We thank Mrs. Matsumoto for the technical assistance.

1. 세포 배양 <ol><li> tetraploidy을 유도하는 세포를 얻습니다. 최신으로이 기술은 인간 섬유 아세포 세포주 TIG-1, BJ, IMR-90 및 텔로 머라 - 불멸화 TIG-1 (TIG-HT)에 적용 할 수있는 것이 확인되었다. </li><li> α 변형 혹은 10 % (v / v)의 5 %에서 배양함으로써 열 - 불 활성화 소 태아 혈청 (FBS) (V / 보충 공부 될 세포 유형에 적합한 임의의 다른 세포 배양액 최소 필수 배지에서 세포 성장 V) CO 37 ° C에서 2 분위기. 통로 세포는 subconfluent 밀도를 초과마다 3 사일 없습니다. 주 : 인구 배증 레벨 (PDL)는 세포 성장 및 세포 연령 평가에서 계대마다 계산되어야한다. PDL은 접시 (N1) 및 다음 식 (X 초기 PDL이다)를 사용하여 다음 계대 (N2)에서 수확 한 세포 수로 접종 세포 수로부터 계산 될 수있다. PDL은 = X + (N1 로그 - N2 로그) / 2 로그 </li></ol> 2. 유도 및 사령관이배체 섬유 아세포에서 배체 세포의 blishment <ol><li> 흔들림 오프없이 tetraploidy 유도한다. 참고 : 일부 세포주 (예 : TIG-1)은 다음과 같이 데메 콜신 (DC)로 거의 완전히 배체 연속 처리에 의한 될 수 있습니다. <ol><li> 치료 전날에 하나 또는 두 개의 100mm 접시에 통로 세포는 tetraploidy 유도합니다. 일반적으로 배체 세포의 유도를 위해 접시 당 5 × 10 5 6 10 × 1 세포를 준비합니다. </li><li> 4 일 동안 0.1 μg의 / ㎖의 DC를 포함하는 매체가 기하 급수적으로 증가 세포 치료. </li><li> 마약없는 매체와 매체를 DC가 함유 교체하고 37 ° C에서 (v / v)의 CO 2 분위기 5 %에서 세포를 배양한다. 세포는 통상 1 주일 이내에 증식을 다시 시작합니다. </li></ol></li><li> 흔들림 오프로 tetraploidy 유도한다. 주 : 대부분의 세포는 DC와 간단한 처리의 결과로서 이배체 및 사배체 집단의 혼합물이 상기 (2.1)에 설명된다. 는 P의 따라서 일부 수정rocedure (그림 1)을 다음과 같이 이배체 인구가 필요합니다 제거합니다. <ol><li> 여러 T75에 통로 세포는 tetraploidy을 유도하는 치료 전날 플라스크. 일반적 배체 세포를 유도하기위한 적어도 5 × 106 세포 (플라스크 당 1 × 106 세포)를 준비한다. </li><li> 유사 분열에서 셀을 체포 18 시간 - 16 0.1 μg의 / ㎖의 DC를 포함하는 매체가 기하 급수적으로 증가 세포 치료. 유사 분열에서 세포를 저지하기 위해 필요한 시간은 표적 세포에 의존 할 수 있고, 가능한 한 많은 유사 분열 세포를 얻기 위해 예비 실험에 의해 결정되어야한다. 예를 들어, 느린 성장 세포는 빠르게 성장하는 세포보다 긴 시간 동안 DC로 처리해야합니다. 주 : 셀이 너무 길면,이 단계에서의 치료를하는 경우, 그들은 유사 분열 슬립을 겪을 수 있으며 불가능 다음 단계에서 흔들림 차단하여 세포 분열을 수집하게 식기 표면에 부착. </li><li> 어에서 흔들림 오프 법에 의해 DC-체포 유사 분열 세포를 수집ICH 느슨하게 부착 유사 분열 세포는 원심 분리 플라스크 중간 세척 부드러운 진탕 (300 XG, 5 분)에 의해 수집된다. 이 단계에서 적절한 방법으로 세포 수를 계산합니다. </li><li> 60mm 배양 접시에 수집 유사 분열 세포를 다시 시드 및 추가 3 일간 0.1 μg의 / ㎖의 DC와 세포를 치료. 세포의 10 % 미만이 처리를 견딜 수 있으므로, 접시 당 이상 1 × 10 6 세포 유사 분열을 시드. </li><li> 마약없는 매체와 매체를 포함-DC를 교체하고 세포는 통상 1 주일 이내에 발생 확산을 재개 할 때까지 기다립니다. </li></ol></li><li> 마찬가지로 원래 이배체 세포 통로 세포. </li></ol> DNA의 배수성 3. 시험 참고 :이 잘 설립 절차 및 기술 설명서는 자세한 절차 및 기술 도움말을 참조해야합니다. <ol><li> 수확 세포 (5 × 10 5 - 1 × 6) 솔루션 콘과 배양 세포에 의한37 ° C에서 10 분 동안 0.05 % 트립신 및 0.02 % EDTA를 이닝, 및 10 % FBS를 함유하는 배지에서 트립신을 중화. </li><li> 매체에 원심 분리기 세포와 원심 분리 (300 XG, 5 분) 다음 인산염 완충 생리 식염수 5 ㎖ (PBS)에 재현 탁하여 그들을 씻는다. </li><li> 다음 두 가지 방법 중 하나에 의해 DNA 분석을 위해 세포를 준비 <ol><li> 고정되지 않은 셀 (10)을 분석하기위한 방법 주 :이 방법은 세포주기 분석을 위해 상업적으로 이용 가능한 키트를 사용하여 수행 될 수있다. 