우리는 도움이 토론의 알토 연구소의 회원 감사드립니다. 우리는 또한 기술적 인 전문 지식과 조언을 UT 남서 의료 센터, 특히 박사 크리스 Gilpin, 톰 Januszewski, 그리고 로리 뮬러에서 분자 및 세포 이미징 시설 감사드립니다. 우리는 또한 원고의 중요한 읽기에 대한 박사 Xionan 동 감사드립니다. 이 작품은 NMA에 NIH 보조금 AI083359에서 지원

1. 포유류의 세포 배양 <ol><li> 일반 쥐 신장 (NRK)는 (모든 시약에 대해 표 1를 참조하거나 셀 요리를 살고 부착 photoetched 유리 gridded coverslips에 자궁 경부암 (헬러), 또는 기타 적절한 포유류의 세포 라인 37 배양 아르 ° C, 5 % CO 2, 불후의 장치 DMEM + 10% FBS에)이 프로토콜에 사용하고 1% 펜 / 패 혈성. 주의 사항은 양식 포유류의 세포와 함께 작업 할 때 무균 환경을 유지하기 위해주의해야한다. </li><li> 실험 시간 선 (0~5시간 대 1~2일의 포스트 분사)에 따라 세포의 confluency는 ~ 50 %로 조정하거나 각각 25 % ~해야한다. </li></ol> 2. Microinjection <ol><li> ~ 50 μl의 최종 볼륨에, 세포 문화의 복종 할 의무에 따라, 버퍼의 선택 원하는 단백질, DNA, 또는 작은 분자를 준비합니다. 이러한 텍사스 레드, 캐스케이드 블루 등의 불활성 형광 염료microinjected 셀을 표시하기 위해 포함되어 있습니다, 사출 염료 및 형광 프로브의 선택은 겹치지 여기와 방출 파장이 있어야합니다. microinjection에 필요한 관심 분자의 농도는 경험적으로 결정되어야하고, 형광등 추적 염료는 일반적으로 0.5-1.0 MG / ML에서 사용됩니다. 일반적으로, rhodamine 또는 다른 형광는 covalently 감지하지만 다른 방법은 감도에 따라 사용할 수 있습니다, 상용 키트를 사용하여 귀하의 관심 분자에 부착된다. 자세한 내용은 아래 중요 고려 사항을 참조하십시오. </li><li> 0.22 μm 원심 필터를 통해 injectant (~ 50 μl)를 필터링 할 수 있습니다. 원심 필터는 진공 및 / 또는 죽은 볼륨을 연결 한 주사기 여과 선호하고 있습니다. </li><li> microinjection의 바늘을 생성하려면, 붕규산 유리 피펫은 불타는 브라운 Micropipette 풀러 다음 제조업체의 지침을 사용하여 뽑아 있습니다. 또한, microinjection바늘은 femtotip의 microinjection의 바늘하게 Eppendorf 등의 업체에서 구입하실 수 있습니다. </li><li> 조심스럽게 Eppendorf 20 Femtotips를 사용하여 microinjection의 바늘의 unmolested 끝으로 injectant 4 μl를 피펫. 더 거품이 당겨 microinjection의 바늘 내에 존재하지 있는지 확인합니다. 역 현미경에 부착 된 Eppendorf FemptoJet Injectman의 micromanipulator 암에 microinjection의 바늘을로드합니다. microinjection 절차의 좋은 검토, 독자는 시각화 실험 제 8의 이전 저널로 이동합니다. </li><li> 역 Zeiss 현미경의 요리 홀더에 gridded coverslip 및 배양 세포와 라이브 셀 요리를 놓습니다. photoetched 그리드 내에서 성장하는 세포를 찾아 격자의 영숫자 식별자를 참고, 다 다음 단계에 사용됩니다. 다음 단계는 coverslip의 가장자리에서 샘플 전송을 제한하므로 이상적으로, coverslip의 중심에 셀을 찾습니다. </li><li> 수동으로 낮은 주입 coverslip 위에 자리로 팔, 그리고 끝이 부드럽게 교양 세포와이 시점 이후 바늘의 움직임을 방지하기 위해 언론 &#39;제한의 표면을 만지는 때까지 micromanipulator 조이스틱 및 컨트롤, 낮은 사출 바늘을 사용하기 때문에 허약 한을 깨는 붕규산 유리를 꺼냈다. 셀 microinjection의 모든 다른 측면 Eppendorf FemtoJet InjectMan 사용자 설명서에 따라 수행됩니다. microinjection 기술은 최근에 박테리아가 9 개인 분비 독성 단백질을 이해하는 데 사용되었습니다. </li><li> 선택한 그리드 내의 모든 다른 셀을 Microinject. 