We thank Joshua Marcus for technical support and Jolien Tyler, Ph.D., Director of the Richard J. McIntosh Light Microscopy Core Facility, for technical advice. This work was supported by funds from the University of Colorado Boulder and the University of Colorado Boulder Graduate School to J.D.O. R.T.B. is partially supported by pre-doctoral training grant from the NIH (T32 GM008759). We thank Karyopharm Therapeutics, Inc. for selinexor and Merck Serono for Kinesin-5 inhibitor. FUCCI plasmids are from Atsushi Miyawaki (RIKEN, Japan) via MTA. mCherry-BP1-2 was from Addgene. HeLa expressing H2b-mCherry and &#946;-tubulin-EGFP are from Daniel Gerlich (IMBA, Austrian Academy of Sciences, Austria).

다음 프로토콜은 그림 4와 6에 대한 인수 설정 및 실험 조건에서 실험에 의해 정의 된 매개 변수를 사용합니다. 이러한 파라미터의 많은 다른 실험에 맞게 수정 될 수있다 (즉, 노출 시간, 비닝 형광 채널, 등.). 모든 절차가 제도적 지침 및 규정을 준수해야하고 제도적 바이오 안전성위원회의 승인을 받아야. 현미경 제조 업체 웹 사이트 라이브 세포 이미징을위한 훌륭한 정보가 포함되어 있습니다. 1. 현미경 및 이미징 소프트웨어 <ol><li> 거꾸로 현미경의 다양한 라이브 세포 이미징을 수행합니다. 가장 일반적인 현미경 표면 형광 및 회전 디스크 공 촛점을 위드 있습니다. 여기서, 200w 메탈 할라이드 광원과 자동화되고 동력 위드의 표면 형광 현미경을 사용한다. </li><li> 무대 정상을 얻거나 환경 챔버를 현미경. 여기에서, 무대 t을 사용영업 환경 챔버. </li><li> 시간 경과 현미경을 실행하는 유틸리티 현미경을 운영하는 상용 소프트웨어를 사용합니다. </li><li> 이미지 분석을위한 상용 소프트웨어 또는 ImageJ에 사용합니다. 많은 분석 도구는 상업적으로 입수 가능하고, (8, 18)를 발표되었다하는 여러 맞춤형 프로그램이있다. </li></ol> 2. 세포 프로세스 및 표현형 응답을 시각화 <ol><li> 시야 현미경으로 세포를 시각화합니다. 단독 차동 간섭 콘트라스트 및 위상 콘트라스트 항암 약물 반응에 대한 반응을 연구하는 것은 매우 유익 할 수있다. 이러한 프로세스는 유사 분열, 세포 운동성 및 세포 사멸을 포함 할 수있다. </li><li> 형광 바이오 센서와 세포 구조, 세포 기관 및 프로세스를 시각화합니다. 형광 프로브는 특정 세포 내 프로세스를 추적하는 정보입니다. 이러한 미세 소관 역학, 미토콘드리아와 소포체 역학, 단백질 축적과 현지화 등을 포함 할 수있다분자 신호 (예., 인산화 칼슘). </li></ol> 샘플 3. 준비 <ol><li> 표준 세포 배양 접시에 세포 인증을 성장 습한 세포 배양기 (예, 37 입출력 C, 5 % CO 2, 80 % 상대 습도). <ol><li> EBSS와 MEM에 HT1080 세포를 성장. 10 %의 v / V의 FBS, 1 % V / V 펜 / 스트렙토 1 % V / V 피루브산 나트륨, 1 % V / V 비 필수 아미노산과 미디어를 보완. </li></ol></li><li> 영상에 이틀 전에, 공인 된 멸균 층류 흐름 후드에 12 잘 # 1.5 유리 바닥 접시의 3 우물에 판 50,000 HT1080 FUCCI 세포. 실험의 시작 ~ 60 % 합류점을 달성하기 위해 도금 된 세포의 수를 조정한다. 세포주 실험 세포 밀도의 특성에 따라 덜 수있다. 주 : 세포 밀도가 세포주의 성장 및 실험 결과에 지대한 영향을 미칠 수있다. 최소화하기 위해 세포를 계산 실험 - 투 - 실험 variabilit밀도로 인해 Y. <ol><li> 환경 챔버와 실험에 필요한 조건, 하나의 잘 요리의 플레이트 세포 (일반적으로 35- 또는 60-mm), 4도 35 mm 요리, 6, 12, 24 웰 세포 배양 접시, 또는에 따라 다양한 형식의 슬라이드 커버 슬립. 세포 배양 플라스틱을 통해 # 1.5 대부분의 대물 렌즈는 유리의이 두께에 최적화 된 바와 같이 유리, 및 이미징 유리 바닥 판을 사용하는 것은 매우 좋지 않습니다. 참고 : 일부 세포주의 성장과 유리에 생존하지 않습니다. 이러한 경우, 유리 (예. 폴리 라이신이나 콜라겐) 세포 접착 성을 향상시키기 위해 코팅 될 수있다. 이 실행 가능한 옵션의 경우 일부 기업은, 그것은 경험적으로 결정해야 광학 세포 배양 플라스틱을 생산하고 있습니다. </li></ol></li></ol> 4. 환경 상공 회의소 셋업 <ol><li> 모든 실험 이전에, 설정 환경 챔버 37 O C를이 습도 80 % ~에서 동작 등 샘플 위치에서의 온도가되도록. 