세포가 절차에 고정 핵이 시간이 지남에 따라 손상되어 염색되지 않기 때문에이 방법으로 제조 된 샘플은 즉시 분석되어야한다. <ol><li> 250 MM의 자당을 함유하는 40 mM의 시트 레이트 버퍼와 세포를 씻으십시오. 이어서 실온에서 10 분 동안 250 mM의 자당을 함유하는 200 μL의 40 mM의 시트르산 완충액, 0.1 % (V / V)의 Nonidet P40, 30 μg의 / ㎖ 트립신 250 μL로 셀을 처리한다. </li><li> 0.5 μg의 / ㎖의 트립신 INH의 200 μL를 추가실온에서 10 분 동안 ibitor 250 mM의 수크로오스를 포함하는 40 mM의 시트르산 완충액 0.1 μg의 / ㎖의 RNase A, 및 세포 배양한다. </li><li> 0.4 mg을 200 μL를 추가 / 250 mM의 자당을 함유하는 40mm의 시트르산 완충액 ㎖의 프로피 디움 요오다 이드 (PI), 및 세포 핵을 염색을 실온에서 10 분 동안 세포를 배양한다. </li></ol></li><li> 고정 된 세포를 분석하기위한 방법 <ol><li> 세포 현탁액을 혼합하고 실온에서 30 분 동안을 남기고 100 % EtOH로 적가 4㎖를 첨가, PBS 1 ㎖로 세포를 현탁하여 80 % 에탄올로 세포를 고정한다. 이 정착액의 셀은 여러 주 동안 -20 ℃에서 저장 될 수있다. </li><li> PBS 5ml에 재현 탁하여이를 세포 씻어 원심 분리 (300 × g으로 5 분) 하였다. 0.5 ㎎ / ㎖의 RNase A의 세포를 취급를 50㎍ / ㎖의 프로피 디움 요오다 이드 (PI) (0.5 ㎎ / ㎖의 RNase (A)의 475 μL 1 ㎎을 25 μL / ㎖ PI)을 실온에서 30 분 동안로 얼룩. </li></ol></li></ol></li><li> t의 DNA 함량을 분석그는 488 nm의 적색 레이저 발광 채널 필터로 유동 세포 계측기를 사용하여 세포 (긴&gt; 내지 610 단계). 표적 세포의 배수성을 평가하는 동시에 정품 이배체 세포로부터 제조 된 기준 샘플을 분석한다. <ol><li> 대안 적으로, 이배체 세포 대 비드의 형광 강도의 비율을 평가하기 위해 표준 형광 비드를 추가한다. 사이토 단일 배체 세포와 이배체 세포 (11)의 덩어리를 구별하는 흐름의 옵션 &#39;펄스 폭 대 펄스 높이&#39;를 사용합니다. </li></ol></li></ol> 염색체 수와 핵형 분석 4. 시험 참고 :이 모든 잘 확립 된 절차이며, 기술 매뉴얼 또는 제조사의 프로토콜 세부 절차 및 기술 도움말을 참조해야합니다. <ol><li> 중기 세포를 체포하기 위해 4 시간 동안 0.1 μg의 / ㎖의 DC와 함께 기하 급수적으로 증가 세포 치료. </li><li> 염색체 슬라이드를 준비합니다. <ol><l난&gt; 트립신 처리하여 수확 세포 (적어도 5 × 10 5 세포)와 FBS를 포함하는 배지에서 일시 중지합니다. </li><li> 배지에서 세포 원심 분리 (300 × g으로 5 분), 10 분 동안 37 ° C에서 저장성 용액 (0.075 M KCl을 5 mL)로 처리한다. </li><li> 수정하고 Carnoy의 정착액 세포를 정지 (메탄올 : 아세트산 = 3 : 1). </li><li> 세포 현탁액의 - (35 μL 25) 작은 볼륨을 드롭하여 유리 슬라이드에 세포를 확산. 이러한 뜨거운 증기에 노출되는 등의 추가 단계가 확산 염색체를 개선해야 할 수도 있습니다. </li></ol></li><li> 현장 하이브리드의 염색체 개수 또는 핵형 분석 또는 여러 가지 빛깔의 형광에 대한 얼룩 세포 (mFISH). <ol><li> 염색체 수가. <ol><li> 20 분 - 5 % 김사 솔루션 (또는 형광 현미경 0.5 ㎎ / ㎖의 RNase A를 포함하는 5 μg의 / ML의 PI) 15와 얼룩 세포. </li><li> 디지털 적어도 50 중기 세포를 사진. </li><li> 이미지 분석을 이용 softwa 셀당 염색체 수를 계산터치 및 사진 편집 소프트웨어를 사용하여 염색체 중복 설명서를 분리 한 후 다시. 염색체 번호를 수동으로 득점 할 수 있지만, 컴퓨터 채점하는 것이 좋습니다. </li></ol></li><li> 핵형 분석 참고 :이 분석은 숙련 된 기술자 또는 전문 회사가 수행해야합니다. <ol><li> 표준 G 밴딩 기술 (12)에 따라 얼룩 세포. </li><li> 표준 karyograms (12)를 만들기 위해 염색체를 분석합니다. </li></ol></li><li> mFISH 참고 :이 단계는 선택 사항이며 필요한 경우 수행해야합니다. <ol><li> 제조 업체의 프로토콜 (13)에 따라 인간의 염색체에 대한 여러 가지 빛깔의 물고기 프로브를 사용하여 얼룩 세포. </li><li> 적절한 필터를 사용하여 형광 현미경 분석 mFISH (13)를위한 소프트웨어를 사용하여 염색체 분석. </li></ol></li></ol></li></ol>

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저자는 더 경쟁 재정적 관심이 없음을 선언합니다.

