Funding was provided by the Austrian Science Fund FWF grant No. P-22969-B11 to F. Ferraguti, and by the Charitable Hertie Foundation and the Werner Reichardt Centre for Integrative Neuroscience and by the DFG (CIN-Exc. 307) to I. Ehrlich.

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The authors declare that they have no competing financial interests.

동결 골절 전자 현미경은 40 년 이상 미세 구조 연구의 주요 기술하고있다. 그러나, 막의 고분자 조성물을 연구하는 유효한 수단의 결여는 그 사용에 상당한 감소를 일으켰다. 최근 인해 immunogold 라벨 (1, 2), 즉 FRIL 기술에 의해 세포막 단백질을 표시하기위한 효과적인 방법의 개발이 동결 골절 전자 현미경의 주요 부활되고있다. FRIL 기술은 다른 immunogold 미세 방법에 비해 몇 가지 장점을 가지고있다. 첫째, 단백질은 감도를 증가 항체에 쉽게 액세스 할 수 있습니다. 둘째, 복제의 2 차원 표면 등 시냅스 막으로서 세포막 전문, 큰 부분의 노출 세리의 힘들고 시간 소모적 재구성없이 관심 분자의 공간적 분포 및 물리적 연속성의 검사를 허용알 얇은 섹션. 셋째, 세포막의 양쪽 절반의 이용은 각각의 구성에 대해 표시 할 수 단백질의 수가 제공 적합한 항체를 사용할 수를 증가시킨다. 파쇄시 분할 멤브레인의 소수성 표면은 골절 표면에 잔류 된 단백질 도메인을 구축하고 그리고 탄소, 백금으로 코팅된다. 이것은 이러한 도메인의 항원에 대한 항체의 접근을 방지 할 수 있습니다. 복제의 P-얼굴 인스턴스의 원형질 공간 대향 만 에피토프 반면 단지 항체에 의해 결합 될 수있는 공간 exoplasmic 대향 에피토프 전자 표면에 항체가 검출 될 수있다 (도 2 참조). 한편, FRIL 기법은 특정 제한이 앓고. 골절이 무작위로 발생, 특정 세포 또는 구조를 대상으로 어려울 수 있습니다. 이것은 또한 FRA의 다른 확률이 주어진, 시냅스 컬렉션, 예를 들어 샘플링 바이어스로 이어질 수 있습니다다른 곡률 (샤프트 대 예를 들어, 등뼈)와 구조의 멤브레인을 따라 cturing. 또한, 상기 두면 중 한 막 단백질의 배치를 예측할 수있다. 따라서, P-E-얼굴이나 얼굴 단백질의 분포는 특별히 정량적 연구에 신중 될 세포와 세포 외 도메인에 대한 반응성 항체를 사용하여 검사한다. 유일한 형태 적 특징에 기초 할 때 마지막으로, 시냅스 축삭 단자로서 특정 구조의 복제본의 식별이 어려울 수있다. 그러나, 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 사용하거나 태그 세포막 단백질 또는 추가 도구 바이러스 벡터를 제공하여 채널의 전달은 골절 막의 식별을 용이하게한다. 예를 들어,이 연구는 시냅스 날 공개 μ-오피오이드 수용체의 편도 또는 라벨에 자신의 축삭의 efferents를 식별하기 위해 시상 신경 세포에 ChR2 - YFP의 전달을 이용했다ITC 뉴런의 mbranes. 성공적 FRIL 기술을 수행하기 위해 특별한주의가 조직 정착 관한주의해야한다. 강 조직을 고정 (&gt; 2 % 파라 포름 알데히드)를 교차 골절 고속 라벨링 감도의 감소를 초래할 수있다. 한편, 약한 고착 티슈 운반 제제 (예 : 부분 절단)을 어렵게 만든다. 이 트리밍 된 블록의 두께는 양면 테이프의 두께와 일치하는지 제어하는​​ 것도 중요하다. 시편의 두께는 테이프보다 낮은 경우, 조직의 표면은 두 개의 금속 담체의 표면에 부착 할 수있는, 따라서 고정 된 시편을 파단되지 않는다. 조직이 두꺼운 경우 두 구리 캐리어 샌드위치이 이루어질 때, 그것은 불가피 구조적 왜곡으로 압축 될 것이다. 시험편이 파단되는 온도 (이 프로토콜에서, -115 ° C)도 중요한 역할을복제의 구조. 높은 온도는 이전 또는 증발 동안 조직의 표면에 수증기 축합 생성물로의 더 높은 레이트를 생성 할 수있다. 낮은 온도 (&lt;-125 ° C) 골절 중 물질의 오프 분할의 위험을 증가시킬 수있다. 이 물질은 시료의 표면에 떨어지거나 연결된 숙박 할 수 있습니다. 재료의이 조각은 코팅 된 이미지에 어두운 반점을 생산 대조된다. 낮은 온도에서 파쇄도 특히 돌기 쪽이 작은 미세 구조물 간 골절의 주파수에 영향을 미칠 수있다. 복제의 제조에서 또 다른 중요한 단계는 세제 소화이다. 소화가 완료되지 않으면, 소화 조직은 TEM의 구조 분석을 교란 복제본에 어두운 패치 나타난다. 또한, 소화 조직 배경 라벨링 증가 비특이적으로 결합하는 항체 또는 트랩을 할 수있다. 세제 한편, 사용조직 소화의 자신의 2 차 및 3 차 구조를 변경 복제에 관련된 분자를 변성 수 있습니다. 따라서, 특정 항원 서서히 추가 세척 단계 SDS 농도를 희석 할 필요가있을 수도있다. immunolabeling 들어, 이차 항체에 접합 된 금 입자의 크기가 서로 다른 가능성이 동시에 검출 할 수 있지만, 단지 성적, 심지어 시냅스 특성화와 세포막의 특정 마이크로 도메인에 여러 단백질. 그러나, 입체 장해로 정량 연구는 일반적으로 단지 하나의 분자의 검출에 한정된다. 금 입자의 크기는 또한 라벨 효능에 영향을 미칠 수있다. FRIL에서 라벨의 해석 들어, 인해가요 복잡한 형태로 immunogold 입자는 항원 20-25 nm의 반경을 갖는 반구 내의 어딘가에 위치 할 수 있음을 명심해야한다일차 및 이차 항체 (26)에 의해 에드. 이론과 FRIL 및 관련 기술의 연습에 대한 자세한 내용은, 우리는 다른 방법 론적 기사 (27), (28)에 또한 독자를 참조하십시오. FRIL 기술은 최근 30. 또한, AMPA-RS에 대한 FRIL 기술의 검출 감도는 하나의 기능 AMPA 하나씩 immunogold 입자 높이로 추정 다양한 시냅스 인구 29에서 글루타메이트 수용체 지역화 고해상도 정량 분석에 사용 된 -R 채널 29. 따라서,이 방법은 정량화 및 중앙 시냅스에서 AMPA-RS 및 NMDA-R과의 시냅스 표현의 패턴을 분석하기 위해 전반적으로 매우 유용합니다. 여기, 우리는 PIN / MGN-ITC 시냅스에서의 적용 가능성, 공포 조건화 동안 미국의 정보를 중계 가능성이 중요한 사이트를 보여 주었다. AMPA 수용체 아 단위의 Glu의 고도로 보존 된 세포 외 아미노산 잔기에 대해 발생하는 항체를 사용하여A1-GluA4, 우리는 시냅스 막 전문 분야에 해당하는 IMP 클러스터 내에서 금 입자의 고른 분포를 발견했다. ITC의 등뼈에서 AMPA-RS의 밀도는 PIN / MGN 시상 구 심성의 대상이 축 시냅스에 비해 유의하게 높았다. 모두 척추와 샤프트 시냅스에서 AMPA-RS에 대한 표시와 시냅스 영역 사이에 양의 상관 관계는 다른 글루타메이트 성 시냅스 (25)에 공통 기능을 검출 하였다. PIN / MGN-ITC 시냅스에서 AMPA-RS의 밀도가 낮은 분산은 대뇌 피질의 시냅스 (25)에서 시상 efferents (7)에 의해 형성된 다른 시냅스와 유사하지만 서로 다른 균일 한 분포를 나타냅니다. 반대로, NMDA-RS의 밀도보다 변수이고 AMPA-RS는 상이한 규제 건의 척추 축 시냅스 차이가 없었다. 미래에, FRIL 기법의 재현성는 중심 시냅스 기저 고분자 조성물을 평가하는 것을 허용하지 않지만 (C)의 검출을 용이하게 할 수있다공포 학습 후 이온 성 글루타메이트 수용체의 숫자와 subsynaptic 분포 hanges, 이러한 입력의 사전 및 시냅스 속성의 전 생체 내 녹음을 보완. 입력의 기원과 시냅스 후 소자의 특성 및 조성 disentangling 것은 중요하지만, 문제가되는 결론적으로,이 방법은 많은 다른 신경 회로에 입력 특정 흥분성 시냅스의 구조 - 기능 관계에 대한 통찰력을 얻기 위해 다른 연구자들에 의해 사용될 수있는 .