대부분의 세포 배양 인해 배지 중탄산 나트륨 완충액 5 % CO 2 / 밸런스 공기 분위기에서 성장한다. 셋업에 따라, 중 5 % CO 2 환경 컨트롤러를 설정하고 공기와 함께 100 %의 CO 2를 혼합, 또는 5 % CO 2 / 밸런스 공기 가스 인증, 미리 혼합 사용합니다. 가스 흐름 속도에 대한 제조 업체의 지시 사항을 따르십시오. 참고 : 일부 세포주는 CO이없이 유지 될 수있는 경우에 CO 2 -independent 배지에서 자란다. 특별히 설계된 영상 미디어 autofluorescent 화합물의 첨가를 제한하는도 사용할 수 있습니다. 목적하는 세포 유형에 대한 논문 매체에서 성장 미리 실험적으로 결정되어야한다. </li><li> 촬영에 앞서, 물이 저수지는 멸균 증류수로 (제조업체의 지침에 따라) 충전되어 있는지 확인합니다. 원하는 온도 설정으로 환경 챔버를 켜고 현미경 무대 삽입에 배치합니다. 가스를 저장하려면,이 시점에서 흐름을 시작하지 마십시오. 참고 : 단계 탑 챔버와 무대 삽입 및 / 또는 실험에 모션 아티팩트를 도입 할 수 챔버에 연결 코드에 어떤 긴장 사이에 여유 공간이있는 경우. <ol><li> 무대에 커플로에 실을 실을 삽입하기 전에 단계 삽입 구멍의 가장자리 위에 파라핀 필름의 조각을 놓고, 어떤 연결이 실을 당겨되지 않았는지 확인합니다. </li></ol></li><li> 챔버 (37) 오 C.에 평형을 허용 세포 생리학에 영향을 드리프트를 도입 할 수 촬상시의 온도의 변동을 방지하기 위해 안정적인 온도를 유지한다. 도달 온도 평형은 일반적으로 환경에 따라 1 시간 30 분을 필요로한다. <ol><li> 승온하면서 챔버로 우물에서 물 &#39;더미&#39;요리를 삽입합니다. 챔버을 위해 도움을 물을 모방하여 샘플을 가득 이미징 요리, 충분히 예열 및 안정화된다. 예열 멸균 수와 실 충진온도 안정에 필요한 시간을 감소시키고, 시험 물질의 첨가시의 온도 저하를 최소화한다. </li></ol></li></ol> 5. 현미경 셋업 <ol><li> 현미경, 관련 컴퓨터 및 필요한 주변 장치의 전원을 켭니다. <ol><li> 광원에 따라 필요할 때까지 전원을 켜 기다릴 (예., LED). </li></ol></li><li> 낮은 위치에 대물 터릿으로 사용될 20X 0.7 NA 대물 렌즈를 선택한다. </li><li> 대물 위에 시료를 놓고 -이 샘플 챔버 내에있을 때 쉽게 셀을 찾을 수 있도록한다. </li><li> 이들은 이전 실험으로부터 공지되어있는 경우,이 시점에서 촬상 파라미터를 정의한다. </li></ol> 6. 현미경 챔버에 세포를 운반 <ol><li> 운송 세포 환경 챔버로 인큐베이터에서 이미지화한다. 이 비교적 낮은 CO 2의 효과를 제한하기 위해 신속하게 수행되었는지 확인 </서브&gt; 분위기는 세포에 온도를 감소. 샘플 운송 및 유출의 경우 청소에 대한 모든 제도적 바이오 안전성 가이드 라인을 따르십시오. <ol><li> 큰 환경 변화를 방지하기 위해 밀봉 된 스티로폼 용기 또는 절연 가방에 세포를 놓습니다. </li></ol></li><li> 제조업체의 지침에 따라 챔버에 샘플 영상 접시를 삽입합니다. </li><li> 세포는 환경 챔버 내에 확보 한 후, 안정된 환경을 유지하고 즉시 분위기 가스의 소스 (S)에 설정하는 챔버를 밀봉. <ol><li> 일부 환경 챔버 타이트한 밀봉 덮개를 사용하지 않기 때문에, 성장 배지 위에 증착 멸균 층, 배아 인증 미네랄 오일을 지연한다. 유리 이미징 영역을 방해하지 않도록주의 샘플 접시의 경계-가장자리 주위 가스 투과 파라핀 필름 랩. 지역화 보조 가습 수단을 이용할 수있다. perfor을 감소 할 수있는 샘플 접시의 뚜껑에 응축명 시야 현미경 mance. </li></ol></li><li> 초기 실험 기간 동안 열 드리프트의 영향을 최소화하기 위해, 시간 경과를 시작하기 전에 30 분 동안 기다린다. 필요한 시간은 영상 접시 크기 및 기타 요인에 따라 달라집니다. 경험적으로 결정합니다. </li></ol> 7. 이미지 설정 <ol><li> 최선의 데이터를 나타냅니다 선택 이미징 조건. , 노출 시간을 제한 낮은 강도의 빛을 이용하여 빛의 긴 파장에 의해 여기되는 프로브를 선택하여 광독성을 방지하기 위해 조치를 취하십시오. </li><li> 각 위치에 대하여 X, Y 및 Z 평면 원하는 파장 (들)을 정의하는 묘화한다. 시간 해상도 위치와 파장의 개수에 의해 제한된다. 대부분의 세포 과정의 장기간의 시간 경과의 경우, 하나의 화상마다 취득 10 - 20 분; 높은 시간 해상도 (짧은 간격, 예. 1 분) 이상의 데이터 포인트 때문에보다 강력한 세포 추적을 제공 할뿐만 아니라 더 통합 결과빛 노출과 큰 데이터 세트. <ol><li> - 50 밀리 초, 텍사스 레드 / TRITC - 40 밀리 초, 브라이트 - 20 밀리 초 FITC / GFP : HT1080 FUCCI 동적 녹색과 적색 형광 단백질을 가지고 (대표 결과를 참조), 다음 노출 시간을 사용합니다. 2 × 2 빈을 사용합니다. </li></ol></li><li> 고급 설정에서 기본 매개 변수를 사용하여 소프트웨어 제어 자동 초점을 사용합니다. 