We thank Joshua Marcus for technical support and Jolien Tyler, Ph.D., Director of the Richard J. McIntosh Light Microscopy Core Facility, for technical advice. This work was supported by funds from the University of Colorado Boulder and the University of Colorado Boulder Graduate School to J.D.O. R.T.B. is partially supported by pre-doctoral training grant from the NIH (T32 GM008759). We thank Karyopharm Therapeutics, Inc. for selinexor and Merck Serono for Kinesin-5 inhibitor. FUCCI plasmids are from Atsushi Miyawaki (RIKEN, Japan) via MTA. mCherry-BP1-2 was from Addgene. HeLa expressing H2b-mCherry and &#946;-tubulin-EGFP are from Daniel Gerlich (IMBA, Austrian Academy of Sciences, Austria).

Le protocole suivant utilise des paramètres définis par les expériences sur les figures 4 et 6 en ce qui concerne les paramètres d&#39;acquisition et les conditions expérimentales. Bon nombre de ces paramètres peuvent être modifiés pour adapter d&#39; autres expériences (c. -à- temps d&#39;exposition, binning, canaux fluorescents, etc.). Toutes les procédures doivent respecter les directives et les règlements institutionnels et être approuvé par le comité de biosécurité institutionnelle. sites fabricant de Microscope contiennent d&#39;excellentes informations pour l&#39;imagerie des cellules vivantes. 1. Microscopes et logiciel d&#39;imagerie <ol><li> Effectuer l&#39;imagerie cellulaire en direct sur une grande variété de microscopes inversés. Les microscopes les plus courants sont Widefield épifluorescence et filature disque confocale. Ici, utiliser un microscope automatisé et motorisé Widefield épifluorescence avec une source de lumière aux halogénures métalliques de 200 watts. </li><li> Obtenir un stade supérieur ou microscope chambre environnementale. Ici, utiliser une étape-tchambre environnementale op. </li><li> Utilisez un logiciel commercial pour faire fonctionner des microscopes avec des utilitaires pour exécuter la microscopie time-lapse. </li><li> Utilisez un logiciel disponible dans le commerce ou ImageJ pour l&#39;analyse d&#39;image. Beaucoup d&#39; autres outils d&#39;analyse sont disponibles dans le commerce, et il existe des programmes sur mesure dont beaucoup ont été publiées 8,18. </li></ol> 2. Visualisation des processus cellulaires et réponses phénotypiques <ol><li> Visualisez les cellules par microscopie en fond clair. Contraste d&#39;interférence différentiel et contraste de phase seul peut être très instructif d&#39;étudier les réponses aux réponses aux médicaments anti-cancer. Ces procédés peuvent comprendre la mitose, la motilité cellulaire et l&#39;apoptose. </li><li> Visualiser les structures cellulaires, les organelles et les procédés de biocapteurs fluorescents. Les sondes fluorescentes sont informatives dans le suivi des processus subcellulaires spécifiques. Ceux-ci peuvent inclure la dynamique des microtubules, des mitochondries et la dynamique du réticulum endoplasmique, l&#39;accumulation de protéines et la localisation, etsignalisation moléculaire (par exemple., la phosphorylation, le calcium). </li></ol> 3. Préparation des échantillons <ol><li> Cultiver des cellules en culture cellulaire plats certifiés par une norme, un incubateur de culture cellulaire humidifiée (par exemple 37 ° C, 5% de CO2, 80% d&#39; humidité relative). <ol><li> Cultiver les cellules HT1080 dans du MEM avec EBSS. Compléter le support avec 10% v / v de FBS, 1% v / v Pen / Strep, 1% v / pyruvate de sodium v ​​et 1% v / v d&#39;acides aminés non essentiels. </li></ol></li><li> Deux jours avant l&#39;imagerie, les cellules plaque 50.000 HT1080 Fucci dans 3 puits d&#39;un # 1.5 verre plat en bas de 12 puits dans une hotte laminaire d&#39;écoulement stérile certifié. Ajuster le nombre de cellules ensemencées pour atteindre ~ 60% de confluence pour le début de l&#39;expérience. En fonction de la lignée cellulaire et de la nature de l&#39;expérience, la densité cellulaire peut être inférieure. Remarque: La densité cellulaire peut avoir une influence profonde sur la croissance de la lignée cellulaire et les résultats expérimentaux. Compter les cellules afin de minimiser l&#39;expérience à l&#39;expérience variability en raison de la densité. <ol><li> Selon la chambre de l&#39;environnement et les conditions nécessaires à l&#39;expérience, les cellules de la plaque dans des boîtes à puits unique (typiquement 35- ou 60-mm), 4 bien des plats de 35 mm, 6, 12 ou 24 plaques de culture cellulaire, ou Coverslip diapositives dans divers formats. Utiliser des plaques de verre à fond avec # 1.5 verre comme la plupart des lentilles de l&#39;objectif sont optimisés pour cette épaisseur de verre, et de l&#39;imagerie par culture cellulaire en plastique est très pauvre. Remarque: Certaines lignées de cellules ne se développent pas et survivent sur le verre. Dans ces cas, le verre peut être revêtue afin d&#39;améliorer l&#39; adhérence des cellules (par ex., La poly-lysine ou de collagène). Certaines entreprises fabriquent optique culture cellulaire en plastique, il doit être déterminé de manière empirique si cela est une option viable. </li></ol></li></ol> 4. Chambre de l&#39;environnement Set-up <ol><li> Avant toute expérimentation, mise en place de la chambre de l&#39; environnement afin qu&#39;il fonctionne à ~ 80% d&#39; humidité et ainsi de la température à la position de l&#39; échantillon est de 37 o C. La plupart des cellules en culture croissent dans 5% de CO 2 / équilibre atmosphère d&#39;air due à un tampon de bicarbonate de sodium dans le milieu. En fonction de la mise en place, soit définir le contrôleur de l&#39; environnement à 5% de CO 2 et il se mélange à 100% de CO 2 avec de l&#39; air, ou pré-mélangé, certifié gaz de l&#39; air 5% de CO 2 / de l&#39; équilibre. Suivez les instructions du fabricant pour des débits de gaz. Remarque: Certaines lignées cellulaires se développent dans CO 2 moyen -indépendante auquel cas ils peuvent être maintenus sans CO 2. Spécialement