세포가 ~ 50% confluency에서 성장으로, 하나는 600 μm이 그리드 당 ~ 80 셀 (예를 들어이 그림. 3A) 기대할 수 있습니다. 따라서, 형광 및 전자 현미경 검사시 ~ 30-40 실험 및 제어 세포의 N가있을 것입니다. </li><li> 원하는에 대한 포유류의 세포 배양 배양기에 다시 라이브 셀 요리를 놓으십시오시간은 실험 설정에 의해 결정. 또한, 하나는 이전에 고정이 관심의 특정 subcellular 구조의 모양을 기다리고 microinjection에서 시간 경과 현미경 분석에 직접 진행할 수 있습니다. </li></ol> 3. 형광 현미경 <ol><li> 원하는 경우, microinjected 세포의 라이브 셀 시간이 경과 형광 측정을 수행, 그 이후, 0.1 M cacodylate 버퍼 (산도 7.4)에 2.5 %의 글 루타 알데히드와 미디어를 교체하고 실온에서 10 분에 품다. 라이브 셀 측정이 필요하지 않는 경우 그러나, 세포의 성장 미디어를 버리고 10 분 동안 실온에서 1xPBS 5 ML 3.7 %의 포름 알데히드로 세포를 해결할 수 있습니다. 정착액을 취소하고 5 ML의 1xPBS로 교체, 3.2 단계로 진행합니다. 참고 : 형광 현미경이 완료 때까지 글 루타 알데히드를 추가하지 중요합니다. </li><li> 형광 현미경의 photoetched gridded coverslip으로 라이브 셀 요리를 장소 (공 촛점이 생 필요하지 않습니다S 단계)과 세포의 배열 (그림 4A)를 문서화하는 5-10 시야하고 적절한 격자의 형광 이미지를 수집합니다. 불활성 분사 염료 (그림 4B)의 여기 및 방출 파장을 사용하여 microinjected 된 해당 셀을 식별합니다. 이 전자 현미경을 포함한 후속 단계에 microinjected 세포의 식별을 용이하게하기 위해 다른 배율 (예 : 10X와 65x)에서 이미지를 얻는 것이 중요합니다. </li><li> 공 촛점 형광 현미경을 사용하여 단계 위의 2.5에서 확인 된 격자 내에서 microinjected 세포의 Z-스택을 수집합니다. 높은 배율 (100x)는 전자 현미경에 표시됩니다 subcellular 구조와 형광 이미지를 상관 관계하기 위해 필요합니다. </li><li> coverslips는 상업적으로 이용 가능한 coverslip 제거 유체와 함께 라이브 셀 요리의 바닥에서 제거, 5 ML을 포함하는 처녀 세포 배양 접시에 세포 측을 배치됩니다1xPBS. 아래의 설명과 같이 coverslip 그런 다음 전자 현미경에 처리됩니다. </li></ol> 4. 전송 전자 현미경 <ol><li> 0.1 M cacodylate 버퍼 (산도 7.4) 2 ML 2.5 %의 글 루타 알데히드와 1xPBS 버퍼를 교체하고 10 분 동안 실온에서 알을 품다. 더 이상 부화가 필요하지하면서, subcellular 구조의 유지에 도움이됩니다. 참고 : 혼자 포름 알데히드는 EM 분석을위한 충분한 정착액하지 않습니다. </li><li> cacodylate 버퍼 든 세 세차에 이어 30 분에 0.1 M cacodylate의 버퍼 2 ML 1 % 오스뮴의 tetroxide의 추가와 정착액 및 얼룩 세포를 제거하고 마지막으로 ddH 2 O.있는 모든 버퍼를 교체 </li><li> 표준 EM 프로토콜 후, 에탄올의 등급 (70 % ~ 100 %) 시리즈의 샘플을 탈수. Epon 수지가 채워진 튜브의 상단에 Epon 수지 및 장소 coverslip 세포 쪽을 준비합니다. 60에서 24 시간을위한 중합을 허용 ° C. photoetched gridded coverslip 셀 측 수행을 배치하여Epon 수지로 wn은 관심뿐만 아니라 격자 패턴의 세포 모두 (예 그림. 3B) 중합 동안 Epon 수지로 전송됩니다. </li><li> 신속하게 액체 질소 및 / 또는 끓는 물에 immersing하여 Epon 수지의 coverslips를 제거합니다. 관심 격자를 (: 그리드 찰싹 찰싹 소리가 미러 이미지로 전송됩니다 주) 찾을 수 쌍안 해부 범위에서 수지의 표면을 검사합니다. 