Die finanzielle Unterstützung durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Wa 1386 / 17-1), das Graduiertenkolleg GRK 2039 (gefördert von der DFG) und KIT gedankt.

Achtung: Bitte konsultieren Sie alle relevanten Sicherheitsdatenblätter (MSDS) vor dem Gebrauch. Einige der Chemikalien in diesen Synthesen verwendet werden, sind giftig und krebserregend. Bitte verwenden Sie alle geeigneten Sicherheitspraktiken, die typischerweise in der organischen Chemie Laboratorien erforderlich sind, wie zum Beispiel ein Laborkittel, Schutzbrille und Handschuhe zu tragen. 1. Synthese der Farbstoffe Anmerkung: Beide Farbstoffe können durch die gleichen Reaktionstypen synthetisiert werden , Figur 2 einen Überblick über diese Reaktionen zeigt.. <ol><li> Synthese von 1- (3-Azidopropyl) -4- (2- (1-methyl-1H-indol-3-yl) vinyl) pyridin-1-ium - iodid (Farbstoff 1) <ol><li> Synthese von 1- (3-Iodpropyl) -4-methylpyridin-1-ium - iodid (2A, Schritt a) <ol><li> Man löst 466 mg 4-Picolin und 5,91 g 1,3-Diiodpropan in 10 ml Acetonitril in einen 20 ml Kopfraumampulle und Dichtung dicht mit einer Septumkappe. </li><li> Hitze auf 85 ° C für 16 Stunden. </li><li> Lassen Sie auf RT abkühlen, entfernen Sie dann das Lösungsmittel unter vermindertem Druck, um einen Rotationsverdampfer. </li><li> 20 ml Ethylacetat zu dem Restöl und behandeln der Mischung in einem 120 W Ultraschallbad für 3 min. </li><li> Sammeln des gebildeten Niederschlag durch Filtration und wäscht fünfmal mit Essigester. Trocknen Sie das feste Produkt unter Vakuum O / N. </li></ol></li><li> Synthese von 1- (3-Azidopropyl) -4-methylpyridin-1-ium (2A, Schritt b) <ol><li> Man löst 900 mg 1- (3-Iodpropyl) -4-methylpyridin-1-ium-iodid in 12 ml Acetonitril in einen 20 ml Kopfraumampulle, fügen 376 mg Natriumazid, und abdichten dicht durch eine Septumkappe. </li><li> Hitze auf 85 ° C für 16 Stunden. </li><li> Lassen Sie auf RT abkühlen, entfernen Sie dann das Lösungsmittel unter reduziertem Druck mit einem Rotationsverdampfer. </li><li> 15 ml Dichlormethan zu dem Rückstand. </li><li> Filter aus und entsorgen Sie die resultierende Niederschlag. </li><li> Entfernen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck unter Verwendung eines rotary Verdampfer um das Produkt als braunes Öl zu erhalten. </li></ol></li><li> Synthese von 1-Methyl-1H-indol-3-carbaldehyd (2A, Schritt c) <ol><li> Unter Schutzgas (Argon), lösen sich 1,45 g Indol-3-carbaldehyd, 1,52 g Kaliumcarbonat und 2,70 g Dimethylcarbonat in 10 ml absolutem Dimethylformamid in einem 50 ml-Rundkolben, der mit einem Rückflußkühler ausgestattet. </li><li> Rühren Sie die Mischung bei 130 ° C für 19 Std. </li><li> Lassen Sie auf RT abkühlen, dann gießen Sie die Mischung auf Eis. </li><li> Die wässrige Phase dreimal mit je 150 ml Ethylacetat. </li><li> Die organischen Schichten, sie mit Wasser waschen, trocknen Sie sie über Natriumsulfat und Entfernen des Lösungsmittels bei 50 ° C unter reduziertem Druck mit einem Rotationsverdampfer. </li></ol></li><li> Ankoppeln an 1- (3-Azidopropyl) -4- (2- (1-methyl-1H-indol-3-yl) vinyl) pyridin-1-ium - iodid (Farbstoff 1) (2A, Schritt d) <ol><li> Arbeiten unter Argon und unter Ausschluss von Feuchtigkeit. DISSOLve 90 mg 1- (3-Azidopropyl) -4-methylpyridin-1-ium und 48 mg 1-methyl-1H-indol-3-carbaldehyd in 4 ml Ethanol in einem 20 ml-Rundkolben, der mit einem Rückflußkühler ausgestattet. </li><li> Hinzufügen, 0,07 ml Piperidin und Wärme auf 80 ° C für 4 Stunden. </li><li> Erlauben auf RT abkühlen. </li><li> Sammle den erhaltenen Niederschlag durch Filtration und wäscht dreimal mit Diethylether. </li><li> Hinzufügen Diäthyläther zu dem Überstand und Sammle den erhaltenen Niederschlag durch Filtration. Waschen dreimal mit Diethylether. </li><li> Kombinieren Sie die Niederschläge. </li></ol></li></ol></li><li> Synthese von 1- (3-Azidopropyl) -4- (2- (1-methyl-2-phenyl-1H-indol-3-yl) vinyl) chinolin-1-ium - iodid (Farbstoff 2) <ol><li> Synthese von 1- (3-Iodpropyl) -4-methylchinolin-1-ium - iodid (2B, Schritt a) <ol><li> Man löst 715 mg 4-methylchinolin und 5,91 g 1,3-Diiodpropan in 10 ml Acetonitril in einen 20 ml Kopfraumampulle und Dichtung dicht mit einer Septumkappe. </li><li> Hitzebis 85 ° C für 16 Stunden. </li><li> Lassen Sie auf RT abkühlen, entfernen Sie dann das Lösungsmittel unter reduziertem Druck mit einem Rotationsverdampfer. </li><li> 20 ml Ethylacetat zu dem restlichen Öl und behandeln der Mischung in einem 120 W Ultraschallbad für 3 min. </li><li> Sammeln des gebildeten Niederschlag durch Filtration und wäscht fünfmal mit Essigester. Trocknen Sie das feste Produkt unter Vakuum O / N. </li></ol></li><li> Synthese von 1- (3-Azidopropyl) -4-methylchinolin-1-ium (2B, Schritt b) <ol><li> Man löst 900 mg 1- (3-Iodpropyl) -4-methylchinolin-1-ium-iodid in 12 ml Acetonitril in einen 20 ml Kopfraumampulle, fügen 333 mg Natriumazid, und abdichten dicht durch eine Septumkappe. </li><li> Hitze auf 85 ° C für 16 Stunden. </li><li> Lassen Sie auf RT abkühlen, entfernen Sie dann das Lösungsmittel unter reduziertem Druck mit einem Rotationsverdampfer. </li><li> 15 ml Dichlormethan zu dem Rückstand. </li><li> Filter aus und entsorgen Sie die resultierende Niederschlag. </li><li> Entfernen Sie das Lösungsmittel under vermindertem Druck am Rotationsverdampfer das Produkt als braunes Öl zu erhalten. </li></ol></li><li> Synthese von 1-Methyl-2-phenyl-1H-indol-3-carbaldehyd (2B, Schritt c) <ol><li> Unter Schutzgas (Argon), lösen sich 1,45 g 2-phenyl-1H-indol-3-carbaldehyd, 0,996 g Kaliumcarbonat und 1,77 g Dimethylcarbonat in 10 ml absolutem Dimethylformamid in einem 50 ml-Rundkolben, der mit einem Rückflußkühler ausgestattet. </li><li> Rühren Sie die Mischung bei 130 ° C für 19 Std. </li><li> Lassen Sie auf RT abkühlen, dann gießen Sie die Mischung auf Eis. </li><li> Die wässrige Phase dreimal mit je 150 ml Ethylacetat. </li><li> Die organischen Schichten, sie mit Wasser waschen, trocknen Sie sie über Natriumsulfat und Entfernen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck am Rotationsverdampfer. </li></ol></li><li> Ankoppeln an 1- (3-Azidopropyl) -4- (2- (1-methyl-2-phe nyl-1H-indol-3-yl) vinyl) chinolin-1-ium - iodid (2B, Schritt d) <ol><li> Die Arbeiten im Rahmen argauf und unter Ausschluss von Feuchtigkeit. Man löst 90 mg 1- (3-Azidopropyl) -4-methylchinolin-1-ium und 59,7 mg 1-Methyl-2-phenyl-1H-indol-3-carbaldehyd in 4 ml Ethanol in einem 20 ml-Rundkolben, ausgestattet mit Rückflußkühler. </li><li> 0.06 ml Piperidin und Wärme auf 80 ° C für 4 Stunden. </li><li> Erlauben auf RT abkühlen. </li><li> Sammle den erhaltenen Niederschlag durch Filtration und wäscht mit Diäthyläther dreimal. </li><li> Hinzufügen Diäthyläther zu dem Überstand und Sammle den erhaltenen Niederschlag durch Filtration. Waschen dreimal mit Diethylether. </li><li> Kombinieren Sie die Niederschläge. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Synthese der DNA-Stränge Anmerkung: Die Synthese der DNA - Stränge erfolgt auf einer Festphase , die Phosphoramidit - Methode, wie von M. Caruthers 11 auf einem DNA - Synthesizer beschrieben. Die Funktionsweise des Synthesizers wird vor dem Syntheseverfahren getestet, und die Reagenzien werden erneuert, wennnotwendig. <ol><li> Vorplanung <ol><li> Man löst den im Handel erhältlichen 2&#39;-O-Propargyl-deoxyuridinephosphoramidite (Cu) in 1,2 ml Amiditchemie Verdünnungsmittel (extra trockenem Acetonitril). Bewegen Lösung in dem Fläschchen mit einem Synthesizer Fläschchen und verschrauben Synthesizer. </li><li> Führen Sie eine &quot;Dichtigkeitsprüfung&quot; (nach Herstellerangaben), um sicherzustellen, dass kein Argongas Leck vorhanden ist. Wenn der &quot;Dichtigkeitsprüfung&quot; versagt, Schraube noch fester in das Fläschchen. </li><li> Prime die cU Lösung durch das Rohr füllt, die auf der Festphasensynthese Kammer verbindet. </li><li> Waschen Sie alle Linien mit Acetonitril. </li></ol></li><li> Synthese von DNA - Strängen <ol><li> Die angeschlossenen Computer die DNA-Sequenz und Kopplungsverfahren einzugeben, nach den Anweisungen aus dem Protokoll des Herstellers. Der Kupplungsschritt des cU Baustein nimmt 168 sec mit 7 Impulsen (jeder Impuls sind 16 &amp; mgr; l) im Vergleich zu 40 Sekunden mit 7 Impulsen für ein herkömmlichesPhosphoramidit als Bausteine. </li><li> Montieren der Säule die CPG (controlled pore glass) als feste Phase enthält, die mit 1 &amp; mgr; Mol der ersten Base modifiziert ist, in den Synthesizer (DNA-Synthese von 3 &#39;bis 5&#39;) durchgeführt. </li><li> Startet die Synthese auf der DNA - Synthesizers 11. </li></ol></li><li> Die Aufarbeitung der synthetisierten DNA - Stränge <ol><li> Trocknen Sie die Spalten mit den synthetisierten DNA-Stränge unter Vakuum O / N. </li><li> Verwenden Sie eine Zange um die Säule zu öffnen und das CPG in ein Reaktionsgefäß lösen. Hinzufügen, 700 &amp; mgr; l konzentrierter wässriger Ammoniaklösung das Oligonucleotid zu entschützen und geben den DNA-Strang aus der CPG. </li><li> Küvette und wenden sie platzen und Hitze ein Sicherheitsdeckel auf das Reaktionsgefäß 18 Stunden auf 50 ° C zu verhindern. </li><li> Entfernen Ammoniak durch Zentrifugation unter vermindertem Druck (100 mbar) bei 30 ° C für 30 min. </li><li> Starten Filtration von CPG: Zentrifugenbehälter bei 11.000 xg for 3 min. Nehmen Überstand und gibt sie in eine Zentrifugenvorrichtung mit einer Porengröße von 0,45 um. Zentrifuge bei 1000 × g für 4 min. </li><li> hinzufügen