conçu support de formation d&#39;image est également disponible, qui limite l&#39;addition de composés autofluorescentes. La croissance des thèses médiums pour le type cellulaire souhaité doit être déterminée empiriquement au préalable. </li><li> Avant imagerie, d&#39;assurer le réservoir d&#39;eau est rempli (en suivant les instructions du fabricant) avec de l&#39;eau distillée stérile. Allumez la chambre de l&#39;environnement à la température désirée et le placer dans l&#39;encart de platine du microscope. Pour économiser de l&#39;essence, ne commencez pas le débit à ce point. Remarque: S&#39;il y a un espace libre entre la chambre stade supérieur et encart de scène et / ou de toute tension sur la connexion des cordons à la chambre, il peut introduire des artefacts de mouvement dans l&#39;expérience. <ol><li> Lay morceaux de pellicule de paraffine sur les bords de l&#39;insert d&#39;ouverture de scène avant d&#39;insérer la chambre en elle pour coupler la chambre à l&#39;étage, et assurez-vous qu&#39;aucune connexion tirent sur la chambre. </li></ol></li><li> Laisser la chambre à équilibrer à 37 o C. Maintenir une température stable pour éviter les fluctuations de température lors de l&#39;imagerie qui peut affecter la physiologie cellulaire et d&#39;introduire la dérive. Atteindre l&#39;équilibre de température nécessite généralement 30 min à 1 h, en fonction de l&#39;environnement. <ol><li> Insérez un plat «factice» avec de l&#39;eau dans les puits dans la chambre tout en chauffant. Un plat d&#39;imagerie rempli d&#39;eau imite l&#39;échantillon, qui aidera à assurer la chambre est suffisamment réchauffé et stabilisé. Remplir la chambre avec de l&#39;eau stérile préchaufféeréduit le temps nécessaire à la stabilisation de la température et réduit au minimum la diminution de la température lors de l&#39;addition de l&#39;échantillon expérimental. </li></ol></li></ol> 5. Microscope Set-up <ol><li> Allumez le microscope, ordinateur associé, et tous les périphériques nécessaires. <ol><li> En fonction de la source de lumière, attendez pour l&#39; allumer jusqu&#39;à ce que nécessaire (par ex., LED). </li></ol></li><li> Avec la tourelle objectif dans une position basse, sélectionnez l&#39;objectif 20X 0,7 NA à utiliser. </li><li> Placer l&#39;échantillon sur l&#39;objectif - ce sera plus facile de trouver les cellules lorsque l&#39;échantillon est dans la chambre. </li><li> Définir les paramètres d&#39;imagerie à ce moment si elles sont connues des expériences précédentes. </li></ol> 6. Le transport des cellules à Microscope et dans la chambre <ol><li> Transport des cellules à imager de l&#39;incubateur à la chambre de l&#39;environnement. Assurez -vous que cela soit fait rapidement pour limiter les effets d&#39;une relativement faible CO 2 </sub&gt; atmosphère et une diminution de la température sur les cellules. Suivez toutes les directives de biosécurité institutionnelles pour le transport des échantillons et de nettoyage en cas de déversement. <ol><li> Placez les cellules dans un récipient en polystyrène étanche ou un sac isolé pour éviter les grands changements environnementaux. </li></ol></li><li> Insérez le plat d&#39;imagerie de l&#39;échantillon dans la chambre en suivant les instructions du fabricant. </li><li> Après que les cellules ont été fixés à l&#39;intérieur de la chambre de l&#39;environnement, sceller la chambre pour maintenir un environnement stable et tournez immédiatement à la source (s) de gaz atmosphérique. <ol><li> Comme certaines chambres environnementales n&#39;utilisent pas un virage serré, couvercle étanche, pour retarder l&#39;évaporation, la couche stérile, l&#39;huile minérale certifiée embryon au-dessus du milieu de croissance. Enveloppez film de paraffine perméant gaz autour du périmètre bords du plat de l&#39;échantillon en faisant attention à ne pas obstruer la zone d&#39;imagerie en verre. , les méthodes d&#39;humidification secondaires localisées peuvent être employées. Condensation sur le couvercle de la boîte d&#39;échantillon peut diminuer performance de la microscopie en fond clair. </li></ol></li><li> Afin de minimiser les effets de la dérive thermique tôt au cours de l&#39;expérience, attendez 30 minutes avant de commencer le time-lapse. Le temps nécessaire varie en fonction de la taille du plat d&#39;imagerie et d&#39;autres facteurs. Déterminer de façon empirique. </li></ol> 7. Configuration de l&#39;imagerie <ol><li> Sélectionnez les conditions d&#39;imagerie qui représenteront le mieux les données. Prendre des précautions pour éviter la phototoxicité en limitant les temps d&#39;exposition, en utilisant la lumière d&#39;intensité plus faible et la sélection des sondes qui sont excités par des longueurs d&#39;onde de la lumière. </li><li> Définir x, y et z plane et la longueur d&#39;onde souhaitée (s) pour chaque position à imager. La résolution temporelle est limitée par le nombre de positions et de longueurs d&#39;onde. Pour long terme time-lapse de la plupart des processus cellulaires, acquérir une image toutes les 10 - 20 min; de plus haute résolution temporelle (intervalles courts, par exemple., 1 min) fournit plus de points de données et le suivi des cellules donc plus robuste, mais entraîne également plus intégréeexposition à la lumière et de plus grands ensembles de données. <ol><li> Comme HT1080 FUCCI ont des protéines dynamiques fluorescentes vert et rouge (voir résultats représentatifs), utiliser les durées d&#39;exposition suivantes: FITC / GFP - 50 msec, Texas Red / TRITC - 40 msec, fond clair - 20 msec. Utilisez un bac 2 x 2. </li></ol></li><li> Activer le logiciel autofocalisation contrôlé en utilisant les paramètres par défaut dans les paramètres avancés. Définir une plage de mise au point automatique de 10 pm avec la taille de l&#39;étape recommandée. Assurez-vous de le faire avant de commencer le time-lapse. Autofocus avec des images en fond clair et jamais avec fluorescence pour réduire la