우리는 기술 지원 J. Cappellani와 J. 키우 감사드립니다. 이 작품은 국립 암 연구소 (U01 CA141451), 스타 암 컨소시엄, 치료를위한 수잔 G. 코멘 유방암, ME에 유방암 반대 Manhasset 여성 연합 방지를 위해 롱 아일랜드 2 일 워크와의 자금에 의해 지원되었다 Congressionally 감독 유방암 연구 프로그램에서 미리 박사 교제, ESNESN에 미국은 또한 생명 과학의 왓슨 스쿨에서 레슬리 C. 빠르고 윌리엄 랜돌프 허스트 재단 동지의 수상자이다. 하는 노르웨이의 연구위원회 (160698/V40 및 151,882) 및 남동부 지역 보건 당국 (2,007,060)의 자금에 의해 지원되었다.

<ol>
	<li>Egeblad, M., Nakasone, E. S., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumors+as+organs:+complex+tissues+that+interface+with+the+entire+organism.">Tumors as organs: complex tissues that interface with the entire organism.</a> Dev. Cell. 18, 884-901 (2010).</li><li>Ahn, G. -. O., Tseng, D., Liao, C. -. H., Dorie, M. J., Czechowicz, A., Brown, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Mac-1+(CD11b/CD18)+enhances+tumor+response+to+radiation+by+reducing+myeloid+cell+recruitment.">Inhibition of Mac-1 (CD11b/CD18) enhances tumor response to radiation by reducing myeloid cell recruitment.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 8363-8368 (2010).</li><li>Tlsty, T. D., Coussens, L. 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저자는 공개 할 관심 충돌이 없습니다. 모든 동물 실험은 IACUC 승인 프로토콜에 따라 실시되었다.

