이 작품은 Carraresi 재단과 당뇨병 연구를위한 유럽 재단 (EFSD)에 의해 투자되었다. GP는 밀라노 대학의 후 문서의 교제에 의해 지원됩니다. 후성 유전학과 Periconception 환경과 BM1308 공유 큰 동물 모델에서 진행 비용 조치 (살람) : 저자는 비용 작업 FA1201 Epiconcept의 구성원입니다. TALB은 비용 조치 CM1406 성적인 화학 생물학 (EPICHEM)의 회원입니다.

주의 : 아래에 기재된 모든 절차를 무균 상태에서 층류 후드에서 수행되어야한다. 그들의 처리에 걸쳐 37 ° C에서 모든 문화 절차가 온도 조절 단계에서 수행하는 세포가 유지되어 있는지 확인합니다. 1. 피부 섬유 아세포의 분리 <ol><li> 문화 접시 코팅액을 제조 <ol><li> 물 (최종 농도 0.1 %) 100 ㎖에 돼지 젤라틴 0.1 g을 녹인다. 오토 클레이브와 솔루션을 소독. </li><li> 35mm 배양 접시에 무균 0.1 % 돼지 젤라틴의 1.5 ML을 추가합니다. 실온에서 그들을 유지, 코트에 2 시간을 기다립니다. 주 : 인간의 피부 생검 전완의 앞쪽 양태의 무 혈관 영역에서 국소 마취 절제하여 수거하고, 사용하기 전에 4 ℃에서 2 % 항생제 항진균제 용액이 보충 된 둘 베코 인산염 완충 식염수 (PBS)에 저장된다. </li></ol></li><li> 새로운 PBS로 세척 생검은 2 % antibi 보충귀 안티 곰팡이 솔루션입니다. </li><li> 장소 a를 100mm 페트리 접시에 조직 검사와 멸균 메스와 약 2mm 3 조각으로 잘라. </li><li> 단편 도금 직전에 도포 액의 과도한 제거. </li><li> 사전 코팅 35mm 페트리 접시에 5-6 피부 조각을 놓습니다. </li><li> 섬유 아세포 배양 배지를 준비 : 77 % 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM) 고 글루코스, 20 % 우 태아 혈청 (FBS), 1 % L- 글루타민 용액 및 2 % 항생제 항진균제 용액. </li><li> 5 % CO 2 37 ° C에서 각각의 조각 (조각 당 보통 100 μL), 문화 그들을 섬유 아세포 매체의 방울을 추가합니다. </li><li> 24 시간 후, 5 % CO 2에서 37 ℃에서 습윤을 유지하기 위해 조각 위에 섬유 아세포 배양 배지 500 μl를 추가한다. </li><li> 적어도 한 번 피펫마다 48 시간과 매체를 변경합니다. </li><li> 배양 6 일 후, 조심스럽게 조직 조각을 제거하고 폐기합니다. 참고 : 6 일 후, 섬유 아세포S는 조직 절편에서 성장하고 세포 단층을 형성하기 시작한다. </li><li> 매체 고침 섬유 아세포 배양액 2 ㎖를 추가 한 5 % CO2 인큐베이터에서 37 ℃에서 세포 단층 배양을 계속한다. </li></ol> 2. 섬유 아세포 문화 <ol><li> 37 ° C에서 배양 섬유 아세포 5 % CO 2에서 80 %의 합류까지 </li><li> 조직 배양 접시에서 계대, 흡인 섬유 아세포 배양 배지하십시오. PBS의 4 ㎖로 세포를 세 번 씻으 1 % 항생제 항진균제 용액으로 보충. </li><li> 트립신 EDTA 수용액 (0.5 g / 리터 돼지 트립신 및 0.2 g / L EDTA)의 얇은 층 (배양 배지 용적의 10 %)를 첨가하고, 세포 단층을 조직의 바닥으로부터 분리되기 시작할 때까지 37 ° C 부화 배양 접시에 세포를 떼어 놓다. </li><li> 트립신 작용을 중화 섬유 아세포 배지 9 부를 세포 현탁액을 희석. 원심 분리는 필요하지 않습니다. </li><li> 새로운 배양 접시에서 플레이트 세포 (와젤라틴 아웃)과 문화 5 % CO 2 배양기에서 37 ° C에서. 성장 속도에 따라, 4 : 2, 1 : 1 사이의 통로 비율을 유지한다. </li><li> 세포 (주당 보통 회) 약 80 %의 합류 통로를 도달하면. </li></ol> 성적인 변환 3. 섬유 아세포 도금 <ol><li> 세포 배양 접시에 0.26 ㎖ / 0.1 % 돼지 젤라틴 cm 2 (1.1에 설명 된대로 준비) 추가합니다. 코트에 2 시간을 기다립니다. </li><li> 섬유 아 세포를 도금하기 전에 도포 액을 초과하는 10 ~ 30 분을 제거합니다. </li><li> 배양 접시에서 섬유 아세포 배양 배지를 제거합니다. PBS로 세포를 세 번 씻으 1 % 항생제 항진균제 용액으로 보충. </li><li> 트립신 EDTA 수용액 (0.5 g / 리터 돼지 트립신 및 0.2 g / L EDTA)의 얇은 층 (배양 배지 용적의 10 %)를 첨가하고, 세포 단층을 조직의 바닥으로부터 분리되기 시작할 때까지 37 ° C 부화 배양 접시에 세포를 떼어 놓다. </li><li> fibrobl 9 부분으로 세포 현탁액을 희석AST 배지는 트립신 중화 작용. </li><li> 실온에서 현미경 카운팅 챔버를 이용하여 세포 수를 계산. / ㎠ 7.8 × 104 섬유 아세포의 세포 농도를 얻기 위해, 세포를 재현 탁하는 섬유 아세포 배양액의 필요한 부피를 계산한다. 이것은 사용 챔버의 특정 유형에 의존 할 것이다. 셀 / μL = 작은 그리드 X 90 (곱셈) × 희석 당 세포의 평균 수 </li><li> 실온에서 5 분 동안 150g로 원심 분리 세포 현탁액. 섬유 아세포 배지 이전에 계산 된 양으로 재현 탁하고 세포 상등액을 제거한다. </li><li> 0.1 % 젤라틴 미리 코팅 요리와 5 % CO 2 배양기에서 37 ° C에서 24 시간 동안 문화를 접시에 세포. </li></ol> 탈 메틸화 에이전트 5 아자 - CR을 사용하여 4. 증가 셀 소성 <ol><li> 날 0 <ol><li> DMEM 고 글루코스 메디칼 10ml에 5- 아자 CR 2.44 mg을 용해시켜 5- 아자 - CR 원액을 준비음. 여과 소독. 바로 사용하기 전에 5 아자 - CR 주식을 준비합니다. </li><li> 섬유 아세포 배양 배지 (최종 농도 1 μM) 1 ㎖에 5 아자 CR 원액 1 μl를 희석. </li><li> 세포의 가소성, 세포 도금 (소호 3.8) 후 24 시간을 늘리려면 시드 섬유 아 세포에서 배지를 제거하고 CO 2 배양기 5 %에서 37 ° C에서 18 시간 동안 1 μM 5 아자 - CR 원액과 문화를 추가 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 1 일 <ol><li> 표 1에 기재된 바와 같이 신선한 인간 다 능성 (HP) 배지를 준비한다. </li><li> 1 μM 5 아자 CR 함께 배양 한 결과, 5- 아자 - CR 멀리 세정되도록 PBS로 3 회 배지를 제거하고 세포를 세척한다. </li><li> 부화 -5- 아자 - CR 5 % CO 2에서 37 ℃에서 3 시간 (회복 기간)에 대한 HP 매체 처리 아세포. </li><li> 회복 기간 후, 중간 제거 PBS로 3 회 세척한다. </li><li> 5- 아자 - CR 처리의 효율을 모니터링하기 위해,이 단계 f 체크인또는 형태 학적 변화의 존재는 (결과 섹션에 설명). 세포는 섬유 아세포의 전형적인 긴 형태를 잃고 확대 핵으로, 크기가 작아지고, 원형 또는 타원형 모양을 취득. </li><li> 췌장 분화를 진행합니다. </li></ol></li></ol> 5. 췌장 분화 프로토콜 <ol><li> 일 1-6 <ol><li> 표 2에 기술 된 바와 같이 췌장 기초 배지를 준비합니다. </li><li> 원액을 티빈 준비 : 멸균의 166.6 μL에서 재조합 인간 단백질을 티빈의 5 μg의 용해. </li><li> 배양 5 아자 CR 5 % CO 2 인큐베이터에서 37 ° C에서 6일 위해 (5.1.2 참조) 1 μL / ㎖ 액 티빈 원액 보충 0.26 ㎖ / cm 췌장 기초 배지 2에서 섬유 아세포를 처리 하였다. 매체 매일을 변경합니다. </li></ol></li><li> 일 7-8 <ol><li> 레티노 ACI 50 mg의 디메틸 설폭 사이드 (DMSO) 16.6 ml에 첨가하여 레티노 산 원액을 준비디. </li><li> 췌장 기초 배지 0.26 ㎖ / cm 2 배양 세포는 1 μL / ㎖ 37 ℃에서 원액 (5.1.2 참조) 2 일간 1 μL / ㎖ 레티노 산 원액을 (5.2.1 참조) 티빈 C 보충 5 %의 CO 2. 매체 매일을 변경합니다. </li></ol></li><li> 일 9-36 <ol><li> 췌장 기초 배지 0.26 ㎖ / cm 2 배양 세포 (v / v)의 인슐린 트랜스페린 - 셀레늄 (ITS), 2 % (v / v)의 B27 0.1 % (v / v)의 재조합 인간 FGF 기본 1 %로 보충 5 % CO 2 인큐베이터에서 37 ℃에서 (bFGF의) 원액 (표 1 참조). 처음 15 일 동안 매일 매체를 변경합니다. </li><li> 이후 하루에 16에서, 배양 접시의 바닥에서 분리 할 수​​ 있습니다 집계 세포를 형성하기 때문에, 현미경, 매일 매체를 새로 고칩니다. </li></ol></li></ol>

