This study was funded by grants from the National Institutes of Health (NIH), Heart, Lung, and Blood Institute (NIHLB): K01-HL-121045, K08-HL-094703, 5T32HL007411-35, P20 HL101425, U01 HL100398. 
Imaging and tissue processing (after NaOH maceration) were performed through the use of the Vanderbilt University Medical Center (VUMC) Cell Imaging Shared Resource (CISR) (supported by NIH grants CA68485, DK20593, DK58404, DK59637 and EY08126). We are especially grateful to the VUMC CISR core directors (Dr. Sam Wells and Dr. W. Gray (Jay) Jerome) for valuable technical advice and also for providing core space and resources for the purposes of filming the technique highlighted in this paper. 
We would like to extend our deepest appreciation to Dr. Yan Ru Su and Ms. Kelsey Tomasek in the Cardiology Core Lab for Translational and Clinical Research at Vanderbilt University for providing technical expertise and for collecting human tissue samples used in this study.

윤리 문 : 동물 처리를위한 프로토콜 밴더빌트 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC에 의해 승인 된, AAALAC-국제 표준에 따라 수 M / 1백17분의 10 (돼지) 및 M / 219분의 10 (마우스) 및 실시를 프로토콜. 뱅크 인간의 심장 조직의 사용법은 밴더빌트 대학 의료 센터 IRB (프로토콜 번호 100887)에 의해 승인되었다. 1. 시료 채취 및 보관 <ol><li> 0.1 M 인산 완충액 (PB) 용액에 신선한 4 % 글루 타르 알데히드를 확인합니다. 주의 : 글루 타르 알데히드는 독성 흄 후드에서 작업용 장갑을 착용하십시오. <ol><li> 1,000 ml의 DH 2 O 21.8 g이 나 HPO 4, 6.4 g의의 NaH 2 PO 4. 양자 satis (품질 평가 점수)를 사용하여 PB, 산도 7.4의 0.2 M 원액을 </li><li> PB 원액 2.5 mL 및 2.1 ml의 DH 2 O.에 50 % 글루 타르 알데히드 400 μl를 추가 </li></ol></li><li> 덩어리를 담가 (더 큰 이상이 C 없다4 %의 글루 타르 알데히드 용액에 조직의 평방 미터). 주 : 작은 조각들도 사용될 수 있지만 쉽게 프로토콜 이후의 단계를 용이하게하기 위해 눈에 의해 가시화 될 수있는 충분한 크기 (NO 미만 5mm 2)이어야한다. </li><li> 4 ℃에서 무한히 저장 후, 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션. </li></ol> 심장 조직의 2. 탈세 포화 <ol><li> 10g의 수산화 나트륨 펠렛 / 100 ㎖ DH 2 O.을 사용 신선한 10 % NaOH 수용액을 주의 : 수산화 나트륨 용액은 부식성 및 알칼리 화상을 입을 수, 장갑을 착용하십시오. </li><li> DH 2 O.에서 조직을 씻어 </li><li> 6 실온에서 10 % NaOH 용액에 품어 - 십일 (까지에 붉은 갈색의 조직 변경 오프 흰색 또는 흰색). </li><li> 조직이 투명하게 될 때까지 DH 2 O에 씻어. </li><li> 실온에서 4 시간 동안 1 % 탄닌산의 조직을 담근다. 4 ML의 DH 2 O. 당 1 ml의 5 % 원액을 사용하여 주의 : 타닌산강한 자극은, 장갑을 착용하십시오. </li><li> 밤새 DH 2 O에 씻어. </li></ol> 3. Osmication과 (안전을위한 연기 후드에서) 심장 조직의 탈수 <ol><li> 21.4 g 나트륨 cacodylate, 10.0 g의 염화 칼슘 및 450 ml의 2 O. DH를 사용 cacodylate 나트륨 완충액, 0.2 M 스톡 용액을 제조 7.4의 pH를 조정하기 위해 필요에 따라 혼합 한 후 염산. Qs를 500 ml의 DH (2)와 O. 주의 : 나트륨 cacodylate 염산은 독성 흄 후드에서 작업용 장갑을 착용하십시오. </li><li> 50 ㎖ DH 2 O. 1g의 산화 오스뮴 결정을 용해시켜 안전 흄 후드에서 산화 오스뮴의 2 % 수용액 스톡 용액을 제조 주의 : 오스뮴 화이이 심한 흡입의 위험이 있습니다; 점막이나 안구의 증기 고정이 가능, 따라서 만 장갑과 흄 후드에서 처리합니다. 스플래시 가드를 권장합니다. </li><li> DH와 1 : 원액 1을 혼합 (0.1 M 나트륨 cacodylate 버퍼에 조직을 씻어 <suB&gt; 2 O) 5 회에 분 (또는 부드러운 교반 용). </li><li> 세 개의 버퍼 린스 총 두 번 이전 단계를 반복합니다. </li><li> 회에 1 시간 동안 0.1 M 나트륨 cacodylate 버퍼 (1 재고 나트륨 cacodylate 및 주식 산화 오스뮴 (1) 혼합)에 1 % 산화 오스뮴의 조직을 담가. </li><li> 5 분, 회 전자의 각 0.1 M 나트륨 cacodylate 완충액을 3 회 조직을 씻어. </li><li> 회에 15 분간 각각의 에탄올 농도를 증가 (30 %, 50 %, 75 %, 85 %, 95 %, 마지막으로 100 %)를 사용하여 조직을 헹군다. </li></ol> SEM 4. 