phototoxicité et photoblanchiment. <ol><li> Utilisez un logiciel contrôlé des systèmes de mise au point automatique sur un microscope avec une platine motorisée, et se concentrer directement sur l&#39;échantillon. Cependant, ils ne peuvent limiter la vitesse d&#39;acquisition de l&#39;expérience. Hardware contrôlé systèmes de focalisation en continu fonctionnent bien pour la microscopie time-lapse et d&#39;améliorer la vitesse, permettant plusieurs positions à imager ou un taux d&#39;acquisition plus élevé. Cependant, ilscompter sur la détection de l&#39;interface air-verre et peut perdre le focus de l&#39;échantillon avec des variations dans l&#39;épaisseur du verre à travers le puits. </li></ol></li><li> Remplacer la moitié du milieu par un milieu contenant la concentration de médicament désiré qui a été chauffé à 37 ° C le remplacement des médias partiel contribue à réduire la dérive thermique. Les conditions de cette expérience sont des véhicules (DMSO), 1 uM selinexor et 10 uM PD0332991. Remarque: Cette étape peut également être effectuée après le démarrage de l&#39;acquisition par une pause et de redémarrer l&#39;expérience. Cela permet un suivi longitudinal des réponses pré- et post-médicament de cellules individuelles. Si la stabilité ou le métabolisme drogue est une préoccupation, une pause et le remplacement des médias peut être fait avec la même méthode. Pour tester la dégradation du médicament ou du métabolisme, des médias à partir de cellules traitées peuvent également être placés sur des cellules naïves pour tester l&#39;action des médicaments. </li><li> Démarrez le time-lapse. </li><li> Comme le time-lapse fonctionne, vérifiez que les champs imagées restent au point et l&#39;chamber maintient une humidité de 37 o C. <ol><li> Réglez la mise au besoin en arrêtant l&#39;acquisition au cours de l&#39;intervalle de temps entre les points de temps. </li></ol></li><li> Si nécessaire, ajouter de l&#39;eau à la chambre lors des expériences plus longues. Éviter de refroidir la chambre en ajoutant de l&#39; eau distillée stérile préchauffée à 37 ° C. </li></ol> 8. Mettre fin à la Time-lapse <ol><li> Lorsque l&#39;expérience a exécuté jusqu&#39;à la fin, arrêtez l&#39;acquisition si elle n&#39;a pas été définie pour arrêter automatiquement. </li><li> Assurez-vous que le time-lapse a été enregistré correctement sur le disque dur, bien que la plupart des logiciels enregistrent automatiquement lors de l&#39;acquisition si pas fini correctement les données peuvent être perdues. </li><li> Retirer la chambre du microscope et de disposer des cellules dans les déchets biologiques en suivant les procédures de biosécurité institutionnelle approuvés. </li></ol> 9. Suivi longitudinal et analyse des données Time-lapse <ol><li> Choisissez la méthode d&#39;analyse qui estappropriés pour les processus biologiques d&#39;intérêt. De nombreux plugins pour ImageJ, les programmes utilisant MatLab, et les plates-formes personnalisées ont été produits pour des applications spécifiques. La méthodologie suivante concerne le suivi des noyaux et l&#39; analyse des sondes fluorescentes nucléaires , comme montré sur les figures 4 et 5. </li><li> Ouvrez les piles d&#39;images .tif pour les canaux utilisés dans ImageJ. Sinon, les fichiers natifs ouverts à partir du programme d&#39;acquisition directement dans ImageJ en utilisant le plugin Bioformats. </li><li> Dessinez une région d&#39;intérêt (ROI) dans le noyau d&#39;une cellule en utilisant l&#39;image de fond clair ou le canal d&#39;étiquette nucléaire (le cas échéant) et l&#39;ajouter au gestionnaire de ROI. Remarque: Si les cellules imagées ont une étiquette nucléaire (par exemple, histone H2B-EGFP.), Puis le suivi automatique des cellules peut être utilisé pour créer des régions d&#39;intérêt (ROI) représentant des noyaux individuels à travers le temps. </li><li> Passer au prochain point de temps et de positionner le retour sur investissement dans le même nucleus. Ajouter le retour sur investissement pour le gestionnaire de ROI. </li><li> Continuer de suivre et de faire ROIs pour la cellule individuelle jusqu&#39;à ce qu&#39;il y est un événement cellulaire (mitose, apoptose, etc.) Ou la cellule ne peut plus être suivi (ie., Se déplace hors du cadre ou l&#39;expérience se termine). </li><li> Lorsque ROIs ont été établies pour les cellules à travers le temps, ils sont sur le terrain, les superposer sur les canaux fluorescents d&#39;intérêt. Mesurer l&#39;intensité moyenne de la fluorescence dans chaque canal pour chaque point temporel. Enregistrer la liste de retour sur investissement pour une utilisation ultérieure. <ol><li> Diverses mesures peuvent être effectuées à l&#39;intérieur de la ROI pour des applications dans différentes expériences. Cliquez sur Analyse → Set mesures ... pour faire apparaître un menu pour choisir la méthode d&#39; analyse (par exemple., L&#39; intensité dans le retour sur investissement, d&#39;intensité intégrée, etc signifie.). </li></ol></li><li> Notez le destin des cellules pour les cellules individuelles (par exemple., L&#39; apoptose, la division, la survie) , tandis que le suivi. Ceci permet la création de courbes de survie et furtheanalyse de la population de r. </li><li> Avec l&#39;intensité moyenne pour les deux canaux, créer un nuage de points pour afficher la dynamique du cycle cellulaire en réponse à la thérapeutique (figure 5B, C). Note: Les parcelles peuvent être créées pour des cellules individuelles dans le temps ou en moyenne sur une population de cellules chenillés. l&#39;imagerie quantitative peut être critique pour l&#39;établissement des réponses complexes et des relations de cellule en réponse à la thérapeutique du cancer. Vidéomicroscopie à long terme, le suivi longitudinal et l&#39; analyse des données est un processus en plusieurs étapes, avec de nombreuses options pour le type d&#39;outils de microscopie et d&#39; analyse, et suit le schéma général présenté à la figure 1. </li></ol>