나노 미터 크기의 생체막의 기능적 구조의 정의는 투과 전자 현미경에 적합한 immunolabeling 기술 다수의 발달로 최근에는 도전되었다. 그러나, 이러한 기술은, 예를 들면 전후의 매립 immunogold을, 항원 및 / 또는 막 결합 단백질의 양적 제한 평가 불량한 검출 포함 중요한 제한들을 갖는다. 이러한 제한은 셀 다양성과 시냅스 이질성 높은 것을 특징으로하는 신경 조직의 미세 구조의 연구에 특히 중요해진다. 사전 및 시냅스 소자 차동 식 농축, 또는 수용체 전송기 및 이펙터 분자로서 시그널링 단백질의 상호 작용에 의해 결정 구조적 및 기능적 다양성이 이질성 결과. 직접 immunolabe에 대한 새로운 접근 방식세제 용해 동결 골절 복제 (FRIL)의 통합 또는 가교 막 단백질의 링은 원래 20 년전 1 후지모토에 의해 소개되었다. 이 원래의 방법이 있었다, 그러나 몇 가지 제한 사항, 즉, 같은 두뇌와 같은 복잡한 조직에서 개별적으로 매핑 된 셀 라벨 분자의 의미있는 상관 관계를 방해 복제의 심각한 분열. 약 10 년 전, Shigemoto와 카자는 점진적으로 기술이 향상되었습니다. 이것은 또한 크게 갭 접합 (3)의 연구, 특히 기술을 향상 콜로라도 주립 대학의 볼더 연구소, 과학자의 또 다른 그룹의 노력이 병행되었다. 동결 파쇄 프로토콜 및 시스템의 개선뿐만 아니라, (고압) 빠른 냉동의 도입은 지금 하이 연구자들은 상대적으로 큰 크기의 시험편의 단절 복제본을 생성 할 수 있도록한계와 강한 화학 고착에 의해 생성 된 유물없이 대부분의 세포 성분의 GH 품질​​의 이미지. FRIL 기술은 사전 및 시냅스의 평면도의 또 다른 장점으로, 이러한 뇌 복잡한 조직 내의 하나 이상의 매핑 학적에서 (동시에) 단백질 및 미세 침 흡인 세포 검사 식별 세포 동일계 식별에 고 정량의 큰 장점을 제공한다 하나의 복제 요소. 따라서, FRIL 기술은 많은 기술적 장애에도 불구하고, 특히 각각의 시냅스의 구조적 및 기능적 특성의 관계에 대해 매우 중대한 과학적 돌파구로 사용하는 가능성을 보유하고있다. 지난 몇 년 동안, 많은 정보는 분자 구성, 구조에 획득하고 있으며, 시냅스의 생리 기능; 아직 시냅스는 형태 학적 및 분자 매우 다양한 사전 및 시냅스 파에 따라 있습니다임대 뉴런 4. 시냅스 만 종류의 소수에 대한 구조 - 기능 연구가 지금까지 5-7 수행 하였다. 이는 사전 및 시냅스 요소의 특성에 대한 정확한 식별을 방지 기술적 제약에 대부분이었다. 미세 분석은 시냅스 전달의 강도와 소성에 큰 영향을 미치는 신경 전달 물질 수용체 6 별개의 시냅스 접촉에 걸쳐 모두 시냅스 크기와 내용면에서 시냅스 막 전문의 변동성에 중요한 통찰력을 제공하고 있습니다. 또한, 많은 연구 기관은 시냅스의 종류 발현 이온 성 글루타메이트 수용체의 수는 afferent- 및 목표 의존적 7-10으로 조절되는 것을 나타낸다. 여기에서, 방법은 정의와 시냅스 막 전문의 구조와 수용체의 조성 분석을 허용하는 개략되어D 시냅스 요소 및 기능. 이 방법은 channelrhodopsin2 (ChR2)와 같은 최근 개발 된 감광성 조류 단백질의 연접 식을 활용하고 FRIL 기술의 α 아미노 -3- 히드 록시 -5- 메틸 -4- isoxazolepropionic의 시냅스 발현의 패턴을 분석 산 (AMPA-RS) 및 N- 메틸 -D- 아스 파르 테이트 (NMDA-RS) 글루타메이트 수용체. 이는 편도 (ITC)의 인터 셀 대중의 신경 세포에 후방 시상 - 중간 geniculate 핵 (PIN / MGN)에서 발생하는 축색 돌기에 의해 형성된 시냅스에서 시연된다. ITC 뉴런은 기저 amygdaloid 복합 (BLA) (11), (12)을 둘러싼 클러스터 구성 작은 가시 GABA 성 세포이다. ITC 신경 세포가 BLA 주요 신경 세포에서 흥분성 입력을 수신하고 (CEA)를 중심 핵을 대상으로하는 것으로 알려져있다, 따라서 억제 게이트 역할을 정보에 대한 BLA와 CEA 12 ~ 15 사이에 흐른다. 최근에, 우리는 IT 시연BLA와 CEA의 메디 - 지느러미 클러스터에있는 C 뉴런은 두려움 파블로프 청각 공포 조건화 16시 학습에 수정 감각 시상 및 시간 대뇌 피질의 영역에서 직접 수렴 흥분성 입력을받을 수 있습니다. 공포의 조절은 뇌 메커니즘의 관점에서 연관 학습의 가장 좋은 이해 형태 중 하나입니다. 공포 에어컨, 초기 중립 조건 자극 (CS, 예를 들면, 톤)에서 CS-US 협회 초래하는 혐오 무조건 자극 (US, 예를 들면, 가벼운 발 충격)와 짝과 공포 응답 (17), (18)를 조절한다. 흥분성을 연사 및 미국을 대표하는 정보를 전달 시상 및 신피질 영역 모두에서 입력은 각각 편도 (LA)의 측면 핵의 피라미드 뉴런에 수렴 및 소성 (19)를 받아야하는 것으로 알려져 있었다. 우리의 이전 작품은 감각 입력 정보가​​ ITC의 신경 세포에 전달 병렬도 밝혀 <s&gt; 16입니다. 각각의 감각 입력의 기계적인 분자 분석을 향한 첫 번째 단계는 ITC의 신경 세포에 시냅스, 우리는 ChR2는 노란색 형광 단백질 (YFP) 태그로 표현하는 아데노 관련 바이러스 (AAV)을 사용했다. AAV는 PIN / MGN에 주입하고, 축삭 단자는 ChR2 - YFP의 발현에 의해 확인되었다. 우리는 PIN / MGN 엑손 단말기들에 의해 ITC 뉴런 형성 시냅스 시냅스 AMPA-RS와 NMDA-RS의 밀도를 평가하기 FRIL 기술에 의해 생성 된 양면을 사용했다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Surgery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotactic frame</td>
			<td>Stoelting, USA</td>
			<td>51670</td>
			<td>can be replaced by other stereotactic frame for mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steretoxic frame mouse adaptor</td>
			<td>Stoelting, USA</td>
			<td>51625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas anesthesia mask for mice</td>
			<td>Stoelting, USA</td>
			<td>50264</td>
			<td>no longer available, replaced by item no. 51609M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure injection device, Toohey Spritzer</td>
			<td>Toohey Company, USA</td>
			<td>T25-2-900</td>
			<td>other pressure injection devices (e.g. Picospritzer) can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik Fill glass capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments, Germany</td>
			<td>1B150F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia machine, IsoFlo</td>
			<td>Eickemeyer, Germany</td>
			<td>213261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC Temperature Controler and heating pad</td>
			<td>FHC, USA</td>
			<td>40-90-8D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal Micropipette Puller Model P-1000</td>
			<td>Sutter Instruments, USA</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical tool sterilizer, Sterilizator 75</td>
			<td>Melag, Germany</td>
			<td>08754200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (serotype 2/9)</td>
			<td>Penn Vector Core, USA</td>
			<td>AV-9-26973P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fast green</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>0301.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane Anesthetic, Isofuran CP (1ml/ml)</td>
			<td>CP Pharma, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antiseptic, Betadine (providone-iodine)</td>
			<td>Purdure Products, USA</td>
			<td>BSOL32</td>
			<td>can be replaced by other disinfectants</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analgesic, Metacam Solution (5mg/ml meloxicam)</td>
			<td>Boehringer Ingelheim, Germany</td>
			<td></td>
			<td>can be replaced by other analgesics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bepanthen eye ointment</td>
			<td>Bayer, Germany</td>
			<td>0191</td>
			<td>can be replaced by other eye ointments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill NM3000 (SNKG1341 and SNIH1681)</td>
			<td>Nouvag, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutranox Suture Needle</td>
			<td>Fine Science Tools, Germany</td>
			<td>12050-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Braided Silk Suture</td>
			<td>Fine Science Tools, Germany</td>
			<td>18020-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Tissue preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde EM grade</td>
			<td>Agar Scientific Ltd., United Kingdom</td>
			<td>AGR1018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saturated picric acid solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>P6744-1GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4-2H20</td>
			<td>Merck Millipore, Germany</td>
			<td>1065860500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4-2H2O&#160;</td>
			<td>Merck Millipore, Germany</td>
			<td>1063451000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Merck Millipore, Germany</td>
			<td>1064041000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4N NaOH</td>
			<td>Carl Roth, Germany</td>
			<td>T198.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiopental</td>
			<td>Sandoz, Austria</td>
			<td>5,133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>G5516-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenPure ultrapure water system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td>50131235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>ISMATEC, Germany</td>
			<td>ISM 930C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Paper</td>
			<td>MACHEREY-NAGEL, Germany</td>