화학 약품에 의한 이배체 세포에서 tetraploidy의 유도에 큰 문제 중 하나 세포질 분열 억제제 또는 스핀들 억제제에 의해 세포가 종종 배체 및 배체 집단의 혼합물이 될 것입니다, 그리고 배체 세포는 이배체 세포로부터 분리해야합니다. 이배체 세포의 무료 배체 인구의 절연을위한 가장 일반적인 방법은 희석을 제한하여 FACS 또는 복제를 사용합니다. 그러나 이러한 과정은 힘들고 수행하기 쉽지 않다. 이 보고서에서 우리는 정상적인 인간의 섬유 아 세포에서 이배체 인구의 무료 증식 배체 세포를 확립 할 수있는 새로운 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 유사 분열에서 이배체 세포를 체포하기위한 스핀들 독 DC를 사용하고 접시 표면에 부착 이배체 간기 세포에서 떨이로 구분됩니다 유사 분열 세포를 체포했다. 수집 된 세포는 추가로 3 일간 DC로 처리되고, 유사 분열 이배체 세포는 아마도 DC B이 장기간 처리하여 G1 배체 세포로 변환Y 체크 포인트 적응 (또한 유사 분열 미끄러짐라고도 함). 이 세포는 약물 제거의 며칠 동안 성장 체포 후 배체 세포와 같은 세포 성장을 다시 시작합니다. 이 방법의 장점은 절차가 비교적 간단하고 FACS를 이용하거나 배체 세포를 분리하기 위해 복제와 비교 ​​가능하다는 것이다. 방법의 한계는 다음과 같다. 이러한 상피 세포 등의 섬유 아 세포가 아닌 다른 세포 유형에 적용은 현재 알려져 있지 않다. 이는 향후 연구에서 확인해야합니다. 작은 이배체 인구는 경우에 남아있을 수 있습니다. 그러나, 이들 세포는 계대 직렬로 감소하는 경향이있다. 중요한 이배체 인구가 DC 치료, DC의 높은 농도 지속되면 (1.2-1.5 μg의 / ㎖) 또는 (4 일 대신 삼일의) 흔들림 오프 후 DC와 더 이상 치료 결과를 향상시킬 수 있습니다. 이 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 다음과 같다. 우선, 용 DC와 처리 시간흔들림 오프하기 전에 유사 분열에서 셀을 rresting하는 것이 중요합니다. 이 처리 시간은 불가능 떨고하여 유사 분열 세포를 수집하게 식기 표면에 분열 미끄러짐 및 부착을 일으킬 수 너무 오랫동안 치료, 가능한 많은 유사 분열 세포를 수집하기 위해 충분히 있어야 않는다. 유사 분열 세포의 최대 복구를위한 적절한 시간은 표적 세포에 의존 할 수 있기 때문에, 예비적인 실험에 의해 결정되어야한다. 세포를 간기하는 것도 중요하다에서 두 번째로, 떨고 단계는 유사 분열 세포를 분리합니다. 이 단계에서 느슨하게 접시 표면에 부착 이배체 세포 분열, 원심 분리 플라스크 부드러운 흔들림에 의해 수집된다. 이 유사 분열 흔들림 오프 나중에 배체 인구에 의한 오염의 원인이 될 수 있습니다 접착 계면 세포로부터 DC에 의해 체포 유사 분열 세포를 분리한다. 또한 간기 세포의 박리 세포 손상 및 수있는 매체의 기포 발생의 원인이 심하게 진탕 R이배체 세포의 오염 esulting. 이러한 방법의 성공에 영향을 미칠 수있는 다른 인자는 배양 배지이다. 강력한 성장 자극 DC 처리 후의 증식의 회복에 필요한 것으로 보인다되므로, MEM-α와 같은 영양소가 풍부한 배지 배체 세포의 증식을 지원하기 위해 사용되어야한다. 배체 세포 (2.2.5)의 유도의 최종 단계에서 20 % FBS의 농도가 증가하면이 방법의 성공을 증가시킬 수있다. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 지금까지 인간 섬유 아세포 균주 TIG-1, BJ, IMR-90와 텔로 머라 제 - 불후 TIG-1 이제 14 ~ 16까지에서 배체 세포를 생산합니다. 4 일 동안, 흔들림 오프하지 않고, DC 연속적으로 처리 할 때이 세포 변형이 거의 완전히 배체되기 때문에 이들 세포주 중, TIG-1은 오히려 이례적인 일이다. 단 TIG-1 세포는 DC와 간단한 처리의 결과로서 완전히 배체 될 이유는 현재 알려져 있지 않다. 가능한 expla국가 배체 G1 단계에서 다른 유형의 체포 세포의 상당 부분이 DC로 처리하고 (1) TIG-1 세포 (2) 동일한 치료 G1에 체포, 또는하지 않는 반면, 치료 후 증식을 다시 시작할 때하는 것이 될 수 있습니다 TIG-1 세포의 인구는 비가 역적 같은 치료에서 G1에 체포 된 후 증식을 다시 시작되지 않습니다. 어떤 경우에, DC의 G1 체크 포인트의 상이한 민감도 DC 연속 처리 후의 세포의 다른 동작을 담당 할 수있다. 종양에서 tetraploidy의 병인 의의를 조사 할 때, 많은 연구자가 tetraploidy는 &quot;tetraploidy 체크 포인트&quot;라고한다 세포의 p53의 의존적 성장 정지를 유도하는 것이 제안되어 있기 때문에, 배체 세포에서 p53 유전자의 상태에 대해 큰 문제가 17-20. 이 가설이 올바른 경우 배체 세포 증식에서 p53의 시그널링은 불 활성화되어야한다. 하나,우리의 프로토콜에 의해 설립 배체 세포는 이배체 세포 (15, 16)와 거의 같은 속도로 성장에도 불구하고 기능 p53의를 갖고있는 것 같다. 이 차이에 대한 이유는 현재 알려져 있지 않고, 배체 세포의 증식에 p53의 불 활성화의 중요성은 향후 연구에서 정밀하게 조사해야한다. 사실, p53의를 통해 기능하는 tetraploidy 체크 포인트의 존재는 논란이 21-23 남아있다. 체외에서 전파 할 수 있습니다 비 형질 배수체 세포는 염색체 불안정과 배수체 세포의 발암 가능성에 대한 자세한 분석을 위해 필수 불가결하지만, 이러한 세포는 지금까지 거의 사용할 수 없었다. 우리 프로토콜 배수체 인간 세포의 형질 전환 선도 메커니즘을 연구하는데 유용한 모델이 될 수있는 정상적인 인간 섬유 아세포에서 세포 증식 배체를 확립하는 간단하고 실현 가능한 방법을 제공한다.