단면 표면 준비 <ol><li> 또한, 100 %의 에탄올을 함유하는 얕은 페트리 접시에 100 % 에탄올에 조직을 옮긴다. </li><li> 양쪽의 플랫 시험편 위에 정삼각형의 양쪽을 형성하기 위해 서로 절단 날 크로스와 접촉되도록 두 개의 매우 날카로운 면도날을 잡아. 이를 달성하기 위해, 샘플의 오른쪽 측면에 하나의 블레이드를 배치 왼손 사용컷 좌측. 동시에, 지금까지 샘플 조각 우측의 좌측의 2 블레이드를 배치 오른손을 사용한다. 따라서, 상기 블레이드는 단일 부드러운 컷을 반대 방향에서 서로에 대해 활주한다. </li><li> 시험편을 손상시키지 않고 바람직하게는 가능한 한 큰 면적을 노광, 왜곡을 최소화 또는 강제 찢어와 시험편의 매우 깨끗한 컷을 만들기 위해 서로 플랫 블레이드 양측 활주. </li><li> 주사 전자 현미경의 검사를 위해 가장 깨끗한 가능한 단면 표면을 노출 각 시료에 대해 반복합니다. </li></ol> 5. 임​​계점 건조 (CPD) 심장 조직의 <ol><li> 조직이 항상 100 % 에탄올에 남아 있도록, 임계점 건조기 (CPD)의 샘플 홀더에 조직을 전송 주걱이나 핀셋을 사용한다. 홀더는 에탄올 및 전송이 몇 초 이상 더 이상 공기에 노출 된 조직으로 달성되도록 침지되어 있는지 확인합니다. </li><li> 우리 당 CPD를 작동ER 서 액체 이산화탄소와 에탄올을 대체 사이클 충전 및 퍼지-3을 작성한다. </li><li> 샘플의 임계점 건조를 달성하고 CO 2의 제어 배기와 대기압에 반환하기 위해 사용 설명서에 따라 CPD를 운영하고 있습니다. </li></ol> SEM에 대한 심장 조직 표본 6. 장착 <ol><li> 알루미늄 스터브의 상면에 탄소 접착제 탭을 접착하여, 각 시험편에 대한 SEM 샘플 스텁을 준비한다. </li><li> 실체 현미경의 도움으로 조심 (멀리 보이는 탭)에서 위를 향 관심 단면 표면과 접착 탭 시험편을 부착 한 최대한 가까운 샘플 스텁 표면의 평면과 평행하도록. 조사 또는 관심의 표면을 만지지 마십시오. </li><li> 페인트 응용 프로그램에 대한 이상적인 테이퍼 브러쉬를 달성하기 위해 나무 주걱 스틱을 휴식. 스터브에 부착을 향상시키기 위해, 기지국 및 시험편의 측면에은이나 카본 페인트를 적용한다. </li><li> 접지 관심 표면으로부터 충전 경로를 제공하기 위해, 관심의 표면의 가장자리까지 칠은 또는 탄소의 매우 얇은 라인을 확장한다. </li><li> 접지에 따라서 금속 스터브 탄소 탭 표면으로부터 도전로를 제공하는 탄소 탭 둘레은이나 카본 페인트 2-3 작은 덧 입힐 적용 후. </li><li> 전도성 페인트가 두 시간 동안 건조하도록 허용합니다. </li><li> 금 - 팔라듐 합금 또는 금 - 상대적으로 무거운 코팅 (40 내지 30 nm의 목표 범위)를 적용하기 위해 사용 설명서에 따라 스퍼터 코터를 운영하고 있습니다. 0.1 밀리바에 시료 챔버 펌프; 40 초에 타이머를 설정합니다. 8:00 위치 (보통 아르곤 가스 유량)에 오픈 세트 밸브. 를 눌러 시작 30mA에서 스퍼터 코팅을 시작합니다. 퍼플 글로우 방전은 시료 챔버에 표시해야한다. </li></ol> 심장 조직 표본의 7 SEM 시험 <ol><li> 화상 (P)을 최소화하도록 비교적 낮은 가속 전압에서 주사 전자 현미경 수행샘플에서 가난한 전하 손실과 관련된 먹는데는 (충전). 제안 된 초기 영상 조건은 다음과 같습니다 5 kV로는 10mm 작동 거리, 가속 전압. </li><li> 숙련 된 작업자의 도움으로, 고용은 Z 차원에서 상당한 기간 동안 연장하는 다수의 초점면에 섬유 또는 섬유의 초점을 필요로하는 이미징 조건에서 피사계 심도를 확장 할 거리를 작동 증가했다. <ol><li> 여기에 사용되는 현미경의 사용자 인터페이스 액세스에, 오른쪽 상단에있는 탐색 탭 (재료의 표 참조). </li><li> 스테이지 메뉴에서 좌표 탭에 액세스 할 수 있습니다. 다음 입력 된 작업 거리에 샘플 단계를 이동하는 탭에 이동을 클릭 좌표 Z에 대한 밀리미터에 더 큰 값을 입력, 작동 거리를 늘립니다. </li></ol></li><li> 숙련 된 오퍼레이터의 도움으로, 전자선에 관심 직교의 표면 위치를 검지 기울기 및 회전을 이용한다. 10 degr 30의 추가 기울기EES이 위치에서 매트릭스 구조의 관찰과 문서를 향상시킬 수 있습니다. <ol><li> 포커스 작동 거리를 지적, 여기에 사용되는 현미경의 경우, (재료의 표 참조) 사용자 인터페이스에 관심 준비된 표면 평면의 주변 근처의 표본을 집중하고 왼쪽 또는 오른쪽으로 슬라이드를 클릭하고 마우스 오른쪽 버튼을 누르고 . </li><li> 표면 반복 초점 반대 가장자리 근처에 이동하는 수동 사용자 인터페이스 조이스틱으로 이동합니다. 거리 작업하는 첫 번째 위치와 대략 동일하지 않은 경우, 경사 시편 (7.2 참조) 및 T의 기울기 값이 좌표 입력 스테이지 메뉴의 좌표 탭을 사용하여 두 위치에서 대략적인 합의를 달성했다. </li><li> 시편을 90도 회전 (필드 좌표 R에 값을 입력) 및 모든 위치가 거의 동일한 작동 거리에서 초점을 맞추고 때까지 과정을 반복합니다. 주 : 변압 SEM은 전하 소산을 개선하기 위해 사용될 수있다가능한 경우. 높은 진공 주사 전자 현미경의 표준 동작 모드이다. </li></ol></li></ol>