			<td>MN 615 1/4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibroslicer, VT1000S</td>
			<td>Leica Microsystems, Austria</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic scalpel</td>
			<td>Alcon Laboratories, USA</td>
			<td></td>
			<td>can be replaced by other ophthalmic scalpels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion cannula</td>
			<td>Vieweg, Germany</td>
			<td>F560088-1</td>
			<td>can be replaced by similar items from other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">High-pressure&#160; Freezing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper carriers</td>
			<td>Engineering Office M. Wohlwend, CH</td>
			<td>528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sidol Polish</td>
			<td>Henkel, Germany</td>
			<td></td>
			<td>can be replaced by same item from other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamois skin</td>
			<td>Household supply store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hole punch, 1,5mm</td>
			<td>Stubai, Austria</td>
			<td></td>
			<td>can be replaced by same item from other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denatured ethanol</td>
			<td>Donauchem, Austria</td>
			<td></td>
			<td>can be replaced by same item from other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aceton</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>9372.5</td>
			<td>CAUTION!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Pressure Freezing Machine HPM 010</td>
			<td>BalTec, CH; now Leica Microsystems</td>
			<td>HPM010</td>
			<td>not produced any more, substituted by LeicaEM HPM100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo-microscope</td>
			<td>Olympus, Japan</td>
			<td>SZX10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>CAUTION!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo-vials</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>E309.1</td>
			<td>can be replaced by same item from other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoCane</td>
			<td>Nalge Nunc International,USA</td>
			<td>5015-0001</td>
			<td>can be replaced by same item from other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoSleeve</td>
			<td>Nalge Nunc International,USA</td>
			<td>5016-0001</td>
			<td>can be replaced by same item from other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen storage vessel</td>
			<td>Cryopal, France</td>
			<td>GT38</td>
			<td>can be replaced by same item from other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-ionic detergent (Lavocid)</td>
			<td>Werner &#38; Mertz Professional, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Freeze-fracture and Replication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sandblaster, Mikromat 200-1</td>
			<td>JOKE Joisten &#38; Kettenbaum, Germany</td>
			<td>SANDURET 2-K</td>
			<td>can be replaced by same item from other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siliciumcarbid SIC 360, grain size 25 - 21&#181;</td>
			<td>JOKE Joisten &#38; Kettenbaum, Germany</td>
			<td>955932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze Fracture System BAF 060</td>
			<td>BalTec, CH; now Leica Microsystems</td>
			<td>BAF060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic 12 well plate</td>
			<td>Gr&#246;pel, Austria</td>
			<td>14511</td>
			<td>can be replaced by same item from other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>SIGMA, USA</td>
			<td>T1503</td>
			<td>can be replaced by same item from other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma hydrochloride</td>
			<td>SIGMA, USA</td>
			<td>T3253</td>
			<td>can be replaced by same item from other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Merck, Germany</td>
			<td>1,064,041,000</td>
			<td>can be replaced by same item from other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS, Sodium lauryl sulfate</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>5136.1</td>
			<td>CAUTION! ;&#160; can be replaced by same item from other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Merck, Germany</td>
			<td>1,076,871,000</td>
			<td>can be replaced by same item from other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>5429.3</td>
			<td>can be replaced by same item from other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal Hybridization Oven</td>
			<td>Binder, Germany</td>
			<td>7001-0050</td>
			<td>can be replaced by same item from other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Immunolabelling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>SIGMA, USA</td>
			<td>A9647</td>
			<td>can be replaced by same item from other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP Antibody</td>
			<td>Molecular Probes, USA</td>
			<td>A11122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-pan-AMPAR Antibody</td>
			<td>Frontier Institute, Japan</td>
			<td>pan AMPAR-GP-Af580-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NMDAR1 Antibody, clone 54.1</td>
			<td>Merck Millipore, Germany</td>
			<td>MAB363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opioid Receptor-Mu (MOR) Antibody</td>
			<td>ImmunoStar, USA</td>
			<td>24216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM goat anti-guinea pig, 5nm; secondary antibody</td>
			<td>BBInternational,</td>
			<td>EM.GAG5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM goat anti-rabbit, 15nm; secondary antibody</td>
			<td>BBInternational,</td>
			<td>EM.GAR15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit, 10nm, secondary antibody</td>
			<td>AURION, Netherlands</td>
			<td>DAR 10nm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper grids, 100 Parallel Bar</td>
			<td>&#160;Agar scientific, UK</td>
			<td>G2012C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Major Science, USA</td>
			<td>MO-RC</td>
			<td>can be replaced by same item from other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pioloform Powder</td>
			<td>&#160;Agar scientific, UK</td>
			<td>R1275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Roth, Germany</td>
			<td>3313.1</td>
			<td>CAUTION! ;&#160; can be replaced by same item from other companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">EM analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Philips CM120 TEM</td>
			<td>Philips/FEI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Morada CCD camera</td>
			<td>Soft Imaging Systems, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTEM Ver. 5.2, imaging software</td>
			<td>Soft Imaging Systems, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combined optogenetic and freeze-fracture replica immunolabeling to examine input-specific arrangement of glutamate receptors in the mouse amygdala