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	<li>Zhou, Q., Brown, J., Kanarek, A., Rajagopal, J., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+reprogramming+of+adult+pancreatic+exocrine+cells+to+beta-cells.">In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to beta-cells.</a> Nature. 455 (7213), 627-632 (2008).</li><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li><li>Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+single+transfected+cDNA+converts+fibroblasts+to+myoblasts.">Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts.</a> Cell. 51 (6), 987-1000 (1987).</li><li>Vierbuchen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+fibroblasts+to+functional+neurons+by+defined+factors.">Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors.</a> Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).</li><li>Caiazzo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+generation+of+functional+dopaminergic+neurons+from+mouse+and+human+fibroblasts.">Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts.</a> Nature. 476, 224-227 (2011).</li><li>Huang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+functional+hepatocyte-like+cells+from+mouse+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of functional hepatocyte-like cells from mouse fibroblasts by defined factors.</a> Nature. 475, 386-389 (2011).</li><li>Marro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Lineage+Conversion+of+Terminally+Differentiated+Hepatocytes+to+Functional+Neurons.">Direct Lineage Conversion of Terminally Differentiated Hepatocytes to Functional Neurons.</a> Cell Stem Cell. 9 (4), 374-382 (2011).</li><li>Pennarossa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+demethylation+step+allows+the+conversion+of+adult+human+skin+fibroblasts+into+insulin-secreting+cells.">Brief demethylation step allows the conversion of adult human skin fibroblasts into insulin-secreting cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (22), 8948-8953 (2013).</li><li>Pennarossa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+Pig+Dermal+Fibroblast+into+Insulin+Secreting+Cells+by+a+Brief+Exposure+to+5-aza-cytidine.">Reprogramming of Pig Dermal Fibroblast into Insulin Secreting Cells by a Brief Exposure to 5-aza-cytidine.</a> Stem Cell Rev. 10 (1), 31-43 (2014).</li><li>Brevini, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+Molecular+Changes+of+Human+Granulosa+Cells+Exposed+to+5-Azacytidine+and+Addressed+Toward+Muscular+Differentiation.">Morphological and Molecular Changes of Human Granulosa Cells Exposed to 5-Azacytidine and Addressed Toward Muscular Differentiation.</a> Stem Cell Rev. 10 (5), 633-642 (2014).</li><li>Thoma, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+conversion+of+human+fibroblasts+into+functional+Schwann+cells.">Chemical conversion of human fibroblasts into functional Schwann cells.</a> Stem Cell Reports. 3 (4), 539-547 (2014).</li><li>Mirakhori, F., Zeynali, B., Kiani, S., Baharvand, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+azacytidine+step+allows+the+conversion+of+suspension+human+fibroblasts+into+neural+progenitor-like+cells.">Brief azacytidine step allows the conversion of suspension human fibroblasts into neural progenitor-like cells.</a> Cell J. 17 (1), 153-158 (2015).</li><li>Plath, K., Lowry, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+understanding+reprogramming+to+the+induced+pluripotent+state.">Progress in understanding reprogramming to the induced pluripotent state.</a> Nat Rev Genet. 12 (4), 253-265 (2011).</li><li>Taylor, S. M., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+new+phenotypes+induced+in+10T1/2+and+3T3+cells+treated+with+5-azacytidine.">Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine.</a> Cell. 17 (4), 771-779 (1979).</li><li>Glover, T. W., Coyle-Morris, J., Pearce-Birge, L., Berger, C., Gemmill, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+demethylation+induced+by+5-azacytidine+does+not+affect+fragile+X+expression.">DNA demethylation induced by 5-azacytidine does not affect fragile X expression.</a> Am J Hum Genet. 38 (3), 309-318 (1986).</li><li>Do, J. T., Scholer, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclei+of+embryonic+stem+cells+reprogram+somatic+cells.">Nuclei of embryonic stem cells reprogram somatic cells.</a> Stem Cells. 22 (6), 941-949 (2004).</li><li>Niwa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+is+pluripotency+determined+and+maintained?.">How is pluripotency determined and maintained?.</a> Development. 134 (4), 635-646 (2007).</li><li>Kahan, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+precursors+and+differentiated+islet+cell+types+from+murine+embryonic+stem+cells:+an+in+vitro+model+to+study+islet+differentiation.">Pancreatic precursors and differentiated islet cell types from murine embryonic stem cells: an in vitro model to study islet differentiation.</a> Diabetes. 52 (8), 2016-2024 (2003).</li></ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