관심 만 그리드 Epon 수지 블록의 정점에 있습니다 있도록 아래 멸균 면도날이나 메스, 트림 Epon 블록을 사용합니다. </li><li> ultramicrotome 사용하여 원하는 두께 (단층 TEM에 대한 기존의 TEM 및 ~ 250 nm의 두께에 ~ 70 nm의 두께)에 다듬어 블록의 직렬 섹션을 습득. 표준 프로토콜에 따라 uranyl 아세트산과 리드 구연산과 대비 섹션을. </li></ol> 5. 상호 빛과 전자 현미경 <ol><li> 에 대한 관심의 세포를 재이미지를 사용하여 전자 현미경은 이전 단계에서 얻은. 관심되면 microinjected 세포가있는 한, 관심 있던 세포 내의 지역을 식별하는 고해상도 공 촛점 형광 이미지를 사용합니다. TEM을 사용하여 높은 해상도 이미지이 있습니다. 이러한 세포 주변과 형광 Z-스택 이미지 EM이 갈라에 해당하는 결정 핵 봉투와 같은 랜드 마크를 사용합니다. </li><li> 선택의 이미징 프로그램을 (예 : 이미지 J, 어도비 포토샵 등) 사용, 50 %로 형광 이미지의 불투명도를 줄이고 연결합니다되는 TEM 이미지에를 입혀 라. 규모를 조정 (비율을 제한하는 것을 잊지)과 TEM 이미지와 일치하는 공 촛점 이미지의 회전에 의해 이미지를 맞 춥니 다. 형광 이미지의 대비, 선명도 등을 정밀 조정 정렬에 도움이 될 수 있습니다. 참고 : 우리는 heterochromatin, 핵 봉투, 그리고 세포 주변이 도움이 할 수있는 훌륭한 랜드 마크를 나타낸다는 것을 발견했습니다두 이미지의 방향 인치 </li></ol> 6. 중요 고려 사항 <ol><li> 크게 주입 작은 분자를 찾는에 도움이 같은 Rhodamine 또는 Fluorescein 같은 형광 태그는 covalently 상업적으로 이용 가능한 키트를 사용하여 부착 할 수 있습니다. 추가 정보는 ectopically 전에 microinjection에 형광 subcellular 지방화 마커 단백질을 표현하여 얻은 수 있습니다. 따라서, fluorophores 및 불활성 microinjection 추적 염료의 선택이 중요합니다. </li><li> 가까운 coverslip의 중심에 준수하고 microinjection에 대한 셀을 선택하고 가장자리에 가까운 격자를 선택하지 마십시오. 이 관심의 세포 전자 현미경에 사용되는 Epon 수지로 전송하는 가장 큰 가능성을 제시합니다. </li><li> 세포의 Confluency 전S 중요한 완전히 합류 플레이트는 매우 어렵 전자 현미경에 microinjected 세포의 식별을 줄 것이라고 믿습니다. 오히려, 종자 세포들은 이러한 짧은 실험 당일 ~ 50% confluency에 도달하거나 이상의 날 (1-2 일) 실험에 ~ 25% confluency.하는 위치와 모양 세포의뿐만 아니라 방향에 랜드 마크와 같은 &#39;빈 공간 전자 현미경 이미지를 사용합니다. </li><li> 공 촛점 광학 슬라이스 두께는 실험의 요구에 조정해야하기 때문에 경험적으로 10 결정해야합니다. </li><li> fixatives의 포름 알데히드 및​​ 글 루타 알데히드는 가장 높은 등급의해야합니다. 포름 알데히드는 단백질과 작은 형광 분자 (예 : Rhodamine 또는 FITC 등) 모두의 형광 특성을 보존 아직 세포가 해결됩니다. 그러나, 구조가 높은 EM 해상도를 허용 보존되지 않습니다. 글 루타 알데히드는 analy EM에 대한 높은 수준의에 멤브레인과 subcellular 구조를 유지시스,하지만 크게 형광 방해합니다. 따라서 두 단계로 고정 모두 형광을위한 중요하고 EM 현미경. 최종 고정이 글 루타 알데히드 처리에 의해 수행 될 수 있으므로 포름 알데히드 고정 단계는 라이브 셀 측정을 수행 할 경우 생략 할 수 있습니다. </li></ol> 7. 대표 결과 이 절차는 직접 진핵 세포의 세포질에 관심있는 분자를 제공 및 멀티 나노 미터 해상도 mm에서 휴대폰 및 organeller 건축에서의 현지화 및 / 또는 효과를 모니터링 할 수있는 능력을 갖게. 실험 설정 및 절차의 개략도는 그림 2에 표시됩니다. 이 기술은 (그림 공 촛점 현미경 후 Epon 수지에 관심뿐만 아니라 격자 패턴의 세포를 모두 양도 할 수있는 레이저 에칭 유리 gridded coverslip (그림 3A)에 성장 세포의 microinjection에 의존3B). 