Name: gene expression profiling of infecting microbes using a digital bar-coding platform
Uploaded: 2016-01-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
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이 작품은 NIH 보조금 R21 DE023311 (APM), R56 AI111836 (APM 및 SGF), R01 AI054928 (SGF), 및 R01 DE017088 (SGF)에 의해 부분적으로 지원되었다.

모든 동물의 절차는 로스 앤젤레스 생물 의학 연구소의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (프로토콜 011000)에 의해 승인과 동물의 윤리적 대우를위한 건강 (NIH) 지침 국립 연구소에 따라 수행되었다. 마우스 하버 - UCLA의 연구 및 교육 기관의 캠퍼스에 위치하고 AAALAC 인증을받은 시설에 감금되었다. 실험 동물 의학 전문 전임 수의사는 자신의 관리를 감독했다. Caging 및 축산는 미국 공중 보건 서비스 간행물 &quot;실험 동물의 관리 및 사용을위한 가이드&quot;의 지침에 따라 제공되었다. 모든 시도는 인도적으로 쥐를 치료​​하기로 결정했습니다. 마우스의 생존과 건강 매일 세 번 모니터링 하였다. 물론 아픈, 무기력 마우스 그룹에서 분리하고 고통을 최소화하기 위해 안락사시켰다. Euthanas의 패널에서 권장하는 마우스, 펜 토바 비탈 과다 복용 (210 ㎎ / ㎏)에 의해 안락사시켰다미국 수의학 협회의 IA. 조직, 시약 및 기기의 1. 준비 <ol><li> 모든 연구 20~22g을 가중 남성을 Balb / c 마우스를 사용합니다. 정맥 1 × 6 효모 상 (C)과 실험군 당 세 마우스 접종 알비 칸스 세포. 특정 시점 후 감염에 동물과 수확 신장을 희생. 스크류 캡 튜브에 각각의 신장을 놓고, 나중에 RNA 추출 6 -80 ° C에서 액체 질소에 동결 및 저장 웁니다. 주 : 슈 외 상세하게 설명한 동물 실험을 수행 하였다 (6).. </li><li> -80 ° C의 냉동고에서 신장을 제거하기 전에 다음과 같은 시약 및 장비를 준비합니다 : <ol><li> 총 RNA 추출 키트를 엽니 다. 2- 머 캅토 에탄올을 추가 (1 % V는 / v)의 RLT 버퍼 및 (각 샘플 2 ml의 준비를) 잘 혼합한다. </li><li> 페놀을 준비 : 클로로포름 : 이소 아밀 알코올 25 : 24 : 1 (각 시료 600 μl를해야합니다). </li><li> 라벨 M 형 균질화 튜브 (M-튜브) 및 얼음에 진정. </li><li> 라벨 2 ml의 캡 튜브 나사, 각 튜브에 약 300 μL 지르코니아 구슬을 추가합니다. </li><li> 검사 도구를 사용할 수 있습니다 : 조직 dissociator, beadbeater, 50 ㎖ 튜브 및 96 웰 플레이트, 광도계 용 어댑터와 탁상 원심 분리기. </li></ol></li></ol> 감염된 조직 2. RNA 추출 <ol><li> -80 ° C의 냉동고에서 신장을 포함하는 튜브를 제거하고 얼음에 넣어. 각각의 신장에 2- 머 캅토 에탄올과 RLT 버퍼 ㎖로 1.2를 추가합니다. M 형 튜브로 균질화 완충액으로 신장 경사 분리한다. </li><li> 사전로드 설정 RNA_02.01에 조직을 사용 dissociator 신장 균질화. </li><li> 실온에서 탁상 원심 분리기에서 1 분 동안 1,000 XG에 원심 분리기. </li><li> 지르코니아 구슬이 들어있는 스크류 캡 튜브에 600 μL 균질을 전송합니다. 