본 논문은 조직 특이 적, 유도 프로토콜이어서 5- 아자 CR에 과도 짧은 노광, 인슐린 생산 세포에 인간의 피부 섬유 아세포의 변환을 허용하는 방법을 설명한다. 이 방법은 전사 인자 또는 마이크로 RNA의 강제 표현이나 세포가 더 불안정하고 실수 (14)하는 경향이 있습니다 안정적인 만능 상태의 취득없이, 중배엽에서 내배엽과 관련된 세포로 전환 할 수 있습니다. 첫 번째 단계에서, 세포 가소성 말단 분화 세포에 일시적, 가역적 허용 상태를 유도하는 합성 후생 유전 학적 개질제로 확실히 증가한다. 특히, 5- 아자 - CR은 피부 섬유 아세포의 전체 메틸화의 감소를 야기하기 위해 사용되었다. 5- 아자 CR 직접 메틸 전이 효소의 활성을 억제하고, 새로 합성 된 DNA 메틸화에 새로이를 방지하는 것으로 알려져있다. 때문에 그 효과,이 분자이전 자동 유전자를 활성화 할뿐만 아니라 15,16 진핵 세포의 분화 상태를 변경하는데 사용되어왔다. 이와 일관되게, 전기 -5- 아자 - CR 피부 섬유 아세포를 본 실험에 사용 된 세포 가소성 증가 -5- 아자 - CR 능력을 나타내는 글로벌 DNA 탈 메틸화 (도 2A)를 보였다. 이 5 아자 - CR은 neurosphere 세포 (NSCs의) 17의 높은 소성 관련 마커 10 월 4의 발현을 용이하게 관찰과 일치에 있습니다. 그러나, 그 후 5 아자 - CR 피부 섬유 아세포가 5 아자 - CR의 제거 후 원래의 표현형으로 되돌아주의하는 것이 재미있다. 실제로, 우리는 이전에 섬유 아세포는 높은 소성 상태는 후생 수정에 응답하여, 취득 된 것을 나타내는 원래 배지에 능성 관련 요인 9,10의 다운 조절 발현을 반환했음을 증명, 과도 가역적이고 포함하지 않는다 t의 영구 변형그는 세포. 세포 형태의 표시 변경은 더 높은 소성 상태 (그림 2A)의 유도를 동반. 비 처리 된 섬유 아세포의 전형적인 신장 세포 기관이 분화 된 세포보다 더 작게 나타나 기준 및 증가 된 핵 볼륨을 제시 원형 또는 타원형 세포로 대체 하였다. 니와는 만능 관련 기능 18 설명 편안한 크로 마틴 구조에이 핵 확대를 상관 관계. 액포 핵과 세포질 과립뿐만 아니라 증가 된 패턴 화 된 형태의 존재는 알 수 있었다. 실제적으로 변환 프로토콜의 첫번째 부분을 성공적으로 완료하기위한 마커로 사용할 수있는 기재의 모든 형태 변화; 변경 사항이 존재하는 우리의 경험에서, 5 아자 - CR은 참으로 더 허용 상태를 취득하는 세포를 도왔다. 이 과도 &quot;하이 그 허가를 활용할 수있다완전히 다른 표현형을 향해 셀을 구동하기 sivity 타임 윈도우 &quot;. 의정서 포스트 -5- 아자 - CR 섬유 아세포가 특정 분화 배지에 응답하여, 췌장의 베타 세포와 같은 세포로 다시 어드레싱 될 수 있음을 보여준다.이 프로토콜은 사용 세포가 내배엽 계통에 속하는 세포 집단에 중배엽 유래 세포 유형으로 전환 할 수 있습니다. 미처리 피부 섬유 아세포에서 처음 탐지했다 인슐린, 분화 프로토콜 (도 3B)의 끝에서 양성이었다. 특정 베타 세포 계보 옆의 외분비, 내분비 및 도관 세포 집단 - 이는 췌장 전체의 분화에 관여하는 등 PDX1 같은 다른 요인의 동시 발현을 수반 하였다. 이 베타 세포에 적절한 분화가 미성숙 세포가 인접 해 계층화 된 경우에만 달성되었음을 나타내는 마우스 배아 줄기 세포에 대한 이전의 연구 (ESC)와 일치랑게르한스 아키텍처의 췌장에 의해 제공되는 로컬 마이크로 환경 강한 기능적 역할을한다는 제안 R 내분비 세포 19. 실제로 EpiCC 성숙한 분화 표현형을 달성하고 20 mM의 포도당 노출 (도 3)에 대응하는 능력을 보여 주었다. 인슐린 적극적 인슐린 생산들 (도 3C) 등 EpiCC의 선의 특성을 확인하는 D 글루코오스 자극 1 시간 후에 배양 배지에 분비 하였다. 성공적인 프로 시저에 대한 별개의 요구 조건은 멸균 층류 및 현미경 이들 처리를 포함하여 모든 단계에서 37 ° C에서 세포의 엄격한 유지된다. 우리의 경험에 의하면, 또한 매우 이전에 문화에서의 사용, 갓 시약을 준비하고 프로토콜에 따라 매체 엄격하게 새로 고침하는 것이 좋습니다. 이 동작은 이후 형성 총 세포 현미경으로 수행해야배양 접시의 바닥에서 분리하고 중간을 변경하는 동안 손실 할 수 있습니다. 후성 변환 프로토콜이 성공적으로 인간에 대해 기술 한 동일한 세포 수 / cm (2) 및 탈 메틸 화제의 농도를 이용하여 돼지 종뿐만 아니라 개 (원고 제출)에인가되었다. 결론적으로, 다른 셀 타입으로 피부 섬유 아세포의 전환을 가능하게하는 프로토콜이 여기에 제시된다. 기재된 전략은 성적으로 기반 셀 전환의 이점이있다 : 암을 일으킬 수있는 셀을 남길 수있는 다 능성 상태를 피하기 위해, 즉 가능성; 세포의 느린 변화를 일으킬 수있는 외생 유전 적 요인의 제거. 이러한 장점은 병진 의학 응용 프로그램에 대한 현재의 접근 방식은 매우 유망하고 환자의 특정 세포 치료 수 있습니다.