The authors have nothing to disclose.

단면 표면 처리 프로토콜 중 가장 중요한 단계입니다. 임계점 건조 공정에 도입 될 때까지 미세 구조를 보존하기 위해 탈수 시험편은 항상 100 % 에탄올에 남아 있어야한다. 따라서 표본의 슬라이스는 표본이 얕은 접시에 에탄올에 잠겨있는 동안 EM 시험을위한 표면을 수행해야합니다 달성했다. 노출 된 표면이 접촉 또는 후속 처리 중에 프로브되지 않는 것이 중요하다. 프로토콜의 SEM 부분에 관계없이 샘플 기원의 기본 전자 현미경 문제 해결이 필요할 수 있지만 더 중요한 수정은 유사한 매트릭스 관측 다른 조직 유형에이 기술의 응용 프로그램에 대한 예상되지 않습니다. 섬유 샘플에서 수집 한 이미지 ( &quot;충전&quot;) 나쁨 전하 소산에 의해 도입 된 유물하는 경향이 있습니다. 충전의 문제는 일반적으로 주사 속도를 증가, 가속 전압 (또한 정지 시간을 감소시킴으로써 최소화 될 수있다) 및 전자 빔의 스폿 사이즈를 감소시킨다. 여러 스캔 통합 저속, 높은 품질의 단일 스캔 이미지에 전하 아티팩트없이 잡음 품질 비교 신호의 화상을 생성한다 전하 아티팩트들을 피하기 위해 충분히 빠르게 수집 하였다. 이러한 기술은 본질적으로 질적이며 따라서 정량적 측정 (예를 들면, 메이슨의 트리 크롬 또는 picoserius 레드 염색, 히드 록시 프롤린 함량, 질량 분석법과 RNASeq의 측정) 시각 구조적 차이점은 다양한 발달 또는 질병 상태와 관련 될 수있는 방법을 확인하기 위해 함께 고려 될 때 보완한다. 세포 외 기질은 체내 거의 모든 기관의 필수 구성 요소이기 때문에, 이러한 제한에도 불구하고,이 방법은 특히 심근 섬유증 이후 중요하다. 심장에서 심장 행렬 데프 연속 복잡한 특징으로 펌핑 스트레칭, 비틀림 및 중요 기계적인 지원을 제공합니다인간의 평균 수명 이상 발생&gt; 25 억 비트에 대한 산화 된 혈액과 환원 된 혈액에 (49)의 최적의 입력 및 유출을 부여 ormation. 심장 조직의 매우 낮은 재생 능력을 감안할 때, 상황의 필요에 따라 개조 할 수있는 동적 인 행렬은 논리적 인 의미가 있습니다. 상상 약간만 스트레칭 한 불리한 섬유증을 제한하면서, 치유 과정을 개선하기 위해 매트릭스 개장 조작을위한 치료 표적이 존재한다고 추정 할 수있다. 최소한의 입증 기술의 적용은 심장 행렬의 정교함과 아름다움을 전시하고 그렇게함으로써 더 기능적 중요성을 강조한다. 정량적 측정 값이 거의 모든 실험 연구의 평가를위한 핵심 원칙이지만,이 기술은 현재의 표준 매트릭스 측정을 보완뿐만 아니라 미세 질적 변화를 나타 내기 위해 사용될 수있다 강조된하지만 질적 변화를 강조 근본적인 생화학 적 변화를 이해하기 위해 다른 조사 경로를 제안 할 수 있습니다. 이 기술의 예상되는 장래의 애플리케이션 매트릭스 변화는 질병 과정의 성분되는 기타 기관을 연구는 심장 질환 모델 매트릭스의 변화를 평가하기위한 상보 적 도구로서 인간 조직에서의 사용뿐만 아니라, 넓어진 사용된다.