동결 골절 전자 현미경은 40 년 이상 미세 구조 연구의 주요 기술하고있다. 그러나, 막의 고분자 조성물을 연구하는 유효한 수단의 결여는 그 사용에 상당한 감소를 일으켰다. 최근 immunogold 라벨링함으로써 세포막 단백질을 표시하기위한 효과적인 방법의 개발이 동결 골절 전자 현미경 덕분에 큰 부활되고있다. 이러한 방법 중 하나는 세제 용해 동결 골절 복제 Immunolabeling (FRIL)로 알려져있다. optogenetics와 FRIL 기술의 조합은 중앙 시냅스의 구조 및 기능적 특성의 상관 분석을 할 수 있습니다. 이 방법을 사용하여 식별 및 태깅 channelrhodopsin 각각 식 특정 분자 표지로 사전 및 시냅스 후 뉴런 모두를 특성화 할 수있다. glutamat의 시냅스 막 전문의 독특한 외관ergic 정량화 이들 수용체의 intrasynaptic 분포를 분석하기 위해, 상기 시냅스 이온 성 글루타메이트 수용체의 라벨링시에 허용한다. 여기서 우리는 페어 복제 방법을 immunolabel하는 방법을 준비하는 데 필요한 절차를 단계별 설명을 제공합니다. 우리는 또한 잠재적 인 샘플링 편견과 관련된 특히 사람들을 FRIL 기술의주의 사항 및 제한 사항에 대해 설명합니다. optogenetics와 결합 할 때 FRIL 기술의 높은 재현성과 다양성은 뇌에서 확인 된 신경 세포의 미세 회로의 시냅스 전달의 다양한 측면의 특성에 대한 매우 강력한 접근 방식을 제공합니다. 여기서는 이러한 접근은 마우스 편도의 인터 세포 질량의 뉴런에서 흥분성 시냅스의 구조 - 기능 관계에 대한 통찰력을 얻기 위해 사용 된 방법의 예를 제공한다. 특히,이 확인 입력에서 이온 성 글루타메이트 수용체의 발현을 조사 하였다하거나시상 후방 intralaminar와 중간 geniculate 핵에서 iginated. 이 시냅스는 두려움 학습을위한 관련 감각 정보를 중계하고 공포 조건화에 플라스틱 변화를 겪는 것으로 나타났다.