Inzwischen wurden 300 ul doppelt destilliertem Wasser auf die CPG, Vortex für 20 Sekunden und Zentrifuge bei 11.000 g für 3 min. Den Überstand in die Fliehkraftvorrichtung und Zentrifuge bei 1000 × g für 4 min. Wiederholen Sie diesen Waschvorgang zweimal. </li><li> Entfernen des Wassers aus den vereinigten wässrigen Lösungen bei 0,1 mbar und 25 ° CO / N Zentrifugieren. </li></ol></li></ol> 3. &quot;Ein Klick&quot; Verfahren <ol><li> Zugabe von 50 &amp; mgr; l doppelt destilliertem Wasser, 25 ul einer Natriumascorbat-Lösung (0,4 M in Wasser), 34 &amp; mgr; l Tris - [(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl) methyl] amin (0,1 M in DMSO / tBuOH 3: 1), 114 &amp; mgr; l des Azids (0,01 M in DMSO / tBuOH 3: 1) und 17 ul eines Tetrakis (acetonitril) kupfer (I) hexafluorophosphat-Lösung (0,1 M in DMSO / tBuOH 3: 1) mit dem lyophilisierten Alkin-modifizierte DNA-Probe. </li&gt; <li> Inkubieren der Probe bei 60 ° C für 1,5 Std. </li><li> Abkühlen auf RT. </li><li> Zugabe von 150 &amp; mgr; l Na 2 EDTA (0,05 M in Wasser) und 450 &amp; mgr; l Natriumacetat (0,3 M in Wasser) zu der DNA - Probe und in ein 10 ml Röhrchen. </li><li> In 10 ml Ethanol (100%) und halten bei -32 ° C für 16 Stunden. </li><li> Zentrifugengefäß für 15 min bei 1000 xg Überstand und zu entfernen. </li><li> Waschen DNA-Pellet mit 2 ml kaltem Ethanol (80%). </li><li> Trocknen des Pellets unter vermindertem Druck. </li></ol> 4. HPLC-Reinigung Hinweis: Vor dem Trennen der DNA-Stränge sicher, dass die HPLC ordnungsgemäß funktioniert, ist genügend Lösungsmittel vorhanden, und die Säule ist sauber. Spülen Sie Spalte mit der Ausgangskonzentration des Puffers / Acetonitril. <ol><li> Man löst das rohe DNA-Pellet in 250 &amp; mgr; l zweifach destilliertem Wasser aufgelöst und in eine HPLC-Fläschchen. </li><li> Starten HPLC-Lauf von 45 min mit einem Gradienten von 0% Acetonitril bis 15% Acetonitril für Farbstoff 1 und einem gradi<html> ent von 0% Acetonitril bis 17% Acetonitril für Farbstoff 2. Lauf durch Prüfen 260 nm (DNA-Absorption) und 459 nm (Farbstoff 1) oder 542 nm (Farbstoff 2) Monitor. Sammeln Sie diese Fraktionen, die Absorption in den beiden Wellenlängenkanälen zeigen. </li><li> Überprüfen Sie die gesammelten Fraktionen für die rechte Masse durch Matrix-unterstützte Laser-Desorption Ionisation (MALDI) Massenspektrometrie eine Matrix, bestehend aus 3-Hydroxypicolinsäure (3HPA) und diammoniumhydrogencitrate. <ol><li> Bereiten Sie die Matrix durch Mischen von 900 ul einer gesättigten 3-HPA-Lösung in 1: 1-Gemisch aus Acetonitril und Wasser mit 100 ul einer diammoniumhydrogencitrate Lösung (100 g / l) in Wasser. </li><li> Pipettieren 1-2 ul der DNA-Sonde auf dem Ziel und lassen Sie es trocken auf Luft. </li><li> In 0,2 ul der 3-HPA / diammoniumhydrogencitrate Matrix auf die Probe und mischen, bis es kristallisiert. </li><li> Führen Sie MALDI-Massenspektrometrie. </li><li> Kombinieren Sie diese HPLC-Fraktionen, die die richtige Masse aufweisen. </li></ol></li></ol>_title &quot;&gt; 5. Bestimmung der Konzentration Anmerkung: Unter Verwendung eines UV / Vis - Spektrophotometer, basierend auf den Extinktionskoeffizienten (ε 260) der DNA - Basen und den Farbstoff Die Konzentration wird bestimmt , indem die Absorption bei 260 nm gemessen wird . <ol><li> Lösen Sie die DNA in 100 bis 200 &amp; mgr; l doppelt destilliertem Wasser. </li><li> Anwenden 1 ul der DNA-Lösung auf dem UV / Vis-Spektrophotometers. </li><li> Messen der Absorption bei 260 nm. Dreimal wiederholen. </li><li> Nehmen den Mittelwert der Konzentration der Lösung zu berechnen. Für die Berechnung der Extinktionskoeffizienten, verwenden &amp; egr 260nm der vier natürlichen Basen 12 und die ε 260nm des gekauften Baustein cU (als natürliche Uridin betrachtet) 12 , um die ε 260nm des gesamten DNA - Strang erhalten. Für Farbstoff 1, Verwendung ε 260nm = 10.200 L * mol -1 * cm -1 und Farbstoff 2, Verwendung ε 260nm = 13.100 L * mol &lt;sup&gt; -1 * cm -1. Berechnen Sie die Konzentration der Lösung nach Lambert-Beers Gesetz basiert auf den Extinktionskoeffizienten und gemessenen Extinktionen. 13 </li></ol> 6. Probenvorbereitung und Spektroskopie <ol><li> Herstellung von Einzelstrang - Proben <ol><li> Bereiten getrennt 1 ml von 2,5 &amp; mgr; M Lösungen von jedem der modifizierten DNA1 und DNA2 in 200 mM NaCl, 50 mM NaP i, pH = 7. </li></ol></li><li> Herstellung von Doppelstrang - Proben <ol><li> Vorbereitung 1 ml einer Lösung , die 2,5 uM und 2,5 uM DNA1 von DNA2 in 200 mM NaCl, 50 mM NaP i, pH = 7 in einem Reaktionsgefäß. </li><li> Befestigen Sie den Deckel mit einer Schutzkappe und Hitze bis 90 ° C für 10 min. Dann Heizung ausschalten und lassen RT O / N abzukühlen. </li></ol></li><li> Absorptionsspektroskopie Hinweis: Um die Anregungswellenlänge für die Fluoreszenz-Spezifikation bestimmentroskopisch Absorptionsspektren aufgezeichnet. <ol><li> Einzelstrang - Messungen <ol><li> Nehmen Sie eine leere Messung mit nur 200 mM NaCl, 50 mM NaP i - Puffer, pH = 7. </li><li> Übertragen Sie die vorbereitete Lösung von DNA1 in eine 1 cm Quarzglaskuvette und notieren Sie die Absorption. Korrigieren Sie die Messung gegen die leeren Daten. Bestimmen Sie den maximalen Wert der Farbstoffabsorption. </li><li> Wiederholen Sie dies für DNA2. </li></ol></li></ol></li><li> Fluoreszenzspektroskopie <ol><li> Einzelstrang - Messungen <ol><li> Nehmen Sie eine leere Messung mit nur 200 mM NaCl, 50 mM NaP i - Puffer, pH = 7; mit der Anregungswellenlänge des Farbstoffes 1. </li><li> Übertragen Sie die DNA1 Lösung in eine 1 cm Quarzglaskuvette. </li><li> Nehmen Sie das Fluoreszenzspektrum. </li></ol></li><li> Doppelstrang - Messung <ol><li> Übertragen Sie die Doppelstrang-Lösung in eine Quarzglaskuvette. </li&gt; <li> Nehmen Sie das Fluoreszenzspektrum mit der Anregungswellenlänge von Farbstoff 1. </li></ol></li></ol></li><li> Visualisierung Experimente Achtung: Geeignete Schutzbrille getragen werden UV-Schäden an den Augen zu vermeiden! <ol><li> Um ein besseres Verständnis dessen , was die aufgenommenen Spektren zeigen, bestrahlen die Küvetten mit Hand UV-Lampen (Abbildung 5). Beachten Sie die Veränderung der Fluoreszenzfarbe von der einzigen zur doppelsträngigen DNA. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Dieses Protokoll zeigt die komplette Prozedur DNA post-synthetisch über CuAAC durch Azid-modifizierte fluoreszierende Farbstoffe zu kennzeichnen. Dies schließt die Synthese der Farbstoffe und Alkin-modifizierte DNA als auch die Markierungsverfahren. Die Synthese der Farbstoffe folgende vier Schritte. Alle Produkte können durch eine recht einfache Fällung erhalten werden aufgrund ihrer positiven Ladung und nicht zeitaufwendig Säulenchromatographie benötigt. Die Einführung der Azid-Funktionalitäten vor den zentralen Kupplungsschritte verkürzt die Synthese der Farbstoffe zu vier statt fünf aufeinanderfolgenden Reaktionsschritten. Die Anwendung von 1,3-Diiodpropan anstelle von 3-iodopropanol für den Alkylierungsschritt, der Appel-Reaktion und die folgenden Reaktionen Finkelstein die Hydroxylfunktion in die iod Funktionalitäten umgewandelt wurden vermieden. Diese Veränderungen im Vergleich zu den veröffentlichten Verfahren ermöglichen es uns, die Farbstoffe in größeren Maßstäben und kürzere Zeiträume zu synthetisieren. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Die verwendeten Farbstoffe eine ausgezeichnete Photostabilität zeigen aber nicht die notwendige Stabilität bei der Festphasen-DNA-Synthese und Aufarbeitung. Daher wurde die post-synthetische Markierungsstrategie ausgewählt. Alternativ kann die Markierung mit solchen wertvollen Farbstoffe während der DNA - Synthese stellt ultra-milde Kupplungs- und Abspaltungsbedingungen (beispielsweise Entschützen mit Kaliumcarbonat). Dies stellt einen wesentlich teurer und erfordert die alternative Synthese der entsprechenden Farbstoffmodifizierten Phosphoramiditen als DNA-Bausteine ​​oder Beschriftung auf dem festen Träger (on-bead). DNA1 wird von Farbstoff 1, der Donor-Farbstoff und DNA2 von Farbstoff 2, der Akzeptor-Farbstoff markiert. Wenn DNA1 und DNA2 geglüht werden erhalten beide Farbstoffe in unmittelbarer Nähe. Eine effiziente Energieübertragung beobachtet wird, wenn Farbstoff 1 angeregt wird. kann mit einer effizienten Energieübertragung stören excitonische Wechselwirkung zwischen den beiden Farbstoffen Prinzipiell da dieser Prozess die abgekoppelt und erregen erfordertd Farbstoff 1 und Farbstoff abgekoppelt 2. Anregung der gekoppelten Farbstoffe würden unterschiedliche photophysikali- Wege initiieren. 14 Unsere bisherigen Studien 9,15 ergab , dass die angelegte 3&#39;-5&#39;-diagonale Anordnung von Farbstoffen für die nur wenig excitonische Wechselwirkungen die strukturelle Basis bietet zwischen die Farbstoffe und effiziente Energieübertragung. Die hohe Effizienz der nachgewiesenen Energietransfer ermöglicht eine präzise Fluoreszenzanzeige in in vitro und in - vivo - Experimenten. Dies bietet eine breite Palette von Anwendungen, einschließlich Sichtbarmachung von DNA-Hybridisierung in molecular beacons, Bindung von Zielmolekülen in Nukleinsäure basierend Aptamere sowie die Visualisierung der Integrität small interfering RNA (siRNA) in Zellen. Die größte Einschränkung ist die Forderung, die beiden DNA-Stränge zu beschriften. In Zukunft wollen wir unsere Arbeit auf die Entwicklung von zweifach markierten Oligonukleotidsonden trägt beide Farbstoffe in einen Strang zu fokussieren.