Fibrosis disrupts the normal myocardial collagen network, which is critical for normal mechanistic functions of cardiomyocytes 1,2 as well as for inter-cellular communication, intracellular signaling, and cell survival 3. The development of fibrosis is a major determinant of cardiac function, and fibrotic remodeling of the cardiac interstitium arising from a variety of etiologies leads to increased left ventricular stiffness and diastolic dysfunction 4. Myocardial fibrosis may also lead to arrhythmias, and whether the progression of fibrotic remodeling is a general or local phenomenon, it is highly associated with a poor prognosis in patients with ischemic and non-ischemic cardiomyopathy 5. Likewise, the absence of myocardial fibrosis is a strong predictor of ventricular functional recovery and long-term survival 6. 
The hallmark of fibrosis is the deposition of excess collagen, which has the tensile strength of steel 7 and can adversely affect cardiomyocyte function on multiple levels. Mechanical forces resulting from an excessively collagenous matrix can lead to cardiomyocyte atrophy 8,9, passive tissue stiffness 10, tonic contraction-induced myocardial stiffness 11-13, and reduced delivery of oxygen to the remaining population of cardiomyocytes. Gap junction coupling of cardiomyocytes and myoFbs can also compromise the heart's electrical characteristics, creating a greater risk for the development of arrhythmias 14-16. Perivascular fibrosis alters vasomotor reactivity of intramural coronary arteries and arterioles 17 and contributes to luminal narrowing that reduces the supply of oxygen and thus the survival of cardiomyocytes 17-22. Pathogenic fibrotic and electrical remodeling, emanating from an initial site of ischemic injury or energy imbalance, inevitably progresses to heart failure. 
Cardiomyocyte necrosis initiates the fibrotic response, and subsequent adverse fibrotic remodeling can occur irrespective of etiology. Finding a way to control cardiac fibrosis would be clinically beneficial for the treatment of ischemic and idiopathic cardiomyopathies, hypertensive heart disease, hypertrophic cardiomyopathy, valvular heart disease and dystrophinopathies 23-42. Regardless of how the fibrotic disease process begins, soluble, profibrotic factors can cross the interstitial space and provoke activation of interstitial and adventitial fibroblasts at sites remote to the initial fibrotic scar, creating a cascade effect that ultimately leads to heart failure. The optimum scenario would be to exploit the fibrillogenic process using a targeted therapeutic that can be applied during the compensative hypertrophic stage of cardiomyopathy before it progresses to systolic pump failure, diastolic heart failure, or other end-stage outcomes. The ultimate goal would be to reverse fibrosis so that dead cardiomyocytes can be replaced and heart function restored completely. 
The importance of the matrix is widely understood, yet methods to study the matrix are limited mainly to quantitative measurements of major structural components, particularly collagen, and relative levels of different matrix and matricellular proteins. This protocol highlights a rarely used technique that is useful for assessing qualitative differences in the cardiac matrix. This technique has been recently used to compare and contrast fundamental differences in heart matrices from different etiologies of heart disease (in human explants), to examine hearts from post-infarcted pigs treated with the glial growth factor (GGF) isoform of neuregulin-1&#946;, relative to untreated animals 43, and to probe for differences in the matrices of cardiac tissues from mdx mice (a commonly used animal model of Duchenne Muscular Dystrophy) at different ages and compared to wild-type controls. This technique was first introduced by Drs. Caulfield and Borg in 1979 44, but few studies have since employed this powerful technique 45-47, re-introduced here with only slight modification. This methodology is a valuable research tool, because it provides qualitative information about extracellular matrix ultrastructure that might otherwise be overlooked when simply measuring matrix component content and/or level of fibrosis.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="791">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Calcium Chloride</td>
			<td style="width:207px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">12340</td>
			<td style="width:167px;">100g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Carbon Adhesive</td>
			<td style="width:207px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">12664</td>
			<td>30g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Carbon Adhesive Tabs</td>
			<td style="width:207px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">77825</td>
			<td>order to fit stubs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Double edge razor blades stainless steel</td>
			<td style="width:207px;">Ted Pella, Inc</td>
			<td style="width:119px;">121-6</td>
			<td>250/pkg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Ethanol</td>
			<td style="width:207px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">15055</td>
			<td>450mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Gluteraldehyde, 50% solution</td>
			<td style="width:207px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">16310</td>
			<td>EM grade, distillation purified</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Hydrochloric Acid</td>
			<td style="width:207px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">16760 or 16770</td>
			<td>100mL</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:299px;">Monosodium phosphate NaH2PO4</td>
			<td style="width:207px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S9251-250G</td>
			<td>250g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Osmium Tetroxide</td>
			<td style="width:207px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">19100</td>
			<td>1g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Silver Conductive Adhesive</td>
			<td style="width:207px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">12686-15</td>
			<td>15g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td style="width:207px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S8045-1KG</td>
			<td>1KG</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:299px;">Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)</td>
			<td style="width:207px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S3264-500G</td>
			<td>500g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Tannic acid, 5% aqueous&#160;</td>
			<td style="width:207px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">21702-5</td>
			<td>500mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Trihydrate Sodium Cacodylate</td>
			<td style="width:207px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">12300</td>
			<td>100g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Gold-palladium Alloy or Gold</td>
			<td style="width:207px;">Refining Systems, Inc.&#160;</td>
			<td style="width:119px;">varies</td>
			<td>&#160;specific to the sputter coater make and model</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Critical Point Dryer</td>
			<td style="width:207px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Plain Wooden Applicators</td>
			<td style="width:207px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">23-400-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Quanta 250 Environmental SEM</td>
			<td style="width:207px;">FEI</td>
			<td style="width:119px;">Q250 SEM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">Sputter coater</td>
			<td style="width:207px;">Cressington Scientific Instruments Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">Model 108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Alluminum SEM Sample Stubs</td>
			<td style="width:207px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">75220-12</td>
			<td>specific to the miscroscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

scanning electron microscopy of macerated tissue to visualize the extracellular matrix

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix biology, there are still major gaps related to how the matrix is formed, how physiological and pathological remodeling differ, and most importantly how matrix dynamics might be manipulated to promote healing and inhibit fibrosis. There is currently no treatment option for controlling, preventing, or reversing cardiac fibrosis. Part of the reason is likely the sheer complexity of cardiac scar formation, such as occurs after myocardial infarction to immediately replace dead or dying cardiomyocytes. The extracellular matrix itself participates in remodeling by activating resident cells and also by helping to guide infiltrating cells to the defunct lesion. The matrix is also a storage locker of sorts for matricellular proteins that are crucial to normal matrix turnover, as well as fibrotic signaling. The matrix has additionally been demonstrated to play an electromechanical role in cardiac tissue. Most techniques for assessing fibrosis are not qualitative in nature, but rather provide quantitative results that are useful for comparing two groups but that do not provide information related to the underlying matrix structure. Highlighted here is a technique for visualizing cardiac matrix ultrastructure. Scanning electron microscopy of decellularized heart tissue reveals striking differences in structure that might otherwise be missed using traditional quantitative research methods.