배수성은 포유 동물 종의 전문 조직에서뿐만 아니라, 암과 같은 퇴행성 질환의 병리 적 상태의 다양한뿐만 관찰되었다. 배수체 (주로 배체) 세포는 종종 경부 3,4의 바렛 식도 2 또는 편평 상피내 병변 인간 조직의 발암 병변 관찰하고, 그 조직을 5 이수성 악성 세포의 근원으로 간주되어왔다 6. 이 이수성 배체 세포로의 전환이 종양 형성의 초기 단계에서 중요한 이벤트가 될 수 있다고 제시되어 있지만,이 과정에 관여하는 메커니즘은 완전히 이해되지 않는다. 이 비 형질 배수체 인간의 세포를 전파 할 수있는 더 체외 모델을 사용할 수 없었다 부분적으로 있기 때문이다. 일부 연구자들은 INH로 이핵 세포의 생성을 통해 비 형질 인간의 상피 세포에서 tetraploidy을 유도 한세포질 분열 7-9 ibiting. 그러나이 방법 불필요한 이배체 세포 -7,8- 형광 - 활성화 세포 분류 (FACS)에 의해 제거해야 또는 희석 9를 제한하여 클로닝. 이러한 절차를 수행하기 쉬운 힘들고 없기 때문에 간단한 방법은 비 형질 배체 세포가이 분야의 연구를 위해 요구되는 설정합니다. 본 보고서에서, 우리는 비교적 간단한 절차에 의해 정상적인 인간 섬유 아세포 또는 텔로 머라 아제 - 불후의 인간 섬유 아세포의 증식 배체 세포를 확립하기위한 프로토콜을 설명합니다. 절차는 또한 DC로 처리 떨고에 의해 수집 된 유사 분열에서 이배체 세포 및 유사 분열 세포를 체포 스핀들 독 데메 콜신 (DC)를 사용합니다. 오랜 시간 동안 DC 처리 이배체 유사 분열 세포는 G1 배체 세포로 변환하고, 이들 세포는 약물의 제거 다음의 며칠 동안 성장 정지 후 같은 배체 세포 증식. 이 프로토콜은 제공염색체 불안정성 배수체 인간 종양 세포의 전위 사이의 관계를 연구하는 유용한 모델을 생성하는 효과적인 방법.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="687">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">MEM-&#945;</td>
			<td style="width:101px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">M8042-500ML</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:101px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">T4174</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">FBS</td>
			<td style="width:101px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">172012-500ML</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:205px;">Demecolcine solution (10 &#956;g/mL in HBSS)</td>
			<td style="width:101px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">D1925-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:205px;">BD CycleTES Plus DNA Reagent Kits</td>
			<td style="width:101px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:136px;">#340242</td>
			<td style="width:245px;">For examination of DNA ploidy by flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:205px;">Human chromosome multicolor FISH probe 24XCyte</td>
			<td style="width:101px;">MetaSystems</td>
			<td style="width:136px;">#D-0125-060-DI</td>
			<td style="width:245px;">Specialized filter set and software for mFISH analysis are necessary</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:205px;">Isis imaging system with mFISH&#160; software&#160;</td>
			<td style="width:101px;">MetaSystems</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td style="width:245px;">Specialized probe kit is necessary</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment of proliferative tetraploid cells from nontransformed human fibroblasts