Die molekulare Bildgebung stellt eine grundlegende Technik für die in lebenden Zellen biologischen Prozesse verstehen. 1-3 Die Entwicklung von fluoreszierenden Nukleinsäure-basierte Sonden für solche chemisch-biologische Anwendungen ein expandierendes Forschungsgebiet geworden ist. Diese Fluoreszenzsonden müssen einige Anforderungen erfüllen die geeigneten Werkzeuge für Cell Imaging zu werden. Erstens sollten die eingesetzten Farbstoffe Fluoreszenz mit hoher Quantenausbeute aufweisen, große Stokes-Verschiebungen und, was am wichtigsten ist , hohe Photostabilitäten Langzeit - in vivo - Bildgebung zu ermöglichen. Und zweitens sollten sie eine zuverlässige Fluoreszenzanzeige zeigen. Herkömmliche Chromophor-Löscher-Systeme auf der Anzeige eines einzelnen Fluoreszenzfarbe durch einfache Veränderungen in der Fluoreszenzintensitäten basieren. 4 Dieser Ansatz das Risiko von falsch - positiven oder falsch - negative Ergebnisse trägt wegen Autofluoreszenz von intrazellulären Komponenten oder Low - Signal-zu-Rausch - Verhältnis aufgrund unerwünschter Löschung durch andere componenten. 4 Vor kurzem berichteten wir über das Konzept der &quot;DNA - Ampel&quot; , die zwei unterschiedliche Chromophore durch Verwendung von Dual - Fluoreszenzfarbe Ablesungen zeigen. 5-6 Das Konzept basiert auf dem Energietransfer (ET) aus dem Donor - Farbstoff an den Akzeptor - Farbstoff, der die Fluoreszenz ändert Farbe (siehe Abbildung 1). Dies ermöglicht eine zuverlässigere Anzeige und stellt damit ein leistungsfähiges Werkzeug für Fluoreszenz-Imaging-Sonden. Markierung von Oligonucleotiden mit Fluoreszenzfarbstoffen kann durch zwei verschiedene Ansätze erreicht werden. Farbstoffe können während der chemischen DNA - Synthese an einer festen Phase unter Verwendung von entsprechend modifizierten Phosphoramidit - Bausteinen. 7 Diese Methode ist beschränkt auf Farbstoffe eingearbeitet werden , die unter Bedingungen Standard - Phosphoramidit und Entschützung stabil sind. Als Alternative wurden post-synthetische Modifikation Methoden in Oligonukleotidchemie etabliert. Hier zeigen wir die Synthese eines unserer neuen FotosTabelle Energietransferpaare 8,9 und die post-synthetischen Markierung von DNA durch Kupfer-katalysierte 1,3-Cyclo zwischen Aziden und Alkinen (CuAAC) verwendet wird . 10