생체의 조직 요법에 대한 종양의 반응은 microenvironment의 급성 반응 및 재발 5를 동시에 영향을 미치는으로 체외에서 암 세포의 자에게 크게 다를 수있다. 생체의 chemoresistance 경로에 explicating에 가장 큰 장애물 중 하나는 암 세포와 microenvironment 사이의 상호 작용의 복잡성입니다. 특히, 고체 종양은 암과 같은 안티 - 암 치료시 발생하는 세포 죽음 stromal 세포, 하나의 구성 요소의 섭동, 사이의 균형을 개발했기 때문에, 조직 조직에 드라마틱 한 효과가 발생할 수 있습니다. 여기에 제공된 intravital 이미징 기술은 안티 - 암 약물 치료를하는 동안 라이브, anesthetized 마우스의 종양에서 암 세포 기질 상호 작용의 직접적인 시각화 할 수 있습니다. 우리는 (17을 참조하십시오 상대 제한된 침투 깊이가 회전 디스크 공 촛점 현미경을 사용 </)&gt;를 한모금,하지만 우리 수술 및 라벨 기술이 현미경 다른 종류의와 함께 사용할 수 있습니다. 이 실험에서 얻은 영화는 형광 강도의 변화 (예를 들어 세포 죽음의 표시 인구 나 유도의 침투로 인해), 세포 운동성, injectables의 배포 (혈관 누출을 추적 할 수 등), 그리고 공동을 포함 프로세스를 추적하는 데 사용할 수 있습니다 형광 신호 5,12,17,20의 국산화. 우리는 정기적으로 이미지 6 이상 시간 마우스 및 18 세 이상 시간도 수행 이미징. 이 이러한 긴 시간 동안 지속적으로 마취 하에서 쥐를 유지해야합니다. 적절한 마취를 통해 우리 동물의 90 % 이상이 6 시간 생존, 약 80 %가 18시간 이상 생존. 장기 마취를 수행하는 방법에 대한 자세한 내용은 이전에 19 게시했습니다. 우리의 경험에서 다섯 요소가 중요합니다 : u는, 저체온증 피하고 탈수를 피하고 생리 혈액 산소 포화 수준을 유지isoflurane에 대한 humidified 캐리어 가스를 노래하며, 고통의 흔적을 표시하지 않습니다되는 마취의 가장 낮은 수준에서 동물을 유지. 체온을 유지하기 위해, 우리는 (38 ° C에서) 온수 담요 쥐를 유지. 탈수를 방지하기 위해, 우리는 전체 이미징 절차를 통해 생리 IP의 작은 볼륨을 주입. 생리 혈액 산소 포화 수준을 유지하기 위해, 우리는 캐리어 가스 (대신 일반적으로 사용되는 100 %보다)의 21 % 산소로 시작합니다. 시간을 실험에 - - 우리가 마우스하면 흡입 산소 수준을 향상 할 수 있도록 혈액 산소 포화도의 감소를 보여줍니다. 우리의 경험에서, 시간 (30~40%에 등)에서 흡입 산소 수준을 증가시키는 것은 거의 항상 추가 영상의 시간 동안 수 있도록 동물을 안정화합니다. 마취의 최적 수준은 60-65/min와 400-450/min의 펄스 속도의 호흡 속도의 1-1.5 % isoflurane과 결과를 달성 대부분의 마우스입니다. 우리의 이미징 실험에서, 우리는 주로 유전자 변형 마우스 모델을 사용s은 (는) (MMTV-PyMT와 C3 [1] - 태그)하는 종양은 단일 이미지 세션에서 여러 X, Y 위치에서 병렬 종양 진행의 다양한 단계에 여러 개의 병변의 이미징을 허용, multifocal 있습니다. 이 단계에 따라 달라 치료 반응을 확인하기위한 실험에 대해 마우스에 마우스 변화에 대한 우려를 감소, 및 이미징에 필요한 동물의 수를 줄일 수 있습니다. intravital 이미징 동안 수행 할 수 있습니다 종양 병변의 병리학 준비가 덜 상세 다른이며, 비록 MMTV-PyMT 모델 (및 기타 자연 암 모델)의 그것보다, intravital 영상 중에 인식 할 수 진보적 인 histopathological 단계를 거칩니다 조직 학적 섹션 5,17. 암 세포는 일반적으로 말기 악성 종양에서 분리 될 때 대조적으로, 이식 모델은 가장 늦게 무대 종양을 반영하는 경향이 있습니다. 이러한 모델은 따라서 종양 - 기질을 공부에 더 의무 아르다른 단계 사이의 이러한 상호 작용의 차이보다 늦게 무대 종양의 상호 작용을 확인할 수 있습니다. 우리는 어떻게 치료에 의해 유도 세포 사망 한 후 발생할 이미지 핵 구조 변화에의 예를 보여줍니다. 항암제 치료의 부재에서이 라벨 전략 대신 elucidating, 원위치에서 이미지 세포 분열에 사용할 수 있습니다 예를 들어, 세포 증식과 휴지는 microenvironment에 얼마나 영향을받습니다. 앞으로 mitochondrial 구성 요소의 형광 라벨은 apoptotic 세포 사망하는 동안 발생하는 이미지 mitochondrial 변경하는 것이 가능하게 할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 또한 다른 microenvironmental 구성 요소는 시각화 및 이미징 될 수있는 방법을 치료 한 후 이미지 암 세포 면역 세포의 상호 작용에 있지만,의 예를 보여 주었다. stromal 구성 요소에 대한 기존의 형질 기자 라인 (예., FSP1-EGFP 17 αSMA - RFP 21 COL1A1-EG 섬유 아세포를위한 사람들을 포함FP 21) 또는 vasculature의 세포 (예 : Tie2-GFP 22, VEGF-GFP 23). Intravital 이미징은 생체 다음과 같은 화학 요법 관리에서 발생하는 상호 작용과 프로세스의 실시간 시각화 할 수 있습니다. 기술이 현재로, 우리는 치료 반응에 영향을 미치는 방법에 골수 양 세포 이해의 주요 진전을 만들었습니다, 종양 microenvironment은 너무나 복잡하기 때문에 그러나, 주요 발전은 여전히​​ 환경 매개 약물 저항을 근간 프로세스에 mechanistically 탐구하기 시작 필요합니다. 여전히 필요한 가장 중요한 발전 중 하나는 특정 세포 집단을위한 더 나은 마커의 식별합니다. 더 나은 마커의 중요성은 잘 유방 종양의 microenvironment, 섬유 아세포와 면역 세포의 가장 눈에 잘 띄는 stromal 세포 구성 요소의 두 사람과 함께 도시된다. α-부드러운 근육 고를 (αSMA)가 자주 식별하는 데 사용됩니다섬유 아세포하지만, 단백질은 혈관 평활근 세포와 세포 myoepithelial (24)에 의해 표시됩니다. αSMA-GFP의 기자 마우스가 존재하지만 따라서, 특정 세포 유형을 결정하는 것은 intravital 이미징 실험이 진행되는 동안 다음이되는 것은 도전이다. 마찬가지로, C-FMS 프로모터에서 표현 등 EGFP와 같은 단일 형광 마커는 종종 12,17 면역 세포의 여러 subpopulations를 식별합니다. 하나가 이상적으로 특정 세포 유형을 식별하는 단일 마커를 사용하고자하지만 따라서, 기본 생물의 복잡성이 접근법을 사용하여의 주요 과제를 안겨주고 있습니다. 이 문제에 대한 하나의 일부 솔루션은 또한 같은 형광 기자를 표현하는 세포의 subpopulations을 차별화하는 데 injectable 라벨을 사용하는 것입니다. 예를 들어, 형광 dextrans는 대 식세포에 의해 촬영되고 C-FMS-EGFP와 Fsp1-EGFP 유전자 변형의 기자 마우스에 의해 표시하는 대 식세포 subpopulations 라벨을 사용할 수 있습니다 <sup&gt; 17. 형광 프로브에 복합 항체는 특정 subpopulations를 (C-FMS-EGFP 기자 17에 의해 분류 골수 양 세포의 Gr1 - 긍정적 인 인구 등) 식별하는 데 사용되었습니다. 어떻게 왜 종양 동물의 큰 무리를 필요로 다른 시간 지점에서 수확 한 조직에서 파생 된 관리 치료, 또는 조직 학적 시리즈에 응답에 대한 약간의 기계론의 정보를 제공 캘리퍼스 측정,에 의해 생성 된 종양 응답 곡선과는 달리, 우리의 기술은 직접, 객관적 정보를 제공합니다 세포 죽음의 역학에 작은 무리의 암 세포와 stromal 세포의 상호 작용에. 따라서, 여기에보고 된 절차를 사용하는 장점은 실시간으로 그대로 종양의 microenvironment의 맥락에서 약물 반응에 대한 동적 정보를 제공한다는 것입니다. 이러한 정보는 5 치료 반응을 유도하는 기본 프로세스에 중요한 통찰력을 초래할 수 &lt;/&gt;를 논의하게 될 것입니다.