전형적인 microinjection의 클레멘 타인 절차는 상관이 때, subcellular 지방화와 ultrastructural 분석을 모두 허용 형광 이미지와 전자 micrographs를 산출. photoetched 유리 gridded coverslip에 성장 세포는 밝은 필드 이미지가 취득하는 후 관심있는 분자 (그림 4A)로 microinjected 있습니다. 불활성 추적 염료가 아닌 microinjected 세포 (그림 4B)에서 microinjected 세포를 구별 할 통합됩니다. 공 촛점 Z-스택은 형광 또는 관심 microinjected 작은 분자 (그림 4C)에 첨부 된 다른 식별자를 사용하여 얻을 수 있습니다. 샘플은 글 루타 알데히드로 고정하고 전자 현미경에 처리됩니다. 전자 micrographs들은 해당하는 셀 (그림 4D)에 취득과 중첩되어 있습니다. 형광 신호를 품고 영역은 (그림의 4E 높은 배율에서 더 상세하게 검사 아르 </STRONG&gt;). <img src="/files/ftp_upload/3650/3650fig1.jpg" alt="그림 1"/> 그림 1. microinjection의 클레멘 타인 절차의 타임 라인. 실험 설정에 따라 microinjection 및 형광 측정은 같은 날에 수행 할 수 있습니다. 전자 현미경의 샘플을 준비하는 것은 긴 incubations 단계에 가장 많은 시간이 소요 때문입니다 후 2-3 일 지속됩니다. TEM 분석 및 전자 현미경 이미지 형광 신호를 상호 연관은 하루에 수행 할 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/3650/3650fig2.jpg" alt="그림 2"/> 그림 2 microinjection의 클레멘 타인 절차의 일반 그림 1 단계 :.. 레이저 에칭 유리 gridded coverslip에 성장 세포를 찾아 관심 분자를 microinject 2 단계 :.. 시야 이미지 및 microinjected 세포의 공 촛점 형광 Z-스택을 모두 캡처 3 단계 : 준비EM에 대한 coverslip 분석하고 Epon 수지에 삽입 할 수 있습니다. 전송 그리드 패턴을 사용하여 관심 등 그 세포를 차단을 다듬 꼭대기에 있습니다 4 단계 :. ultramicrotome과 시리얼 부분을 잘라 5 단계 :. EM 이미지로 형광 이미지를 상관 관계. <img src="/files/ftp_upload/3650/3650fig3.jpg" alt="그림 3"/> . 그림 3 그리드 패턴은 관심 세포의 식별을 용이하게 패널은 ~ 50% confluency로 성장 세포의 microinjection을 묘사,. 격자 식별자 AK을 확인합니다. 스케일 바는 100 μm이다. 패널 B는 관심의 그리드가 해부 현미경에서 확인 후 순차적으로 sectioned 될 polymerized Epon 수지 블록 위에 coverslip에서 전송 격자 패턴을 보여줍니다. 패널 C는 sectioning에 대비 양도 그리드 패턴을 보여줍니다 . 전송 그리드 찰싹 찰싹 소리가 수지 블록에 역에 있습니다, scal전자 바는 1200 μm이다. <img src="/files/ftp_upload/3650/3650fig4.jpg" alt="그림 4"/> .. 그림 4 microinjection의 상호의 빛과 전자 ​​현미경의 대표 결과 패널은 레이저 에칭 유리 gridded coverslip에 성장 NRK 세포의 밝은 필드 현미경을 보여줍니다, 화살표는 패널 CD에서 클레멘 타인에 의해 시각화 두 셀을 나타냅니다 패널 B의 형광을 보여줍니다. 불활성 추적 염료 때문에,이 경우에는 캐스케이드 블루, microinjected 된 셀을 식별하는 데 사용됩니다. 패널 C는 밝은 분야의 오버레이와 Rhodamine-라벨 작은 분자의 형광 서명을 보여줍니다. 여기에 표시된 두 개의 세포는 A &amp; B. 패널 D는 시야, 형광 및 전자 현미경의 클레멘 타인을 나타내는 패널의 화살표로 표시되며,. 화살표 머리 형광 puncta이 패널 E의 높은 배율의 이미지로 나타냅니다 스케일 바는 fol과낮은 : 패널 A &amp; B, 100 μm, C &amp; D, 50 μm, E, 100 nm의.