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="885">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:409px;">synthesis</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4-Picoline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>239615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1,3-Diiodopropane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>238414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetonitrile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10660131</td>
			<td>HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethyl acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10456870</td>
			<td>technical grade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium azide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71290</td>
			<td>p.a. grade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dichloromethane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10626642</td>
			<td>technical grade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Indole-3-carboxaldehyde; 98%</td>
			<td>ABCR</td>
			<td>AB112969</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Potassium carbonate, 99+%</td>
			<td>Acros</td>
			<td>424081000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dimethylcarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>517127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">N,N-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry over Molecular Sieve</td>
			<td>Acros</td>
			<td>348435000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium sulfate</td>
			<td>Bernd Kraft</td>
			<td>12623.46</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol, 99.5%</td>
			<td>Acros</td>
			<td>397690010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Piperidine, 99%</td>
			<td>Acros</td>
			<td>147181000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Diethylether</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10407830</td>
			<td>technical grade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2-Phenylindole-3-carboxaldehyde; 97%</td>
			<td>ABCR</td>
			<td>AB125050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4-Methylquinoline</td>
			<td>ABCR</td>
			<td>AB117222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DNA synthesis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Expedite 8909 Nucleic Acid Synthesizer</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMT-dA(bz) Phosphoramidite</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A111081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMT-dT Phosphoramidite</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T111081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMT-dG(dmf) Phosphoramidite</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G11508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMT-dC(bz) Phosphoramidite</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C11108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Amidite Diluent for DNA synthesis</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L010010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ultrapure Acetonitrile for DNA synthesis</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L010400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cap A</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L840000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cap B</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L850000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CPG dT Column 1.0 &#181;mole</td>
			<td>Proligo Reagents</td>
			<td>T461010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CPG dA(bz) Column 1.0 &#181;mole</td>
			<td>Proligo Reagents</td>
			<td>A461010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CPG dG(ib) Column 1.0 &#181;mole</td>
			<td>Proligo Reagents</td>
			<td>G461010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CPG dC(bz) Column 1.0 &#181;mole</td>
			<td>Proligo Reagents</td>
			<td>C461010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ammonia (aqueous solution)&#160;</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>318612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">centrifugal devices nanosep 0.45 &#181;m</td>
			<td>Pall</td>
			<td>ODGHPC34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5-(Benzylthio)-1H-tetrazole (Activator)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>75666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2&#39;-O-propargyl deoxyuridinephosphoramidite</td>
			<td>Chem Genes</td>
			<td>ANP-7754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">workup</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">vacuum concentrator</td>
			<td>Christ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">clicking procedure</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tetrakis(acetonitrile)copper(I) hexafluorophosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>346276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">(+)-Sodium L-ascorbate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA disodium salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TBTA-ligand</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td>&#160;-</td>
			<td>synthesized according to a literature procedure [1]</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HPLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HPLC-system</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MALDI-Biflex-IV spectrometer</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LC-318 C18 column</td>
			<td>Supelcosil via Sigma Aldrich</td>
			<td>58368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">determination of concentration</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ND 1000 Spectrophotometer</td>
			<td>nanodrop</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">sample preparation and spectroscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cary 100 Bio</td>
			<td>Varian</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluoromax-3 fluorimeter</td>
			<td>Jobin-Yvon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:409px;">[1] R. Chan Timothy, R. Hilgraf, K. B. Sharpless, V. Fokin Valery, Org Lett 2004, 6, 2853-2855.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis of wavelength-shifting dna hybridization probes by using photostable cyanine dyes