권장 스텝 크기 10 μm의의 자동 초점 범위를 정의합니다. 시간 경과를 시작하기 전에이 작업을 수행해야합니다. 시야 이미지 자동 초점 결코 형광 광독성 및 광표백을 줄일 수 있습니다. <ol><li> 전동 무대와 모든 현미경에 소프트웨어 제어 자동 초점 시스템을 사용하여, 직접 샘플에 초점을 맞 춥니 다. 그러나, 실험의 인수 속도를 제한 할 수있다. 연속 초점 시스템이 더 위치를 허용, 시간 경과 현미경 잘 작동 속도를 향상 제어 하드웨어 이미징 또는 취득의 높은 비율합니다. 그러나공기 유리 인터페이스의 검출에 의존 우물에서 유리 두께의 변화와 샘플의 초점을 잃을 수 있습니다. </li></ol></li><li> 미디어 O 37 ℃로 가온 한 원하는 약물 농도를 함유하는 매체의 절반을 교체 일부 미디어 교체 열 드리프트를 줄일 수 있습니다. 이 실험의 조건은 차량 (DMSO), 1 μM의 selinexor 10 μM PD0332991이다. 참고 :이 단계는 또한 일시 중지 및 실험을 다시 시작하여 인수를 시작한 후 수행 할 수 있습니다. 이 단일 세포의 사전 및 사후 약물 반응의 종 추적 할 수 있습니다. 약물의 안정성이나 신진 대사하다면 일시 중지하고 미디어가 동일한 방법으로 수행 할 수 있습니다 대체 관심사입니다. 약물 분해 또는 신진 대사를 테스트하기 위해, 처리 된 세포의 미디어는 약물 작용을 테스트하는 순진 세포에 배치 할 수 있습니다. </li><li> 시간 경과를 시작합니다. </li><li> 시간 경과가 실행됨에 따라 이미징 필드가 초점과 chambe에 남아 있는지 확인r은 습기 (37) 오 C.을 유지 <ol><li> 시점 사이의 시간 간격 동안 획득을 일시 중지하여 필요에 따라 포커스를 조정한다. </li></ol></li><li> 필요한 경우, 더 이상 실험 동안 챔버에 물을 추가 할 수 있습니다. O 37 ℃에서 미리 가온 멸균 증류수를 첨가하여 냉각 실 피 </li></ol> 8. 시간 경과 종료 <ol><li> 실험이 실행을 완료하면이 자동으로 중지로 설정되지 않은 경우, 인수를 중지합니다. </li><li> 제대로 데이터가 손실 될 수 있습니다 완료되지 않은 경우 대부분의 소프트웨어 패키지를 자동으로 수집하는 동안 저장되지만 시간 경과가 하드 드라이브에 제대로 저장되었는지 확인하십시오. </li><li> 현미경에서 챔버를 제거하고 승인 기관 바이오 안전성 절차에 따라 생물학적 위험 폐기물로 세포를 폐기하십시오. </li></ol> 9. 종 추적 및 분석 시간 경과 데이터의 <ol><li> 인 분석을위한 방법론을 선택관심있는 생물학적 과정에 적합합니다. 많은 ImageJ에 대한 플러그인, 매트랩을 사용하는 프로그램 및 사용자 지정 플랫폼은 특정 애플리케이션을 위해 제작되었습니다. 도 4 및도 5에 설명 된대로 다음 방법은 핵 핵 형광 프로브의 분석의 추적을 포함한다. </li><li> ImageJ에의 활용 채널에 대한이 .tif 이미지 스택을 엽니 다. 또는, Bioformats 플러그인을 사용하여 직접 ImageJ에의 수집 프로그램에서 열려있는 기본 파일입니다. </li><li> 시야 이미지 또는 (사용 된 경우) 핵 라벨 채널을 사용하여 하나의 세포의 핵 내에서 ROI (region of interest)를 치고, ROI 관리자에 추가. 주 : 묘화 세포 핵 라벨이있는 경우 (예를 들어, 히스톤 H2B-EGFP.) 다음, 자동 세포 추적 시간을 통해 관심 (로아) 각각의 핵을 표현 영역을 만드는 데 사용될 수있다. </li><li> 다음에, 시점을 진행하고 동일한 nucleu 내에서 ROI의 위치를에스. 투자 수익 (ROI) 관리자에게 투자 수익 (ROI)을 추가합니다. </li><li> 추적 셀룰러 이벤트 (분열, 세포 사멸, 등.) 또는 셀이 더 이상 추적 될 수 없다있을 때까지 개별 셀 로아을 계속 (즉., 프레임 밖으로 이동하거나 실험이 종료 됨). </li><li> 로아 그들이 필드에있는 시간을 통해 세포 확립되었을 때, 관심있는 형광체에 채널을 중첩. 각 시점에 대한 각 채널의 평균 형광 강도를 측정한다. 나중에 사용하기 위해 ROI 목록을 저장합니다. <ol><li> 각종 측정은 다른 실험에서 애플리케이션에 대한 ROI 내에서 이루어질 수있다. (예. 투자 수익 (ROI), 통합 강도 등 내 강도를 의미한다.) 분석 방법을 선택하는 메뉴가 나타납니다 ... 분석 → 설정 측정을 클릭합니다. </li></ol></li><li> 추적하는 동안 각각의 세포에 대한 세포의 운명 (예., 세포 사멸, 분할, 생존을) 참고. 이것은 생존 곡선과 furthe의 생성을 허용R 인구 분석. </li><li> 두 채널에 대한 평균 강도, 치료제 (그림 5B, C)에 반응하여 세포주기 역학을 표시하는 산점도를 만들 수 있습니다. 주 : 플롯 시간 동안 각 셀에 대해 생성되거나 추적 세포 집단을 통해 평균화 될 수있다. 양적 이미징은 암 치료법에 응답하여 복잡한 세포 반응 관계를 구축 중요 할 수있다. 장기간 경과 현미경 길이 추적 및 데이터 분석 현미경 및 분석 도구의 유형을위한 많은 옵션, 다단계 공정이며,도 1에 제공된 일반적인 개요를 따른다. </li></ol>