FRIL 기술은 미생물 기원 (21) 즉, 세포막 통합 효과적으로 축삭을 따라 anterogradely 전송 채널 optogenetic 액추에이터 식으로 결합 될 때, 정의 된 서브 그룹에서 정량 AMPA-RS와 NMDA-RS의 시냅스 발현을 조사 할 수 있도록 시냅스의. 이 편도에 ITC 뉴런에 (예를 들어, PIN / MGN) 별개의 시상 핵에서 발생하는 축삭을 위해 여기에 표시됩니다. 이 접근법은 ITC 뉴런, 지금까지 상세한 해부학 분자 특성화 난치성이었다 셀 그룹 상 개별 감각 입력 시냅스의 분자 분석을 가능하게한다. 4 주 PIN / MGN에 rAAV-ChR2 - YFP의 정위 주사 후, ChR2 - YFP 양성 축색 돌기 밀도가 LA의 amygdalostriatal 전이 지역 (Astria) 및 내측 paracapsular의 I를 신경 지배<html> 편도선에 TC 클러스터는, 이전의 추적과 완벽하게 일치하는 패턴은 22, 16 연구. 우리는 또한 rAAV-ChR2-YFP-에서 동결 골절 복제의 축삭과 단자의 P-얼굴에 ChR2 - YFP에 대한 immunolabeling 강한 금을 감지 주입 된 마우스 (도 5a), 그러나 비 - 주입 된 쥐에서 복제된다. 복제에서 글루타메이트 시냅스의 시냅스 막 특성화 원형질막 2 (23)의 E-얼굴 intramembrane 입자 (하는 IMP)의 클러스터로서 관찰 될 수 있고, 종종 시냅스 전 혈장 막 (7)의 P-얼굴 수반 (그림 5B-C). PIN / MGN의 축삭 단자에 의해 형성 글루타메이트 성 시냅스의 시냅스 전문화를 식별 할 수 이러한 기능 (그림 5, 6). 우리는 NMDA-RS는 필수 NR1 서브 유닛에 대한 항체를 사용하여 검출 된 반면, 네 개의 서브 유닛 (GluA1-4)를 인식하는 항체와 AMPA-R을 표시. &quot;FO : 유지-together.within 페이지를 =&quot;ntent 1 &quot;은&gt;이 시냅스가 돌기 쪽 또는 ITC 뉴런의 축으로 만들어진 여부를 동일한 복제본에 감지 할 수있는 도구의 부족 때문에, 우리는 μ에 대한 대응 복제의 얼굴을 표지 ITC 뉴런이 수용체 (24)의 postsynaptically 높은 수준의 발현으로 -opioid 수용체. 이것은 최적의 고용 전략을 사용하여 두 개의 복제본 (도 5C-F 및도 6A-D)에서 동일한 시냅스 정보의 확인 요구 (도 4E) . <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/53853/53853fig5.jpg" /> 그림 5. Immunogold 입자에 의한 복제에 ChR2 - YFP 및 이온 성 글루타메이트 수용체의 검출. (A) 크로스 골절 축삭 터미널 (하늘색)과 ChR2 - YFP을 검출하는 15 나노 금 입자로 표지의 P-얼굴의 작은 부분. the 터미널 내에있는 경우의 O-F 수많은 시냅스 소포가 관찰 될 수있다 (SV). 원형질막에 한정되는 대부분의 immunolabeling의 특이성 주. ChR2에 대한 라벨링은 PIN / MGN에서 발생 등의 단말기를 식별합니다. 단말은 척추 비대칭 시냅스를 형성한다. 전자의 얼굴에 시냅스 막 전문화 (PSD)는 intramembrane 입자의 특성 클러스터를 보여줍니다 AMPA-R을 공개 5 나노 금 입자로 표지한다. (B) (15 나노 금 입자로 표지)를 ChR2 발현 축삭의 P-얼굴이 수상 돌기, 그들이 NMDA-R을 공개 5 나노 금 입자로 표지 두의 PSD를 보유 중 하나를 경계 표시됩니다. (CD)는 PIN / MGN-ITC 시냅스의 사전 및 시냅스 막의 반대면. (C) 상기 단말기의 P-얼굴 (15 nm의 금 입자로 표지) ChR2 표현 두 돌기 축, 그들 AMPA-RS (5 nm의 금 입자) 표지 두 개의 PSD를 포함하는 하나의 E-면 위에 연장된다. ( <strong&gt; D) 두 개의 수상 돌기의 대응 P-얼굴 μ-아편 유사 수용체 (10 나노 금 입자) 표지 할 것. (EF) 점선으로 설명하는 부분 확대도. 스케일 바 :. 500 nm의 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53853/53853fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> PIN을 / MGN-ITC 시냅스에서 AMPA-RS에 대한 Immunoparticles은 시냅스 전문 (그림 5E) 내에서 균일 한 분포를 제안, 모든 IMP 클러스터를 통해 발견되었다. 유의하게 높은 (짝 t 테스트 페이지가 &lt;0.018) AMPA-R 라벨의 밀도는 PIN / MGN에서 관찰되었다 ITC의 등뼈에 시냅스 (715 ± 38 금 입자 / μm의 2, N = 32) ITC의 수상 돌기 위에 시냅스에 비해 (590 ± 44 금 입자 / ㎛의 2, N = 32). 전반적으로, PIN / MGN-ITC 시냅스에서 AMPA-RS의 밀도가 비교적 낮은 나타났다분산 (분산 계수, CV = 0.37) 균일 한 분포와 일치. PIN을 / MGN-ITC 시냅스에서 NMDA-RS에 대한 Immunoparticles은 종종 불균일 시냅스 IMP 클러스터 (그림 5B) 내에 분포 관찰되었다. NMDA-R 라벨의 밀도는 (짝 t 테스트 P = 0.39) PIN / MGN은 ITC의 등뼈에 시냅스 사이에 유사했다 (1070 ± 153 금 입자 / μm의 2, N = 8)과 ITC의 수상 돌기 (812 ± 183 금 입자 / μm의 2, N = 9). AMPA-RS에 대한 관찰 내용과는 달리, PIN / MGN-ITC 시냅스에서 NMDA-RS의 밀도 (CV는 = 0.54)이 높은 변수였다. <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/53853/53853fig6.jpg" /> 확인 된 PIN / MGN-ITC 시냅스에서 그림 6. AMPA-RS 및 NMDA-R과 Immunolabeling. (AB)는 PIN / MGN-ITC의 사전 및 시냅스 막의 반대면단말기의 P-얼굴 ChR2을 표현하는 수지상 척추에 만들어진 시냅스는 (15 나노 금 입자로 표지) 및 수지상 척추 상에 PSD는 AMPA-RS (5 나노 금 입자) 표지 할 것. (CD)에 점선으로 설명하는 부분 확대도. 이 지역은 PSD의 더 잘 볼 수 있도록 약 45 ° 시계 반대 방향으로 회전하고있다. (E) ITC 등뼈와 돌기 시냅스 영역 대 AMPA-R 입자 수의 산점도. 두 구조에서 양의 상관 관계가 관찰되었다. (F) ITC 등뼈와 돌기 시냅스 NMDA 영역에 대해 R-입자 수의 산점도. 유의 한 양의 상관 관계 만 돌기 쪽이 검출되었다. 스케일 바 :. 500 nm의 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53853/53853fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 때문에종종 부분적으로 시냅스 IMP 클러스터에 겹쳐 시냅스 세포막의 P-면, 우리는 시냅스의 30 %의 시냅스 영역을 추정 수 (등뼈는 : 영역을 0.032 ㎛의 제 2 범위의 의미 : 0.007 ㎛의 2 0.063로를 N = 8; 수상 돌기 : 0.047 μm의 2 범위 : 0.024 11 μm의 2 0.166로, N =). 이전 분석 telencephalic 글루타메이트 25 시냅스 이러한 유사한 범위에 있었다. 두 쪽과 수상 돌기에서, 각각의 시냅스에서 AMPA-R과 골드 immunoparticles의 수는 긍정적 인 시냅스 영역과의 상관 관계를 보였다 (스피어, 쪽 : R = 0.88, 수상 돌기 : R = 0.60, p &lt;0.0001) (그림 6E). 하지만 수상 돌기 (R = 0.21, P = 0.29) (그림 6 층에서 : 반대로, NMDA-R과 골드 immunoparticles의 수는 쪽 (R = 0.90, P &lt;0.002 스피어, 등뼈)의 시냅스 영역과 상관 관계가 밝혀졌다 ).