The authors have no conflicts of interest to disclose.

Avantages de Time-lapse Microscopie et le suivi longitudinal Le microscope est un instrument idéal pour des études longitudinales de la réponse aux médicaments car il permet aux enquêteurs de suivre les cellules individuelles et leurs destins ainsi que l&#39;ensemble de la population. Variabilité dans la réponse aux médicaments au sein d&#39;une population de cellules est un enjeu majeur pour la conception thérapeutique anti-cancer. Le suivi longitudinal des cellules individuelles permet aux enquêteurs d&#39;observer cette variabilité et commencent à comprendre les mécanismes sous-jacents et les conséquences en ce qui concerne la population de cellules. Utilisant une variété de sondes fluorescentes offre une multitude de façons d&#39;observer et de comprendre les deux phénotypes de réponse communes et rares. Le moment et la contribution des différents destins cellulaires à la réponse de la population, les relations entre les phénotypes et sorts spécifiques, et les différences de réponse entre des lignées cellulaires ou l&#39;état lors du traitement sont des exemples de ce qui peut être appris. De nombreux procédés associés au cancer peuvent être étudiés. Certains qui ne sont pas mis en évidence dans cet article incluent la mort cellulaire à l&#39; apoptose, l&#39; autophagie, et les journalistes de nécrose 39-42, l&#39; invasion des cellules 43,44, et la dynamique de p53 qui déterminent les décisions du destin cellulaire 27. En outre, cette approche ne se limite pas à des études dans la lutte contre le cancer thérapeutiques études. Les mêmes principes peuvent être utilisés pour étudier de nombreux autres processus biologiques , y compris la mitose 45 la dynamique du cytosquelette 46,47 et intracellulaire de signalisation 48. Time-lapse microscopie fluorescente peut aussi fournir des données de localisation et de l&#39;intensité de protéines et de molécules d&#39;intérêt. Non seulement les changements dans le niveau important de la réponse au médicament protéique, mais la localisation proprement dite (ou inadéquate) des protéines dans la cellule est essentielle pour comprendre la réponse. Vidéomicroscopie fournit des données sur l&#39; endroit où les protéines sont localisées (par exemple., Le noyau, le cytosol, organites spécifiques,etc.) après traitement de la toxicomanie et de la façon dont la localisation et les niveaux totaux changent au fil du temps à un niveau cellulaire et seule population. Défis et limites Malgré les points forts de la microscopie time-lapse et analyse longitudinale des cellules individuelles, il y a des limites. rapporteurs de fluorescence sont limitées par leur stabilité et leur spécificité. Lors de la conception des protéines de fusion fluorescentes, il est essentiel de choisir une sonde qui est photo-stable et clair, mais il est également nécessaire d&#39;examiner les effets de l&#39;étiquette fluorescente étant attachée à la protéine d&#39;intérêt en ce qui concerne sa fonction normale et la capacité de localiser correctement . Ces questions ont été examinées en détail ailleurs et il y a beaucoup de protéines marquées fluorescentes disponibles qui ont été publiées 15,49,50. D&#39;autres étiquettes ou marqueurs fluorescents peuvent être ajoutés aux cellules, et les soins doivent être prises pour veiller à ce qu&#39;ils ne sont pas toxiques. Dans notre expérience, ces pvêtements, par exemple des marqueurs mitochondriaux (potentiel de membrane cellulaire) ou perméable à des colorants d&#39;ADN, ont tendance à blanchir plus facilement et sera diluée, en raison de la prolifération cellulaire. En outre, il existe de nombreux défis techniques avec la croissance et l&#39;observation des cellules au microscope. Instabilité en ce qui concerne la température, l&#39;humidité, l&#39;atmosphère et la lumière aura des effets importants sur les cellules, ce qui entraîne une perte de données ou même toute l&#39;expérience. Problèmes de stabilité concernant la capture d&#39; image peut être vu dans les films 1 et 2. Cet effet peut être minimisée par l&#39;utilisation de film de paraffine (voir 4.2). Il y a aussi des algorithmes de stabilisation d&#39;image disponibles pour le traitement post-acquisition, par exemple en utilisant ImageJ (NIH). Un aspect de long terme time-lapse qui est souvent négligé est la gestion des données et la taille de fichier. Même lorsque binning les données, une expérience unique time-lapse est souvent supérieure à 30 gigaoctets. Haute capacité, à haute vitesse, le stockage de données fiables et de transfert sont fortsly encouragée. En fonction du biocapteur fluorescent (s) étant imagé, il est souvent nécessaire d&#39;acquérir des images pleine résolution, par exemple des capteurs nucléaires ou cytoplasmiques. Nous vous recommandons, si possible, de prendre des mesures pour maintenir la taille des fichiers, ce qui facilite l&#39;utilisation des données, besoins informatiques moins exigeants, et l&#39;amélioration des flux de travail. Phototoxicité est une préoccupation majeure lors de l&#39;exécution à long Vidéomicroscopie terme. la lumière d&#39;intensité élevée et de longues expositions peuvent conduire à photoblanchiment de sondes fluorescentes, le stress cellulaire et la mort cellulaire. Ces effets peuvent avoir des effets importants sur les données et conduire à de fausses déclarations de l&#39;expérience. binning et le gain caméra peuvent être utilisés pour réduire les temps d&#39;exposition. Les filtres de densité neutre dans le trajet de la lumière à réduire l&#39;intensité de la lumière sur l&#39;échantillon. Les longueurs d&#39;onde de la lumière utilisée à l&#39;image seront également affecter les cellules. longueurs d&#39;onde plus courtes (UV, près UV) sont plus dommageables pour les cellules et entraînent photo-blanchiment à des taux plus rapides quedes longueurs d&#39; onde (par exemple., rouge, rouge lointain). Choix de l&#39;objectif peut également affecter l&#39;imagerie conditions. La hausse des lentilles ouverture numérique (NA) va produire des images haute résolution, mais plus fort grossissement permet moins de lumière à transmettre de l&#39;échantillon qui entraînera une hausse des temps d&#39;exposition ou de la lumière plus intense. Un objectif doit être choisi avec un NA et grossissement approprié qui permettra de résoudre votre objet d&#39;intérêt sans suréchantillonnage. Dans de nombreux cas, l&#39;objectif le plus élevé ne peut pas être le choix le plus approprié. Avec des sondes nucléaires (figures 4, 5), un objectif à faible grossissement permet un plus grand champ d&#39;être capturé, augmentant efficacement la taille de l&#39; échantillon, sans compromettre la résolution de l&#39;objet désiré. À long terme time-lapse en trois dimensions doit être réalisée avec précaution en raison de l&#39;exposition lumineuse intégrée. Au moyen d&#39; un disque tournant confocal, une caméra sensible (par ex., EM-CCD), le gain de la caméra, et un moteur piézo - électrique rapide pour la série Z est suggested pour réduire l&#39;exposition de la lumière. acquisition z série rapide est également important de minimiser les artefacts dus au mouvement et à la dynamique des cellules de mouvement qui se produisent au cours de la période d&#39;acquisition. L&#39;analyse empirique des cellules non traitées à l&#39;aide de nombreux paramètres différents peuvent être utiles pour déterminer les effets de la lumière fluorescente sur une lignée cellulaire donnée ou reporter. En outre, un témoin non traité doit être inclus dans chaque expérience pour déterminer les effets cytotoxiques des paramètres expérimentaux. Les variations de la Technique À long terme time-lapse est robuste et très flexible. En utilisant des techniques de co-culture, les différentes lignées cellulaires ou les mêmes lignées cellulaires exprimant différents rapporteurs peuvent être utilisés. Un exemple remarquable de ce que l&#39;imagerie des cellules phagocytaires avec des cellules cibles qui meurent en réponse à un médicament anti-cancer. Un autre exemple pourrait être d&#39;étudier l&#39;impact de répondre cellules sur les cellules naïves de la drogue voisine. Couplé avec photo-activateable, photo-convertible, et les protéines fluorescentes photo-commutables, et des protéines modifiées qui peuvent être activés par la lumière pour déclencher des effets spécifiques (par exemple., KillerRed), il y a beaucoup de possibilités. Des approches plus complexes peuvent être utilisés qui emploient divers types spécialisés de la microscopie telles que la redistribution fluorescente après photoblanchiment, Förster transfert d&#39;énergie par résonance (FRET), et super résolution (par exemple., La microscopie de reconstruction optique stochastique (STORM), structure microscopique d&#39;éclairage (SIM), ou une déplétion émission stimulée (STED)), et bien d&#39;autres, et il y a des avantages et des limites de chaque approche. À long terme (par exemple., Semaines, mois) réponses et la récupération des cellules après élimination du médicament est essentielle à la compréhension anti-cancer action du médicament. plats à fond de verre GRILLE sont un outil précieux pour surveiller des cellules ou des régions spécifiques au sein d&#39;une population / région à plusieurs reprises. Par exemple, avec un plat grillagée, le dr initialréponse ug peut être imagée en utilisant un time-lapse, le médicament peut être retiré, et les domaines spécifiques de la grille peut être imagée dans le temps ou soumis à supplémentaire time-lapse au moment voulu. Le fond de verre sur la vaisselle peut être enlevée soit par découpe avec un outil de traçage ou en utilisant un réactif du commerce, et les cellules sur le verre peut être colorée pour d&#39;autres marqueurs d&#39;intérêt pour l&#39;activité associée exemple sénescence β-galactosidase, et par rapport à le time-lapse de comprendre l&#39;histoire de la façon dont les cellules ont atteint cet état. Si la population de cellules est suffisamment grand, il peut également être soumis à un immunotransfert ou cytométrie de flux. échantillons épais ont toujours été difficiles à l&#39;image, par exemple sphéroïdes dans divers matériaux de gel et de matrices. Les approches plus récentes , y compris confocal fluorescent ou multi-microscopie biphotonique 16,18,19,51 peut être utilisé pour étendre l&#39;approche à une dans la compréhension in situ de la façon dont les cellules répondent à la thérapeutique anti-cancer. leétudes soi et un nombre croissant de scientifiques utilisant time-lapse pour étudier la réponse aux médicaments anti-cancer 24,52-54 démontrent clairement que nous nous dirigeons vers le développement d&#39; une compréhension de la pharmacodynamique de cellules uniques qui aideront à améliorer notre capacité à utiliser des médicaments anti-cancer et peut-être plus efficacement prédire la réponse aux médicaments anti-cancéreux.

