially synthesized probes and for a larger probe for comparison. This procedure uses simple laboratory supplies and reagents, and is ideal for investigators who have little experience with performing DNA ISH.

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.