강조 표시된 기술은 사용하지 않는 인간의 심장 이식 기증자 (그림 1), 이식, 야생형과 이영 마우스 (그림 3)에서 마음에서 외식 조직에서 심장 조직에, 그리고 돼지에서 후 심근 경색 심장 샘플에 적용되었다 심장 손상 모델 (그림 2). 도 1에 도시 된 바와 같이, 인간의 심장 행렬은 단면에서 보았을 때, 벌집 형 패턴을 표시 가교 된 단백질의 복잡한 직조이다. 각 &#39;벌집&#39;구조는 그림 1의 평면도를 고려할 때 인터 디스크로 연결하면로드 할 때 은유 &#39;터널&#39;을 통해 길이 실행으로 약 40 μm의 폭, 일반적으로 단일 심근 세포를 우회,., 여러 심근 구상 할 수있다 세 차원으로 확장된다. 또한 1 하이라이트도절삭 가공 (그림 1, 오른쪽) 중 &quot;분쇄&quot;하는 부분보다 정밀도가 더 계시 지형 데이터를 산출로 절단 절차의 중요성, (그림 1, 왼쪽 위). 상주 심장 세포, 혈관 및 SEM 처리에 앞서 순환 세포의 제거는 전체 심장 조직 블록을 SEM으로 덜 감지 될 추가적인 극도의 세부 구조를 폭로한다. 각 콜라겐 &quot;지주&quot;(예를 들어,도 1, 하단 패널) 명백하게 일정한 간격으로 정렬 근섬유 분절 근원 섬유를 수직이다. 이 배열은 스트레칭에 대해 패브릭 몸과 양식을 유지하는 데 도움이 섬유의 &#39;경사와 위사&#39;과 유사한 수축과 이완 사이클 동안 가해 카운터 작용 변형에 의해 심장 구조를 유지 도움에 적합하다. fo를하기 : 유지-together.within 페이지를 = &quot;1&quot;&gt; <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54005/54005fig1.jpg" /> 그림 1 :. 사용되지 않는 인간의 기증자 심장에서 획득 Decellularized 좌심실 조직의 세포 외 매트릭스의 3 차원 배열의 대표 주사 전자 현미경 사진은 상단이 패널은 낮은 배율 (바 = 500 μm의)에서 단면 행렬을 보여 정상적인 인간의 심장 조직의 구조의 공중보기를 제공한다. 높은 배율에서, 하나는 더 규칙적으로 이격 된 근섬유에 대한 기계적 지원 (가운데 왼쪽과 오른쪽 패널 바 = 100 μm의 50 μm의 각각)을 제공지지 섬유의 일반적인 벌집 모양의 구조를 관찰 할 수있다. 가까이 검사시 각 &#39;벌집&#39;는 수직 주민 심근 (아래 왼쪽과 오른쪽 패널 바 = 각각 10 μm의 5 μm의)에 서로 동안 병렬로 구성되어 섬유로 구성되어있다.ttps : //www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54005/54005fig1large.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 구조 정보를 제공 할뿐만 아니라, decellularized 조직의 SEM은 부상이나 심근 병증의 비 해로운 형태의 질문에 답변 세포 외 기질 변화의 의미, 질적 평가를 할 수 있습니다. 예를 들어,이 기술은 최근 후 경색 돼지 심장 조직 (43)의 외 기질을 조사 하였다. 이 대형 동물 실험의 과정에서 심장 매트릭스의 변화를 눈에 띄는 나타내었다 심부전, 정맥 NRG-1β 투여를받은 후 경색 돼지에 대한 잠재적 치료제로서 NRG-1β의 GGF2 동종의 효과를 평가하기 위해 특별히 설계된 포스트 경색 동물의 치료 심장 조직에 비해. 이 결과는 이후 테 (43)를 발표 하였다chnique이 초기, ​​뜻밖의 발견에 구축하기위한 유용한 도구를 유지하고있다. (2) 치료 및 NRG-1β 처리 행렬 사이의 격렬한 매트릭스의 차이를 강조하는 연구 과정 중에 생성 예 현미경을 포함 그림. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54005/54005fig2.jpg" /> 그림 2 :. 처리되지 않은 및 NRG-1 β 처리 한 돼지에서 왼쪽 심실 세포 외 매트릭스의 대표적인 주사 전자 현미경 사진은, NaOH를 침용 후 단면의 행렬은 치료 후 심근 경색에서 섬유의 규칙적인 공간 배열을 강조 (포스트 MI) 돼지 (왼쪽 위), 후 MI는 NRG-1β 처리 된 동물 (오른쪽) 비교. 경도에서 볼 때, 처리되지 않은 돼지의 행렬은 NRG-1β 처리 된 돼지의 행렬 반면 두꺼운 매트와 같은 모습 (왼쪽 아래)를 전시섬유의 규칙적인 공간 배열 (오른쪽 아래)를 표시합니다. 흰색 막대 = 40 μm의 (전 4 패널). 더 자세한 결과와 수치는 관련 원고 (43)에 포함되어 있습니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54005/54005fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 이영 마음에서 발생하는 행렬 변경의 탐험은 뒤 시엔 느 근이영양증 심근증 (DMD)의 동물 모델의 진행 및 개발에 질적 통찰력을 굴복했다. MDX 마우스, DMD의 일반적으로 사용되는 마우스 모델에서, 야생형 및 고정 및 NaOH로 처리 후 SEM 볼 MDX 하트 중 상당한 연령 의존적 차이가있다. 도 3에 도시 된 바와 같이, 매트릭스 성분은 정상 마우스에 작용 디스트로핀 상대적인 결여 6주 된 MDX 하트 비교적 정상이었다. 더 INTeresting, 세포 외 매트릭스 조직은 마음에 DMD의 진보적 인 성격을 보여주는 명확하게 파괴 이하 MDX 쥐에 비해 나이가 디스트로핀 결핍 생쥐에서 아마도 저하되었다. MDX 생쥐 인해 그들이 훨씬 온화한 심근증 표현형과 DMD (48)보다 느린 인간 사망률을 나타낸다는 사실 인간 DMD 심근증의 저조한 대표 때문에 이러한 깊은 차이는 예상되지 않았다. 이는 심장 기능 심지어 작은 변경이 논문에 제시된 시각화 기법을 사용하여 캡처 될 수 있음을 시사한다. 이 방법은 더 현재 마찬가지로 사용할 수 섬유증 타겟팅 치료가되지 않은 다른 장기의 세포 외 매트릭스에 쉽게 적응할 수 있어야합니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54005/54005fig3.jpg" /> 그림 3 : 왼쪽 벤의 대표적인 주사 전자 현미경 사진MDX 마우스에 비해 야생형에서 tricular 외 매트릭스는. 야생형 마우스에서 좌심실 심근 매트릭스 (상단 패널)의 다른 종에서 관찰 된 것과 유사하다. 나이 6 주에서 MDX 마우스의 행렬은 외관 (가운데 패널)에서 비록 약간 &quot;무성&quot;상대적으로 보통 보인다. 반대로, 이전 MDX 마우스의 심장 행렬은 이영 프로세스 성적 고정 NaOH를 침연 (macerated) 조직에서 SEM을 사용하여 캡처 될 수 있음을 나타낸다 (하단 패널) 심각한 변성 나타난다. 흰색 막대 = 10 μm의 (세 개의 패널). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54005/54005fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix at JoVE.com