La microscopie des cellules vivantes et le suivi longitudinal des cellules individuelles ne sont pas une nouvelle technique. Dès les premiers microscopes, les amateurs et les scientifiques ont observé et étudié des cellules individuelles et les organismes, leurs comportements, et le développement 1-3. Un exemple célèbre de la fin David Rogers à l&#39; Université Vanderbilt dans les années 1950 montre un neutrophile humaine dans un frottis sanguin chassant une bactérie Staphylococcus aureus et éventuellement le processus de phagocytose 4. Ce film live-cellule est une excellente illustration de la façon dont les processus multiples peuvent être observés et corrélées en une seule expérience: détection d&#39;un gradient chimique, mécanique et de la vitesse de la motilité cellulaire, cellule façonne la dynamique, l&#39;adhérence et la phagocytose d&#39;un agent pathogène. L&#39;avènement des microscopes entièrement automatisés et des caméras numériques très sensibles a donné lieu à un nombre croissant de chercheurs en utilisant la microscopie à poser des questions fondamentales en biologie cellulaire allant from comment les cellules se déplacent 5,6 et 7,8 à diviser organite dynamique et le trafic membranaire 9-11. Non-fluorescent, la microscopie en fond clair, y compris à contraste de phase (PC), qui a recueilli le prix Nobel de Frits Zernike en 1953, et le contraste d&#39;interférence différentiel (DIC) permettre l&#39;observation des cellules et des noyaux, mais aussi des structures sous-cellulaires, y compris les faisceaux de microtubules , les chromosomes, les nucléoles, la dynamique des organites et des fibres d&#39;actine épaisses 12. Génétiquement codés protéines fluorescentes et le développement des colorants fluorescents contre organites ont considérablement influencé time-lapse microscopie 13-15. Bien que pas l&#39;objet de cet article, l&#39; imagerie en sphéroïdes cellulaires et in situ (microscopie intravitale) en utilisant la microscopie confocale et multiphotonique représentent une autre expansion de l&#39;approche, et il y a des articles en suspens qui utilisent et traitent de ces approches 16-19. Les réponses des cellules à l&#39;anti-cancmédicaments er ou de produits naturels sont déterminés à l&#39;échelle moléculaire et cellulaire. Comprendre le traitement des réponses cellulaires et sorts suivants implique souvent la population (par exemple , des analyses moyennes., Immunoblot, des mesures entières de puits), ou points de temps fixes avec détection par immunofluorescence et la cytométrie de flux, qui mesurent des cellules individuelles. Hétérogénéité dans les réponses des cellules individuelles à des médicaments au sein d&#39;une population, en particulier dans les tumeurs, peut expliquer en partie la variabilité de la réponse observée dans les lignées cellulaires et les tumeurs qui sont traités avec le même médicament à saturation. À long terme des approches longitudinales de suivre une seule cellule donnée ou une population de cellules est une approche moins commune , mais très puissant qui permet l&#39;étude directe des voies de réponse moléculaire, différents phénotypes (par exemple., La mort cellulaire ou la division cellulaire), l&#39; observation de la variabilité de cellule à cellule dans une population, et comment ces facteurs contribuent à la dynamique de la réponse de la population 20-22. Optimiste, pouvoird&#39;observer et de quantifier les réponses des cellules individuelles contribuera à améliorer notre compréhension de la façon dont les médicaments fonctionnent, pourquoi ils ne parviennent pas toujours, et comment les utiliser au mieux. La technique de la microscopie à long terme time-lapse, suivi longitudinal, et l&#39; analyse des réponses des médicaments est disponible pour de nombreux chercheurs et peut être simple, en utilisant la lumière uniquement transmis à observer le phénotype des réponses 20,21. Les principales composantes de l&#39;approche comprennent: la préparation appropriée des cellules d&#39;intérêt, un microscope automatisé avec la chambre de l&#39;environnement, un appareil photo intégré à un ordinateur pour acquérir et stocker les images, et le logiciel pour examiner le time-lapse et de mesurer et d&#39;analyser les cellules et tous les biocapteurs fluorescents. Nous fournissons un protocole détaillé avec de nombreux conseils pour la conduite Vidéomicroscopie des cellules cultivées aussi longtemps que plusieurs jours en utilisant clair et / ou microscopie épifluorescence widefield. Ce protocole peut être utilisé pour toute lignée cellulaire qui peut être cultivée dans une culturepour étudier les réponses aux traitements anti-cancéreux. Nous fournissons des exemples de données acquises et analysées en utilisant plusieurs différents biocapteurs fluorescents génétiquement codés et un exemple de la microscopie à contraste de phase, discuter brièvement les différents types de sondes, les avantages et les inconvénients à long terme time-lapse et le suivi longitudinal, ce qui peut être appris pour cette approche qui est difficile à comprendre des approches non-directes, et quelques variations que nous espérons être d&#39;intérêt et de la valeur pour les chercheurs inexpérimentés qui ne l&#39;ont pas envisagé d&#39;utiliser l&#39;approche et à des chercheurs expérimentés.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Taxol (paclitaxel)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7191</td>
			<td>microtubule stabilizing drug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>etoposide</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1225</td>
			<td>topoisomerase II inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>selinexor</td>
			<td>Karyopharm Therapeutics</td>
			<td>na</td>
			<td>XPO1/CRM1 inhibitor, gift</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinesin-5 inhibitor</td>
			<td>Merck Serono</td>
			<td>na</td>
			<td>gift, also available from American Custom Chemicals Corporation. CAS 858668-07-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell growth medium</td>
			<td>HyClone (Fisher) or Mediatech</td>
			<td></td>
			<td>many companies available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% CO2/balance air, certified</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>Z03NI7222004379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm dish, 20mm glass bottom</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>D35-20-1.5-N</td>
			<td>many companies available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm 4 well dish, 20mm glass bottom</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>D35C4-20-1.5-N</td>
			<td>many companies available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm dish, gridded glass bottom</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-2-14-CGRD</td>
			<td>many companies available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multi-well, glass bottom</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>P12-1.5H-N</td>
			<td>many companies available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX81 inverted epifluorescence microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX2-UCB controller</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRIOR LumenPro200</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td>Lumen200PRO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRIOR Proscan III motorized stage</td>
			<td>Prio Scientific</td>
			<td>H117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEV chamber</td>
			<td>InVivo Scientific</td>
			<td>STEV.ECU.HC5 STAGE TOP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Environmental Controller Unit</td>
			<td>InVivo Scientific</td>
			<td>STEV.ECU.HC5 STAGE TOP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamamatsu ORCA R2 CCD with controller</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C10600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon laser launch</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOLA light engine</td>
			<td>lumencor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXon Ultra 897 EM-CCD</td>
			<td>ANDOR&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOKAI HIT inclubation chamber</td>
			<td>TOKAI HIT</td>
			<td>TIZSH</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