In diesem Protokoll zeigen wir ein Verfahren für die Synthese von 2&#39;-Alkin-Desoxyribonukleinsäure (DNA) Stränge durch automatisierte Festphasensynthese unter Verwendung von Standard-Phosphoramidit-Chemie modifiziert. Oligonukleotide werden nach der Synthese durch zwei neue photo Cyaninfarbstoffen markiert unter Verwendung von Kupfer-katalysierte Klick-Chemie. Die Synthese von Spender und Akzeptor-Farbstoff ist, beschrieben und wird in drei aufeinanderfolgenden Schritten durchgeführt. Mit der DNA wie die umgebende Architektur, diese beiden Farbstoffe laufen einen Energietransfer, wenn sie in die Nähe von Hybridisierung gebracht werden. Daher Annealing von zwei einzelsträngigen DNA-Stränge wird durch eine Veränderung der Fluoreszenzfarbe visualisiert. Diese Farbänderung wird durch Fluoreszenz-Spektroskopie charakterisiert, sondern auch durch die Verwendung eines Hand ultraviolette (UV) Lampe direkt beobachtet werden kann. Das Konzept einer Doppelfluoreszenzfarbe Auslese macht diese Oligonukleotidsonden hervorragende Werkzeuge für die molekulare Bildgebung vor allem, wenn die beschriebene photostable Farbstoffe verwendet. Dadurch Photobleaching der Abbildungssonden verhindert und biologische Prozesse in Echtzeit für einen längeren Zeitraum beobachtet werden.