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

Shown here is a method for visualizing extracellular matrix ultrastructure in decellularized cardiac tissues.

침연 (macerated) 조직의 전자 현미경을 스캔하면 세포 외 매트릭스를 시각화하기

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

scanning-electron-microscopy-macerated-tissue-to-visualize

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

9.8K 조회수.  Vanderbilt University Medical Center. Shown here is a method for visualizing extracellular matrix ultrastructure in decellularized cardiac tissues.

비디오: Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

The eukaryotic cell relies on complex, highly regulated, and functionally distinct membrane bound compartments that preserve a biochemical polarity necessary for proper cellular function. Understanding how the enzymes, proteins, and cytoskeletal components govern and maintain this biochemical segregation is therefore of paramount importance. The use of fluorescently tagged molecules to localize to and/or perturb subcellular compartments has yielded a wealth of knowledge and advanced our understanding of cellular regulation. Imaging techniques such as fluorescent and confocal microscopy make ascertaining the position of a fluorescently tagged small molecule relatively straightforward, however the resolution of very small structures is limited 1.
On the other hand, electron microscopy has revealed details of subcellular morphology at very high resolution, but its static nature makes it difficult to measure highly dynamic processes with precision 2,3. Thus, the combination of light microscopy with electron microscopy of the same sample, termed Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) 4,5, affords the dual advantages of ultrafast fluorescent imaging with the high-resolution of electron microscopy 6. This powerful technique has been implemented to study many aspects of cell biology 5,7. Since its inception, this procedure has increased our ability to distinguish subcellular architectures and morphologies at high resolution. 
Here, we present a streamlined method for performing rapid microinjection followed by CLEM (Fig. 1). The microinjection CLEM procedure can be used to introduce specific quantities of small molecules and/or proteins directly into the eukaryotic cell cytoplasm and study the effects from millimeter to multi-nanometer resolution (Fig. 2). The technique is based on microinjecting cells grown on laser etched glass gridded coverslips affixed to the bottom of live cell dishes and imaging with both confocal fluorescent and electron microscopy. Localization of the cell(s) of interest is facilitated by the grid pattern, which is easily transferred, along with the cells of interest, to the Epon resin used for immobilization of samples and sectioning prior to electron microscopy analysis (Fig. 3). Overlay of fluorescent and EM images allows the user to determine the subcellular localization as well as any morphological and/or ultrastructural changes induced by the microinjected molecule of interest (Fig. 4). This technique is amenable to time points ranging from &le;5 s up to several hours, depending on the nature of the microinjected sample.

Correlative Light and Electron Microscopy CLEM as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

The CLEM technique has been adapted to analyze ultrastructural morphology of membranes, organelles, and subcellular structures affected by microinjected molecules. This method combines the powerful techniques of micromanipulation/microinjection, confocal fluorescent microscopy, and electron microscopy to allow millimeter to multi-nanometer resolution. This technique is amenable to a wide variety of applications.

도구로 상호 빛과 전자 현미경 (클레멘 타인)는 Microinjected 분자와 진핵 세포 하위 세포 목표를 시각화하는 방법


The eukaryotic cell relies on complex, highly regulated, and functionally distinct membrane bound compartments that preserve a biochemical polarity ...