The authors have no conflicts of interest to disclose.

시간 경과 현미경 및 종 추적의 장점 이 연구자들은 각 셀 그들의 운명뿐만 아니라 전체 모집단을 추적 할 수 있도록, 상기 현미경은 약물 반응 종의 연구를위한 이상적인 도구이다. 세포 집단 내에서 약물 반응의 다양성은 항암 치료 설계를위한 중요한 문제입니다. 단일 세포의 종 추적 수사관이 변화를 관찰하고 세포 인구에 관한로서 기본 메커니즘과 결과를 이해하기 시작 할 수 있습니다. 형광 프로브의 다양한 활용하여 관찰하고 일반적인 희귀 응답 표현형 모두를 이해하는 방법의 군중을 제공한다. 인구 응답 타이밍과 다른 세포 운명의 기여는, 치료시 세포주 또는 국가 간의 응답의 특정 표현형과 운명, 그리고 차이 사이의 관계를 배울 수있는 예입니다. 많은 암 관련 프로세스를 연구 할 수있다. 이 문서에서 강조되지 않은 일부는 세포 사멸, 자식 작용과 세포 사멸 및 괴사 기자 39-42, 세포 침공 43, 44, 및 세포 운명 결정 (27)을 결정 p53의 역학을 포함한다. 또한,이 방법은 항암 치료제의 연구 조사에 한정되지 않는다. 같은 원리 48 신호 유사 분열 (45) 세포 골격 역학 (46, 47)와 세포를 포함한 다른 많은 생물학적 과정을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 시간 경과 형광 현미경은 단백질과 관심의 분자의 현지화 및 강도 데이터를 제공 할 수 있습니다. 뿐만 아니라, 약물 반응에 중요한 단백질 레벨의 변화가 있지만, 세포 내 단백질의 적절한 (또는 부적절한) 버전 이해 응답 중요하다. 시간 경과 현미경 (단백질 지역화 된 위치에 대한 데이터를 제공합니다 예., 핵, 세포질, 특정 세포 기관,등.) 약물 치료 방법과 현지화 및 전체 레벨이 단일 셀과 인구 수준에서 시간이 지남에 따라 변경 후. 도전과 한계 시간 경과 현미경 및 단일 세포의 종 방향 분석의 장점에도 불구하고, 한계가있다. 형광 기자는 안정성과 특이성에 의해 제한됩니다. 형광 융합 단백질을 설계 할 때, 광 안정 밝 프로브를 선택하는 것이 중요하지만, 그 정상적인 기능을 제대로 지역화 능력에 관한 관심의 단백질에 연결되는 형광 물질의 효과를 고려하는 것도 필요 . 이러한 문제는 다른 곳에서 자세히 설명되어 있고 15,49,50 출판 된 많은 사용 가능한 형광 태그 단백질이있다. 기타 형광 라벨 또는 태그를 세포에 첨가 할 수있어,주의가 독성되지 않도록주의해야한다. 우리의 경험에서,이 페이지가운은, 예를 들어 미토콘드리아 라벨 (막 전위) 또는 세포 투과성 DNA 염료를 들어, 쉽게 표백하는 경향으로 인해 세포 증식에​​ 희석 아웃 될 것입니다. 또한, 성장 및 현미경에 세포를 관찰 많은 기술적 인 어려움이있다. 온도, 습도, 분위기, 광 불안정성에 관해서는 데이터 손실 또는 심지어 전체 실험의 결과, 세포에 많은 영향을 미칠 것이다. 촬상에 대한 안정성 문제 무비 1 및 2에서 볼 수있다. 이러한 효과는 (4.2 참조) 파라핀 필름의 사용을 통해 최소화 할 수있다. ImageJ에 (NIH)을 이용하여, 예를 들어 사후 - 취득 처리 가능한 이미지 안정화 알고리즘도있다. 종종 간과 장기간 경과의 양태는 데이터 관리 및 파일 크기이다. 데이터 비닝 경우에도, 하나의 시간 경과 실험 30 기가 바이트를 초과 많다. 대용량, 고속의 신뢰성있는 데이터의 저장 및 전송이 강한LY는 격려했다. 몇 군데되는 형광 바이오 센서 (들)에 따라, 예를 들면 핵이나 세포질 센서 전체 해상도 이미지를 획득하는 것이 필요하지 않습니다. 가능하면 우리는 쉽게 발생하는 데이터, 덜 까다로운 컴퓨팅 요구, 개선 된 작업 흐름으로 작은 일을 지정 크기가 파일을 유지하는 조치를 취하도록 권장합니다. 장기적으로 시간 경과 현미경을 수행 할 때 광독성 주요 관심사입니다. 높은 강도의 빛과 긴 노출 형광 프로브, 세포 스트레스와 세포 사멸의 photobleaching에 발생할 수 있습니다. 이러한 효과는 데이터에 큰 영향을 미칠 및 실험의 부실로 이어질 수 있습니다. 카메라 비닝 및 이득은 노출 시간을 감소 시키는데 사용될 수있다. 광로에 감광 필터가 샘플에 빛의 강도를 감소시킨다. 이미지에 사용되는 빛의 파장은 세포에 영향을 미칠 것입니다. 짧은 파장 (UV, 근처 UV)은 세포에 더 많은 손상하고보다 빠른 속도로 사진 표백 결과긴 파장 (예., 빨강, 멀리 빨간색). 목표의 선택은 조건 이미징에 영향을 줄 수 있습니다. 높은 개구 수 (NA)의 렌즈보다 높은 해상도의 이미지를 생성하지만, 높은 배율 적은 광이 높은 노광 배 이상 강한 빛 얻어진 샘플로부터 송신 할 수있다. 목적은 오버 샘플링없이 관심의 개체를 해결할 적절한 NA 및 배율을 선택해야합니다. 많은 경우, 가장 높은 목표는 가장 적절한 선택이 아닐 수있다. 더 많은 필드가 원하는 객체의 해상도를 손상시키지 않고, 효과적으로 샘플 크기를 증가 캡처 할 핵 프로브 (도 4, 5)으로 저배율의 목적은 허용한다. 세 가지 차원에서 장기 시간 경과로 인해 통합 된 빛의 노출에 조심스럽게 수행해야합니다. 회전하는 디스크 공 초점 현미경, 민감한 카메라를 사용 (예., EM-CCD) 카메라 이득 및 z 시리즈에 대한 빠른 압전 모터는 suggeste입니다d를 빛 노출을 줄일 수 있습니다. 고속 Z 계 획득은 획득주기 동안 발생하는 세포 이동 및 역학 때문에 모션 아티팩트를 최소화하는 것이 중요하다. 많은 서로 다른 설정을 이용하여 미처리 세포의 경험적 분석은 특정 세포주에서 또는 리포터 형광의 효과를 결정하는데 유용 할 수있다. 또한, 처리되지 않은 대조군은 실험 설정의 세포 독성 효과를 결정하기 위해 각각의 실험에 포함되어야한다. 기술의 변화 장기 시간 경과는 강력하고 매우 유연합니다. 공동 배양 기술, 다른 세포주 또는 상이한 리포터 발현 같은 세포주를 사용하는 것이 이용 될 수있다. 이것의 한 예는 뛰어난 항암 약물에 반응 죽어 표적 세포와 대 식세포를 묘화한다. 또 다른 예는 약 순 인접 셀에 셀 응답의 영향을 연구 할 수 있었다. 사진 ACTIVA와 결합teable, 사진 변환 및 사진 전환 형광 단백질, 특정 효과를 유발하는 빛에 의해 활성화 될 수있는 설계 단백질 (예., KillerRed)는 많은 가능성이있다. 더 복잡한 방법은, 예컨대, 포스터 공명 에너지 전달 (FRET)을 photobleaching에 후 형광 재분배, 슈퍼 해상도 (예., 확률 광학 재구성 ​​현미경 (STORM) 구조 조명 현미경 (SIM)과 같은 현미경의 다양한 특화된 형태를 사용하는 것이 사용될 수있다 또는 유도 방출 고갈 (STED)), 및 많은 다른 사람과 장점과 각 방법의 제한이 있습니다. 장기 (예., 주, 월) 반응 및 약물 제거 후 세포의 회복은 항암 약물 작용을 이해하는 핵심이다. 격자 유리 바닥 요리 반복적으로 인구 / 지역 내의 특정 세포 또는 지역을 모니터링 할 수있는 유용한 도구입니다. 예를 들어, 리딩 된 접시 초기 DRUG 반응 약물을 제거 할 수 있고, 시간 경과를 사용하여 이미지화 될 수 있고, 그리드의 특정 영역을 원하는 시점에서 시간이 지남에 이미징 또는 추가 시간 경과를 실시 할 수있다. 접시에 유리 저부 스크라이브 도구 중 절단하거나 상업적 시약을 사용하여 제거 될 수 있고, 유리 셀은, 예를 노화 관련 β-galactocidase 활동에 대한 관심의 다른 마커에 대해 염색 할 수 있으며, 비교 시간 경과 세포가이 상태에 도달하는 방법의 역사를 이해합니다. 세포 집단이 충분히 큰 경우도 면역의 대상 또는 유세포있다. 두꺼운 샘플은 전통적으로 다양한 겔 물질 및 매트릭스의 예 타원체를 들어, 이미지에 어려웠다. 새로운 셀은 항암 치료제에 반응하는 방법 시츄 이해에서 행 방식을 확장하는 데 사용할 수있는 형광 공 초점 또는 다중 광자 현미경 16,18,19,51 등 접근한다. 그만큼자체 연구와 우리가 항암 약물을 사용하는 우리의 능력을 개선하는 데 도움이됩니다 단일 세포의 약물 동력학에 대한 이해를 개발하는쪽으로 이동되는 24,52-54 명확하게 보여 항암 약물 반응을 연구하기 위해 시간 경과를 사용하여 과학자의 수가 증가 보다 효과적이고, 아마 항암 약물 반응을 예측한다.