Polyploid (mostly tetraploid) cells are often observed in preneoplastic lesions of human tissues and their chromosomal instability has been considered to be responsible for carcinogenesis in such tissues. Although proliferative polyploid cells are requisite for analyzing chromosomal instability of polyploid cells, creating such cells from nontransformed human cells is rather challenging. Induction of tetraploidy by chemical agents usually results in a mixture of diploid and tetraploid populations, and most studies employed fluorescence-activated cell sorting or cloning by limiting dilution to separate tetraploid from diploid cells. However, these procedures are time-consuming and laborious. The present report describes a relatively simple protocol to induce proliferative tetraploid cells from normal human fibroblasts with minimum contamination by diploid cells. Briefly, the protocol is comprised of the following steps: arresting cells in mitosis by demecolcine (DC), collecting mitotic cells after shaking off, incubating collected cells with DC for an additional 3 days, and incubating cells in drug-free medium (They resume proliferation as tetraploid cells within several days). Depending on cell type, the collection of mitotic cells by shaking off might be omitted. This protocol provides a simple and feasible method to establish proliferative tetraploid cells from normal human fibroblasts. Tetraploid cells established by this method could be a useful model for studying chromosome instability and the oncogenic potential of polyploid human cells.

우리의 경험에 의하면, TIG-1 세포 4 일 0.1 μg의 / mL의 DC (그림 2A)와 간단한 연속 처리에 의해 거의 완전히 배체 할 수있다. 대조적으로, 예 BJ 또는 IMR-90 및 TIG-HT 세포와 같은 다른 섬유 아세포 균주, 흔들림 오프 법에 의해 이배체 동일한 처리 다음 배체 집단, 및 유사 분열 세포의 분리 혼합물되었다이 과정에서 필요한 (- 치료 시작 후 18 시간 일반적으로 16) (도 2B, C) DC 치료. 3 일간 DC와 추가 처리 후, 세포 성장 체포를 시행하고 대형 전시, 며칠 동안 형태를 평평. 일반적으로 일주일 이내에, 작은 증식 세포는 큰 평평한 세포 사이 (그림 3) 나타났다. DC 처리 후 삼주 - 세포는 거의 완전히 배체 2가되었다. 설립 배체 세포 모달 염색체 번호 exce, 대부분의 경우 92이었다PT TIG-HT 세포로부터 설정된 배체 세포주 중 하나는 세포의 대부분 염색체 91 (도 4)를 가졌다. 설립 배체 세포는 이배체 세포와 거의 같은 속도 (그림 5)에서 성장했다. 불멸화 세포로부터 이들도 불멸 (도 5)가 될 듯하면서 않은 불멸화 세포로부터 확립 배체 세포주 원래 이배체 세포와 같은 거의 동일한 복제 성 수명을 나타내었다. 비 불후 TIG-1 세포에서 설립 배체 세포는 그림 6 (세포가 오히려 복잡한 클론 수차를 보였다 불후 TIG-1 (TIG-HT)에서 그 반면에하는 배체 염색체 수 (그림 6 상단 패널)을 갖는 제외하고 정상 핵형을 보였다 중간과 하단 패널). 후자 세포 클론 수차의 주파수 (TIG-HT-4N)는 PDL에 450 세포 당 5.2 수차 255 집단 배가 레벨 (의 PDL)으로 셀당 2.5 수차 증가반복 하위 문화와. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55028/55028fig1.jpg" /> 그림 1 : Tetraploidy의 유도를위한 프로토콜의 도식 그림. 일부 세포주 (예 : TIG-1) 연속 처리에 의해 거의 완전히 배체 될 수있는 반면 이배체 세포의 최소 오염과 배체 세포를 얻으려면, 유사 분열 흔들림 오프 및 DC 치료의 조합, 대부분의 세포주 (아래 그림)에 필요한 데메 콜신 (위 그림)와 함께. 유사 분열에서 셀을 체포 18 시간 (이 시간이 예비 실험에 의해 결정되어야한다) - 1) 16 0.1 μg의 / ㎖의 DC와 T75 플라스크 (적어도 5 × 10 6)에 세포를 치료. 2) 흔들림 오프 법에 의해 유사 분열 세포를 수집하고 60mm 배양 접시에 시드. 3) 추가로 3 일 동안 0.1 μg의 / ㎖의 DC와 세포를 치료. 4) 약물이없는 배지에서 세포 (일반적으로 셀 (P)를 다시 인큐베이션일주일 내 roliferation). 스케일 바는 100 μm의를 나타냅니다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55028/55028fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55028/55028fig2.jpg" /> 그림 2 : 전 섬유 아 세포와 Tetraploidy의 유도에 대한 치료 후 DNA 히스토그램. (A) TIG-1 세포. 이 세포주는 4 일 동안 0.1 μg의 / ㎖의 DC와 간단한 연속 처리하여 배체된다. (B) BJ 세포. 이 세포주는 DC (왼쪽 패널)와 간단한 치료 다음 배체 및 배체 집단의 혼합물이되기 때문에, 떨고에 의해 유사 분열 세포의 분리는 배체 세포 (오른쪽 패널)을 설정하기 위해 DC 치료 중 필요합니다. (C) TIG-HT 세포 (TIG-1, 텔로 머라 아제 - 불멸화). 이들 세포는 또한 빗살에 의해 제조 될 필요<html> DC 처리 및 흔들어 오프 배체 세포의 설립의 ination. 히스토그램의 숫자는 약 제거 후 시간 (일)을 나타냅니다. 횡축은 DNA 함량 (C 보체)을 나타낸다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55028/55028fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55028/55028fig3.jpg" /> 그림 3 : DC로 치료 BJ 세포의 대표 현미경 사진. (A) BJ 세포는 16 시간 동안 0.1 μg의 / ㎖ DC로 처리 하였다. 유사 분열에서 체포 많은 세포를 볼 수 있습니다. (B) DC 치료의 끝. 거의 모든 세포 성장 체포. 칠일 DC 처리 후 (C). 큰 병합 된 셀 사이의 작은 증식 세포를 볼 수 있습니다. 십사일 DC 처리 후 (D). 세포는 활발하게 성장하고있다.<html> e.com/files/ftp_upload/55028/55028fig3large.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/55028/55028fig4.jpg" /> 그림 4 : 각 세포주에서 설립 배체 세포에 대한 염색체와 염색체 수의 히스토그램의 대표 현미경 사진. 최고, 중간과 하단 패널은 TIG-1에서 설립 배체 세포 (DC 처리 후 이주), BJ (2 주 후 DC 처리) 및 TIG-HT (DC 처리 후 7 주)는 각각 세포를 나타냅니다. 염색체는 적어도 50 중기 득점했다. 히스토그램의 숫자는 모달 염색체 숫자입니다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55028/55028fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> ftp_upload / 55028 / 55028fig5.jpg &quot;/&gt; 그림 5 : 인간 섬유 아세포 (이배체 세포)와 각 세포주에서 설립 배체 세포의 대표 성장 프로필. 왼쪽, 중앙, 오른쪽 패널은 원래 TIG-1의 성장 프로필을 보여, BJ와 TIG-HT 세포 (오픈 마커) 각각의 세포주에서 설립 배체 세포들은 (마커를 폐쇄). 세포는 일주일에 두 번 계대하고의 PDL은 세포 수를 계산 하였다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55028/55028fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/55028/55028fig6.jpg" /> 그림 6 : G-밴딩 및 mFISH에 의해 대표 Karyograms. 상단 패널은 TIG-1에서 설립 배체 세포 (DC 처리 후 이주)의 G-밴딩하여 karyogram을 보여줍니다. 중간과 하단 패널 표시TIG-HT 세포 (DC 치료 후 15, 41 주)에서 설립 배체 세포 mFISH에 의해 karyograms. 핵형 10 세포 (TIG-1) 또는 20 세포 (TIG-HT)에 기초 하였다. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55028/55028fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Establishment of Proliferative Tetraploid Cells from Nontransformed Human Fibroblasts