재생 의료의 기본적인 목적은 수리되거나 손상된 대체 할 수있는 새로운 기능성 세포의 세대, 조직 변성. 다른 하나의 세포 유형에서 그들을 변환하여, 새로운에 쉽게 사용할 성인 세포 개조하기 필요한 세포 집단 액세스가 풍부하거나 어렵지 않다 특히, 특히 매력적인 방법이다. 그러나, 성인 세포는 매우 안정하다. 그들은 성숙한 터미널 전문화에 도달하면, 그들은 안정적는 1을 유지, 자신의 선택에 점진적으로 제한을 통해 차별화 된 상태를 취득합니다. 체세포 (IPS)의 다 능성을 재 프로그래밍을 가능하게하는 프로토콜 번호가 개발되었으며 최근 년에 전사 세트 2,3- 요인의 강제 발현을 통해 달성. 또한, 셀 변환 (4) 하나를 소개, 직접 혈통의 분화에 의해 얻을 수있다 </sup는&gt; 또는 전사의 조합은 5-7 요인. 이 전략은 역 분화 상태를 통해 전환을 포함하지만, 특정 전사가 8 요인의 고 발현을 필요로하지 않습니다. 우리는 최근 시티 딘 유사체 5- 아자 시티 딘 (5 아자 - CR), 잘 특징 DNA의 메틸화 억제제의 탈 메틸화 특성 성체 세포의 짧은 노출에 기초하여 변환 프로토콜을 개발했다. 탈 메틸화 단계는 즉시 필요한 단말 표현형을 얻을 수있는 특정 분화 프로토콜 9-11 따른다. 이 방법은 다른 혈통의 세포로 성숙, 분화 세포로 변환 할 수 있으며, 바이러스 벡터의 사용 및 외인성 전사 인자의 형질을 모두 회피하는 상당한 이점을 갖는다. 안정적인 만능 상태의 취득 및 불안정성을 셀에 관련 증가 감수성도 피할 수있다. <p class=&quot;jove_content&quot;&gt; 여기에 제시되는 모든 기능 인슐린 분비 세포로 성인 인간의 피부 섬유 아세포의 전환을 할 수 있습니다 자세한 프로토콜입니다. 그러나, 본 기술은 상이한 유형의 세포에 적용된 다양한 분화 세포를 향해 경로를 다루는 경우, 긍정적 인 결과를 생성 한 것을 주목할 가치가있다. 또한, 후생 유전 학적 변환이 성공적으로 인간 및 돼지 9-13 종뿐만 아니라 개에서 사용 된 방법의 다양한 효능과 안정성을 제안 (원고 제출).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1019">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D5652</td>
			<td style="width:408px;">PBS; for cell wash and solution preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Antibiotic Antimycotic Solution</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A5955</td>
			<td style="width:408px;">Component of Fibroblast, HP and Pancreatic media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">100 mm petri dish</td>
			<td style="width:155px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">83.3902</td>
			<td style="width:408px;">For Fibroblast isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Porcine Gelatin</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G1890</td>
			<td style="width:408px;">For dish coating</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Water</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">W3500</td>
			<td style="width:408px;">For solution preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">35 mm petri dishes</td>
			<td style="width:155px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">83.39</td>
			<td style="width:408px;">For Fibroblast isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">DMEM, high glucose, pyruvate</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">41966052</td>
			<td style="width:408px;">For Fibroblast culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10500064</td>
			<td style="width:408px;">FBS; Component of Fibroblast and HP media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">L-Glutamine solution</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G7513</td>
			<td style="width:408px;">Component of Fibroblast, HP and Pancreatic media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Trypsin-EDTA solution</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T3924</td>
			<td style="width:408px;">For Fibroblast dissociation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">KOVA GLASSTIC SLIDE 10 WITH GRIDS</td>
			<td style="width:155px;">Hycor Biomedical</td>
			<td style="width:119px;">87144</td>
			<td style="width:408px;">Cell counting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">5-Azacytidine</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A2385</td>
			<td style="width:408px;">5-aza-CR, for increrase cell plasticity in fibroblasts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Ham&#39;s F-10 Nutrient Mix</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">31550031</td>
			<td style="width:408px;">For HP medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">DMEM, low glucose, pyruvate</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">31885023</td>
			<td style="width:408px;">For HP medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">KnockOut Serum Replacement</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10828028</td>
			<td style="width:408px;">Component of HP medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">MEM Non-Essential Amino Acids Solution</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11140035</td>
			<td style="width:408px;">Component of HP and Pancreatic Basal media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M7522</td>
			<td style="width:408px;">Component of HP and Pancreatic Basal media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Guanosine</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G6264</td>
			<td style="width:408px;">Nucleoside mix stock component of HP medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Adenosine</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A4036</td>
			<td style="width:408px;">Nucleoside mix stock component of HP medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Cytidine</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C4654</td>
			<td style="width:408px;">Nucleoside mix stock component of HP medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Uridine</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">U3003</td>
			<td style="width:408px;">Nucleoside mix stock component of HP medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Thymidine</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T1895</td>
			<td style="width:408px;">Nucleoside mix stock component of HP medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Millex-GS 0,22 &#181;m</td>
			<td style="width:155px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SLGS033SB</td>
			<td style="width:408px;">For sterilizing of solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">PHG0261</td>
			<td style="width:408px;">bFGF; Component of HP and Pancreatic Basal medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A3311</td>
			<td style="width:408px;">BSA; Component of Pancreatic Basal medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">DMEM/F-12</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11320074</td>
			<td style="width:408px;">For Pancreatic Basal medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">B-27 Supplement Minus Vitamin A</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">12587010</td>
			<td style="width:408px;">Component of Pancreatic medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">N-2 Supplement</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">17502048</td>
			<td style="width:408px;">Component of Pancreatic Basal medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Activin A Recombinant Human Protein</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">PHG9014</td>
			<td style="width:408px;">For Pancreatic medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Retinoic Acid</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">R2625</td>
			<td style="width:408px;">For Pancreatic medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D2650</td>
			<td style="width:408px;">DMSO; for Retinoic Acid stock preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Insulin-Transferrin-Selenium</td>
			<td style="width:155px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">41400045</td>
			<td style="width:408px;">ITS; for Pancreatic Final medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Anti-Vimentin antibody&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab8069</td>
			<td>For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">4&#8242;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">32670</td>
			<td>DAPI. For immunocytochemical analisys. Working dilution&#160; 1&#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">5-Methylcytidine</td>
			<td style="width:155px;">Eurogentec</td>
			<td style="width:119px;">MMS-900P-B</td>
			<td>For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Anti-C Peptide antibody&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab14181</td>
			<td>For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Anti-PDX1 antibody&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab47267</td>
			<td>For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Mercodia Insulin ELISA</td>
			<td style="width:155px;">Mercodia</td>
			<td style="width:119px;">10-1113-10</td>
			<td>For insulin release detection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

epigenetic conversion as a safe and simple method to obtain insulin-secreting cells from adult skin fibroblasts

Regenerative medicine requires new, fully functional cells that are delivered to patients in order to repair degenerated or damaged tissues. When such cells are not readily available, they can be obtained using different approaches that include, among the many, reprogramming and trans-differentiation, with advantages and limitations that are specific of the different techniques. Here a new strategy for the conversion of an adult mature fibroblast into an insulin-secreting cell, arbitrarily designated as epigenetic converted cells (EpiCC), is described. The method has been developed, based on the increasing understanding of the mechanisms controlling epigenetic regulation of cell fate and differentiation. In particular, the first step uses an epigenetic modifier, namely 5-aza-cytidine, to drive adult cells into a "highly permissive" state. It then takes advantage of this brief and reversible window of epigenetic plasticity, to re-address cells toward a different lineage. The approach is designated "epigenetic cell conversion". It is a simple and robust way to obtain an efficient, controlled and stable cellular inter-lineage switch. Since the protocol does not involve the use of any gene transfection, it is free of viral vectors and does not involve a stable pluripotent state, it is highly promising for translational medicine applications.