through the looking glass: time-lapse microscopy and longitudinal tracking of single cells to study anti-cancer therapeutics

La réponse des cellules individuelles aux médicaments anti-cancer contribue de manière significative dans la détermination de la réponse de la population, et est donc un facteur important dans le résultat global. Immunoblotting, la cytométrie en flux et les expériences cellulaires fixes sont souvent utilisés pour étudier comment les cellules répondent aux médicaments anti-cancéreux. Ces méthodes sont importants, mais ils ont plusieurs lacunes. Variabilité dans les réponses de la drogue entre le cancer et les cellules normales, et entre les cellules d&#39;origine du cancer différents, transitoires et réponses rares sont difficiles à comprendre en utilisant des tests population de moyenne et sans être en mesure de suivre et de les analyser longitudinalement directement. Le microscope est particulièrement bien adapté à des cellules vivantes d&#39;image. Les progrès réalisés dans la technologie permettent de routinière les cellules d&#39;image à une résolution qui permet non seulement le suivi des cellules, mais également l&#39;observation d&#39;une variété de réponses cellulaires. Nous décrivons une approche en détail qui permet l&#39;imagerie en continu time-lapse deles cellules au cours de la réponse à un médicament pour l&#39;essentiel aussi longtemps que souhaité, typiquement jusqu&#39;à 96 h. Utilisation de variations de l&#39;approche, les cellules peuvent être surveillés pendant des semaines. Avec l&#39;emploi des codés génétiquement biocapteurs fluorescents de nombreux processus, les voies et les réponses peuvent être suivies. Nous montrons que des exemples comprennent le suivi et la quantification de la croissance cellulaire et la progression du cycle cellulaire, la dynamique des chromosomes, des lésions de l&#39;ADN et la mort cellulaire. Nous discutons également des variations de la technique et de sa flexibilité, et mettre en évidence certains pièges courants.

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Through the Looking Glass: Time-lapse Microscopy and Longitudinal Tracking of Single Cells to Study Anti-cancer Therapeutics

Here, we describe a method of long-term time-lapse microscopy to longitudinally track single cells in response to anti-cancer therapeutics.

Through the Looking Glass: Time-lapse Microscopie et le suivi longitudinal des cellules individuelles pour l&#39;étude Therapeutics Anti-cancer

The response of single cells to anti-cancer drugs contributes significantly in determining the population response, and therefore is a major contributing ...

through-looking-glass-time-lapse-microscopy-longitudinal-tracking

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

10.9K vues.  University of Colorado, Boulder. Here, we describe a method of long-term time-lapse microscopy to longitudinally track single cells in response to anti-cancer therapeutics.

Vidéo: Through the Looking Glass: Time-lapse Microscopy and Longitudinal Tracking of Single Cells to Study Anti-cancer Therapeutics

Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens

The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined by current drug efficacy tests and the efficacy on patients. Thus, novel and reliable methods for evaluating drug efficacy are warranted in pre-clinical phase. In vitro culture of tumor tissues, including cell lines, has substantial phenotypic, genetic, and epigenetic alterations of cancer cells caused by artificial environment of cell culture, which may not reflect the biology of original tumors in situ. Xenograft models with the immunodeficient mice also have limitations, i.e., the lack of immune system and interspecies genetic and epigenetic discrepancies in microenvironment. Here, we demonstrate a novel method using the surgical specimens of malignant glioma as undissociated tumor blocks to evaluate treatment effects. To validate this method, data with the current first-line chemotherapeutic agent, temozolomide (TMZ), are described.


We used the freshly-removed surgical specimen of malignant glioma for our experiments. We performed intratumoral injection of TMZ or other drug candidates, followed by incubation and analysis on surgical specimens. Here, we sought to establish a tumor tissue explant method as a platform to determine the efficacy of novel anti-cancer therapies so that we may be able to overcome, at least, some of the current limitations and fill the existing gap between the current experimental data and the efficacy on an actual patient's tumor. This method may have the potential to accelerate identifying novel chemotherapeutic agents for solid cancer treatment.

Here, we established a method for drug efficacy testing with surgical specimens of brain tumors, termed &#x201C;tumor explant method&#x201D;. With this method, we can evaluate drug efficacy without breaking the microenvironment of solid tumors. To validate reliability of this method, we describe representative data with our glioma specimen treated with the current first-line chemotherapeutic agent, temozolomide.

Méthode pour le développement de nouveaux médicaments anti-cancer en utilisant des explants des tumeurs des spécimens chirurgicaux


The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined ...

Recherche

Médecine

The Measurement and Treatment of Suppression in Amblyopia

Amblyopia, a developmental disorder of the visual cortex, is one of the leading causes of visual dysfunction in the working age population. Current estimates put the prevalence of amblyopia at approximately 1-3%1-3, the majority of cases being monocular2. Amblyopia is most frequently caused by ocular misalignment (strabismus), blur induced by unequal refractive error (anisometropia), and in some cases by form deprivation.
Although amblyopia is initially caused by abnormal visual input in infancy, once established, the visual deficit often remains when normal visual input has been restored using surgery and/or refractive correction. This is because amblyopia is the result of abnormal visual cortex development rather than a problem with the amblyopic eye itself4,5 . Amblyopia is characterized by both monocular and binocular deficits6,7 which include impaired visual acuity and poor or absent stereopsis respectively. The visual dysfunction in amblyopia is often associated with a strong suppression of the inputs from the amblyopic eye under binocular viewing conditions8. Recent work has indicated that suppression may play a central role in both the monocular and binocular deficits associated with amblyopia9,10 .
Current clinical tests for suppression tend to verify the presence or absence of suppression rather than giving a quantitative measurement of the degree of suppression. Here we describe a technique for measuring amblyopic suppression with a compact, portable device11,12 . The device consists of a laptop computer connected to a pair of virtual reality goggles. The novelty of the technique lies in the way we present visual stimuli to measure suppression. Stimuli are shown to the amblyopic eye at high contrast while the contrast of the stimuli shown to the non-amblyopic eye are varied. Patients perform a simple signal/noise task that allows for a precise measurement of the strength of excitatory binocular interactions. The contrast offset at which neither eye has a performance advantage is a measure of the "balance point" and is a direct measure of suppression. This technique has been validated psychophysically both in control13,14 and patient6,9,11 populations.
In addition to measuring suppression this technique also forms the basis of a novel form of treatment to decrease suppression over time and improve binocular and often monocular function in adult patients with amblyopia12,15,16 . This new treatment approach can be deployed either on the goggle system described above or on a specially modified iPod touch device15.