Although proliferative polyploid cells are necessary to analyze chromosomal instability of polyploid cells, creating such cells from nontransformed human cells is not easy. The present report describes relatively simple procedures to establish proliferative tetraploid cells free of a diploid population from normal human fibroblasts.

비 형질 인간 섬유 아세포의 증식 배체 세포의 수립

Polyploid (mostly tetraploid) cells are often observed in preneoplastic lesions of human tissues and their chromosomal instability has been considered to ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

7.2K 조회수.  Saitama Medical University. Although proliferative polyploid cells are necessary to analyze chromosomal instability of polyploid cells, creating such cells from nontransformed human cells is not easy. The present report describes relatively simple procedures to establish proliferative tetraploid cells free of a diploid population from normal human fibroblasts.

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Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated from human muscle biopsy samples using enzymatic digestion and their myogenic properties studied in culture. Quantitatively, the two main adherent cell types obtained from enzymatic digestion are: (i) the satellite cells (termed myogenic cells or muscle precursor cells), identified initially as CD56+ and later as CD56+/desmin+ cells and (ii) muscle-derived fibroblasts, identified as CD56&#8211; and TE-7+. Fibroblasts proliferate very efficiently in culture and in mixed cell populations these cells may overrun myogenic cells to dominate the culture. The isolation and purification of different cell types from human muscle is thus an important methodological consideration when trying to investigate the innate behavior of either cell type in culture. Here we describe a system of sorting based on the gentle enzymatic digestion of cells using collagenase and dispase followed by magnetic activated cell sorting (MACS) which gives both a high purity (&#62;95% myogenic cells) and good yield (~2.8 x 106 &#177; 8.87 x 105 cells/g tissue after 7 days in vitro) for experiments in culture. This approach is based on incubating the mixed muscle-derived cell population with magnetic microbeads beads conjugated to an antibody against CD56 and then passing cells though a magnetic field. CD56+ cells bound to microbeads are retained by the field whereas CD56&#8211; cells pass unimpeded through the column. Cell suspensions from any stage of the sorting process can be plated and cultured. Following a given intervention, cell morphology, and the expression and localization of proteins including nuclear transcription factors can be quantified using immunofluorescent labeling with specific antibodies and an image processing and analysis package.

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

인간의 골격근에서 기본 근육 조직 세포와 섬유 아 세포의 분리 및 정량 면역 세포 화학 특성

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

연구

발생학

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to primary human adult neural cultures raises unique challenges. Recent developments in induced pluripotent stem cells (iPSC) provides an alternative approach to derive neural cultures from skin fibroblasts through patient specific iPSC, but this process is labor intensive, requires special expertise and large amounts of resources, and can take several months. This prevents the wide application of this technology to the study of neurological diseases. To overcome some of these issues, we have developed a method to derive neural stem cells directly from human adult peripheral blood, bypassing the iPSC derivation process. Hematopoietic progenitor cells enriched from human adult peripheral blood were cultured in vitro and transfected with Sendai virus vectors containing transcriptional factors Sox2, Oct3/4, Klf4, and c-Myc. The transfection results in morphological changes in the cells which are further selected by using human neural progenitor medium containing basic fibroblast growth factor (bFGF) and vascular endothelial growth factor (VEGF). The resulting cells are characterized by the expression for neural stem cell markers, such as nestin and SOX2. These neural stem cells could be further differentiated to neurons, astroglia and oligodendrocytes in specified differentiation media. Using easily accessible human peripheral blood samples, this method could be used to derive neural stem cells for further differentiation to neural cells for in vitro modeling of neurological disorders and may advance studies related to the pathogenesis and treatment of those diseases.