Absorptions- und Fluoreszenzspektren des Einzel- und Doppelstrang - DNA, wie in Figur 4 gezeigt aufgezeichnet. Die aufgezeichneten Absorptionsspektren (Abbildung 4 rechts) zeigen Absorptionsmaxima λ max bei 465 nm für einsträngige DNA1 (Farbstoff 1) und 546 nm für einsträngige DNA2 (Farbstoff 2). Das angelagerte DNA1_2 (Farbstoff 1 Farbstoff 2) zeigt Maxima bei sowohl 469 nm und 567 nm. Beide Absorptionsmaxima zeigen eine bathochrome Verschiebung, 4 nm für Farbstoff 1 und 21 nm für Farbstoff 2. Diese kleinen spektroskopischen Veränderungen das Ergebnis exzitonischer Wechselwirkungen zwischen den Farbstoffen in der DNA-Doppelhelix-Architektur sind. Die entsprechende Fluoreszenzspektren (Abbildung 4 links) zeigen Maxima λ max bei 537 nm für einsträngige DNA1 (Farbstoff 1, Anregung bei 435 nm), bei 607 nm für einzelne-litzen DNA2 (Farbstoff 2, Anregung bei 535 nm) und bei 615 nm für geglüht DNA1_2 (Farbstoff 1 Farbstoff 2, Anregung bei 435 nm). DNA1_2 zeigt lediglich den Emissionsmaximum von Farbstoff 2 obwohl Farbstoff 1 selektiv angeregt wird, die beweist, dass die Energieübertragung 1 effizient von Farbstoff tritt 2. färben Daraus ergibt sich ein Emissionskontrastverhältnis von 1.57. Der Unterschied zwischen Einzel- und Doppelstrang ist offensichtlich durch die Emissionsfarbe in der Küvette während der Anregung mit einem Standard - UV-Lampe zu vergleichen , wie in Figur 5 gezeigt. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54121/54121fig1.jpg" /> Abbildung 1. Grundkonzept eines Energietransfer in DNA. Der Spender modifizierte DNA - Strang (grün) zeigt Fluoreszenz bei 535 nm bei Bestrahlung bei 435 nm. Wenn es mit dem Akzeptor-modifizierten Gegenstrang (rot) die resultierende Doppelstrang s hybridisiertHows nur die rote Fluoreszenz des Akzeptor - Farbstoff bei 610 nm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54121/54121fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54121/54121fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54121/54121fig2.jpg" /> Figure 2. Synthese Überblick Farbstoff 1 und Farbstoff 2 Die Synthese der zwei Cyaninfarbstoffen 1 (A) und 2 (B) wird in drei aufeinanderfolgenden Schritten durchgeführt. 9 (A) a) 1,3-Diiodpropan, CH 3 CN, 85 ° C, 16 h, 94%; b) NaN 3, CH 3 CN, 85 ° C, 16 h, 87%; c) K 2 CO 3, Dimethylcarbonat, DMF, 130 ° C, 19 h, 89%; d) piperidin, EtOH, 80 ° C, 4 h, 80%. (B) a) 1,3-Diiodpropan, CH 3 CN, 85 ° C, 16 h, 49%; b) NaN 3, CH 3 CN, 85 ° C, 16 h, 93%; c) K 2 CO 3, Dimethylcarbonat, DMF, 130 ° C, 19 h, 98%; d) piperidin, EtOH, 80 ° C, 4 Stunden, 44%. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54121/54121fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54121/54121fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54121/54121fig3.jpg" /> Abbildung 3. Struktur von cU-Baustein, Farbstoffe 1 und 2 und Sequenzen von DNA1 und DNA2. Die Farbstoffe 1 und 2 an der 2&#39; - Position verknüpft sind der Ribose durch ein Triazol Linker innerhalb der vorgegebenen Sequenzen von DNA1 und DNA2. 9 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54121/54121fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54121/54121fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54121/54121fig4.jpg" /> Abbildung 4. Fluozenz von Einzel- und Doppelstrang - DNA - Stränge (links) und die Aufnahme von Einzel- und Doppelstrang - DNA - Stränge (rechts). Die Emissionsspektren von DNA1 (schwarz) angeregt bei 464 nm, DNA2 (rot), angeregt bei 535 nm und 435 nm (pink ) und DNA1_DNA2 hybrid (blau), gezeigt bei 435 nm angeregt werden. Die Absorptionsspektren des einsträngigen DNA1 (schwarz), DNA2 (rot) und der hybridisierten Doppelstrang DNA1_DNA2 (blau) sind auf der rechten Seite zeigen gezeigt. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54121/54121fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54121/54121fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/54121/54121fig5.jpg" /> Abbildung 5. Emissionsfarbe der Einzelstrang - DNA mit Donorfarbstoffes (links) und doppelsträngige DNA mit Donator und Akzeptor - Farbstoff (rechts) bei der Anregung durch eine UV-Lampe. Das Bild der Küvette die einsträngige DNA1 enthält (left Seite) zeigt helle grüne Fluoreszenz, und das Bild von doppelsträngigen DNA1_DNA2 (rechte Seite) zeigt rote Fluoreszenz bei Anregung durch einen Handheld - UV-Lampe bei 366 nm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54121/54121fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54121/54121fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Synthesis of Wavelength-shifting DNA Hybridization Probes by Using Photostable Cyanine Dyes

Photostable cyanine dyes are attached to oligonucleotides to monitor hybridization by energy transfer.