Amblyopia is a developmental disorder of the visual cortex that is often accompanied by strong suppression of one eye. We present a new technique for measuring and treating interocular suppression in patients with amblyopia that can be deployed using virtual reality goggles or a portable iPod Touch device.

La mesure et le traitement de répression dans l&#39;amblyopie

Amblyopia, a developmental disorder of the visual cortex, is one of the leading causes of visual dysfunction in the working age population. Current ...

Intranasal Administration of CNS Therapeutics to Awake Mice

Intranasal administration is a method of delivering therapeutic agents to the central nervous system (CNS). It is non-invasive and allows large molecules that do not cross the blood-brain barrier access to the CNS. Drugs are directly targeted to the CNS with intranasal delivery, reducing systemic exposure and thus unwanted systemic side effects1. Delivery from the nose to the CNS occurs within minutes along both the olfactory and trigeminal neural pathways via an extracellular route and does not require drug to bind to any receptor or axonal transport2. Intranasal delivery is a widely publicized method and is currently being used in human clinical trials3.
Intranasal delivery of drugs in animal models allows for initial evaluation of pharmacokinetic distribution and efficacy. With mice, it is possible to administer drugs to awake (non-anesthetized) animals on a regular basis using a specialized intranasal grip. Awake delivery is beneficial because it allows for long-term chronic dosing without anesthesia, it takes less time than with anesthesia, and can be learned and done by many people so that teams of technicians can dose large numbers of mice in short periods. Efficacy of therapeutics administered intranasally in this way to mice has been demonstrated in a number of studies including insulin in diabetic mouse models 4-6 and deferoxamine in Alzheimer's mouse models. 7,8
The intranasal grip for mice can be learned, but is not easy and requires practice, skill, and a precise grip to effectively deliver drug to the brain and avoid drainage to the lung and stomach. Mice are restrained by hand using a modified scruff in the non-dominant hand with the neck held parallel to the floor, while drug is delivered with a pipettor using the dominant hand. It usually takes 3-4 weeks of acclimating to handling before mice can be held with this grip without a stress response. We have prepared this JoVE video to make this intranasal delivery technique more accessible.

A method to intranasally administer drugs to awake mice for the purpose of targeting the brain is described. This method allows for repeat dosing over long periods using intranasal administration of drug without anesthesia, and nose-to-brain delivery with minimal systemic exposure.

L&#39;administration intranasale d&#39;Therapeutics SNC à des souris éveillées

Intranasal administration is a method of delivering  therapeutic agents to the central nervous system (CNS). It is  non-invasive and allows large ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from different genetically engineered mouse models of breast cancer. For example, time between cell divisions (cell lifetimes), apoptotic cell numbers, evolution of morphological changes, and mechanism of colony formation can be quantified and compared in cells carrying specific genetic lesions. Primary mammary epithelial cell cultures are generated from mammary glands without palpable tumor. Glands are carefully resected with clear separation from adjacent muscle, lymph nodes are removed, and single-cell suspensions of enriched mammary epithelial cells are generated by mincing mammary tissue followed by enzymatic dissociation and filtration. Single-cell suspensions are plated and placed directly under a microscope within an incubator chamber for live-cell imaging. Sixteen 650 &mu;m x 700 &mu;m fields in a 4x4 configuration from each well of a 6-well plate are imaged every 15 min for 5 days. Time-lapse images are examined directly to measure cellular behaviors that can include mechanism and frequency of cell colony formation within the first 24 hr of plating the cells (aggregation versus cell proliferation), incidence of apoptosis, and phasing of morphological changes. Single-cell tracking is used to generate cell fate maps for measurement of individual cell lifetimes and investigation of cell division patterns. Quantitative data are statistically analyzed to assess for significant differences in behavior correlated with specific genetic lesions.

Time-lapse imaging is used to assess behavior of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer risk to determine if there are correlations between specific behavioral parameters and distinct genetic lesions.

Imagerie time-lapse de primaires prénéoplasiques cellules épithéliales mammaires issues de modèles de souris génétiquement modifiées de cancer du sein

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

A Novel haute résolution<em&gt; In vivo</em&gt; Technique d&#39;imagerie pour étudier la réponse dynamique des structures intracrâniennes à la croissance tumorale et de thérapeutique

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

Pulse Wave Velocity Testing in the Baltimore Longitudinal Study of Aging

Carotid-femoral pulse wave velocity is considered the gold standard for measurements of central arterial stiffness obtained through noninvasive methods1.&#160;Subjects are placed in the supine position and allowed to rest quietly for at least 10 min prior to the start of the exam. The proper cuff size is selected and a blood pressure is obtained using an oscillometric device. Once a resting blood pressure has been obtained, pressure waveforms are acquired from the right femoral and right common carotid arteries. The system then automatically calculates the pulse transit time between these two sites (using the carotid artery as a surrogate for the descending aorta). Body surface measurements are used to determine the distance traveled by the pulse wave between the two sampling sites. This distance is then divided by the pulse transit time resulting in the pulse wave velocity. The measurements are performed in triplicate and the average is used for analysis.

Pulse wave velocity (PWV) measurement assesses arterial stiffness by a tonometry-based system that measures the speed with which arterial pressure wave travels along the arterial tree, typically approximating the time that it takes this wave to travel from the descending aorta (using the carotid artery as a surrogate) to the femoral artery. Carotid-femoral PWV increases two- to threefold across the adult lifespan.

Vague d&#39;impulsion de tests de vitesse dans la Baltimore Longitudinal Study of Aging

Carotid-femoral pulse wave velocity is considered the gold standard for measurements of central arterial stiffness obtained through noninvasive ...