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관심의 충돌이 선포되지 않습니다.

여기에 제시된 방법은 진핵 세포 세포질에 정화 단백질, 핵산, 또는 작은 분자의 직접 전송을 할 수 있으며 형광 및 전자 현미경의 상관 관계를 통해 초 고해상도 분석을 갖게. 이 방법의 사용은 단순하지만 강력한이 많은 기존의 핵심 시설 및 / 또는 적절하게 구비 전자 현미경 실험실와 함께 집에서 수행 할 수 있습니다. 이 기술은 사용자가 실시간으로 휘황 태그 분자의 역학을 모니터링 할 수 있으며 따라서 시간 경과 현미경과 함께 사용 단층 전자 현미경에 상관 할 수 있도록 라이브 셀 의무가 있습니다. 예비 경험적 실험은 전자 micr에 대한 최적의 confluency, microinjection 효율과 injectant, fluorophores의 최적화 및 사출 / 염료 (들)을 추적의 적절한 수량의 전달, 가용성 및 / 또는 전문 지식을 결정하기 위해 실험의 모든 단계에서 실시되어야한다oscopy 분석. 클레멘 타인 절차의 모든 단계에서 주입 셀을 찾기이 프로토콜에 중요하다, 따라서 그것은 coverslip의 중심 근처에 영숫자 그리드에 성장 세포가 모두 공 촛점에서 표본이 문서화 될 가능성이 높아하도록 선택하는 것이 좋습니다 그리고 전자 현미경. 관심 세포를 찾는에 도움이 주변 세포의 상대적인 위치는 랜드 마크는 EM 분석하는 동안 적절한 표본을 찾아에 도움이로 사용되어야합니다. 마지막으로, 섹션 두께는 원하는 측정에 맞게 조정해야합니다. 두꺼운 부분 (~ 250-300 nm 정도)이 EM의 단층 촬영하는 것이 좋습니다 동안 ~ 70 나노 미터 두께의 시리얼 섹션은 TEM하는 것이 좋습니다. microinjection의 클레멘 타인 기술은 주로 타입 III 분비 세균 이펙터 단백질 전달을 시뮬레이션하여 진핵 세포의 subcellular ultrastructure에 미치는 영향을 분석하기 위해 실험실에서 사용됩니다. 그러나, 소성 및 EAS클레멘 타인 다음 microinjection의 이용 e는 조사의 많은 다른 수단을 갖게.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> Photoetched Coverslip와 라이브 셀 플레이트 </td><td> MatTek </td><td> P35G-2-14-CGR​​D </td><td></td></tr><tr><td> 텍사스 레드 </td><td> Invitrogen </td><td> D3329 </td><td></td></tr><tr><td> 캐스케이드 블루 </td><td> Invitrogen </td><td> D7132 </td><td></td></tr><tr><td> Rhodamine 라벨 키트 </td><td> 열 과학 </td><td> 53,002 </td><td></td></tr><tr><td> 0.22 μm 원심 여과 장치 </td><td> Millipore </td><td> UFC30GV00 </td><td></td></tr><tr><td> 붕규산 유리 피펫 </td><td> 셔터 악기 </td><td> BF100-50-10 </td><td></td></tr><tr><td> Micropipette 풀러 </td><td> 셔터 악기 </td><td> 모델 P-97 </td><td> 램프 테스트를 수행 한 후에는 프로그램을 # 4를 사용 </td></tr><tr><td> FemtoJet의 Microinjection 시스템 </td><td> Eppendorf </td><td> Injectman NI2 </td><td></td></tr><tr><td> Coverslip 제거 유체 </td><td> MatTek </td><td> PDCF OS 30 </td><td></td></tr><tr><td> Technai 전송 전자 현미경 </td><td> 페이 </td><td> Technai G2 BioTWIN </td><td></td></tr><tr><td> Ultramicrotombe </td><td> Leica </td><td> EM UC6 </td><td></td></tr></tbody></table>