연구

생물학

A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved substances from the blood into the liver parenchyma for metabolism and processing. Fenestrations are dynamic structures - both their size and/or number can be altered in response to various physiological states, drugs, and disease, making them an important target for modulation. An understanding of how LSEC morphology is influenced by various disease, toxic, and physiological states and how these changes impact on liver function requires accurate measurement of the size and number of fenestrations. In this paper, we describe scanning electron microscopy fixation and processing techniques used in our laboratory to ensure reproducible specimen preparation and accurate interpretation. The methods include perfusion fixation, secondary fixation and dehydration, preparation for the scanning electron microscope and analysis. Finally, we provide a step by step method for standardized image analysis which will benefit all researchers in the field.

The fenestrated liver sinusoidal endothelial cell is a biologically important filter system that is highly influenced by various diseases, toxins, and physiological states. These changes significantly impact on liver function. We describe methods for the standardisation of the measurement of the size and number of fenestrations in these cells.

주사 전자 현미경으로 간 사인 내피 세포의 분석 및 그들의 Fenestrations위한 표준화 된 방법

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved ...

Studying the Supramolecular Organization of Photosynthetic Membranes within Freeze-fractured Leaf Tissues by Cryo-scanning Electron Microscopy

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we describe a technique for studying the supramolecular organization of photosynthetic (thylakoid) membranes within leaf samples. This is achieved by high-pressure freezing of leaf tissues, freeze-fracturing, double-layer coating and finally cryo-SEM imaging. Use of the double-layer coating method allows acquiring high magnification (&#62;100,000X) images with minimal beam damage to the frozen-hydrated samples as well as minimal charging effects. Using the described procedures we investigated the alterations in supramolecular distribution of photosystem and light-harvesting antenna protein complexes that take place during dehydration of the resurrection plant Craterostigma pumilum, in situ.

Here we describe a procedure for studying freeze-fractured plant tissues. High-pressure frozen leaf samples are freeze-fractured and double-layer coated, yielding well preserved frozen-hydrated samples that are imaged using the cryo-scanning electron microscope at high magnifications with minimal beam damage.

알아내는 주사 전자 현미경에 의해 동결 골절 잎 조직 내에서 광합성 멤브레인의 초분자 조직을 공부

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we ...

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Using young floral tissues, oomycete cysts, and fungi spores (Agaricales) as examples, specific protocols to process delicate samples are described here that overcome some of the main challenges in sample treatment for image capture under the SEM.
Floral meristems fixed with FAA (Formalin-Acetic-Alcohol) and processed with the Critical Point Dryer (CPD) did not display collapsed cellular walls or distorted organs. These results are crucial for the reconstruction of floral development. A similar CPD-based treatment of samples from wet microenvironments, such as the glutaraldehyde-fixed oomycete cysts, is optimal to test the differential growth of diagnostic characteristics (e.g., the cyst spines) on different types of substrates. Destruction of nurse cells attached to fungi spores was avoided after rehydration, dehydration, and the CPD treatment, an important step for further functional studies of these cells.
The protocols detailed here represent low-cost and rapid alternatives for the acquisition of good-quality images to reconstruct growth processes and to study diagnostic characteristics.

Scanning Electron Microscopy SEM Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Problems in the processing of biological samples for scanning electron microscopy observation include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Low-cost and relatively rapid protocols suited for preparing challenging samples such as floral meristems, oomycete cysts, and fungi (Agaricales) are compiled and detailed here.

문제있는 공장, 난균 강 및 곰팡이 샘플에 대한 전자 현미경 (SEM) 프로토콜을 스캔

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM)

Scanning electron microscopy (SEM) is a widely available technique that has been applied to study biological specimens ranging from individual proteins to cells, tissues, organelles, and even whole organisms. This protocol focuses on two chemical drying methods, hexamethyldisilazane (HMDS) and t-butyl alcohol (TBA), and their application to imaging of both prokaryotic and eukaryotic organisms using SEM. In this article, we describe how to fix, wash, dehydrate, dry, mount, sputter coat, and image three types of organisms: cyanobacteria (Toxifilum mysidocida, Golenkina sp., and an unknown sp.), two euglenoids from the genus Monomorphina (M. aenigmatica and M. pseudopyrum), and the fruit fly (Drosophila melanogaster). The purpose of this protocol is to describe a fast, inexpensive, and simple method to obtain detailed information about the structure, size, and surface characteristics of specimens that can be broadly applied to a large range of organisms for morphological assessment. Successful completion of this protocol will allow others to use SEM to visualize samples by applying these techniques to their system.

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy SEM

SEM analysis is an effective method to aid in species identification or phenotypic discrimination. This protocol describes the methods for examining specific morphological details of three representative types of organisms and would be broadly applicable to examining features of many organismal and tissue types.