라이브 세포 현미경 단셀 길이 추적 새로운 기술이 아니다. 최초의 현미경에서 매니아와 과학자들은 하나의 세포와 생물, 자신의 행동, 개발 1-3을 관찰하고 연구 하였다. 1950 년대에 밴더빌트 대학에서 후반 데이비드 로저스에서 유명한 예는 황색 포도상 구균 박테리아와 식균 작용 (4) 결국 프로세스를 쫓는 혈액 도말 검사에서 인간의 호중구를 보여줍니다. 이 라이브 셀 영화는 하나의 실험에서 관찰하고 상관 관계를 할 수있는 방법을 여러 프로세스의 우수한 그림이다 : 화학 그라데이션, 역학 및 세포 운동의 속도를 감지, 세포 역학, 접착 및 병원체의 식균 작용을 형성한다. 완전 자동화 현미경 고감도 디지털 카메라들의 출현은 세포 생물학 F까지의 기본적인 질문을 현미경을 사용하여 연구자의 수가 증가 가져왔다세포가 5,6를 이동하고 역학 및 멤브레인 인신 매매 9-11 소기관에 7,8를 분할하는 방법 롬. 비 형광, 1953 년 프리츠 제르 니커의 노벨상을 얻고 위상차 (PC), 미분 간섭 대비를 포함하여 시야 현미경 (DIC) 미세 소관 번들을 포함한 세포와​​ 핵뿐만 아니라 하위 세포 구조의 관찰을 허용 , 염색체, 핵소체, 세포 기관 역학, 두꺼운 액틴 섬유 (12). 유전자 형광 단백질을 인코딩 및 세포 소기관에 대한 형광 염료의 개발은 극적으로 시간 경과 현미경 13-15 영향을하고있다. 이 기사의 초점이 아니라 동안, 세포 타원체와 현장 (생체 내에 현미경) 공 초점 및 광자 현미경을 사용하여 이미징은 접근의 또 다른 확장을 나타내고, 사용하고 이러한 방법 16-19을 논의 뛰어난 기사가있다. 안티 canc에 대한 세포의 반응어 약물이나 천연 제품은 분자 및 세포 규모에 따라 결정됩니다. 이해 세포 반응과 운명 다음 치료는 종종 단일 세포 측정 인구 평균 분석 (예., 면역, 전체 잘 측정), 또는 면역 형광 검출에 고정 된 시간 지점 및 유동 세포 계측법을 포함한다. 집단 내의 약물 단일 세포 반응의 이질성은 종양, 특히 포화에서 동일한 약제로 처리 된 세포주와 종양을 본 반응 다양성의 일부를 설명 할 수있다. 주어진 단일 셀 또는 셀의 인구를 따르지 세로 방법 장기 분자 반응 경로의 직접적인 연구 할 수있는 덜 일반적인하지만 매우 강력한 방법입니다, 서로 다른 표현형 (예., 세포 사멸 또는 세포 분열), 관찰 세포 간 집단 내의 변화 방법 및 이러한 요소 인구 응답 20-22 역학에 기여한다. 낙관적, 수있는관찰과 약물들이 종종 실패하는 이유, 작동, 및 최선의 방법을 사용하는 방법에 대한 우리의 이해를 개선하는 데 도움이됩니다 단일 세포 반응을 정량화한다. 장기적으로 시간 경과 현미경, 종 추적 및 약물 반응의 분석 기술은 많은 연구자에 사용할 수 있으며 표현형 응답 (20, 21)을 관찰하기 만 투과광을 이용하여 간단 할 수있다. 접근법의 주요 구성 요소는 : 관심있는 세포의 적당한 제제 환경 챔버와 자동화 현미경, 카메라가 획득 및 시간 경과를 검토 할 이미지를 저장하고, 소프트웨어를 측정하고, 세포를 분석하는 컴퓨터로 통합 및 형광 바이오 센서. 우리는 시야 및 / 또는 위드 epifluorescent 현미경을 사용하여만큼 몇 일 동안 배양 된 세포의 시간 경과 현미경을 수행하기위한 많은 조언과 자세한 프로토콜을 제공합니다. 배양에서 성장 될 수있는 임의의 세포주를 사용할 수있다이 프로토콜항암 치료에 대한 자신의 반응을 연구합니다. 우리는 수집 된 데이터의 예를 제공하며, 간단하게 다른 프로브 타입의 장점과 장기간 경과 및 종 추적 단점 논의 상이한 유전자 부호화 형광 바이오 센서 및 위상차 현미경의 일례를 분석하여, 어떤 일 수 비 - 직접 접근, 우리가 접근 방식을 사용하여 고려하지 않은 경험이 연구자들에게 관심과 가치가있을 것입니다 희망 약간의 변화에​​서 이해하기 어려운, 경험이 풍부한 연구자하다이 방법에 대해 배웠습니다.