피부 생검에서 차 문화의 설립 피부 생검은 작은 조각으로 잘라 젤라틴 미리 코팅 요리에 넣었다. 육일 후, 섬유 아세포는 조직 조각에서 성장하기 시작하고 세포 단층 (그림 1A)을 형성했다. 세포는 전형적인 긴 형태를 보여, 예상대로 섬유 아세포 특정 마커 멘틴 (빔, 그림 1B)의 균일 한 면역 양성을 표시. 5 아자 - CR에 18 시간 노출 후 피부 섬유 아 세포의 형태 학적 변화와 메틸화 패턴 인슐린 분비 세포로 섬유 아세포의 성공적인 후생 유전 학적 변환을 얻으려면, 우리는 탈 메틸 화제, 5 아자 - CR을 사용하여 가소성을 증가했다. 인간 섬유 아세포를 7.8 × 104 아세포 / ㎠의 농도로 0.1 % 젤라틴 프레 코트 접시에 플레이 팅 하였다. 파종 후 스물 네 시간, 세포 w조립식 18 시간 동안 1 μm의 5 아자 - CR 배양. 이러한 처리의 마지막에, 세포의 표현형의 광범위한 변화는 POST (5- 아자 CR,도 2a) 볼 수 있었다. 미처리 섬유 아세포 (T0,도 2a)의 전형적인 가늘고 긴 형태는 원형 또는 타원형으로 대체하고 셀 크기가 훨씬 작다되었다. 세포질 과립이었다 평평하고 세포 배양 표면에 부착 하였다. 핵 크게 나타나 완화 염색질 구조의 결과로서, 액포. 우리의 경험에서, 이러한 형태 학적 변화의 존재는 필수적이고 신중 -5- 아자 - CR 처리의 효율을위한 마커로서 모니터링되어야한다. 18 시간 노출 오 아자 - CR, 글로벌 DNA 메틸화의 급격한 감소 (또한 분명했다 명확하게 5 메틸 시티 딘의 면역 염색의 감소 강도에 의해 입증 된 후 <strong&gt; 그림 2B). 피부의 후생 유전 학적 변환하는 동안 형태 학적 및 기능적 변화는 인슐린 분비 세포로 섬유 아세포 췌장 분화를 유도하기 위해, 5- 아자 - CR 처리 된 섬유 아세포는 바로 3 시간 회복 기간 후에, 췌장 유도 세 단계 프로토콜에 노출시켰다. 첫 번째 단계에서, 세포는 내배엽의 투입을 촉진 티빈 보충 췌장 기초 배지에서 7 일간 배양 하였다. 이 간격에서 서서히 평평하고 세포 클러스터 (7 일,도 3a)에 정리하기 시작했다. 그 후, 췌장 혈통 차별화 2 일 레티노 산의 추가로 승진했다. 이러한 처리에 응답하여, 셀은 망상 패턴으로 재 배열하고 명확하게 구별 세포 집합체 (주 10,도 3A)에서 자랐다. 클러스터링 형성 페이지로웠 시간 증가 또한 B27, 및 bFGF에 ITS에 세포의 노출로 이루어진 세 번째와 마지막 단계에 의해 자극 하였다. 이 큰 3D 식민지에서 집계 세포의 증가 (주 20,도 3a)의 채용되었다. 하루 36 주위에,이 식민지는 체외에서 전형적인 췌장 섬 (주 36,도 3a)를 연상시키는 독특한 원형 구조를 보였다. 새로운 EpiCC 표현형의 인수는 처리되지 않은 섬유 아세포 (5 MC 일 36도 3b)에서 관찰에게 반환 글로벌 DNA 메틸화 수준의 점진적 증가를 동반했다. 췌장 유도 36 일 후, 후생 유전 학적 변환의 효율도 처리되지 않은 섬유 아 세포에서 원래 검출되지 있었다 전형적인 성숙 췌장 마커의 발현 (T0에 의해 입증되었다, <stroNG&gt; 그림 3B). 췌장과 십이지장 호 메오 박스 (1) (PDX1)와 C 펩타이드 (C-PEP)의 공동 현지화가 인슐린을 생산하는 것들로 EpiCC의 타고난 성격 확인 (주 36, 그림 3B). 또한, 세포 기능 표현형 20 mM의 생리 트리거 화합물을 대표하는 포도당 노출에 반응하는 능력에 의해 입증되었다 변환. 보다 상세하게, EpiCC 적극적 D 글루코오스 자극 1 시간 후 배양 배지 내 인슐린 분비. 어떤 자료는 L-포도당의 몰량 (그림 3C)에 노출 된 후 검출 없었다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53880/53880fig1.jpg" /> 그림 1 : 분리 및 인간의 피부 섬유 아세포의 특성 조직 조각의 성장하는 섬유 아 세포의 (A) 대표 이미지.. (B) 섬유 아 세포는 초 동안 균일 한 면역 양성을 표시pecific 마커 멘틴 (빔). 핵은 DAPI로 염색된다. (스케일 바, 100 μm의). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53880/53880fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53880/53880fig2.jpg" /> 그림 2 : 인간의 피부 섬유 아 세포의 형태 학적 및 메틸화 변화 5 아자 - CR 처리 후 (A) 과립 가늘고 긴 모양 (T0)를 보여주는 치료 섬유 아 세포의 대표 이미지 및 원형 또는 타원형 형태를 표시하는 5 아자 - CR 처리 된 섬유 아세포. 세포질 및 확대 및 액포 핵 (후 5 아자 - CR). (스케일 바, 100 μm의). (B)는 전체 DNA 메틸화가 감소 5- 아자 - CR 처리 후 (포스트 -5- 아자 - CR) 검출이다. (스케일 바, 50 μm의). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53880/53880fig2large.jpg" target="_blank">카스티하세요</a>이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 ICK. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53880/53880fig3.jpg" /> 그림 3 :. 후생 유전 학적 변환하는 동안 형태 학적 및 기능적 변화 (A) 내분비 췌장 분화하는 동안 일어나는 형태 학적 변화의 대표적인 사진. 유도의 7 일 후, 인간의 세포는 점차 클러스터 (7 일)에 개최합니다. 레티노 산의 첨가에 응답하여, 그들이 구별 집합체 (10 일째)에서 그물 무늬 클러스터에서 재 배열. 이 구조물은 (주 20) 세포를 모집 대형 3D 식민지에서 집계, 시간 진행. 마지막으로, 콜로니를 분리하고 체외에서 전형적인 췌장 섬 (주 36)를 연상시키는 배지, 자유롭게 부유하는 경향이 구형 구조가된다. (스케일 바, 100 μm의). 췌장 36 일 후 (B)duction, 처리되지 않은 섬유 아세포 (5 MC의 날 36)에서 관찰 된 것과 인간의 EpiCC 반환의 글로벌 DNA 메틸화 수준. (스케일 바, 50 μm의). 이러한 내분비 췌장 마커가 처리되지 않은 섬유 아세포 (T0)에서 완전히 결석하는 동안 C-PEP와 PDX1의 공동 현지화, 전환 기간 (주 36)의 끝에서 검출합니다. (스케일 바, 100 μm의). 20 mM의 D-포도당과 20 mM의 L 포도당 노출에 응답 (C) EpiCC의 인슐린 분비. 바는 3 개의 독립적 인 복제의 SD ± 평균을 나타냅니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53880/53880fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> 소재 / 장비의 이름 </td><td> 수량 (v / v)의 </td><td> 댓글 / 설명 </td></tr><tr><td> 햄의 F-10 영양소 믹스 </td><td> 40 % </td><td></td></tr><tr><td> DMEM 낮은 포도당 </td><td> 40 % </td><td></td></tr><tr><td> 마네 세럼 교체 </td><td> 10 % </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> 5 % </td><td></td></tr><tr><td> 항생제 항진균제 솔루션 </td><td> 1% </td><td></td></tr><tr><td> L 글루타민 솔루션 </td><td> 1% </td><td></td></tr><tr><td> MEM 비 필수 아미노산 솔루션 </td><td> 1% </td><td></td></tr><tr><td> 2- 머 캅토 에탄올의 재고 </td><td> 1% </td><td> 2- 머 캅토 에탄올 스톡 제조 : 멸균 PBS 5ml에 2- 머 캅토 에탄올 diluite 3.5 μL. 4 ° C에서 어둠 속에서 보관하십시오. 참고 : 2 주 이내에 사용 </td></tr><tr><td> 뉴 클레오 시드 믹스 재고 </td><td> 1% </td><td> 재고 준비를 혼합 뉴 클레오 시드 : 0.042 g의 구아노 신, 0.040 g의 아데노신, 0.036 g의 시티 딘, 0.036 g의 우리 딘 및 멸균 물 50 ㎖에서 0.012 g의 Timidine을 녹인다. 용해 50 ℃에서 용융. filtrat에 의해 소독4 ° C에서 이온 및 저장 </td></tr><tr><td> ESGRO (LIF) </td><td> 0.1 % </td><td></td></tr><tr><td> 재조합 인간 FGF 기본 (bFGF를) 재고 </td><td> 0.1 % </td><td> bFGF를 재고 준비 : 5 ㎖를 추가 0.1 %의 bFGF의 25 μg의에서 PBS에 소 혈청 알부민 (BSA) </td></tr></tbody></table> 표 1 : 소재 솔루션을 제공합니다. <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> 소재 / 장비의 이름 </td><td> 수량 (v / v)의 </td><td> 댓글 / 설명 </td></tr><tr><td> DMEM / F-12 </td><td> 93 % </td><td></td></tr><tr><td> B-27 보충 마이너스 비타민 A </td><td> 2 % </td><td></td></tr><tr><td> N-2 (부록) </td><td> 1% </td><td></td></tr><tr><td> MEM 비 필수 아미노산 솔루션 </td><td> 1% </td><td></td></tr><tr><td> 항생 물질안티 곰팡이 솔루션 </td><td> 1% </td><td></td></tr><tr><td> 2- 머 캅토 에탄올의 재고 </td><td> 1% </td><td> 2- 머 캅토 에탄올 스톡 제조 : 멸균 PBS 5ml에 2- 머 캅토 에탄올 diluite 3.5 μL. 4 ° C에서 어둠 속에서 보관하십시오. 참고 : 2 주 이내에 사용 </td></tr><tr><td> L 글루타민 솔루션 </td><td> 1% </td><td></td></tr><tr><td> BSA의 재고 </td><td> 1% </td><td> BSA 스톡의 제조 : 물 50 ㎖에 250 mg을 용해. 4 ° C에서 여과하고 저장하여 소독. </td></tr></tbody></table> 표 2 : 소재 솔루션을 제공합니다.