Synthese von Wavelength-Verschiebung DNA Hybridisierungssonden durch Verwendung von Photostabile Cyaninfarbstoffe

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase ...

synthesis-wavelength-shifting-dna-hybridization-probes-using

Nanyang Technological University

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Organic Chemistry

Biology

Unit 1

Alkynes

SCIENTISTS IN ACTION

11.0K Aufrufe.  Karlsruhe Institute of Technology. Photostable cyanine dyes are attached to oligonucleotides to monitor hybridization by energy transfer.

Serie: Synthesis of Wavelength-shifting DNA Hybridization Probes by Using Photostable Cyanine Dyes

Selective Labelling of Cell-surface Proteins using CyDye DIGE Fluor Minimal Dyes

Surface  proteins are central to the cell's ability to react to its environment and to interact with neighboring cells. They are known to be inducers of almost all intracellular signaling. Moreover, they play an important role in environmental adaptation and drug treatment, and are often involved in disease pathogenesis and pathology (1). Protein-protein interactions are intrinsic to signaling pathways, and to gain more insight in these complex biological processes, sensitive and reliable methods are needed for studying cell surface proteins. Two-dimensional (2-D) electrophoresis is used extensively for detection of biomarkers and other targets in complex protein samples to study differential changes. Cell surface proteins, partly due to their low abundance (1 2% of cellular proteins), are difficult to detect in a 2-D gel without fractionation or some other type of enrichment. They are also often poorly represented in 2-D gels due to their hydrophobic nature and high molecular weight (2). In this study, we present a new protocol for intact cells using CyDye  DIGE Fluor minimal dyes for specific labeling and detection of this important group of proteins. The results showed specific labeling of a large number of cell surface proteins with minimal labeling of intracellular proteins. This protocol is rapid, simple to use, and all three CyDye DIGE Fluor minimal dyes (Cy 2, Cy 3 and Cy 5) can be used to label cell-surface proteins. These features allow for multiplexing using the 2-D Fluorescence Difference Gel Electrophoresis (2-D DIGE) with Ettan  DIGE technology and analysis of protein expression changes using DeCyder  2-D Differential Analysis Software. The level of cell-surface proteins was followed during serum starvation of CHO cells for various lengths of time (see Table 1). Small changes in abundance were detected with high accuracy, and results are supported by defined statistical methods.

A simple and specific method was demonstrated for fluorescent labeling and enhanced detection of cell surface proteins without a fractionation step. Differential abundance in cell surface proteins was analyzed using two-dimensional (2-D) electrophoresis and Ettan&#x2122; DIGE technology.

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Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

DNA Microarrays: Sample Quality Control, Array Hybridization and Scanning

Microarray expression profiling of the nervous system provides a powerful approach to identifying gene activities in different stages of development, different physiological or pathological states, response to therapy, and, in general, any condition that is being experimentally tested1. Expression profiling of neural tissues requires isolation of high quality RNA, amplification of the isolated RNA and hybridization to DNA microarrays. In this article we describe protocols for reproducible microarray experiments from brain tumor tissue2. We will start by performing a quality control analysis of isolated RNA samples with Agilent's 2100 Bioanalyzer "lab-on-a-chip" technology. High quality RNA samples are critical for the success of any microarray experiment, and the 2100 Bioanalyzer provides a quick, quantitative measurement of the sample quality. RNA samples are then amplified and labeled by performing reverse transcription to obtain cDNA, followed by in vitro transcription in the presence of labeled nucleotides to produce labeled cRNA. By using a dual-color labeling kit, we will label our experimental sample with Cy3 and a reference sample with Cy5. Both samples will then be combined and hybridized to Agilent's 4x44 K arrays. Dual-color arrays offer the advantage of a direct comparison between two RNA samples, thereby increasing the accuracy of the measurements, in particular for small changes in expression levels, because the two RNA samples are hybridized competitively to a single microarray. The arrays will be scanned at the two corresponding wavelengths, and the ratio of Cy3 to Cy5 signal for each feature will be used as a direct measurement of the relative abundance of the corresponding mRNA. This analysis identifies genes that are differentially expressed in response to the experimental conditions being tested.

We demonstrate the use of DNA microarrays for expression profiling of the nervous system. We describe RNA quality control, sample labeling, and array hybridization and scanning.

DNA Microarrays: Sample Quality Control, Array Hybridisierung und Scannen

Microarray expression profiling of the nervous system provides a powerful approach to identifying gene activities in different stages of development, ...

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)

In the past fifteen years the notion that cell membranes are not homogenous and rely on microdomains to exert their functions has become widely accepted. Lipid rafts are membrane microdomains enriched in cholesterol and sphingolipids. They play a role in cellular physiological processes such as signalling, and trafficking1,2 but are also thought to be key players in several diseases including viral or bacterial infections and neurodegenerative diseases3.
Yet their existence is still a matter of controversy4,5. Indeed, lipid raft size has been estimated to be around 20 nm6, far under the resolution limit of conventional microscopy (around 200 nm), thus precluding their direct imaging. Up to now, the main techniques used to assess the partition of proteins of interest inside lipid rafts were Detergent Resistant Membranes (DRMs) isolation and co-patching with antibodies. Though widely used because of their rather easy implementation, these techniques were prone to artefacts and thus criticized7,8. Technical improvements were therefore necessary to overcome these artefacts and to be able to probe lipid rafts partition in living cells.
Here we present a method for the sensitive analysis of lipid rafts partition of fluorescently-tagged proteins or lipids in the plasma membrane of living cells. This method, termed Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS), relies on the disparity in diffusion times of fluorescent probes located inside or outside of lipid rafts. In fact, as evidenced in both artificial membranes and cell cultures, probes would diffuse much faster outside than inside dense lipid rafts9,10. To determine diffusion times, minute fluorescence fluctuations are measured as a function of time in a focal volume (approximately 1 femtoliter), located at the plasma membrane of cells with a confocal microscope (Fig. 1). The auto-correlation curves can then be drawn from these fluctuations and fitted with appropriate mathematical diffusion models11.
FCS can be used to determine the lipid raft partitioning of various probes, as long as they are fluorescently tagged. Fluorescent tagging can be achieved by expression of fluorescent fusion proteins or by binding of fluorescent ligands. Moreover, FCS can be used not only in artificial membranes and cell lines but also in primary cultures, as described recently12. It can also be used to follow the dynamics of lipid raft partitioning after drug addition or membrane lipid composition change12.