<table><tbody><tr><td>Taxol (paclitaxel)</td><td>Sigma</td><td>T7191</td><td>microtubule stabilizing drug</td></tr><tr><td>Etoposide</td><td>Selleckchem</td><td>S1225</td><td>topoisomerase II inhibitor</td></tr><tr><td>Selinexor</td><td>Karyopharm Therapeutics</td><td>na</td><td>XPO1/CRM1 inhibitor, gift</td></tr><tr><td>Kinesin-5 inhibitor</td><td>Merck Serono</td><td>na</td><td>gift, also available from American Custom Chemicals Corporation. CAS 858668-07-2</td></tr><tr><td>Cell growth medium</td><td>HyClone (Fisher) or Mediatech</td><td></td><td>many companies available</td></tr><tr><td>5% CO2/balance air, certified</td><td>Airgas</td><td>Z03NI7222004379</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Dish, 20 mm glass bottom</td><td>Cellvis</td><td>D35-20-1.5-N</td><td>many companies available</td></tr><tr><td>35 mm 4-well Dish, 20 mm glass bottom</td><td>Cellvis</td><td>D35C4-20-1.5-N</td><td>many companies available</td></tr><tr><td>35 mm Dish, gridded glass bottom</td><td>MatTek</td><td>P35G-2-14-CGRD</td><td>many companies available</td></tr><tr><td>Multi-well, glass bottom</td><td>Cellvis</td><td>P12-1.5H-N</td><td>many companies available</td></tr><tr><td>Olympus IX81 inverted epifluorescence microscope</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX2-UCB controller</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PRIOR LumenPro200</td><td>Prior Scientific</td><td>Lumen200PRO</td><td></td></tr><tr><td>PRIOR Proscan III motorized stage</td><td>Prio Scientific</td><td>H117</td><td></td></tr><tr><td>STEV chamber</td><td>InVivo Scientific</td><td>STEV.ECU.HC5 STAGE TOP</td><td></td></tr><tr><td>Environmental Controller Unit</td><td>InVivo Scientific</td><td>STEV.ECU.HC5 STAGE TOP</td><td></td></tr><tr><td>Hamamatsu ORCA R2 CCD with controller</td><td>Hamamatsu</td><td>C10600</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ti</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon laser launch</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SOLA light engine</td><td>lumencor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iXon Ultra 897 EM-CCD</td><td>ANDOR&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TOKAI HIT inclubation chamber</td><td>TOKAI HIT</td><td>TIZSH</td><td></td></tr></tbody></table>

through the looking glass: time-lapse microscopy and longitudinal tracking of single cells to study anti-cancer therapeutics

항암제에 대한 단 전지의 반응은 모집단 응답을 결정하는데 크게 기여하고, 따라서 전체 결과에서 중요한 요인이다. 면역은 유동 세포 계측법 고정 세포 실험은 종종 세포가 항암제에 반응하는 방법을 연구하는 데 사용됩니다. 이러한 방법은 중요하지만, 몇 가지 단점이 있습니다. 암과 정상 세포간에, 다른 암 유래의 세포 및 과도 희귀 응답 사이의 약물 반응의 다양성 인구 평균 어 세이를 이용하여 직접 추적 종을 분석 할 수없이 이해하기 어렵다. 현미경은 특히 이미지 살아있는 세포에 적합합니다. 기술의 발전뿐만 아니라 세포 추적뿐만 아니라, 세포 반응의 다양한 관찰을 가능하게하는 해상도에서 일상적으로 이미지 세포에 우리를 가능하게한다. 우리의 연속적인 시간 경과 이미징을 허용 자세히 접근 방식을 설명기본적으로 한 일반적으로 96 시간까지 원하는대로에 대한 약물 반응 동안 세포. 접근 방법의 변형을 사용하여, 세포 주에 대해 모니터링 될 수있다. 유전자 인코딩 된 형광 바이오 센서 수많은 프로세스, 경로 및 응답의 고용으로 이어 할 수 있습니다. 우리는 추적 및 세포 성장 및 세포주기 진행 염색체 역학, DNA 손상의 정량화 및 세포 사멸 등을 실시 예를 나타낸다. 우리는 또한 기술과 유연성의 변화를 토론하고 몇 가지 일반적인 함정을 강조 표시합니다.

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Through the Looking Glass: Time-lapse Microscopy and Longitudinal Tracking of Single Cells to Study Anti-cancer Therapeutics

Here, we describe a method of long-term time-lapse microscopy to longitudinally track single cells in response to anti-cancer therapeutics.

유리를 통해 보면 : 시간 ​​경과 현미경 및 단일 세포의 종 추적 항암 치료를 공부하기

The response of single cells to anti-cancer drugs contributes significantly in determining the population response, and therefore is a major contributing ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

10.9K 조회수.  University of Colorado, Boulder. Here, we describe a method of long-term time-lapse microscopy to longitudinally track single cells in response to anti-cancer therapeutics.

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A Time-lapse, Label-free, Quantitative Phase Imaging Study of Dormant and Active Human Cancer Cells

The acquisition of the angiogenic phenotype is an essential component of the escape from tumor dormancy. Although several classic in vitro assays (e.g., proliferation, migration, and others) and in vivo models have been developed to investigate and characterize angiogenic and non-angiogenic cell phenotypes, these methods are time and labor intensive, and often require expensive reagents and instruments, as well as significant expertise. In a recent study, we used a novel quantitative phase imaging (QPI) technique to conduct time-lapse and labeling-free characterizations of angiogenic and non-angiogenic human osteosarcoma KHOS cells. A panel of cellular parameters, including cell morphology, proliferation, and motility, were quantitatively measured and analyzed using QPI. This novel and quantitative approach provides the opportunity to continuously and non-invasively study relevant cellular processes, behaviors, and characteristics of cancer cells and other cell types in a simple and integrated manner. This report describes our experimental protocol, including cell preparation, QPI acquisition, and data analysis.

Dormant and active cancer cell phenotypes were characterized using quantitative phase imaging. Cell proliferation, migration, and morphology assays were integrated and analyzed in one simple method.

시간 레이블, 양적 위상 이미징 휴면 하 고 적극적인 인간 암 세포의 연구

The acquisition of the angiogenic phenotype is an essential component of the escape from tumor dormancy. Although several classic in vitro assays (e.g., ...