A method was developed to directly derive human neural stem cells from hematopoietic progenitor cells enriched from peripheral blood cells.

말초 혈액 조혈 전구 세포에서 인간 신경 줄기 세포의 직접 유도

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are distributed along the dendrites. Their morphology is largely dependent on neuronal activity, and they are dynamic. Dendritic spines express glutamatergic receptors (AMPA and NMDA receptors) on their surface and at the levels of postsynaptic densities. Each spine allows the neuron to control its state and local activity independently. Spine morphologies have been extensively studied in glutamatergic pyramidal cells of the brain cortex, using both in vivo approaches and neuronal cultures obtained from rodent tissues. Neuropathological conditions can be associated to altered spine induction and maturation, as shown in rodent cultured neurons and one-dimensional quantitative analysis 1. The present study describes a protocol for the 3D quantitative analysis of spine morphologies using human cortical neurons derived from neural stem cells (late cortical progenitors). These cells were initially obtained from induced&#160;pluripotent stem cells. This protocol allows the analysis of spine morphologies at different culture periods, and with possible comparison between induced&#160;pluripotent stem cells obtained from control individuals with those obtained from patients with psychiatric diseases.

Dendritic spines of pyramidal neurons are the sites of most excitatory synapses in mammalian brain cortex. This method describes a 3D quantitative analysis of spine morphologies in human cortical pyramidal glutamatergic neurons derived from induced&#160;pluripotent stem cells.

인간 유도 만능 줄기 세포에서 파생 된 피라미드 뉴런에서 돌기 쪽의 3 차원 정량화

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Establishment of Genome-edited Human Pluripotent Stem Cell Lines: From Targeting to Isolation

Genome-editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) provides a genetically controlled and clinically relevant platform from which to understand human development and investigate the pathophysiology of disease. By employing site-specific nucleases (SSNs) for genome editing, the rapid derivation of new hPSC lines harboring specific genetic alterations in an otherwise isogenic setting becomes possible. Zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs) and clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 are the most commonly used SSNs. All of these nucleases function by introducing a double stranded DNA break at a specified site, thereby promoting precise gene editing at a genomic locus. SSN-meditated genome editing exploits two of the cell&#39;s endogenous DNA repair mechanisms, non-homologous end joining (NHEJ) and homology directed repair (HDR), to either introduce insertion/deletion mutations or alter the genome using a homologous repair template at the site of the double stranded break. Electroporation of hPSCs is an efficient means of transfecting SSNs and repair templates that incorporate transgenes such as fluorescent reporters and antibiotic resistance cassettes. After electroporation, it is possible to isolate only those hPSCs that incorporated the repair construct by selecting for antibiotic resistance. Mechanically separating hPSC colonies and confirming proper integration at the target site through genotyping allows for the isolation of correctly targeted and genetically homogeneous cell lines. The validity of this protocol is demonstrated here by using all three SSN platforms to incorporate EGFP and a puromycin resistance construct into the AAVS1 safe harbor locus in human pluripotent&#160;stem cells.

Genome editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) can be done quickly and efficiently. Presented here is a robust experimental procedure to genetically engineer hPSCs as exemplified by editing the AAVS1 safe harbor locus to express EGFP and introduce antibiotic resistance.

게놈 편집 인간 다 능성 줄기 세포의 설립 : 분리에 타겟팅에서

Genome-editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) provides a genetically controlled and clinically relevant platform from which to understand human ...

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can direct the differentiation of hPSCs into the cell type of interest by manipulating the culture conditions to recapitulate signals seen during development. One such cell type is the melanocyte, a pigment-producing cell of neural crest (NC) origin responsible for protecting the skin against UV irradiation. This protocol presents an extension of a currently available in vitro Neural Crest differentiation protocol from hPSCs to further differentiate NC into fully pigmented melanocytes. Melanocyte precursors can be enriched from the Neural Crest protocol via a timed exposure to activators of WNT, BMP, and EDN3 signaling under dual-SMAD-inhibition conditions. The resultant melanocyte precursors are then purified and matured into fully pigmented melanocytes by culture in a selective medium. The resultant melanocytes are fully pigmented and stain appropriately for proteins characteristic of mature melanocytes.

This work describes an in vitro differentiation protocol to produce pigmented, mature melanocytes from human pluripotent stem cells via a neural crest and melanoblast intermediate stage using a feeder-free, 25 day protocol.