Confocal Time Lapse Imaging as an Efficient Method for the Cytocompatibility Evaluation of Dental Composites

It is generally accepted that in vitro cell material interaction is a useful criterion in the evaluation of dental material biocompatibility. The objective of this study was to use 3D CLSM time lapse confocal imaging to assess the in vitro biocompatibility of dental composites. This method provides an accurate and sensitive indication of viable cell rate in contact with dental composite extracts. The ELS extra low shrinkage, a dental composite used for direct restoration, has been taken as example. In vitro assessment was performed on cultured primary human gingival fibroblast cells using Live/Dead staining. Images were obtained with the FV10i confocal biological inverted system and analyzed with the FV10-ASW 3.1 Software. Image analysis showed a very slight cytotoxicity in the presence of the tested composite after 5 hours of time lapse. A slight decrease of cell viability was shown in contact with the tested composite extracts compared to control cells. The findings highlighted the use of 3D CLSM time lapse imaging as a sensitive method to qualitatively and quantitatively evaluate the biocompatibility behavior of dental composites.

The most studied aspect of the biocompatibility of dental composites is their cytotoxicity 3D CLSM time lapse imaging combined with fluorescent signal quantification allows sensitive evaluation of the cell fate over time. Utilizing this method could be an efficient tool to assess the cytocompatibility of dental composites.

Confocale Accéléré Imaging comme une méthode efficace pour l&#39;évaluation cytocompatibilité de composites dentaires

It is generally accepted that in vitro cell material interaction is a useful criterion in the evaluation of dental material biocompatibility. The ...

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

Recent advances in the application of bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSC) for the treatment of tendon and ligament injuries in the horse suggest improved outcome measures in both experimental and clinical studies. Although the BMMSC are implanted into the tendon lesion in large numbers (usually 10 - 20 million cells), only a relatively small number survive (&#60;10%) although these can persist for up to 5 months after implantation. This appears to be a common observation in other species where BMMSC have been implanted into other tissues and it is important to understand when this loss occurs, how many survive the initial implantation process and whether the cells are cleared into other organs. Tracking the fate of the cells can be achieved by radiolabeling the BMMSC prior to implantation which allows non-invasive in vivo imaging of cell location and quantification of cell numbers.
This protocol describes a cell labeling procedure that uses Technetium-99m (Tc-99m), and tracking of these cells following implantation into injured flexor tendons in horses. Tc-99m is a short-lived (t1/2 of 6.01 hr) isotope that emits gamma rays and can be internalized by cells in the presence of the lipophilic compound hexamethylpropyleneamine oxime (HMPAO). These properties make it ideal for use in nuclear medicine clinics for the diagnosis of many different diseases. The fate of the labeled cells can be followed in the short term (up to 36 hr) by gamma scintigraphy to quantify both the number of cells retained in the lesion and distribution of the cells into lungs, thyroid and other organs. This technique is adapted from the labeling of blood leukocytes and could be utilized to image implanted BMMSC in other organs.

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

This protocol describes the radiolabeling of equine mesenchymal stem cells and their implantation into tendon injuries in the horse in order to determine cell survival and tissue distribution using gamma scintigraphy.

Imagerie in vivo et le suivi de technétium 99m Étiqueté moelle osseuse Cellules souches mésenchymateuses dans Tendinopathie Hippique

Recent advances in the application of bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSC) for the treatment of tendon and ligament injuries in the horse suggest ...

Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and metastasis. Multicellular interactions in the tumor microenvironment can lead to transient events including directional tumor cell motility and vascular permeability. Quantification of tumor vascular permeability has frequently used end-point experiments to measure extravasation of vascular dyes. However, due to the transient nature of multicellular interactions and vascular permeability, the kinetics of these dynamic events cannot be discerned. By labeling cells and vasculature with injectable dyes or fluorescent proteins, high-resolution time-lapse intravital microscopy has allowed the direct, real-time visualization of transient events in the tumor microenvironment. Here we describe a method for using multiphoton microscopy to perform extended intravital imaging in live mice to directly visualize multicellular dynamics in the tumor microenvironment. This method details cellular labeling strategies, the surgical preparation of a mammary skin flap, the administration of injectable dyes or proteins by tail vein catheter and the acquisition of time-lapse images. The time-lapse sequences obtained from this method facilitate the visualization and quantitation of the kinetics of cellular events of motility and vascular permeability in the tumor microenvironment.

This protocol describes the use of multiphoton microscopy to perform extended time-lapse imaging of multicellular interactions in real time, in vivo at single cell resolution.

Time-lapse Extended Imagerie intravitale du temps réel multicellulaire Dynamics dans le microenvironnement de la tumeur

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and ...

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

Remodeling of the brain vasculature is a common trait of brain pathologies. In vivo imaging techniques are fundamental to detect cerebrovascular plasticity or damage occurring overtime and in relation to neuronal activity or blood flow. In vivo two-photon microscopy allows the study of the structural and functional plasticity of large cellular units in the living brain. In particular, the thinned-skull window preparation allows the visualization of cortical regions of interest (ROI) without inducing significant brain inflammation. Repetitive imaging sessions of cortical ROI are feasible, providing the characterization of disease hallmarks over time during the progression of numerous CNS diseases. This technique accessing the pial structures within 250 &#956;m of the brain relies on the detection of fluorescent probes encoded by genetic cellular markers and/or vital dyes. The latter (e.g., fluorescent dextrans) are used to map the luminal compartment of cerebrovascular structures. Germane to the protocol described herein is the use of an in vivo marker of amyloid deposits, Methoxy-O4, to assess Alzheimer&#39;s disease (AD) progression. We also describe the post-acquisition image processing used to track vascular changes and amyloid depositions. While focusing presently on a model of AD, the described protocol is relevant to other CNS disorders where pathological cerebrovascular changes occur.

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

This manuscript describes a procedure to track the remodeling of the cerebrovasculature during amyloid plaque accumulation in vivo using longitudinal two-photon microscopy. A thinned-skull preparation enables the visualization of fluorescent dyes to assess the progression of cerebrovascular damage in a mouse model of Alzheimer&#39;s disease.

Through the Looking Glass: Time-lapse Microscopie et le suivi longitudinal des cellules individuelles pour l'étude Therapeutics Anti-cancer

Résumé

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Chapitres dans cette vidéo

Méthode pour le développement de nouveaux médicaments anti-cancer en utilisant des explants des tumeurs des spécimens chirurgicaux

La mesure et le traitement de répression dans l'amblyopie

L'administration intranasale d'Therapeutics SNC à des souris éveillées

Imagerie time-lapse de primaires prénéoplasiques cellules épithéliales mammaires issues de modèles de souris génétiquement modifiées de cancer du sein

A Novel haute résolution

Vague d'impulsion de tests de vitesse dans la Baltimore Longitudinal Study of Aging

Confocale Accéléré Imaging comme une méthode efficace pour l'évaluation cytocompatibilité de composites dentaires

Imagerie in vivo et le suivi de technétium 99m Étiqueté moelle osseuse Cellules souches mésenchymateuses dans Tendinopathie Hippique

Time-lapse Extended Imagerie intravitale du temps réel multicellulaire Dynamics dans le microenvironnement de la tumeur

Longitudinal