correlative light and electron microscopy (clem) as a tool to visualize microinjected molecules and their eukaryotic sub-cellular targets

진핵 세포는 복잡한에 의존 높은 규제하고, 적절한 세포 기능에 필요한 생화학 극성을 보존 기능 뚜렷한 막 바인딩 된 구획. 효소, 단백질, 그리고 cytoskeletal 부품이 생화학 분리를 적용하고 유지하는 방법을 이해하는 것은 파라마운트 중요성을 따라서입니다. 휘황 태그 분자의 사용 또는 교란 subcellular 구획은 풍부한 지식이 나왔고 및 셀룰러 규제에 대한 우리의 이해를 전진했다와 / 현지화입니다. 이러한 형광 및 공 촛점 현미경 등의 이미징 기술은 비교적 간단 휘황 태그 작은 분자의 위치를 ascertaining 수 있도록 매우 작은 구조 그러나 해상도는 1 제한됩니다. 한편, 전자 현미경은 매우 높은 해상도로 subcellular 형태의 세부 사항을 발표했다 있지만 정적 자연은 어려운 매우 동적 프로를 측정 할 수 있습니다정밀도 2,3와 cesses. 따라서, 동일한 샘플의 전자 현미경, 칭했다 상호 빛과 전자 ​​현미경 (클레멘 타인) 4,5과 빛 현미경의 조합은, 전자 현미경 6 높은 해상도로 ultrafast 형광 이미징의 듀얼 장점을 갖게. 이 강력한 기술은 세포 생물학 5,7의 여러 측면을 연구 구현되었습니다. 처음 소개 된 이래,이 절차는 높은 해상도의 subcellular 구조와 morphologies를 구별 할 수있는 능력을 향상 시켰습니다. 여기, 우리는 클레멘 타인 (그림 1) 다음 빠른 microinjection을 수행하기위한 간소화 된 방법을 제시한다. microinjection의 클레멘 타인 절차는 직접 진핵 세포 세포질에 작은 분자 및 / 또는 단백질의 특정 수량을 소개하고 (그림 2) 멀티 나노 미터 해상도 mm의 효과를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 기술은 microinjecting을 기반으로합니다세포는 모두 공 촛점 형광 및 전자 현미경과 라이브 셀 요리와 이미지의 하단에 부착 레이저 에칭 유리 gridded coverslips에 성장. 관심 세포의 현지화 (들) 쉽게 (그림 3) 시료의 고정에 사용되는 Epon 수지에 이르기까지 관심의 세포와 함께 양도 및 이전 전자 현미경 분석에 sectioning되는 격자 패턴에 의해 촉진된다. 형광 및 EM 이미지의 중첩은 사용자가 subcellular 지방화뿐만 아니라 관심 microinjected 분자 (그림 4)에 의해 유도 된 형태학 및 / 또는 ultrastructural 변경 사항을 확인할 수 있습니다. 이 기술은 microinjected 샘플의 특성에 따라 몇 시간이 ≤에서 5 초를 이르는 시간이 가리키는 의무가 있습니다.

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Correlative Light and Electron Microscopy CLEM as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

클레멘 타인 기술은 microinjected 분자에 의해 영향을 멤브레인, 세포 소기관, 그리고 subcellular 구조 ultrastructural 형태를 분석하도록 구성되었습니다. 이 방법은 다중 나노 미터 해상도 밀리미터 수 있도록 미세 조작 / microinjection의 강력한 기술, 공 촛점 형광 현미경 및 전자 현미경을 자랑합니다. 이 기술은 응용 프로그램의 다양한 의무가 있습니다.

도구로 상호 빛과 전자 현미경 (클레멘 타인)는 Microinjected 분자와 진핵 세포 하위 세포 목표를 시각화하는 방법


The eukaryotic cell relies on complex, highly regulated, and functionally distinct membrane bound compartments that preserve a biochemical polarity ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

19.1K 조회수.  University of Texas Southwestern Medical Center. 클레멘 타인 기술은 microinjected 분자에 의해 영향을 멤브레인, 세포 소기관, 그리고 subcellular 구조 ultrastructural 형태를 분석하도록 구성되었습니다. 이 방법은 다중 나노 미터 해상도 밀리미터 수 있도록 미세 조작 / microinjection의 강력한 기술, 공 촛점 형광 현미경 및 전자 현미경을 자랑합니다. 이 기술은 응용 프로그램의 다양한 의무가 있습니다.

비디오: Correlative Light and Electron Microscopy CLEM as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

Electroantennographic Bioassay as a Screening Tool for Host Plant Volatiles

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host plant.1,2 When a host plant is an important agronomic commodity feeding damage by insect pests can inflict serious economic losses to growers. Accordingly, kairomones can be used as attractants to lure or confuse these insects and, thus, offer an environmentally friendly alternative to pesticides for insect control.3 Unfortunately, plants can emit a vast number volatiles with varying compositions and ratios of emissions dependent upon the phenology of the commodity or the time of day. This makes identification of biologically active components or blends of volatile components an arduous process. To help identify the bioactive components of host plant volatile emissions we employ the laboratory-based screening bioassay electroantennography (EAG). EAG is an effective tool to evaluate and record electrophysiologically the olfactory responses of an insect via their antennal receptors. The EAG screening process can help reduce the number of volatiles tested to identify promising bioactive components. However, EAG bioassays only provide information about activation of receptors. It does not provide information about the type of insect behavior the compound elicits; which could be as an attractant, repellent or other type of behavioral response. Volatiles eliciting a significant response by EAG, relative to an appropriate positive control, are typically taken on to further testing of behavioral responses of the insect pest. The experimental design presented will detail the methodology employed to screen almond-based host plant volatiles4,5 by measurement of the electrophysiological antennal responses of an adult insect pest navel orangeworm (Amyelois transitella) to single components and simple blends of components via EAG bioassay. The method utilizes two excised antennae placed across a "fork" electrode holder. The protocol demonstrated here presents a rapid, high-throughput standardized method for screening volatiles. Each volatile is at a set, constant amount as to standardize the stimulus level and thus allow antennal responses to be indicative of the relative chemoreceptivity. The negative control helps eliminate the electrophysiological response to both residual solvent and mechanical force of the puff. The positive control (in this instance acetophenone) is a single compound that has elicited a consistent response from male and female navel orangeworm (NOW) moth. An additional semiochemical standard that provides consistent response and is used for bioassay studies with the male NOW moth is (Z,Z)-11,13-hexdecadienal, an aldehyde component from the female-produced sex pheromone.6-8

A method to rapidly screen host plant volatiles by measurement of the electrophysiological response of adult navel orangeworm (Amyelois transitella) antennae to single components and blends via electroantennographic analysis is demonstrated.