인간 다 능성 줄기 세포에서 멜라닌 세포의 공급이없는 유도

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Epigenetic Conversion as a Safe and Simple Method to Obtain Insulin-secreting Cells from Adult Skin Fibroblasts

Regenerative medicine requires new, fully functional cells that are delivered to patients in order to repair degenerated or damaged tissues. When such cells are not readily available, they can be obtained using different approaches that include, among the many, reprogramming and trans-differentiation, with advantages and limitations that are specific of the different techniques. Here a new strategy for the conversion of an adult mature fibroblast into an insulin-secreting cell, arbitrarily designated as epigenetic converted cells (EpiCC), is described. The method has been developed, based on the increasing understanding of the mechanisms controlling epigenetic regulation of cell fate and differentiation. In particular, the first step uses an epigenetic modifier, namely 5-aza-cytidine, to drive adult cells into a "highly permissive" state. It then takes advantage of this brief and reversible window of epigenetic plasticity, to re-address cells toward a different lineage. The approach is designated "epigenetic cell conversion". It is a simple and robust way to obtain an efficient, controlled and stable cellular inter-lineage switch. Since the protocol does not involve the use of any gene transfection, it is free of viral vectors and does not involve a stable pluripotent state, it is highly promising for translational medicine applications.

Here, a new method that allows the conversion of adult skin fibroblasts into insulin-secreting cells is presented. This technique is based on epigenetic conversion, does not involve the use of retroviral vectors nor the acquisition of a stable pluripotent state. It is therefore highly promising for translational medicine applications.

성인 피부 섬유 아 세포에서 인슐린 분비 세포를 얻을 수있는 안전하고 간단한 방법으로 성적인 변환

Regenerative medicine requires new, fully functional cells that are delivered to patients in order to repair degenerated or damaged tissues. When such ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the human body. The differentiation of hPSCs to human hepatocyte-like cells (HLCs) has been extensively studied, and efficient differentiation protocols have been established. The combination of extracellular matrix and biological stimuli, including growth factors, cytokines, and small molecules, have made it possible to generate HLCs that resemble primary human hepatocytes. However, the majority of procedures still employ undefined components, giving rise to batch-to-batch variation. This serves as a significant barrier to the application of the technology. To tackle this issue, we developed a defined system for hepatocyte differentiation using human recombinant laminins as extracellular matrices in combination with a serum-free differentiation process. Highly efficient hepatocyte specification was achieved, with demonstrated improvements in both HLC function and phenotype. Importantly, this system is easy to scale up using research and GMP-grade hPSC lines&#160;promising advances in cell-based modelling and therapies.

The method presented here describes a scalable and good manufacturing practice (GMP)-ready differentiation system to generate human hepatocyte-like cells from pluripotent stem cells. It serves as a cost-effective and standardized system to generate human hepatocyte-like cells for basic and applied human liver research.

정의 및 간세포와 같은 세포의 확장 성 생성 인간 다 능성 줄기 세포에서

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

RNA-based Reprogramming of Human Primary Fibroblasts into Induced Pluripotent Stem Cells

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative therapeutic requires a safe, robust, and expedient reprogramming protocol. Here, we present a clinically relevant, step-by-step protocol for the extremely high-efficiency reprogramming of human dermal fibroblasts into iPSCs using a non-integrating approach. The core of the protocol consists of expressing pluripotency factors (SOX2, KLF4, cMYC, LIN28A, NANOG, OCT4-MyoD fusion) from in vitro transcribed messenger RNAs synthesized with modified nucleotides (modified mRNAs). The reprogramming modified mRNAs are transfected into primary fibroblasts every 48 h together with mature embryonic stem cell-specific microRNA-367/302 mimics for two weeks. The resulting iPSC colonies can then be isolated and directly expanded in feeder-free conditions. To maximize efficiency and consistency of our reprogramming protocol across fibroblast samples, we have optimized various parameters including the RNA transfection regimen, timing of transfections, culture conditions, and seeding densities. Importantly, our method generates high-quality iPSCs from most fibroblast sources, including difficult-to-reprogram diseased, aged, and/or senescent samples.

Here we describe a clinically relevant, high-efficiency, feeder-free method to reprogram human primary fibroblasts into induced pluripotent stem cells using modified mRNAs encoding reprogramming factors and mature microRNA-367/302 mimics. Also included are methods to assess reprogramming efficiency, expand clonal iPSC colonies, and confirm expression of the pluripotency marker TRA-1-60.

인간의 기본 섬유 아 세포의 유도 만능 줄기 세포로 재프로그래밍 RNA 기반

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

인간 유도에서 Somite 파생 상품의 체 외 발생에서 만능 줄기 세포

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human HSC emergence in vitro are required to overcome limitations in studying this complex developmental process. Here, we describe a protocol to generate hematopoietic stem and progenitor-like cells from human dermal fibroblasts employing a direct cell reprogramming approach. These cells transit through a hemogenic intermediate cell-type, resembling the endothelial-to-hematopoietic transition (EHT) characteristic of HSC specification. Fibroblasts were reprogrammed to hemogenic cells via transduction with GATA2, GFI1B and FOS transcription factors. This combination of three factors induced morphological changes, expression of hemogenic and hematopoietic markers and dynamic EHT transcriptional programs. Reprogrammed cells generate hematopoietic progeny and repopulate immunodeficient mice for three months. This protocol can be adapted towards the mechanistic dissection of the human EHT process as exemplified here by defining GATA2 targets during the early phases of reprogramming. Thus, human hemogenic reprogramming provides a simple and tractable approach to identify novel markers and regulators of human HSC emergence. In the future, faithful induction of hemogenic fate in fibroblasts may lead to the generation of patient-specific HSCs for transplantation.

This protocol demonstrates the induction of a hemogenic program in human dermal fibroblasts by enforced expression of the transcription factors GATA2, GFI1B and FOS to generate hematopoietic stem and progenitor cells.

전사 요인의 강제 표현에 의한 인간 섬유아세포의 혈생 재프로그래밍

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human ...