얼음에 나머지 균질을 저장합니다. </li><li> 600 μL 페놀을 추가 클로로포름 : 이소 아밀 알코올 25 : 24 : 1에이전 단계에서 튜브. </li><li> 4 ° C의 추운 방에서 3 분 동안 beadbeater에 단단히 뚜껑을 닫고 소용돌이. </li><li> 4 ℃ 냉장실에서 5 분 동안 15,000 XG에서 튜브를 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 새로운 1.5ml의 미세 원심 분리 튜브로 수성 상을 전송할 70 % 에탄올의 동량 잘 혼합 한 다음 (2 회 부하)을 스핀 컬럼 상으로로드. </li><li> 두 번 500 μL 버퍼 RPE 다음, 700 μL 버퍼 RW 한 번 스핀 열을 씻으십시오. 건식 포집 관에서 원심 분리기 하나 추가 분 스핀 컬럼에 남아있는 액체를 제거합니다. 8,000 X g에서 모든 원심 분리 단계를 수행합니다. </li><li> 50 μL의 H 2 O와 용출 RNA 분광 광도계를 사용하여 OD 260에서 RNA 농도를 측정한다. </li></ol> 3. 유전자 발현은 디지털 바 코딩 사용하여 프로파일 <ol><li> 해동 기자 코드 세트 (녹색 캡 튜브) 얼음에 캡처 코드 세트 (회색 캡 튜브). </li><li> 다시 130 μL 하이브리드 버퍼를 추가포터 코드 세트는, 혼합 스핀 다운 반전. </li><li> 12 반응 튜브의 각 믹스의 20 μl를 추가합니다. </li><li> 각 튜브 (5 μL의 볼륨) 전체 조직의 RNA 10 μg의 추가. 피펫으로 섞는다. </li><li> 각각의 튜브에 5 μL 캡처 코드 세트를 추가합니다. 빠른 스핀 다운 다음에 튜브를 뒤집기로 섞는다. </li><li> 가열 뚜껑 O / N (~ 18 시간)과 열 자전거 타는 사람에 65 ° C에서 반응을 품어. </li><li> -20 ° C에서 하나의 샘플 카트리지를 제거하고 실온으로는 따뜻한 보자. </li><li> 탁상 원심 분리기에서 2 분 동안 670 XG에서 4 ° C와 원심 분리기에서 두 시약 플레이트를 제거합니다. </li><li> 화면에 대한 단계별 지침에 따라 준비 스테이션을 설정 고감도 옵션을 선택합니다. </li><li> 열 자전거 타는 사람에서 반응을 제거하고 즉시 준비 스테이션에로드합니다. 고감도 프로그램 (3 시간)를 실행하려면이 옵션을 선택합니다. </li><li> 준비 스테이션 프로그램이 완료되면, 카트리지를 제거하고 투명한 테이프로 밀봉 레인. AP = 연합 뉴스플라이 카트리지의 바닥에 광유 (세대 하나는 nCounter 만 세대이 단계를 필요로하지 않는 이상), 그 다음 디지털 분석기 상에 카트리지를 적재. </li><li> 고해상도 스캔 옵션을 선택, 화면에 대한 단계별 지침은 다음과 같은 디지털 분석기를 설정합니다. </li><li> 스캐닝 프로그램 (~ 4.5 시간)를, 높은 해상도 (600 필드) 옵션을 선택 실행합니다. </li><li> 스캐닝 프로그램이 완료되면, 결과를 다운로드 (또는 이메일로 결과를 수신하도록 선택), 그리고 제조 회사의 소프트웨어로 원 데이터를 가져. 소프트웨어는 자동적으로 데이터 품질을 확인하고 데이터의 품질은 정상 범위를 벗어날 경우에는 플래그를 발생한다. 다음 엑셀 파일로 데이터를 내보낼, (, 소프트웨어의 지시에 따라 선택 사양) 내장 함수를 사용하여 기술적 인 조정을 수행합니다. </li><li> 다음 방법 중 하나를 사용하여 데이터 정규화 : 코드 세트의 모든 유전자의 총 수를; 하나 또는 몇 개의 내부 제어 유전자; 기하 평균의 높은 발현 유전자 (설명 참조). </li><li> 그때 다른 실험군 간의 발현 수준의 비율을 계산하는 각 유전자 (실험 복제 또는 삼중으로 수행 된 경우)에 대한 평균 식 값을 계산한다. </li><li> (선택 사항) 분석 및 MultiExperiment 뷰어 10 nSolver 소프트웨어 또는 클러스터링 프로그램에 내장 된 기능에 의해 프로파일 링 결과를 시각화. </li></ol>