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy FCS

A technique to probe the lipid raft partitioning of fluorescent proteins at the plasma membrane of living cells is described. It takes advantage of the disparity in diffusion times of proteins located inside or outside of lipid rafts. Acquisition can be performed dynamically in control conditions or after drug addition.

Bestimmung der Lipid Raft Partitionieren von Fluoreszenz-markierten Sonden in lebenden Zellen mittels Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS)

In the past fifteen years the notion that cell membranes are not homogenous and rely on microdomains to exert their functions has become widely accepted. ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

Nachweis viraler RNA durch Fluoreszenz<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place over the next 5 years. For example, the sequencing of the genomes for 15 malaria mosquitospecies is currently being done using an Illumina platform3,4. This Anopheles species cluster includes both vectors and non-vectors of malaria. When the genome assemblies become available, researchers will have the unique opportunity to perform comparative analysis for inferring evolutionary changes relevant to vector ability. However, it has proven difficult to use next-generation sequencing reads to generate high-quality de novo genome assemblies5. Moreover, the existing genome assemblies for Anopheles gambiae, although obtained using the Sanger method, are gapped or fragmented4,6.
Success of comparative genomic analyses will be limited if researchers deal with numerous sequencing contigs, rather than with chromosome-based genome assemblies. Fragmented, unmapped sequences create problems for genomic analyses because: (i) unidentified gaps cause incorrect or incomplete annotation of genomic sequences; (ii) unmapped sequences lead to confusion between paralogous genes and genes from different haplotypes; and (iii) the lack of chromosome assignment and orientation of the sequencing contigs does not allow for reconstructing rearrangement phylogeny and studying chromosome evolution. Developing high-resolution physical maps for species with newly sequenced genomes is a timely and cost-effective investment that will facilitate genome annotation, evolutionary analysis, and re-sequencing of individual genomes from natural populations7,8.
Here, we present innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization (FISH), and imaging that facilitate rapid development of physical maps. Using An. gambiae as an example, we demonstrate that the development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies and, thus, the quality of genomic analyses. First, we use a high-pressure method to prepare polytene chromosome spreads. This method, originally developed for Drosophila9, allows the user to visualize more details on chromosomes than the regular squashing technique10. Second, a fully automated, front-end system for FISH is used for high-throughput physical genome mapping. The automated slide staining system runs multiple assays simultaneously and dramatically reduces hands-on time11. Third, an automatic fluorescent imaging system, which includes a motorized slide stage, automatically scans and photographs labeled chromosomes after FISH12. This system is especially useful for identifying and visualizing multiple chromosomal plates on the same slide. In addition, the scanning process captures a more uniform FISH result. Overall, the automated high-throughput physical mapping protocol is more efficient than a standard manual protocol.

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Genome assemblies based on massively parallel DNA sequencing technologies are usually highly fragmented. The development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies. Here, we demonstrate innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization, and imaging that significantly increase throughput of the physical map development.

High-Throughput-Physikalische Kartierung von Chromosomen unter Verwendung von Automated<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

3D DNA FISH has become a major tool for analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations of the technique have been published. In this article we describe a protocol which has been optimized for robustness, reproducibility, and ease of use. Brightly fluorescent directly labeled probes are generated by nick-translation with amino-allyldUTP followed by chemical coupling of the dye. 3D DNA FISH is performed using a freeze-thaw step for cell permeabilization and a heating step for simultaneous denaturation of probe and nuclear DNA. The protocol is applicable to a range of cell types and a variety of probes (BACs, plasmids, fosmids, or Whole Chromosome Paints) and allows for high-throughput automated imaging. With this method we routinely investigate nuclear localization of up to three chromosomal regions.

We describe a robust and versatile protocol for analyzing nuclear architecture by 3D DNA FISH using directly labeled fluorescent probes.

Robust 3D DNA FISH Mit Direkt markierten Sonden

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

Echtzeit-Bildgebung von Einzel Engineered RNA-Transkripte in lebenden Zellen Mit Ratiometrische Bimolekulare Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into nucleosomes. Thermodynamics of dsDNA bending has been studied by a method called cyclization which relies on DNA ligase to covalently join short sticky ends of a dsDNA. However, ligation efficiency can be affected by many factors that are not related to dsDNA looping such as the DNA structure surrounding the joined sticky ends, and ligase can also affect the apparent looping rate through mechanisms such as nonspecific binding. Here, we show how to measure dsDNA looping kinetics without ligase by detecting transient DNA loop formation by FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). dsDNA molecules are constructed using a simple PCR-based protocol with a FRET pair and a biotin linker. The looping probability density known as the J factor is extracted from the looping rate and the annealing rate between two disconnected sticky ends. By testing two dsDNAs with different intrinsic curvatures, we show that the J factor is sensitive to the intrinsic shape of the dsDNA.

This study presents a detailed experimental procedure to measure looping dynamics of double-stranded DNA using single-molecule Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET). The protocol also describes how to extract the looping probability density called the J factor.

Studieren von DNA-Looping von Einzelmolekül-FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly effective at mapping highly repetitive sequences to heterochromatic regions, where computational approaches face prohibitive challenges. Here we describe a streamlined protocol for DNA ISH that circumvents formamide washes that are standard steps in other DNA ISH protocols. Our protocol is optimized for hybridization with short single strand DNA probes that carry fluorescent dyes, which effectively mark repetitive DNA sequences within heterochromatic chromosomal regions across a number of different insect tissue types. However, applications may be extended to use with larger probes and visualization of single copy (non-repetitive) DNA sequences. We demonstrate this method by mapping several different repetitive sequences to squashed chromosomes from Drosophila melanogaster neural cells and Nasonia vitripennis spermatocytes. We show hybridization patterns for both small, commercially synthesized probes and for a larger probe for comparison. This procedure uses simple laboratory supplies and reagents, and is ideal for investigators who have little experience with performing DNA ISH.

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.