종양이 성장 1 적절한 환경을 유지하는 데 도움이 암 세포와 stromal 성분 (세포와 비 휴대폰 모두) : 고체 종양은 두 가지 주요 격실로 구성되어 있습니다. 이 stromal 성분은 유방 2-5의 일정을 포함 암의 많은 종류의 개발, 진행 및 전이에 중요한 역할을 재생합니다. stromal 환경은 또한 치료 반응 할 2,4,5 영향을 미칩니다. 따라서, 암 세포가 손상 microenvironment의 컨텍스트 내에서 기존과 소설 치료에 응답 방법을 결정하는 것은 암 생물학에 대한 우리의 이해를 발전 및 현재 치료 전략 개선을위한 중요합니다. 또한, 암 세포 기질의 상호 작용은 치료의 관리에 따라 변경하는 방법 정의하는 것은 종양 재발의 생물학을 이해하는 데 중요합니다. Organotypic 공동 배양 시스템은 종양 - 기질 상호 작용을 연구하는 데 유용되었습니다 <s6&gt;까지하지만, 현재 사용할 수있는 방법을 성공적으로 면역 세포의 혈관 기능 및 채용에 대하여 특히 체외에서 그대로 종양의 microenvironment를 요점을 되풀이 할 수 분명하다. 사실, 체외에서 관찰 요법으로 암 세포 응답은 종종 microenvironment 5 그대로 생체에서 관찰 것과 크게 다릅니다. 따라서, 치료 반응에 종양이 - 기질 상호 작용하고 영향을 공부 생체 모델에 더 나은 임상 적으로 관련성이 높은 메커니즘에게 7 반영 될 수 있습니다. 생체의 항 암 치료에 반응을 연구의 주요 수단은 종양 크기와 처리 동물이나 환자에서 파생 된 조직의 조직 학적 평가의 측정을 겪었습니다. 그러나 지난 20 년 동안 현미경과 형광 기자의 진보는 간 및 세포 내 프로세스의 시각화을 사용하도록 설정 한라이브, anesthetized 동물의 고해상도 (intravital 영상) 8시. 이 intravital 현미경 기술은 spatially과 시간적 셀룰러 및 하위 세포의 해상도 8,9에서 종양 - 기질 상호 작용의 생체 역학에을 해부 특히 도움이 될 입증되었습니다. intravital 이미징에 의해를 풀 된 프로세스 안티 종양 T 세포의 세포 독성 10,11, T 세포와 골수 양 세포 12 사이의 상호 작용, 치료 치료 13 대 식세포에 의존 암 세포 intravasation 및 전이에 따라 콜라겐 성분과 조직의 변화의 역학을 포함 14 및 혈관 투과성 15. intravital 이미지에 대한 세 가지 주요 요구 사항이 있습니다. 다음은 적절한 준비와 노출 조직의 이미징, 관심의 조직 구성 요소의 형광 라벨을위한, 그리고 페어 현미경 카메라을 포함이미지 16을 획득 할 수 ystem. 이러한 요구 사항을 해결하는 데 사용되는 가장 일반적인 전략은 다음과 같습니다 : 1) heterotopic 준비 (예 : 귀 및 눈 궤도의 접종), 영구적 인 이미지 창 또는 exteriorized 준비 (예를 들어, 등쪽 피부 플랩), 2) 유전자 변형 형광 기자입니다.. 형광 injectables는 조직 구성 요소에 라벨을 지정하기 위해, 그리고 3) multiphoton 또는 공 촛점 현미경 시스템은 각각 9 광전자 증 튜브 또는 전하 결합 소자 (CCD) 카메라,와 페어링. 우리는 형광 기자 인코딩 transgenes을 표현 anesthetized 동물 이미징의 사타구니 유선 노출 할 수있는 수술 준비 피부 플랩 모델을 사용합니다. 이미지는 4 레이저 회전 디스크 공 촛점 현미경 시스템 17와 짝을 강화 CCD (ICCD) 카메라를 사용하여 12~40시간 기간 동안 얻을 수 있습니다. 이러한 방식으로 이미징은 우리가 생체 의약품 유통, 단계에 따라 달라 채널에서 같은 과정을 연구 할 수있다emotherapeutic 반응, 화학 요법 유도 된 세포의 죽음, 그리고 골수 양 세포의 행동 5 종류. 우리는 항암제 치료, 유방암의 마우스 모델에서 종양 - 기질 상호 작용에 암 세포 응답의 intravital 이미징을위한 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜은 하나의 이미지 세션 40 시간까지의 기간에 대한 유전자 변형과 이식 두 가지 모델에서 유전자 변형과 injectable 형광 라벨의 다양한 다양한 암 세포와 stromal 구성 요소를 모두의 행동과 죽음을 추적하는 데 사용할 수 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> 시약 </td></tr><tr><td> MMTV-PyMT 마우스 </td><td> 잭슨 연구소 </td><td> 2374 </td><td></td></tr><tr><td> C3 (1) 태그 마우스 </td><td> 잭슨 연구소 </td><td> 13,591 </td><td></td></tr><tr><td> ACTB - ECFP 마우스 </td><td> 잭슨 연구소 </td><td> 3773 </td><td></td></tr><tr><td> ACTB-H2B-EGFP 마우스 </td><td> 잭슨 연구소 </td><td> 5418 </td><td></td></tr><tr><td> 1 개 PBS </td><td> - 집에서 제작 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2 MD Dextran, Fluorescein-복합 </td><td> Invitrogen </td><td> D-7137 </td><td> 1 개 PBS에 희석 1 MG / ML, DH 2 O (-20 ° C 4 MG / ML, 저장)에 Reconstitute </td></tr><tr><td> 10 KD Dextran, 알렉사 형석 647-복합 </td><td&gt; Invitrogen </td><td> D-22914 </td><td> 1 개 PBS에 희석 1 MG / ML, DH 2 O (-20 ° C 4 MG / ML, 저장)에 Reconstitute </td></tr><tr><td> Doxorubicin 염산염 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> 44,583 </td><td> 4 번 DH 2 O와 매장에서 Reconstitute는 ° C, 1 개 PBS에 희석 </td></tr><tr><td> Isothesia (Isoflurane) </td><td> 버틀러 동물 건강 공급 </td><td> 029450 </td><td> 250 ML </td></tr><tr><td> Propidium의 요오드화물 </td><td> Invitrogen </td><td> P3566 </td><td> 1 MG / ML, 희석 1시 15분 1 개 PBS에 </td></tr><tr><td> 질소 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 산소 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 장비 </td></tr><tr><td> 18G × 1 ½ &quot;일반 베벨 바늘 </td><td> BD </td><td> 305196 </td><td></td></tr><tr><td> μManager </td><td> 베일 연구소, UCSF </td><td> <a href="www.micro-manager.org" target="_blank">www.micro - manager.org</a> </td><td> 오픈 소스 소프트웨어 </td></tr><tr><td> 알코올 면봉 </td><td> BD </td><td> 326895 </td><td> 70% 이소 프로필 알콜 면봉 </td></tr><tr><td> 마취 시스템 </td><td> 분자 이미징 제품, (주) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 유리 커버 </td><td> 코닝 </td><td> 2940-245 </td><td> 1 ½, 24x50 mm 번호, 70% 이소프로판올 잎사귀와 소독 </td></tr><tr><td> Curity의 거즈 스폰지 (무균) </td><td> 켄달 </td><td> 6939 </td><td></td></tr><tr><td> 유리 현미경 슬라이드 </td><td> 코닝 </td><td> 2948-75x25 </td><td> 미리 청소, 미리 청소하지 않을 경우 70 % 이소프로판올 잎사귀와 소독 </td></tr><tr><td> 강화 된 고급 가위 </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 14090-11 </td><td> 이쌍, 스테인레스 강, 날카로운 날카로운 팁, 스트레이트 팁, 26mm 절단 가장자리, 11cm 길이 </td></tr><tr><td> 가열 담요 </td><td> Gaymar 산업 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 핫 비드 살균기 </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 18000-45 </td><td> 사용하기 전에 약 30 분을 켜십시오;&gt; 200 도구를 소독 ° C 30 초에 </td></tr><tr><td> Imaris </td><td> Bitplane </td><td> <a href="www.bitplane.com" target="_blank">www.bitplane.com</a> </td><td></td></tr><tr><td> Krazy 접착제 </td><td> 엘머의 제품 </td><td> KG484 </td><td></td></tr><tr><td> 연구실 테이프 (½ &quot;) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 연구실 테이프 (1 &quot;) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 에 뚜껑스티로폼 배송 쿨러 </td><td></td><td></td><td> 이것은 수술 플랫폼으로 사용됩니다 </td></tr><tr><td> 마이크로 해부 포셉 </td><td> Roboz </td><td> RS-5153 </td><td> 1x2 치아, 약간의 곡선, 0.8 mm 팁 폭, 4 &quot;길이 </td></tr><tr><td> 마이크로 해부 포셉 </td><td> Roboz </td><td> RS-5135 </td><td> 톱니 모양의, 약간의 곡선, 0.8 mm 팁 폭, 4 &quot;길이 </td></tr><tr><td> 현미경 </td><td></td><td></td><td> 스피닝 디스크 공 촛점, XYZ 압전 단계, epifluourescence capablility 17,25 </td></tr><tr><td> 현미경 무대 삽입 </td><td> 응용 과학 계측 </td><td></td><td> 사용자는 두 원형 영상 포트와 함께, 제조 </td></tr><tr><td> MouseOx 산소 농도계, 소프트웨어 및 센서 </td><td> 스타 생명 과학 </td><td> <a href="www.starrlifesciences.com" target="_blank">www.starrlifescience</a>s.com </td><td></td></tr><tr><td> Nalgene 슈퍼 Versi - 드라이 연구소 soakers </td><td> 열 과학 </td><td> 74218-00 </td><td> 수술 플랫폼을 늘어서에 4 분에 잘라 내기 </td></tr><tr><td> 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요 </td><td> 제염업자 연구소 </td><td> 8901 </td><td> 가스를 ...을 축이다하는 데 사용하는, 폐 조직의 염증을 방지 </td></tr><tr><td> 슬립 - 팁 일회용 투베르쿨린 주사기 (1 ML) </td><td> BD </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td> Surflo 날개 달린 주입 세트 </td><td> Terumo </td><td> SV-23BLK </td><td> 23G X ¾ &quot;매우가는 바늘, 12&quot;튜브 </td></tr><tr><td> Betadine 스프레이 </td><td> 퍼듀 제약 </td><td> BASP3H </td><td></td></tr></tbody></table>