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Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate Receptors in the Mouse Amygdala

This article illustrates how the expression of neurotransmitter receptors can be quantified and the pattern analyzed at synapses with identified pre and postsynaptic elements using a combination of viral transduction of optogenetic tools and the freeze-fracture replica immunolabeling technique.

Optogenetic 및 동결 골절 복제 Immunolabeling는 마우스 편도체에서 글루타메이트 수용체의 입력 특정 배열을 검사하기 위해 결합

Freeze-fracture electron microscopy has been a major technique in ultrastructural research for over 40 years. However, the lack of effective means to ...

combined-optogenetic-freeze-fracture-replica-immunolabeling-to

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.9K 조회수.  Medical University of Innsbruck. This article illustrates how the expression of neurotransmitter receptors can be quantified and the pattern analyzed at synapses with identified pre and postsynaptic elements using a combination of viral transduction of optogenetic tools and the freeze-fracture replica immunolabeling technique.

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Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

글루타민산 염과 GABA의 빠른 마이크로 이온 도입 : 시냅틱 통합을 조사하는 유용한 도구

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

연구

신경과학

Use of pHluorin to Assess the Dynamics of Axon Guidance Receptors in Cell Culture and in the Chick Embryo

During development, axon guidance receptors play a crucial role in regulating axons sensitivity to both attractive and repulsive cues. Indeed, activation of the guidance receptors is the first step of the signaling mechanisms allowing axon tips, the growth cones, to respond to the ligands. As such, the modulation of their availability at the cell surface is one of the mechanisms that participate in setting the growth cone sensitivity. We describe here a method to precisely visualize the spatio-temporal cell surface dynamics of an axon guidance receptor both in vitro and in vivo in the developing chick spinal cord. We took advantage of the pH-dependent fluorescence property of a green fluorescent protein (GFP) variant to specifically detect the fraction of the axon guidance receptor that is addressed to the plasma membrane. We first describe the in vitro validation of such pH-dependent constructs and we further detail their use in vivo, in the chick spinal chord, to assess the spatio-temporal dynamics of the axon guidance receptor of interest.