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This protocol is developed in the laboratory of Dr. Aaron P. Mitchell at Carnegie Mellon University. The publication of this manuscript is sponsored by NanoString Technologies.

이 프로토콜은 nanoString nCounter 플랫폼을 사용하여 세균 감염의 전사 프로파일을 최적화하기 위해 개발된다. 전체 절차는, 식 데이터를 조직 수집에서, 이하 48 시간을 필요로한다. 실습 시간은 12 샘플 약 4 시간이다. 이 프로토콜의 하나의 중요한 변수는 첫 단계에서 조직에 첨가 RLT 완충액의 양이다. 너무 작은 버퍼 페놀 클로로포름 추출 단계 이후 점성 겔의 형성을 초래할 및 RNA 회복에 대한 성상을 떠날 수있는 반면 너무 많은 버퍼가 균질 희석하고 RNA 농도를 저하로 이어질 것. (전형적인 크기 가정) 마우스 조직에 대한 버퍼의 RLT 경험적으로 결정될 최적 볼륨은 : 신장 (1.2 ㎖), 설부 (1.0 mL) 및 폐 (2.0 mL)을 첨가 하였다. 특히 이러한 사상 형태로 성장 미생물 병원체를 들어, 비드를 제패 한 단계는 완전히 휴대 내용을 공개하는 오픈 두꺼운 세포벽을 분해하는 데 도움이됩니다. 용출 단계에서, 위해서 최종 RNA를 증가시키기농도는 처음 라운드 용출액 열에 다시 첨가하고, 두 번째로 용출 될 수있다. 약 100 μg의 전체 조직의 RNA는 하나하고, RNeasy 스핀 열 (~ 2 μg의 / μL × 50 μL)에서 복구 할 수 있습니다. RNA의 더 많은 양이 필요할 경우, 제 대비 나머지 조직 파쇄로부터 제조 될 수있다. RNA 농도가 측정 될 때까지 단지의 경우, 나머지 균질 폐기하지 마십시오. 감염 모델에 따라 접종량 및 병원체 균주, 전체 조직에서 RNA 병원체 RNA의 비율은 0 % -2 %로 다르며, 일반적으로 0.05 % -0.5 %의 범위 내에. C.로부터 총 RNA의 조직, 예를 들면, 10 μg의 알비 칸스 감염 순수한 C의 10 NG와 동일한 원료 수를 생성 할 수 신장 체외 배양에서 알비 칸스 RNA (10 NG / 10 μg의 0.1 %). 조직 총 RNA의 병원체 RNA의 백분율은 넓은 범위에서 변화하기 때문에, pathoge의 양을 알고 어렵다전체 RNA의 주어진 양에 n 개의 RNA. 소모성 코드 세트를 방지하기 위해 검출 레벨 아래 병원균 RNA와 샘플들에 (250 유전자 X (192)의 반응에 대한 반응 당 비용은 약 $ 200이다), RNA의 품질 관리 단계는 각 시료 내의 병원체 RNA 수준을 결정하기 위해 수행 될 수있다. 이것은 Q-를 RT 또는 몇 하우스 키핑 유전자를 함유하는 작은 코드 세트 중 하나에 의해 수행 될 수있다. 병원체 유전자를 사용하여 정규화는 다른 시료 간의 비교 될 수있는 발현 양상 전에 중요한 단계이다. 정상화를위한 세 가지 일반적으로 사용되는 방법이 있습니다. 코드 세트의 모든 유전자에서 1. 총 계산합니다. 2. 하나 또는 소수의 &#39;가사&#39;유전자. 3. 기하 평균 (N N 번호의 생성물 루트 번째) 고도로 발현 유전자. 큰 코드 세트 (&gt; 100 유전자), 좋은 선택 일 수 정규화 총 개수를 사용하여, 임의로 선택된 프로브를 수용하기 때문에 비 관련 유전자 수도 믿음 다수의 총 개수전체 RNA 입력의 양을 반영한다. 작은 코드 세트 (균사 성장 유전자 공동 규제되는 경향이 주어진 이러한 균사 성장 같은) 특정 프로세스에 집중 프로브를 함유하는 (&lt;100 유전자), 하나를 선택하거나 몇 키핑 유전자 정상화 제어가 필수적이기 때문에. TDH3, 견고하게 표현 된 대사 유전자는 많은 실험 대조군으로 잘 역임했다. 세 번째 방법은 매우 표현 유전자에서 동등한 기여에 대한 강조와 함께, 방법 1과 2의 하이브리드입니다. nCounter 플랫폼은 게놈 넓은 아니지만, 그것은 하나의 분석에서 최대 800 유전자 발현 수준의 정량화 할 수 있습니다. 따라서, 분석하는 가장 유익한 유전자를 선택하면 프로파일의 성공을 위해 중요하다. 프로브를 선택하는 두 가지 방법이 사용되어왔다. 첫 번째 방법은 &quot;기초 지식&quot;입니다. 게시 된 표현과 기능 데이터의 정보는 현재 잠재적 인 관심있는 유전자 화면으로 컴파일이러한 환경 응답 유전자 6-9로 공부합니다. 이 방법은 생체는 따라서 데이터 해석에 대한 컨텍스트를 제공하고, 기존의 많은 데이터 세트에 데이터를 프로파일 링을 쉽게 비교 할 수 있습니다. 두 번째 방법은 &quot;기초 탐사&quot;이다. 이러한 전사 인자, 또는 키나제 세포벽 단백질을 지정하는 모든 유전자로서 미생물 게놈 유전자의 범주는 프로브 선택된다. 이 접근법은 생체 데이터 6에 기초하여 프로파일 신규 병원성 인자 및 신규 규제 관계 발견을 식별 할 수있다.