live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer

종양 microenvironment는 종양 개시, 진행, 전이, 그리고 안티 - 암 치료에 대한 반응에 중추적 인 역할을 담당하고 있습니다. 입체 공동 문화 시스템은 자주 약물 반응에서의 역할 등의 종양 - 기질 상호 작용을 설명하다하는 데 사용됩니다. 그러나, 손상 microenvironment의 생체에서 발생하는 상호 작용의 많은 완전히 체외 설정에서 이러한 복제 할 수 없습니다. 따라서, 실시간으로 해당 프로세스를 직접 시각화 요법에 종양 반응을 이해하고 암 세포 이러한 반응에 영향을 미칠 수있는 기질 사이의 상호 작용을 식별하는 중요한 도구로 자리 잡았습니다. 여기에 직접 약물 배포, 암 세포 반응과 유방암 모델에서 전신 치료의 관리에 따라 종양 - 기질 상호 작용의 변화를 관찰 할 라이브, anesthetized 마우스 회전 디스크 공 촛점 현미경을 사용하는 방법을 제공합니다. 우리는 labeli위한 절차를 설명NG 다른 종양 부품, 치료 반응을 관찰을위한 동물의 치료, 40 시간 영상에 대한 종양 조직을 노출하기위한 수술. 이 프로토콜에서 얻은 결과는 약물 침투, 암 세포의 죽음과 stromal 세포 마이그레이션과 같은 프로세스가 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 평가 될 수있는 시간 경과 영화입니다.

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Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

우리는 안티 - 암 치료에 영상 응답하는 방법을 설명<em&gt; 생체 내</em&gt; 및 단일 셀 해상도.

유방암의 마우스 모델에서 종양 Microenvironment에 약물 응답의 영상을 라​​이브

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

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Nanyang Technological University

Research

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Medicine

24.8K 조회수.  Watson School of Biological Sciences. 우리는 안티 - 암 치료에 영상 응답하는 방법을 설명 생체 내 및 단일 셀 해상도.

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Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens

The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined by current drug efficacy tests and the efficacy on patients. Thus, novel and reliable methods for evaluating drug efficacy are warranted in pre-clinical phase. In vitro culture of tumor tissues, including cell lines, has substantial phenotypic, genetic, and epigenetic alterations of cancer cells caused by artificial environment of cell culture, which may not reflect the biology of original tumors in situ. Xenograft models with the immunodeficient mice also have limitations, i.e., the lack of immune system and interspecies genetic and epigenetic discrepancies in microenvironment. Here, we demonstrate a novel method using the surgical specimens of malignant glioma as undissociated tumor blocks to evaluate treatment effects. To validate this method, data with the current first-line chemotherapeutic agent, temozolomide (TMZ), are described.


We used the freshly-removed surgical specimen of malignant glioma for our experiments. We performed intratumoral injection of TMZ or other drug candidates, followed by incubation and analysis on surgical specimens. Here, we sought to establish a tumor tissue explant method as a platform to determine the efficacy of novel anti-cancer therapies so that we may be able to overcome, at least, some of the current limitations and fill the existing gap between the current experimental data and the efficacy on an actual patient's tumor. This method may have the potential to accelerate identifying novel chemotherapeutic agents for solid cancer treatment.

Here, we established a method for drug efficacy testing with surgical specimens of brain tumors, termed &#x201C;tumor explant method&#x201D;. With this method, we can evaluate drug efficacy without breaking the microenvironment of solid tumors. To validate reliability of this method, we describe representative data with our glioma specimen treated with the current first-line chemotherapeutic agent, temozolomide.

외과 종양 표본의 Explants를 사용하여 소설 안티 - 암 의약품 개발을위한 방법


The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined ...