We describe here the use of a pH-sensitive green fluorescent protein variant, pHluorin, to study the spatio-temporal dynamics of axon guidance receptors trafficking at the cell surface.&#160;The pHluorin-tagged receptor is expressed both in cell culture and in vivo, using electroporation of the chick embryo.

세포 배양과 병아리 배아에서 축슨 유도 수용체의 역학을 평가하기 위해 pHluorin의 사용

During development, axon guidance receptors play a crucial role in regulating axons sensitivity to both attractive and repulsive cues. Indeed, activation ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

에있는 후각 수용체 뉴런의 전체 마운트 Immunolabeling<em&gt; 초파리</em&gt; 안테나

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

설치류 중추 신경계의 생체 Optogenetic 자극

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high spatial and temporal resolution. Combined with electrophysiology, it is widely used to study activity-related calcium signals in small subcellular compartments such as dendrites and dendritic spines. In addition to calcium transients, synaptic activity also induces postsynaptic sodium signals, the properties of which are only marginally understood. Here, we describe a method for combined whole-cell patch-clamp and multi-photon sodium imaging in cellular micro domains of central neurons. Furthermore, we introduce a modified procedure for ultra-violet (UV)-light-induced uncaging of glutamate, which allows reliable and focal activation of glutamate receptors in the tissue. To this end, whole-cell recordings were performed on Cornu Ammonis subdivision 1 (CA1) pyramidal neurons in acute tissue slices of the mouse hippocampus. Neurons were filled with the sodium-sensitive fluorescent dye SBFI through the patch-pipette, and multi-photon excitation of SBFI enabled the visualization of dendrites and adjacent spines. To establish UV-induced focal uncaging, several parameters including light intensity, volume affected by the UV uncaging beam, positioning of the beam as well as concentration of the caged compound were tested and optimized. Our results show that local perfusion with caged glutamate (MNI-Glutamate) and its focal UV-uncaging result in inward currents and sodium transients in dendrites and spines. Time course and amplitude of both inward currents and sodium signals correlate with the duration of the uncaging pulse. Furthermore, our results show that intracellular sodium signals are blocked in the presence of blockers for ionotropic glutamate receptors, demonstrating that they are mediated by sodium influx though this pathway. In summary, our method provides a reliable tool for the investigation of intracellular sodium signals induced by focal receptor activation in intact brain tissue.

We describe the combination of focal UV-induced photo-activation of neuro-active compounds with whole-cell patch-clamp and multi-photon imaging of intracellular sodium transients in dendrites and spines of hippocampal neurons in acute tissue slices of the mouse brain.

다중 광자 세포 내 나트륨 이미징 CA1 피라미드 뉴런의 글루타메이트의 UV 매개 초점 Uncaging과 결합

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high ...

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted deaf subjects1-6. Nonetheless, sound coding with current CIs has poor frequency and intensity resolution due to broad current spread from each electrode contact activating a large number of SGNs along the tonotopic axis of the cochlea7-9. Optical stimulation is proposed as an alternative to electrical stimulation that promises spatially more confined activation of SGNs and, hence, higher frequency resolution of coding. In recent years, direct infrared illumination of&#160;the cochlea has been used to evoke responses in the auditory nerve10. Nevertheless it requires higher energies than electrical stimulation10,11 and uncertainty remains as to the underlying mechanism12. Here we describe a method based on optogenetics to stimulate SGNs with low intensity blue light, using transgenic mice with neuronal expression of channelrhodopsin 2 (ChR2)13 or virus-mediated expression of the ChR2-variant CatCh14. We used micro-light emitting diodes (&#181;LEDs) and fiber-coupled lasers to stimulate ChR2-expressing SGNs through a small artificial opening (cochleostomy) or the round window. We assayed the responses by scalp recordings of light-evoked potentials (optogenetic auditory brainstem response: oABR) or by microelectrode recordings from the auditory pathway and compared them with acoustic and electrical stimulation.

Cochlear implants (CIs) enable hearing by direct electrical stimulation of the auditory nerve. However, poor frequency and intensity resolution limits the quality of hearing with CIs. Here we describe optogenetic stimulation of the auditory nerve in mice as an alternative strategy for auditory research and developing future CIs.

청각 신경의 자극 Optogenetic

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular guidance cues like netrin-1 and results in dramatic increases to the surface area of the axonal plasma membrane. Netrin-1-dependent axon branching likely involves temporal and spatial control of plasma membrane expansion, the components of which are supplied through exocytic vesicle fusion. These fusion events are preceded by formation of SNARE complexes, comprising a v-SNARE, such as VAMP2 (vesicle-associated membrane protein 2), and plasma membrane t-SNAREs, syntaxin-1 and SNAP25 (synaptosomal-associated protein 25). Detailed herein isa multi-pronged approach used to examine the role of SNARE mediated exocytosis in axon branching. The strength of the combined approach is data acquisition at a range of spatial and temporal resolutions, spanning from the dynamics of single vesicle fusion events in individual neurons to SNARE complex formation and axon branching in populations of cultured neurons. This protocol takes advantage of established biochemical approaches to assay levels of endogenous SNARE complexes and Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy of cortical neurons expressing VAMP2 tagged with a pH-sensitive GFP (VAMP2-pHlourin) to identify netrin-1 dependent changes in exocytic activity in individual neurons. To elucidate the timing of netrin-1-dependent branching, time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy of single neurons over the order of hours is utilized. Fixed cell immunofluorescence paired with botulinum neurotoxins that cleave SNARE machinery and block exocytosis demonstrates that netrin-1 dependent axon branching requires SNARE-mediated exocytic activity.