호스트 식물 휘발성 물질에 대한 선별 도구로 Electroantennographic Bioassay

Plant volatiles play an important role in plant-insect interactions. Herbivorous insects use plant volatiles, known as kairomones, to locate their host ...

연구

생물학

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Ribosome 바운드 Polypeptides을 파악하는 도구로 SecM 체포 시퀀스를 사용하여

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being used to evaluate the structure and function of plant xylem network in three dimensions (3D) (e.g. Brodersen et al. 2010; 2011; 2012a,b). HRCT imaging is based on the same principles as medical CT systems, but a high intensity synchrotron x-ray source results in higher spatial resolution and decreased image acquisition time. Here, we demonstrate in detail how synchrotron-based HRCT (performed at the Advanced Light Source-LBNL Berkeley, CA, USA) in combination with Avizo software (VSG Inc., Burlington, MA, USA) is being used to explore plant xylem in excised tissue and living plants. This new imaging tool allows users to move beyond traditional static, 2D light or electron micrographs and study samples using virtual serial sections in any plane. An infinite number of slices in any orientation can be made on the same sample, a feature that is physically impossible using traditional microscopy methods.
Results demonstrate that HRCT can be applied to both herbaceous and woody plant species, and a range of plant organs (i.e. leaves, petioles, stems, trunks, roots). Figures presented here help demonstrate both a range of representative plant vascular anatomy and the type of detail extracted from HRCT datasets, including scans for coast redwood (Sequoia sempervirens), walnut (Juglans spp.), oak (Quercus spp.), and maple (Acer spp.) tree saplings to sunflowers (Helianthus annuus), grapevines (Vitis spp.), and ferns (Pteridium aquilinum and Woodwardia fimbriata). Excised and dried samples from woody species are easiest to scan and typically yield the best images. However, recent improvements (i.e. more rapid scans and sample stabilization) have made it possible to use this visualization technique on green tissues (e.g. petioles) and in living plants. On occasion some shrinkage of hydrated green plant tissues will cause images to blur and methods to avoid these issues are described. These recent advances with HRCT provide promising new insights into plant vascular function.

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique that can be used to study the structure and function of plant vasculature in 3D. We demonstrate how HRCT facilitates exploration of xylem networks across a wide range of plant tissues and species.

공장 Vasculature의 3 차원 구조 및 기능을 시각화하기 위해 높은 해상도로 계산 된 단층 촬영을 사용하여

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

공 초점 및 다중 광자 현미경을 사용하여 다섯 형광 단백질에 의해 표시됨 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 클론 추적에서

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

성인 마우스 두개골 골수에서 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 4 차원 추적에서

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved substances from the blood into the liver parenchyma for metabolism and processing. Fenestrations are dynamic structures - both their size and/or number can be altered in response to various physiological states, drugs, and disease, making them an important target for modulation. An understanding of how LSEC morphology is influenced by various disease, toxic, and physiological states and how these changes impact on liver function requires accurate measurement of the size and number of fenestrations. In this paper, we describe scanning electron microscopy fixation and processing techniques used in our laboratory to ensure reproducible specimen preparation and accurate interpretation. The methods include perfusion fixation, secondary fixation and dehydration, preparation for the scanning electron microscope and analysis. Finally, we provide a step by step method for standardized image analysis which will benefit all researchers in the field.

The fenestrated liver sinusoidal endothelial cell is a biologically important filter system that is highly influenced by various diseases, toxins, and physiological states. These changes significantly impact on liver function. We describe methods for the standardisation of the measurement of the size and number of fenestrations in these cells.

주사 전자 현미경으로 간 사인 내피 세포의 분석 및 그들의 Fenestrations위한 표준화 된 방법

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved ...

Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell

Delineation of a cell&#8217;s ultrastructure is important for understanding its function. This can be a daunting project for rare cell types diffused throughout tissues made of diverse cell types, such as enteroendocrine cells of the intestinal epithelium. These gastrointestinal sensors of food and bacteria have been difficult to study because they are dispersed among other epithelial cells at a ratio of 1:1,000. Recently, transgenic reporter mice have been generated to identify enteroendocrine cells by means of fluorescence. One of those is the peptide YY-GFP mouse. Using this mouse, we developed a method to correlate confocal and serial block-face scanning electron microscopy. We named the method cocem3D and applied it to identify a specific enteroendocrine cell in tissue and unveil the cell&#8217;s ultrastructure in 3D. The resolution of cocem3D is sufficient to identify organelles as small as secretory vesicles and to distinguish cell membranes for volume rendering. Cocem3D can be easily adapted to study the 3D ultrastructure of other specific cell types in their native tissue.

Here, we introduce a method, cocem3D, to unveil the ultrastructure of a specific cell in its native tissue by bridging confocal and serial block-face scanning electron microscopy.

특정 감각 세포의 상호 공 초점 및 3D 전자 현미경

Delineation of a cell&#8217;s ultrastructure is important for understanding its function. This can be a daunting project for rare cell types diffused ...

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix biology, there are still major gaps related to how the matrix is formed, how physiological and pathological remodeling differ, and most importantly how matrix dynamics might be manipulated to promote healing and inhibit fibrosis. There is currently no treatment option for controlling, preventing, or reversing cardiac fibrosis. Part of the reason is likely the sheer complexity of cardiac scar formation, such as occurs after myocardial infarction to immediately replace dead or dying cardiomyocytes. The extracellular matrix itself participates in remodeling by activating resident cells and also by helping to guide infiltrating cells to the defunct lesion. The matrix is also a storage locker of sorts for matricellular proteins that are crucial to normal matrix turnover, as well as fibrotic signaling. The matrix has additionally been demonstrated to play an electromechanical role in cardiac tissue. Most techniques for assessing fibrosis are not qualitative in nature, but rather provide quantitative results that are useful for comparing two groups but that do not provide information related to the underlying matrix structure. Highlighted here is a technique for visualizing cardiac matrix ultrastructure. Scanning electron microscopy of decellularized heart tissue reveals striking differences in structure that might otherwise be missed using traditional quantitative research methods.

Shown here is a method for visualizing extracellular matrix ultrastructure in decellularized cardiac tissues.

침연 (macerated) 조직의 전자 현미경을 스캔하면 세포 외 매트릭스를 시각화하기

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize macromolecular complexes at very high resolution. However, to get as close as possible to the native state, perfect sample preservation is required. Conventional electron microscopy (EM) fixation with aldehydes, for instance, does not provide good ultrastructural preservation. The slow penetration of fixatives induces cell reorganization and loss of various cell components. Therefore, conventional EM fixation does not allow for an instantaneous stabilization and preservation of structures and antigenicity. The best choice for examining intracellular events is to use cryofixation followed by the freeze-substitution fixation method that keeps cells in their native state. High-pressure freezing/freeze-substitution, which preserves the integrity of cellular ultrastructure, is the most commonly used method, but requires expensive equipment. Here, an easy-to-use and low-cost freeze fixation method followed by freeze-substitution for suspension cell cultures is presented.

This manuscript describes an easy-to-use and low-cost cryofixation method for visualizing suspension cells by transmission electron microscopy.

플 런지 프리즈 : 투과 전자 현미경에서 서스펜션 세포의 초 구조 및 면역 로컬 ​​라이 제이션 연구를위한 도구

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize ...

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM)

Scanning electron microscopy (SEM) is a widely available technique that has been applied to study biological specimens ranging from individual proteins to cells, tissues, organelles, and even whole organisms. This protocol focuses on two chemical drying methods, hexamethyldisilazane (HMDS) and t-butyl alcohol (TBA), and their application to imaging of both prokaryotic and eukaryotic organisms using SEM. In this article, we describe how to fix, wash, dehydrate, dry, mount, sputter coat, and image three types of organisms: cyanobacteria (Toxifilum mysidocida, Golenkina sp., and an unknown sp.), two euglenoids from the genus Monomorphina (M. aenigmatica and M. pseudopyrum), and the fruit fly (Drosophila melanogaster). The purpose of this protocol is to describe a fast, inexpensive, and simple method to obtain detailed information about the structure, size, and surface characteristics of specimens that can be broadly applied to a large range of organisms for morphological assessment. Successful completion of this protocol will allow others to use SEM to visualize samples by applying these techniques to their system.

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy SEM

SEM analysis is an effective method to aid in species identification or phenotypic discrimination. This protocol describes the methods for examining specific morphological details of three representative types of organisms and would be broadly applicable to examining features of many organismal and tissue types.

스캐닝 전자 현미경 (SEM)에서 형태소 분석에 대 한 화학 건조를 사용 하 여 간결한 진 핵 유기 체의 준비

Scanning electron microscopy (SEM) is a widely available technique that has been applied to study biological specimens ranging from individual proteins to ...