연구

의학

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

구강 편평 세포 암종의 Orthotopic 마우스 모델에서 종양 세포 침략의 다중 광자 이미징

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There is little knowledge about in situ, in vivo, tumor hypoxia during intracranial development of malignant brain tumors because of lack of efficient means to monitor it in these deep-seated orthotopic tumors. Bioluminescence imaging (BLI), based on the detection of light emitted by living cells expressing a luciferase gene, has been rapidly adopted for cancer research, in particular, to evaluate tumor growth or tumor size changes in response to treatment in preclinical animal studies. Moreover, by expressing a reporter gene under the control of a promoter sequence, the specific gene expression can be monitored non-invasively by BLI. Under hypoxic stress, signaling responses are mediated mainly via the hypoxia inducible factor-1&alpha; (HIF-1&alpha;) to drive transcription of various genes. Therefore, we have used a HIF-1&alpha; reporter construct, 5HRE-ODD-luc, stably transfected into human breast cancer MDA-MB231 cells (MDA-MB231/5HRE-ODD-luc). In vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay is performed by incubating the transfected cells in a hypoxic chamber (0.1% O2) for 24 hr before BLI, while the cells in normoxia (21% O2) serve as a control. Significantly higher photon flux observed for the cells under hypoxia suggests an increased HIF-1&alpha; binding to its promoter (HRE elements), as compared to those in normoxia. Cells are injected directly into the mouse brain to establish a breast cancer brain metastasis model. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics is initiated 2 wks after implantation and repeated once a week. BLI reveals increasing light signals from the brain as the tumor progresses, indicating increased intracranial tumor hypoxia. Histological and immunohistochemical studies are used to confirm the in vivo imaging results. Here, we will introduce approaches of in vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay, surgical establishment of a breast cancer brain metastasis in a nude mouse and application of in vivo bioluminescence imaging to monitor intracranial tumor hypoxia.

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

Bioluminescence imaging of hypoxia inducible factor-1&alpha; activity is applied to monitor intracranial tumor hypoxia development in a breast cancer brain metastasis mouse model.

유방암 뇌 전이의 종양 Hypoxia 역학 생체내의 Bioluminescence 이미징에서는 마우스 모델에서

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

MAME Models for 4D Live-cell Imaging of Tumor: Microenvironment Interactions that Impact Malignant Progression

We have developed 3D coculture models, which we term MAME (mammary architecture and microenvironment engineering), and used them for live-cell imaging in real-time of cell:cell interactions. Our overall goal was to develop models that recapitulate the architecture of preinvasive breast lesions to study their progression to an invasive phenotype. Specifically, we developed models to analyze interactions among pre-malignant breast epithelial cell variants and other cell types of the tumor microenvironment that have been implicated in enhancing or reducing the progression of preinvasive breast epithelial cells to invasive ductal carcinomas. Other cell types studied to date are myoepithelial cells, fibroblasts, macrophages and blood and lymphatic microvascular endothelial cells. In addition to the MAME models, which are designed to recapitulate the cellular interactions within the breast during cancer progression, we have developed comparable models for the progression of prostate cancers. 
Here we illustrate the procedures for establishing the 3D cocultures along with the use of live-cell imaging and a functional proteolysis assay to follow the transition of cocultures of breast ductal carcinoma in situ (DCIS) cells and fibroblasts to an invasive phenotype over time, in this case over twenty-three days in culture. The MAME cocultures consist of multiple layers. Fibroblasts are embedded in the bottom layer of type I collagen. On that is placed a layer of reconstituted basement membrane (rBM) on which DCIS cells are seeded. A final top layer of 2% rBM is included and replenished with every change of media. To image proteolysis associated with the progression to an invasive phenotype, we use dye-quenched (DQ) fluorescent matrix proteins (DQ-collagen I mixed with the layer of collagen I and DQ-collagen IV mixed with the middle layer of rBM) and observe live cultures using confocal microscopy. Optical sections are captured, processed and reconstructed in 3D with Volocity visualization software. Over the course of 23 days in MAME cocultures, the DCIS cells proliferate and coalesce into large invasive structures. Fibroblasts migrate and become incorporated into these invasive structures. Fluorescent proteolytic fragments of the collagens are found in association with the surface of DCIS structures, intracellularly, and also dispersed throughout the surrounding matrix. Drugs that target proteolytic, chemokine/cytokine and kinase pathways or modifications in the cellular composition of the cocultures can reduce the invasiveness, suggesting that MAME models can be used as preclinical screens for novel therapeutic approaches.

We have developed 3D coculture models for live-cell imaging in real-time of interactions among breast tumor cells and other cells in their microenvironment that impact progression to an invasive phenotype. These models can serve as preclinical screens for drugs to target paracrine-induced proteolytic, chemokine/cytokine and kinase pathways implicated in invasiveness.

종양의 4D 라이브 세포 이미징을위한 MAME 모델 : Microenvironment 상호 작용 영향을 미치는 악성 진행

We have developed 3D coculture models, which we term MAME (mammary architecture and microenvironment engineering), and used them for live-cell imaging in ...