Light microscopy techniques coupled with biochemical assays elucidate the involvement of SNARE-mediated exocytosis in netrin-dependent axon branching. This combination of techniques permits identification of molecular mechanisms controlling axon branching and cell shape change.

결합 된 방법론을 활용하여 축삭 분기 및 신경 세포 형태 형성 동안 플라즈마 멤브레인 배달의 역할을 정의합니다

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

Using Enzyme-based Biosensors to Measure Tonic and Phasic Glutamate in Alzheimer's Mouse Models

Neurotransmitter disruption is often a key component of diseases of the central nervous system (CNS), playing a role in the pathology underlying Alzheimer's disease, Parkinson's disease, depression, and anxiety. Traditionally, microdialysis has been the most common (lauded) technique to examine neurotransmitter changes that occur in these disorders. But because microdialysis has the ability to measure slow 1-20 minute changes across large areas of tissue, it has the disadvantage of invasiveness, potentially destroying intrinsic connections within the brain and a slow sampling capability. A relatively newer technique, the microelectrode array (MEA), has numerous advantages for measuring specific neurotransmitter changes within discrete brain regions as they occur, making for a spatially and temporally precise approach. In addition, using MEAs is minimally invasive, allowing for measurement of neurotransmitter alterations in vivo. In our laboratory, we have been specifically interested in changes in the neurotransmitter, glutamate, related to Alzheimer's disease pathology. As such, the method described here has been used to assess potential hippocampal disruptions in glutamate in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease. Briefly, the method used involves coating a multi-site microelectrode with an enzyme very selective for the neurotransmitter of interest and using self-referencing sites to subtract out background noise and interferents. After plating and calibration, the MEA can be constructed with a micropipette and lowered into the brain region of interest using a stereotaxic device. Here, the method described involves anesthetizing rTg(TauP301L)4510 mice and using a stereotaxic device to precisely target sub-regions (DG, CA1, and CA3) of the hippocampus.

Here, we describe the setup, software navigation, and data analysis for a spatially and temporally precise method of measuring tonic and phasic extracellular glutamate changes in vivo using enzyme-linked microelectrode arrays (MEA).

효소 기반의 바이오 센서를 사용하면 알츠하이머 병 마우스 모델에서 토닉과 Phasic이 품목을 측정하는

Neurotransmitter disruption is often a key component of diseases of the central nervous system (CNS), playing a role in the pathology underlying ...

A High-throughput Calcium-flux Assay to Study NMDA-receptors with Sensitivity to Glycine/D-serine and Glutamate

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) are classified as ionotropic glutamate receptors and have critical roles in learning and memory. NMDAR malfunction, expressed as either over- or under-activity caused by mutations, altered expression, trafficking, or localization, can contribute to numerous diseases, especially in the central nervous system. Therefore, understanding the receptor&#39;s biology as well as facilitating the discovery of compounds and small molecules is crucial in ongoing efforts to combat neurological diseases. Current approaches to studying the receptor have limitations including low throughput, high cost, and the inability to study its functional abilities due to the necessary presence of channel blockers to prevent NMDAR-mediated excitotoxicity. Additionally, the existing assay systems are sensitive to stimulation by glutamate only and lack sensitivity to stimulation by glycine, the other co-ligand of the NMDAR. Here, we present the first plate-based assay with high-throughput power to study an NMDA receptor with sensitivity to both co-ligands, glutamate and D-serine/glycine. This approach allows the study of different NMDAR subunit compositions and allows functional studies of the receptor in glycine- and/or glutamate-sensitive modes. Additionally, the method does not require the presence of inhibitors during measurements. The effects of positive and negative allosteric modulators can be detected with this assay and the known pharmacology of NMDAR has been replicated in our system. This technique overcomes the limitations of existing methods and is cost-effective. We believe that this novel technique will accelerate the discovery of therapies for NMDAR-mediated pathologies.

The goal of this protocol is to facilitate the study of NMDA-receptors (NMDAR) at a larger scale and allow the examination of modulatory effects of small molecules and their therapeutic applications.

글리신/D-떠들고와 조미료에 감도와 NMDA 수용 체를 공부 하는 높은 처리량 칼슘-플럭스 분석 결과

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) are classified as ionotropic glutamate receptors and have critical roles in learning and memory. NMDAR ...

Muscle Velocity Recovery Cycles to Examine Muscle Membrane Properties

Although conventional nerve conduction studies (NCS) and electromyography (EMG) are suitable for the diagnosis of neuromuscular disorders, they provide limited information about muscle fiber membrane properties and underlying disease mechanisms. Muscle velocity recovery cycles (MVRCs) illustrate how the velocity of a muscle action potential depends on the time after a preceding action potential. MVRCs are closely related to changes in membrane potential that follow an action potential, thereby providing information about muscle fiber membrane properties. MVRCs may be recorded quickly and easily by direct stimulation and recording from multi-fiber bundles in vivo. MVRCs have been helpful in understanding disease mechanisms in several neuromuscular disorders. Studies in patients with channelopathies have demonstrated the different effects of specific ion channel mutations on muscle excitability. MVRCs have been previously tested in patients with neurogenic muscles. In this prior study, muscle relative refraction period (MRRP) was prolonged, and early supernormality (ESN) and late supernormality (LSN) were reduced in patients compared to healthy controls. Thereby, MVRCs can provide in vivo evidence of membrane depolarization in intact human muscle fibers that underlie their reduced excitability. The protocol presented here describes how to record MVRCs and analyze the recordings. MVRCs can serve as a fast, simple, and useful method for revealing disease mechanisms across a broad range of neuromuscular disorders.

Presented here is a protocol for the recording of muscle velocity recovery cycles (MVRCs), a new method of examining muscle membrane properties. MVRCs enable in vivo assessment of muscle membrane potential and alterations in muscle ion channel function in relation to pathology, and it enables the demonstration of muscle depolarization in neurogenic muscles.

근육 속도 복구 주기 근육 막 속성을 검사 하려면

Although conventional nerve conduction studies (NCS) and electromyography (EMG) are suitable for the diagnosis of neuromuscular disorders, they provide ...