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Epigenetic Conversion as a Safe and Simple Method to Obtain Insulin-secreting Cells from Adult Skin Fibroblasts

Here, a new method that allows the conversion of adult skin fibroblasts into insulin-secreting cells is presented. This technique is based on epigenetic conversion, does not involve the use of retroviral vectors nor the acquisition of a stable pluripotent state. It is therefore highly promising for translational medicine applications.

성인 피부 섬유 아 세포에서 인슐린 분비 세포를 얻을 수있는 안전하고 간단한 방법으로 성적인 변환

Regenerative medicine requires new, fully functional cells that are delivered to patients in order to repair degenerated or damaged tissues. When such ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

6.7K 조회수.  Università degli Studi di Milano. Here, a new method that allows the conversion of adult skin fibroblasts into insulin-secreting cells is presented. This technique is based on epigenetic conversion, does not involve the use of retroviral vectors nor the acquisition of a stable pluripotent state. It is therefore highly promising for translational medicine applications.

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Transfection, Selection, and Colony-picking of Human Induced Pluripotent Stem Cells TALEN-targeted with a GFP Gene into the AAVS1 Safe Harbor

Targeted transgene addition can provide persistent gene expression while circumventing the gene silencing and insertional mutagenesis caused by viral vector mediated random integration. This protocol describes a universal and efficient transgene targeted addition platform in human iPSCs based on utilization of validated open-source TALENs and a gene-trap-like donor to deliver transgenes into a safe harbor locus. Importantly, effective gene editing is rate-limited by the delivery efficiency of gene editing vectors. Therefore, this protocol first focuses on preparation of iPSCs for transfection to achieve high nuclear delivery efficiency. When iPSCs are dissociated into single cells using a gentle-cell dissociation reagent and transfected using an optimized program, >50% cells can be induced to take up the large gene editing vectors. Because the AAVS1 locus is located in the intron of an active gene (PPP1R12C), a splicing acceptor (SA)-linked puromycin resistant gene (PAC) was used to select targeted iPSCs while excluding random integration-only and untransfected cells. This strategy greatly increases the chance of obtaining targeted clones, and can be used in other active gene targeting experiments as well. Two weeks after puromycin selection at the dose adjusted for the specific iPSC line, clones are ready to be picked by manual dissection of large, isolated colonies into smaller pieces that are transferred to fresh medium in a smaller well for further expansion and genetic and functional screening. One can follow this protocol to readily obtain multiple GFP reporter iPSC lines that are useful for in vivo and in vitro imaging and cell isolation.

TALEN-mediated gene editing at the safe harbor AAVS1 locus enables high-efficiency transgene addition in human iPSCs. This protocol describes the procedures for preparing iPSCs for TALEN and donor vector delivery, transfecting iPSCs, and selecting and isolating iPSC clones to achieve targeted integration of a GFP gene to generate reporter lines.