Multi-modal Imaging of Angiogenesis in a Nude Rat Model of Breast Cancer Bone Metastasis Using Magnetic Resonance Imaging, Volumetric Computed Tomography and Ultrasound

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell proliferation in the bone marrow cavity as well as for interaction of tumor and bone cells resulting in local bone destruction. Our aim was to develop a model of experimental bone metastasis that allows in vivo assessment of angiogenesis in skeletal lesions using non-invasive imaging techniques.
For this purpose, we injected 105 MDA-MB-231 human breast cancer cells into the superficial epigastric artery, which precludes the growth of metastases in body areas other than the respective hind leg1. Following 25-30 days after tumor cell inoculation, site-specific bone metastases develop, restricted to the distal femur, proximal tibia and proximal fibula1. Morphological and functional aspects of angiogenesis can be investigated longitudinally in bone metastases using magnetic resonance imaging (MRI), volumetric computed tomography (VCT) and ultrasound (US).
MRI displays morphologic information on the soft tissue part of bone metastases that is initially confined to the bone marrow cavity and subsequently exceeds cortical bone while progressing. Using dynamic contrast-enhanced MRI (DCE-MRI) functional data including regional blood volume, perfusion and vessel permeability can be obtained and quantified2-4. Bone destruction is captured in high resolution using morphological VCT imaging. Complementary to MRI findings, osteolytic lesions can be located adjacent to sites of intramedullary tumor growth. After contrast agent application, VCT angiography reveals the macrovessel architecture in bone metastases in high resolution, and DCE-VCT enables insight in the microcirculation of these lesions5,6. US is applicable to assess morphological and functional features from skeletal lesions due to local osteolysis of cortical bone. Using B-mode and Doppler techniques, structure and perfusion of the soft tissue metastases can be evaluated, respectively. DCE-US allows for real-time imaging of vascularization in bone metastases after injection of microbubbles7.
In conclusion, in a model of site-specific breast cancer bone metastases multi-modal imaging techniques including MRI, VCT and US offer complementary information on morphology and functional parameters of angiogenesis in these skeletal lesions.

In the pathogenesis of bone metastasis, angiogenesis is a crucial process and therefore represents a target for imaging and therapy. Here, we present a rat model of site-specific breast cancer bone metastasis and describe strategies to non-invasively image angiogenesis in vivo using magnetic resonance imaging, volumetric computed tomography and ultrasound.

자기 공명 영상, 체적 계산의 Tomography 및 초음파를 이용한 유방암의 뼈 전이의 누드 쥐 모델에서 Angiogenesis의 멀티 모달 이미징

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from different genetically engineered mouse models of breast cancer. For example, time between cell divisions (cell lifetimes), apoptotic cell numbers, evolution of morphological changes, and mechanism of colony formation can be quantified and compared in cells carrying specific genetic lesions. Primary mammary epithelial cell cultures are generated from mammary glands without palpable tumor. Glands are carefully resected with clear separation from adjacent muscle, lymph nodes are removed, and single-cell suspensions of enriched mammary epithelial cells are generated by mincing mammary tissue followed by enzymatic dissociation and filtration. Single-cell suspensions are plated and placed directly under a microscope within an incubator chamber for live-cell imaging. Sixteen 650 &mu;m x 700 &mu;m fields in a 4x4 configuration from each well of a 6-well plate are imaged every 15 min for 5 days. Time-lapse images are examined directly to measure cellular behaviors that can include mechanism and frequency of cell colony formation within the first 24 hr of plating the cells (aggregation versus cell proliferation), incidence of apoptosis, and phasing of morphological changes. Single-cell tracking is used to generate cell fate maps for measurement of individual cell lifetimes and investigation of cell division patterns. Quantitative data are statistically analyzed to assess for significant differences in behavior correlated with specific genetic lesions.

Time-lapse imaging is used to assess behavior of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer risk to determine if there are correlations between specific behavioral parameters and distinct genetic lesions.

기본 Preneoplastic 유방 상피 세포의 시간 경과 영상은 유방암의 유전자 변형 마우스 모델에서 파생

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

MRI and PET in Mouse Models of Myocardial Infarction

Myocardial infarction is one of the leading causes of death in the Western world. The similarity of the mouse heart to the human heart has made it an ideal model for testing novel therapeutic strategies.
In vivo magnetic resonance imaging (MRI) gives excellent views of the heart noninvasively with clear anatomical detail, which can be used for accurate functional assessment. Contrast agents can provide basic measures of tissue viability but these are nonspecific. Positron emission tomography (PET) is a complementary technique that is highly specific for molecular imaging, but lacks the anatomical detail of MRI. Used together, these techniques offer a sensitive, specific and quantitative tool for the assessment of the heart in disease and recovery following treatment.
In this paper we explain how these methods are carried out in mouse models of acute myocardial infarction. The procedures described here were designed for the assessment of putative protective drug treatments. We used MRI to measure systolic function and infarct size with late gadolinium enhancement, and PET with fluorodeoxyglucose (FDG) to assess metabolic function in the infarcted region. The paper focuses on practical aspects such as slice planning, accurate gating, drug delivery, segmentation of images, and multimodal coregistration. The methods presented here achieve good repeatability and accuracy maintaining a high throughput.

We describe how to perform MRI and PET imaging of the mouse heart. The protocol is tailored to assess treatment efficacy in models of myocardial infarction and heart failure.