스캐닝 전자 현미경 (SEM)에서 형태소 분석에 대 한 화학 건조를 사용 하 여 간결한 진 핵 유기 체의 준비

Scanning electron microscopy (SEM) is a widely available technique that has been applied to study biological specimens ranging from individual proteins to ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

고압 냉동, 전자 레인지를 이용한 콘트라스트 향상, 그리고 볼륨 이미지에 대 한 포함 하는 최소한의 수 지에 의해 생물학 견본 준비

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Array Tomography Workflow for the Targeted Acquisition of Volume Information using Scanning Electron Microscopy

Electron microscopy is applied in biology and medicine for imaging of cellular and structural details at nanometer resolution. Historically, Transmission Electron Microscopy (TEM) provided insight into cell ultrastructure, but in the recent decade, the development of modern Scanning Electron Microscopes (SEM) has changed the way of looking inside the cells. Even though the resolution of TEM is superior when protein-level structural details are needed, SEM-resolution is sufficient for the majority of the organelle-level cell biology-related questions. The advancement in technology enabled automatic volume acquisition solutions such as Serial block-face imaging (SBF-SEM) and Focused ion beam SEM (FIB-SEM). Nevertheless, to this day, these methods remain inefficient when the identification and navigation to areas of interest are crucial. Without the means for precise localization of target areas before imaging, operators need to acquire much more data than they need (in SBF-SEM), or, even worse, prepare many grids and image them all (in TEM). We propose the strategy of "lateral screening" using Array Tomography in SEM, which facilitates the localization of areas of interest, followed by automated imaging of the relevant fraction of the total sample volume. Array tomography samples are conserved during imaging, and they can be arranged into section libraries ready for repeated imaging. Several examples are shown in which lateral screening enables us to analyze structural details that are incredibly challenging to access with any other method.

We describe the preparation of ribbons of serial sections and their collection on large transfer support for use as Array Tomography samples, along with automated imaging procedures in a scanning electron microscope. The protocol allows screening, retrieval, and targeted imaging of local, rare events, and the acquisition of large data volumes.

스캐닝 전자 현미경 을 사용하여 대량 정보의 표적 수집을위한 배열 단층 학워크

Electron microscopy is applied in biology and medicine for imaging of cellular and structural details at nanometer resolution. Historically, Transmission ...

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, offering an unprecedented three-dimensional view of tissue microanatomy. While SBF-SEM has seen an exponential increase in use in recent years, technical aspects such as proper tissue preparation and imaging parameters are paramount for the success of this imaging modality. This imaging system benefits from the automated nature of the device, allowing one to leave the microscope unattended during the imaging process, with the automated collection of hundreds of images possible in a single day. However, without appropriate tissue preparation cellular ultrastructure can be altered in such a way that incorrect or misleading conclusions might be drawn. Additionally, images are generated by scanning the block-face of a resin-embedded biological sample and this often presents challenges and considerations that must be addressed. The accumulation of electrons within the block during imaging, known as "tissue charging," can lead to a loss of contrast and an inability to appreciate cellular structure. Moreover, while increasing electron beam intensity/voltage or decreasing beam-scanning speed can increase image resolution, this can also have the unfortunate side effect of damaging the resin block and distorting subsequent images in the imaging series. Here we present a routine protocol for the preparation of biological tissue samples that preserves cellular ultrastructure and diminishes tissue charging. We also provide imaging considerations for the rapid acquisition of high-quality serial-images with minimal damage to the tissue block.

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBF-SEM of Biological Tissue Samples

This protocol outlines a routine method for using serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM), a powerful 3D imaging technique. Successful application of SBF-SEM hinges on proper fixation and tissue staining techniques, as well as careful consideration of imaging settings. This protocol contains practical considerations for the entirety of this process.

생물학적 조직 샘플의 직렬 블록-얼굴 스캐닝 전자 현미경 검사(SBF-SEM)

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental challenge of great interest to the field of cryo-electron microscopy (cryo-EM). A few methodological strategies have been developed that support these &#34;time-resolved&#34; studies, one of which, Spotiton-a novel robotic system-combines the dispensing of picoliter-sized sample droplets with precise temporal and spatial control. The time-resolved Spotiton workflow offers a uniquely efficient approach to interrogate early structural rearrangements from minimal sample volume. Fired from independently controlled piezoelectric dispensers, two samples land and rapidly mix on a nanowire EM grid as it plunges toward the cryogen. Potentially hundreds of grids can be prepared in rapid succession from only a few microliters of a sample. Here, a detailed step-by-step protocol of the operation of the Spotiton system is presented with a focus on troubleshooting specific problems that arise during grid preparation.

The protocol presented here describes the use of Spotiton, a novel robotic system, to deliver two samples of interest onto a self-wicking, nanowire grid that mix for a minimum of 90 ms prior to vitrification in liquid cryogen.

새로운 로봇 시스템, 스포티폰을 사용하여 시간 해결 연구를 위한 극저온 전자 현미경 그리드 준비

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...

Confocal Laser Scanning Microscopy of Calcium Dynamics in Acute Mouse Pancreatic Tissue Slices

The acute mouse pancreatic tissue slice is a unique in situ preparation with preserved intercellular communication and tissue architecture that entails significantly fewer preparation-induced changes than isolated islets, acini, ducts, or dispersed cells described in typical in vitro studies. By combining the acute pancreatic tissue slice with live-cell calcium imaging in confocal laser scanning microscopy (CLSM), calcium signals can be studied in a large number of endocrine and exocrine cells simultaneously, with a single-cell or even subcellular resolution. The sensitivity permits the detection of changes and enables the study of intercellular waves and functional connectivity as well as the study of the dependence of physiological responses of cells on their localization within the islet and paracrine relationship with other cells. Finally, from the perspective of animal welfare, recording signals from a large number of cells at a time lowers the number of animals required in experiments, contributing to the 3R-replacement, reduction, and refinement-principle.

We present the preparation of acute pancreatic tissue slices and their use in confocal laser scanning microscopy to study calcium dynamics simultaneously in a large number of live cells, over long time periods, and with high spatiotemporal resolution.

급성 마우스 췌장 조직 조각에서 칼슘 역학의 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사

The acute mouse pancreatic tissue slice is a unique in situ preparation with preserved intercellular communication and tissue architecture that entails ...