형질, 선택 및 인간 유도 만능 줄기 세포의 콜로니 따기는 AAVS1 세이프 하버 (Safe Harbor)에 GFP 유전자 TALEN는 타겟팅

Targeted transgene addition can provide persistent gene expression while circumventing the gene silencing and insertional mutagenesis caused by viral ...

연구

발생학

An Efficient Method to Obtain Dedifferentiated Fat Cells

Tissue engineering and cell therapy hold great promise clinically. In this regard, multipotent cells, such as mesenchymal stem cells (MSCs), may be used therapeutically, in the near future, to restore function to damaged organs. Nevertheless, several technical issues, including the highly invasive procedure of isolating MSCs and the inefficiency surrounding their amplification, currently hamper the potential clinical use of these therapeutic modalities. Herein, we introduce a highly efficient method for the generation of dedifferentiated fat cells (DFAT), MSC-like cells. Interestingly, DFAT cells can be differentiated into several cell types including adipogenic, osteogenic, and chondrogenic cells. Although other groups have previously presented various methods for generating DFAT cells from mature adipose tissue, our method allows us to produce DFAT cells more efficiently. In this regard, we demonstrate that DFAT culture medium (DCM), supplemented with 20% FBS, is more effective in generating DFAT cells than DMEM, supplemented with 20% FBS. Additionally, the DFAT cells produced by our cell culture method can be redifferentiated into several tissue types. As such, a very interesting and useful model for the study of tissue dedifferentiation is presented.

We have modified the conditions for DFAT cell generation and provide herein information regarding the use of an improved growth medium for the production of these cells.

효율적인 방법은 탈분화 지방 세포를 얻는 방법

Tissue engineering and cell therapy hold great promise clinically. In this regard, multipotent cells, such as mesenchymal stem cells (MSCs), may be used ...

Protocol for the Direct Conversion of Murine Embryonic Fibroblasts into Trophoblast Stem Cells

Trophoblast stem cells (TSCs) arise as a consequence of the first cell fate decision in mammalian development. They can be cultured in vitro, retaining the ability to self-renew and to differentiate into all subtypes of the trophoblast lineage, equivalent to the in vivo stem cell population giving rise to the fetal portion of the placenta. Therefore, TSCs offer a unique model to study placental development and embryonic versus extra-embryonic cell fate decision in vitro. From the blastocyst stage onwards, a distinct epigenetic barrier consisting of DNA methylation and histone modifications tightly separates both lineages. Here, we describe a protocol to fully overcome this lineage barrier by transient over-expression of trophoblast key regulators Tfap2c, Gata3, Eomes and Ets2 in murine embryonic fibroblasts. The induced trophoblast stem cells are able to self-renew and are almost identical to blastocyst derived trophoblast stem cells in terms of morphology, marker gene expression and methylation pattern. Functional in vitro and in vivo assays confirm that these cells are able to differentiate along the trophoblast lineage generating polyploid trophoblast giant cells and chimerizing the placenta when injected into blastocysts. The induction of trophoblast stem cells from somatic tissue opens new avenues to study genetic and epigenetic characteristics of this extra-embryonic lineage and offers the possibility to generate trophoblast stem cell lines without destroying the respective embryo.

Here we present a protocol for the direct conversion of murine embryonic fibroblasts into fully functional and stable trophoblast stem cells by ten day over-expression of Tfap2c, Gata3, Eomes and Ets2.

영양막 줄기 세포로 쥐 배아 섬유 아세포의 직접적인 변환을위한 프로토콜

Trophoblast stem cells (TSCs) arise as a consequence of the first cell fate decision in mammalian development. They can be cultured in vitro, retaining ...

Modified MicroSecure Vitrification: A Safe, Simple and Highly Effective Cryopreservation Procedure for Human Blastocysts

Clinical embryo vitrification evolved with the development of unique vitrification devices in the 21st century and with the misconception that ultra-rapid cooling in an &#34;open&#34; system (i.e., direct LN2 contact) was a necessity to optimize vitrification success. The dogma surrounding the importance of cooling rates led to unsafe practices subject to technical variation and to the creation of vitrification devices that disregarded important quality-control factors (e.g., ease of use, repeatability, reliability, labeling security, and storage safety). Understanding the quality-control flaws of other devices allowed for the development of a safe, secure, repeatable, and reliable &#181;S-VTF method aimed to minimize intra- and inter-technician variation. Equally important, it combined the availability of two existing FDA-compliant devices: 1) a 0.3-mL ionomeric resin embryo straw with internalized, dual-colored, tamper-proof labeling with repeatable weld seal potential; and 2) shortened, commonly-used, 300-&#181;m ID sterile flexipettes to directly load the embryo(s) in order to create a highly-effective global vitrification device. Like other aseptic, closed vitrification systems (e.g., High Security Vitrification (HSV), Rapid-i, and VitriSafe) effectively used in reproductive medicine, microSecure Vitrification (&#181;S-VTF) has proven that it can achieve high post-warming survival and pregnancy outcomes with its attention to simplicity, and reduced technical variation. Although the 0.3-mL embryo straw containing an internal hydrophobic plug was commercially replaced with a standard semen straw possessing cotton-polyvinyl pyrrolidone (PVP) plugs, it maintained its ionomeric resin composition to ensure weld sealing. However, the cotton plugs can wick out the fluid-embryo contents of the flexipettes upon contact. A modified &#181;S-VTF method was adapted to include an additional internal weld seal before the plug on the device loading side. The added technical step to the &#181;S-VTF procedure has not affected its successful application, as high survival rates (&#62; 95%) and pregnancy rates continue today.

MicroSecure Vitrification was developed as a non-commercial, aseptic closed vitrification device system that is compliant with FDA good manufacturing and tissue-handling practices. Due to the withdrawal of hydrophobic plugged embryo straws from the industry, the vitrification procedure was modified to include an inner seal before the standard internal cotton plug.

수정 MicroSecure의 유리화 : 인간 배반포를위한 안전 간단하고 매우 효과적인 냉동 보존 절차

Clinical embryo vitrification evolved with the development of unique vitrification devices in the 21st century and with the misconception that ultra-rapid ...

Establishment of Proliferative Tetraploid Cells from Nontransformed Human Fibroblasts

Polyploid (mostly tetraploid) cells are often observed in preneoplastic lesions of human tissues and their chromosomal instability has been considered to be responsible for carcinogenesis in such tissues. Although proliferative polyploid cells are requisite for analyzing chromosomal instability of polyploid cells, creating such cells from nontransformed human cells is rather challenging. Induction of tetraploidy by chemical agents usually results in a mixture of diploid and tetraploid populations, and most studies employed fluorescence-activated cell sorting or cloning by limiting dilution to separate tetraploid from diploid cells. However, these procedures are time-consuming and laborious. The present report describes a relatively simple protocol to induce proliferative tetraploid cells from normal human fibroblasts with minimum contamination by diploid cells. Briefly, the protocol is comprised of the following steps: arresting cells in mitosis by demecolcine (DC), collecting mitotic cells after shaking off, incubating collected cells with DC for an additional 3 days, and incubating cells in drug-free medium (They resume proliferation as tetraploid cells within several days). Depending on cell type, the collection of mitotic cells by shaking off might be omitted. This protocol provides a simple and feasible method to establish proliferative tetraploid cells from normal human fibroblasts. Tetraploid cells established by this method could be a useful model for studying chromosome instability and the oncogenic potential of polyploid human cells.