Myocardial infarction is one of the leading causes of death in the Western world. The similarity of the mouse heart to the human heart has made it an ...

Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in exponential tumor growth and metastasis to distal tissues and the collapse of anti-tumor immunity. Many useful animal models exist to study breast cancer, but none completely recapitulate the disease progression that occurs in humans. In order to gain a better understanding of the cellular interactions that result in the formation of latent metastasis and decreased survival, we have generated an inducible transgenic mouse model of YFP-expressing ductal carcinoma that develops after sexual maturity in immune-competent mice and is driven by consistent, endocrine-independent oncogene expression. Activation of YFP, ablation of p53, and expression of an oncogenic form of K-ras was achieved by the delivery of an adenovirus expressing Cre-recombinase into the mammary duct of sexually mature, virgin female mice. Tumors begin to appear 6 weeks after the initiation of oncogenic events. After tumors become apparent, they progress slowly for approximately two weeks before they begin to grow exponentially. After 7-8 weeks post-adenovirus injection, vasculature is observed connecting the tumor mass to distal lymph nodes, with eventual lymphovascular invasion of YFP+ tumor cells to the distal axillary lymph nodes. Infiltrating leukocyte populations are similar to those found in human breast carcinomas, including the presence of &#945;&#946; and &#947;&#948; T cells, macrophages and MDSCs. This unique model will facilitate the study of cellular and immunological mechanisms involved in latent metastasis and dormancy in addition to being useful for designing novel immunotherapeutic interventions to treat invasive breast cancer.

Activation of latent mutations with adenovirus-Cre into the mammary ductal system results in a clinically relevant metastatic breast cancer. Incorporation of a YFP promoter allows tracking of distal metastatic tumor cells. This model is useful to study latent metastasis, anti-tumor immunity, and for designing novel immunotherapies to treat breast cancer.

유방암의 소설 형질 전환 마우스 모델 : 아데노 바이러스 크레와 유관 상피의 대상으로 전이성 유방암의 개시

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in ...

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the extracellular matrix (ECM). Characterizing the biology of this phenotypically distinct group of cells could substantially improve our understanding of early events during the metastatic cascade.

Tumor invasion is a dynamic process facilitated by bidirectional interactions between malignant epithelium and the cancer associated stroma. In order to examine cell-specific responses at the tumor stroma-interface we have combined organotypic co-culture and laser micro-dissection techniques.
Organotypic models, in which key stromal constituents such as fibroblasts are 3-dimentioanally co-cultured with cancer epithelial cells, are highly manipulatable experimental tools which enable invasion and cancer-stroma interactions to be studied in near-physiological conditions.

Laser microdissection (LMD) is a technique which entails the surgical dissection and extraction of the various strata within tumor tissue, with micron level precision.
By combining these techniques with genomic, transcriptomic and epigenetic profiling we aim to develop a deeper understanding of the molecular characteristics of invading tumor cells and surrounding stromal tissue, and in doing so potentially reveal novel biomarkers and opportunities for drug development in CRC.&#160;&#160;&#160;

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Molecular profiling of laser microdissected cells and stroma from synthetic, tissue-engineered colorectal cancer models represents a novel and manipulatable approach to characterize and dissect the distinctive biology at the interface between tumor cells at the invasive front and cancer associated stromal cells. &#160;

분자 대장 암 세포의 3 차원 모델의 침윤성 종양 미세 환경의 프로파일 및<em&gt; 예 생체 내</em&gt; 섬유 아세포

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the ...

High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal systems. HFUS has the ability to detect structures as small as 30 &#181;m, a property that has been utilized for visualizing superficial lymph nodes in rodents in brightness (B)-mode. Combining power Doppler with B-mode imaging allows for measuring circulatory blood flow within lymph nodes and other organs. While HFUS has been utilized for lymph node imaging in a number of mouse&#160; model systems, a detailed protocol describing HFUS imaging and characterization of the cervical lymph nodes in mice has not been reported. Here, we show that HFUS can be adapted to detect and characterize cervical lymph nodes in mice. Combined B-mode and power Doppler imaging can be used to detect increases in blood flow in immunologically-enlarged cervical nodes. We also describe the use of B-mode imaging to conduct fine needle biopsies of cervical lymph nodes to retrieve lymph tissue for histological&#160; analysis. Finally, software-aided steps are described to calculate changes in lymph node volume and to visualize changes in lymph node morphology following image reconstruction. The ability to visually monitor changes in cervical lymph node biology over time provides a simple and powerful technique for the non-invasive monitoring of cervical lymph node alterations in preclinical mouse models of oral cavity disease.

This protocol describes the application of high-frequency ultrasound (HFUS) for imaging mouse cervical lymph nodes. This technique optimizes visualization and quantification of cervical lymph node morphology, volume and blood flow. Image-guided biopsy of cervical lymph nodes and processing of lymph tissue for histological evaluation is also demonstrated.

유방암의 마우스 모델에서 종양 Microenvironment에 약물 응답의 영상을 라​​이브

유방암의 마우스 모델에서 종양 Microenvironment에 약물 응답의 영상을 라이브