연구

암 연구학

Long-term Live-cell Imaging to Assess Cell Fate in Response to Paclitaxel

Live-cell imaging is a powerful technique that can be used to directly visualize biological phenomena in single cells over extended periods of time. Over the past decade, new and innovative technologies have greatly enhanced the practicality of live-cell imaging. Cells can now be kept in focus and continuously imaged over several days while maintained under 37 &#176;C and 5% CO2 cell culture conditions. Moreover, multiple fields of view representing different experimental conditions can be acquired simultaneously, thus providing high-throughput experimental data. Live-cell imaging provides a significant advantage over fixed-cell imaging by allowing for the direct visualization and temporal quantitation of dynamic cellular events. Live-cell imaging can also identify variation in the behavior of single cells that would otherwise have been missed using population-based assays. Here, we describe live-cell imaging protocols to assess cell fate decisions following treatment with the anti-mitotic drug paclitaxel. We demonstrate methods to visualize whether mitotically arrested cells die directly from mitosis or slip back into interphase. We also describe how the fluorescent ubiquitination-based cell cycle indicator (FUCCI) system can be used to assess the fraction of interphase cells born from mitotic slippage that are capable of re-entering the cell cycle. Finally, we describe a live-cell imaging method to identify nuclear envelope rupture events.

Live-cell imaging provides a wealth of information on single cells or whole populations that is unattainable by fixed cell imaging alone. Here, live-cell imaging protocols to assess cell fate decisions following treatment with the anti-mitotic drug paclitaxel are described.

장기 라이브 셀 이미징 셀 운명 Paclitaxel에 대 한 응답에서을 평가 하

Live-cell imaging is a powerful technique that can be used to directly visualize biological phenomena in single cells over extended periods of time. Over ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized treatment determination. However, perturbation of the tumor architecture by biopsy and other invasive procedures has been associated with undesired effects on tumor progression, which need to be studied in depth to further improve the clinical benefit of these procedures. Conventional static approaches, which only provide a snapshot of the tumor, are limited in their ability to reveal the impact of biopsy on tumor cell behavior such as migration, a process closely related to tumor malignancy. In particular, tumor cell migration is the key in highly aggressive brain tumors, where local tumor dissemination makes total tumor resection virtually impossible. The development of multiphoton imaging and chronic imaging windows allows scientists to study this dynamic process in living animals over time. Here, we describe a method for the high-resolution longitudinal imaging of brain tumor cells before and after a biopsy in the same living animal. This approach makes it possible to study the impact of this procedure on tumor cell behavior (migration, invasion, and proliferation). Furthermore, we discuss the advantages and limitations of this technique, as well as the ability of this methodology to study changes in the cancer cell behavior for other surgical interventions, including tumor resection or the implantation of chemotherapy wafers.

Here we describe a method for high-resolution time-lapse multiphoton imaging of brain tumor cells before and after invasive surgical intervention (e.g., biopsy) within the same living animal. This method allows studying the impact of these invasive surgical procedures on tumor cells&#39; migratory, invasive, and proliferative behavior at a single cell level.

침략적인 외과 생검에 응하여 뇌종양 세포 행동의 경도 내 활력 화상 진찰

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

Time-Lapse 2D Imaging of Phagocytic Activity in M1 Macrophage-4T1 Mouse Mammary Carcinoma Cells in Co-cultures

Tumor-associated macrophages (TAMs) have been identified as an important component for tumor growth, invasion, metastasis, and resistance to cancer therapies. However, tumor-associated macrophages can be harmful to the tumor depending on the tumor microenvironment and can reversibly alter their phenotypic characteristics by either antagonizing the cytotoxic activity of immune cells or enhancing anti-tumor response. The molecular actions of macrophages and their interactions with tumor cells (e.g., phagocytosis) have not been extensively studied. Therefore, the interaction between immune cells (M1/M2-subtype TAM) and cancer cells in the tumor microenvironment is now a focus of cancer immunotherapy research. In the present study, a live cell coculture model of induced M1 macrophages and mouse mammary 4T1 carcinoma cells was developed to assess the phagocytic activity of macrophages using a time-lapse video feature using phase-contrast, fluorescent, and differential interference contrast (DIC) microscopy. The present method can observe and document multipoint live-cell imaging of phagocytosis. Phagocytosis of 4T1 cells by M1 macrophages can be observed using fluorescent microscopy before staining 4T1 cells with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE). The current publication describes how to coculture macrophages and tumor cells in a single imaging dish, polarize M1 macrophages, and record multipoint events of macrophages engulfing 4T1 cells during 13 h of coculture.

Macrophage phagocytic activity against cancer cells, specifically 4T1 mouse mammary carcinoma cells, was imaged in this study. The live cell coculture model was established and observed using a combination of fluorescent and differential interference contrast microscopy. This assessment was imaged using imaging software to develop multipoint time-lapse video.

M1 대식세포-4T1 마우스 유방 암암 세포에서 식세포 활동의 타임랩스 2D 이미징

Tumor-associated macrophages (TAMs) have been identified as an important component for tumor growth, invasion, metastasis, and resistance to cancer ...

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional co-culture systems are frequently used to explicate tumor-stroma interactions, including their role in drug responses. However, many of the interactions that occur in vivo in the intact microenvironment cannot be completely replicated in these in vitro settings. Thus, direct visualization of these processes in real-time has become an important tool in understanding tumor responses to therapies and identifying the interactions between cancer cells and the stroma that can influence these responses. Here we provide a method for using spinning disk confocal microscopy of live, anesthetized mice to directly observe drug distribution, cancer cell responses and changes in tumor-stroma interactions following administration of systemic therapy in breast cancer models. We describe procedures for labeling different tumor components, treatment of animals for observing therapeutic responses, and the surgical procedure for exposing tumor tissues for imaging up to 40 hours. The results obtained from this protocol are time-lapse movies, in which such processes as drug infiltration, cancer cell death and stromal cell migration can be evaluated using image analysis software.

We describe a method for imaging response to anti-cancer treatment in vivo and at single cell resolution.

유방암의 마우스 모델에서 종양 Microenvironment에 약물 응답의 영상을 라​​이브

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

의학

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from different genetically engineered mouse models of breast cancer. For example, time between cell divisions (cell lifetimes), apoptotic cell numbers, evolution of morphological changes, and mechanism of colony formation can be quantified and compared in cells carrying specific genetic lesions. Primary mammary epithelial cell cultures are generated from mammary glands without palpable tumor. Glands are carefully resected with clear separation from adjacent muscle, lymph nodes are removed, and single-cell suspensions of enriched mammary epithelial cells are generated by mincing mammary tissue followed by enzymatic dissociation and filtration. Single-cell suspensions are plated and placed directly under a microscope within an incubator chamber for live-cell imaging. Sixteen 650 &mu;m x 700 &mu;m fields in a 4x4 configuration from each well of a 6-well plate are imaged every 15 min for 5 days. Time-lapse images are examined directly to measure cellular behaviors that can include mechanism and frequency of cell colony formation within the first 24 hr of plating the cells (aggregation versus cell proliferation), incidence of apoptosis, and phasing of morphological changes. Single-cell tracking is used to generate cell fate maps for measurement of individual cell lifetimes and investigation of cell division patterns. Quantitative data are statistically analyzed to assess for significant differences in behavior correlated with specific genetic lesions.