Although proliferative polyploid cells are necessary to analyze chromosomal instability of polyploid cells, creating such cells from nontransformed human cells is not easy. The present report describes relatively simple procedures to establish proliferative tetraploid cells free of a diploid population from normal human fibroblasts.

비 형질 인간 섬유 아세포의 증식 배체 세포의 수립

Polyploid (mostly tetraploid) cells are often observed in preneoplastic lesions of human tissues and their chromosomal instability has been considered to ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality microscopic images is not entirely dependent upon the quality of the microscope, but also upon the methods of tissue processing, which often involve multiple critical actions or steps. Furthermore, mesenchymal cell types in the skin and other tissues represent a new challenge for tissue preparation and imaging. Here, we present a complete process, from tissue harvest to microscopy. Our technique, called &#34;horizontal whole mount,&#34; is one that novices can quickly become proficient in and that allows for antigen preservation and detection in 60-300 &#181;m-thick sections cut with a cryostat. Sections of this thickness provide enhanced visualization of tissue microarchitecture in a three-dimensional environment. In addition, the protocol preserves mesenchymal cells in a manner that enhances image quality when compared to standard cryostat or paraffin sections, thereby increasing the efficacy and reliability of immunostaining. We believe that this protocol will benefit all laboratories that visualize skin, and possibly other tissues and organs.

This work presents a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-section analysis that enables the full exploitation of confocal imaging modalities. This protocol preserves antigenicity and represents a robust system to analyze skin histology and potentially other tissue types.

수평 한 전체적인 거치 : 피부의 두껍고, 3 차원 조직 단면도를위한 비발 한 가공 그리고 화상 진찰 의정서

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. In addition, keratinocytes play an essential role in the initiation, maintenance, and regulation of epidermal immune responses by being part of the innate immune system responding to antigenic stimuli in a fast, nonspecific manner. Here, we describe a protocol for isolation of primary human keratinocytes from adult skin, and demonstrate that these cells respond to calcium-induced terminal differentiation, as measured by an increased expression of the differentiation marker involucrin. In addition, we show that the isolated keratinocytes are responsive to IL-1&#946;-induced activation of intracellular signaling pathways as measured by the activation of the p38 MAPK pathway. Taken together, we describe a method for isolation and culturing of primary human keratinocytes from adult skin. Because the keratinocytes are the predominant cell type in the epidermis, this method is useful to study molecular mechanisms in cutaneous biology in vitro.

The human skin acts as a first line of defense against the external environment. We present a method for isolating primary human keratinocytes from adult skin. These isolated keratinocytes are useful in numerous experimental setups, and are a highly suitable model for studying molecular mechanisms in cutaneous biology in vitro.

생성 및 기본 인간 Keratinocytes 성인 피부에서의 경작

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, antibodies for specific cell markers are applied on tissue sections. In adult skeletal muscle, satellite cells (SCs) are stem cells that contribute to muscle repair and regeneration. Therefore, it is important to visualize and trace the satellite cell population under different physiological conditions. In resting skeletal muscle, SCs reside between the basal lamina and myofiber plasma membrane. A commonly used marker for identifying SCs on the myofibers or in cell culture is the paired box protein Pax7. In this article, an optimized Pax7 immunofluorescence protocol on skeletal muscle sections is presented that minimizes non-specific staining and background. Another antibody that recognizes a protein (laminin) of the basal lamina was also added to help identify SCs. Similar protocols can also be used to perform double or triple labeling with Pax7 and antibodies for additional proteins of interest.

The precise identification of satellite cells is essential for studying their functions under various physiological and pathological conditions. This article presents a protocol to identify satellite cells on adult skeletal muscle sections by immunofluorescence-based staining.

Pax7 Laminin 항 체와 면역 형광에 의해 골격 근육 인공위성 세포의 식별

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical applications. The conventional isolation method of human keratinocytes involves a two-step sequential enzymatic digestion procedure, which has been proven to be inefficient in generating primary cells from adult tissues due to the low cell recovery rate and reduced cell viability. We recently reported an advanced method to isolate human primary epidermal progenitor cells from skin tissues that utilizes the Rho kinase inhibitor Y-27632 in the medium. Compared with the traditional protocol, this new method is simpler, easier, and less time-consuming, and increases epithelial stem cell yield and enhances their stem cell characteristics. Moreover, the new methodology does not require the separation of the epidermis from the dermis, and, therefore, is suitable for isolating cells from different types of adult tissues. This new isolation method overcomes the major shortcomings of conventional methods and is more suitable for producing large numbers of epidermal cells with high potency both for laboratory and for clinical applications. Here, we describe the new method in detail.

Here we present a protocol to efficiently isolate primary human keratinocytes from adult skin tissues. This method simplifies the conventional procedure by using the ROCK Inhibitor Y-27632 in the inoculation medium to spontaneously separate epidermal cells from dermal cells.

성인 피부 조직에서 기본 인간의 Keratinocytes를 분리 하는 단순 하 고 효율적인 방법

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...

Adult Mouse Digit Amputation and Regeneration: A Simple Model to Investigate Mammalian Blastema Formation and Intramembranous Ossification

Here, we present a protocol of adult mouse distal terminal phalanx (P3) amputation, a procedurally simple and reproducible mammalian model of epimorphic regeneration, which involves blastema formation and intramembranous ossification analyzed by fluorescence immunohistochemistry and sequential in-vivo microcomputed tomography (&#956;CT). Mammalian regeneration is restricted to amputations transecting the distal region of the terminal phalanx (P3); digits amputated at more proximal levels fail to regenerate and undergo fibrotic healing and scar formation. The regeneration response is mediated by the formation of a proliferative blastema, followed by bone regeneration via intramembranous ossification to restore the amputated skeletal length. P3 amputation is a preclinical model to investigate epimorphic regeneration in mammals, and is a powerful tool for the design of therapeutic strategies to replace fibrotic healing with a successful regenerative response. Our protocol uses fluorescence immunohistochemistry to 1) identify early-and-late blastema cell populations, 2) study revascularization in the context of regeneration, and 3) investigate intramembranous ossification without the need for complex bone stabilization devices. We also demonstrate the use of sequential in vivo &#956;CT to create high resolution images to examine morphological changes after amputation, as well as quantify volume and length changes in the same digit over the course of regeneration. We believe this protocol offers tremendous utility to investigate both epimorphic and tissue regenerative responses in mammals.

Here, we present a protocol of adult mouse terminal phalanx amputation to investigate mammalian blastema formation and intramembranous ossification, analyzed by fluorescent immunohistochemistry and sequential in-vivo microcomputed tomography.

성인 마우스 숫자 절단 및 재생 : 포유류 블라스터 마 형성 및 intramembranous Ossification을 조사하는 간단한 모델

Here, we present a protocol of adult mouse distal terminal phalanx (P3) amputation, a procedurally simple and reproducible mammalian model of epimorphic ...