Time-lapse imaging is used to assess behavior of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer risk to determine if there are correlations between specific behavioral parameters and distinct genetic lesions.

기본 Preneoplastic 유방 상피 세포의 시간 경과 영상은 유방암의 유전자 변형 마우스 모델에서 파생

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

siRNA Transfection 후의 유사 분열의 시간 저속 영상

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

생물학

Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and metastasis. Multicellular interactions in the tumor microenvironment can lead to transient events including directional tumor cell motility and vascular permeability. Quantification of tumor vascular permeability has frequently used end-point experiments to measure extravasation of vascular dyes. However, due to the transient nature of multicellular interactions and vascular permeability, the kinetics of these dynamic events cannot be discerned. By labeling cells and vasculature with injectable dyes or fluorescent proteins, high-resolution time-lapse intravital microscopy has allowed the direct, real-time visualization of transient events in the tumor microenvironment. Here we describe a method for using multiphoton microscopy to perform extended intravital imaging in live mice to directly visualize multicellular dynamics in the tumor microenvironment. This method details cellular labeling strategies, the surgical preparation of a mammary skin flap, the administration of injectable dyes or proteins by tail vein catheter and the acquisition of time-lapse images. The time-lapse sequences obtained from this method facilitate the visualization and quantitation of the kinetics of cellular events of motility and vascular permeability in the tumor microenvironment.

This protocol describes the use of multiphoton microscopy to perform extended time-lapse imaging of multicellular interactions in real time, in vivo at single cell resolution.

종양 미세 환경에서 실시간 다세포 역학의 확장 시간 경과 생체 내에 영상

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and ...

Live Imaging Followed by Single Cell Tracking to Monitor Cell Biology and the Lineage Progression of Multiple Neural Populations

Understanding the mechanisms that control critical biological events of neural cell populations, such as proliferation, differentiation, or cell fate decisions, will be crucial to design therapeutic strategies for many diseases affecting the nervous system. Current methods to track cell populations rely on their final outcomes in still images and they generally fail to provide sufficient temporal resolution to identify behavioral features in single cells. Moreover, variations in cell death, behavioral heterogeneity within a cell population, dilution, spreading, or the low efficiency of the markers used to analyze cells are all important handicaps that will lead to incomplete or incorrect read-outs of the results. Conversely, performing live imaging and single cell tracking under appropriate conditions represents a powerful tool to monitor each of these events. Here, a time-lapse video-microscopy protocol, followed by post-processing, is described to track neural populations with single cell resolution, employing specific software. The methods described enable researchers to address essential questions regarding the cell biology and lineage progression of distinct neural populations.

A robust protocol to monitor neural populations by time-lapse video-microscopy followed by software-based post-processing is described. This method represents a powerful tool to identify biological events in a selected population during live imaging experiments.

영상 모니터 세포 생물학과 여러 신경 인구의 계보 진행을 추적 하는 단일 셀 다음 라이브

Understanding the mechanisms that control critical biological events of neural cell populations, such as proliferation, differentiation, or cell fate ...

신경과학

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

Conventional imaging techniques can provide detailed information about cellular processes. However, this information is based on static images in an otherwise dynamic system, and successive phases are easily overlooked or misinterpreted. Live-cell imaging and time-lapse microscopy, in which living cells can be followed for hours or even days in a more or less continuous fashion, are therefore very informative. The protocol described here allows for the investigation of the fate of chemotherapeutic nanoparticles after the delivery of doxorubicin (dox) in living cells. Dox is an intercalating agent that must be released from its nanocarrier to become biologically active. In spite of its clinical registration for more than two decades, its uptake, breakdown, and drug release are still not fully understood. This article explores the hypothesis that lipid-based nanoparticles are taken up by the tumor cells and are slowly degraded. Released dox is then translocated to the nucleus. To prevent fixation artifacts, live-cell imaging and time-lapse microscopy, described in this experimental procedure, can be applied.

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

Live-cell imaging is a powerful tool to visualize dynamic processes. The examination of fixed cells provides only static pictures, which can lead to misinterpretation and confusion about the process. This work presents a method to study uptake, drug release, and intracellular localization of liposomal nanoparticles in living cells.

사용 하 여 체 외에서 전달 Chemotherapeutics 탐험 라이브 셀 이미징 지질 기반 나노 입자에 의해

Conventional imaging techniques can provide detailed information about cellular processes. However, this information is based on static images in an ...

유리를 통해 보면 : 시간 경과 현미경 및 단일 세포의 종 추적 항암 치료를 공부하기

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

시간 레이블, 양적 위상 이미징 휴면 하 고 적극적인 인간 암 세포의 연구

장기 라이브 셀 이미징 셀 운명 Paclitaxel에 대 한 응답에서을 평가 하

침략적인 외과 생검에 응하여 뇌종양 세포 행동의 경도 내 활력 화상 진찰

M1 대식세포-4T1 마우스 유방 암암 세포에서 식세포 활동의 타임랩스 2D 이미징

유방암의 마우스 모델에서 종양 Microenvironment에 약물 응답의 영상을 라이브

기본 Preneoplastic 유방 상피 세포의 시간 경과 영상은 유방암의 유전자 변형 마우스 모델에서 파생

siRNA Transfection 후의 유사 분열의 시간 저속 영상

종양 미세 환경에서 실시간 다세포 역학의 확장 시간 경과 생체 내에 영상

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M1 대식세포-4T1 마우스 유방 암암 세포에서 식세포 활동의 타임랩스 2D 이미징

유방암의 마우스 모델에서 종양 Microenvironment에 약물 응답의 영상을 라​​이브

기본 Preneoplastic 유방 상피 세포의 시간 경과 영상은 유방암의 유전자 변형 마우스 모델에서 파생

siRNA Transfection 후의 유사 분열의 시간 저속 영상

종양 미세 환경에서 실시간 다세포 역학의 확장 시간 경과 생체 내에 영상

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