유전자 발현 역학 셀이 환경 변화에 대응하는 방법에 대한 중요한 정보를 보유하고 있습니다. 미생물 감염의 경우, 유전자 발현 데이터는 병원체 감염 환경에 적응하고 호스트의 손상을 유발하는 방법에 관한 임상 적 통찰력을 제공 할 수있다. 지난 20 년 동안, 생체 외 및 생체 내 유전자 발현 연구는 대량의 데이터를 생성하고 감염 1-3 생물학을 이해하기위한 기초를 마련했다. 그러나, 마이크로 어레이를 포함하고 RNAseq 전류 프로파일 링 기술은 병원균 감염시 유전자 발현 프로파일 링에 최적이 아니다. RNA는 감염된 조직 샘플에서 분리 된 총 RNA의 절대적인 부분 (일반적으로&gt; 99 %)을 구성하는 호스트. 호스트 RNA는 마이크로 어레이에 높은 배경에 기여하고, 순서가 RNAseq 읽 지배하고있다. 감염된 조직에서 병원균 세포 격리 이론적으로 병원체에 대한 RNA 풍부하게 할 수 있지만 이것은 또한 포즈알 문제 : 그것은 감​​염된 조직 다량 필요; 지루한 과정이 될 수있다; 가장 중요한 것은 긴 과정에서 원시 상태 또는 RNA의 무결성을 보존하는 것이 곤란하다. 실제 감염 병원체 중 유전자 발현에 대한 포괄적이고 정확한 데이터를 생성하기 위해, 우리는 혼합 RNA 인구 소수 RNA 종의 신뢰성과 비용 효율적인 정량화를 허용하는 프로토콜을 개발 착수. NanoString nCounter 4, 5.이 플랫폼은 QRT-PCR에 필적 감도 레벨을 갖지만 효소 증폭을 필요로하지 않는 디지털 바코드 프로브 쌍을 이용하여 유전자 발현의 직접적인 다중화 측정한다 최근 개발 플랫폼이다. 이 기술은 전체 게놈되지 않고, 각각의 분석에서 최대 800 가지 유전자의 검출을 허용한다. 따라서 프로파일 링을위한 프로브와 같은 정보를 유전자를 선택하는 것이 중요합니다. 여기에서 우리는 주요 험의 연구 프로파일 유전자 발현을 사용예를 들어 침습성 감염시 병원체, 칸디다 알비 칸스는 설명 : 1) 실험 절차 (프로토콜)의 기술 정보, 2)이 법의 민감도, 재현성 및 동적 범위 (대표 결과), 3) 중요 이 프로토콜 (토론)를 기반으로 실험을 설계하고 수행하기위한 고려 사항. 이 프로토콜은 다양한 병원균에 대해 쉽게 적응 될 수 있고, 성공적으로 감염 모델 6-9의 숫자에 적용되어왔다.

<table><tbody><tr><td>gentleMACS Dissociator</td><td>Miltenyl Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>gentelMACS M tube</td><td>Miltenyl Biotec</td><td>130-093-236</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M-3148</td><td></td></tr><tr><td>Phenol:CHCl&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;:IAA</td><td>Sigma</td><td>P-2069</td><td></td></tr><tr><td>Zirconia beads</td><td>Biospec Products</td><td>11079110zx</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Beadbeater-16</td><td>Biospec Products</td><td>607</td><td></td></tr><tr><td>nCounter Analysis system</td><td>nanoString Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>nCounter Gene Expression Codesets</td><td>nanoString Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>nSolver Analysis tool</td><td>nanoString Technologies</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

gene expression profiling of infecting microbes using a digital bar-coding platform

대부분의 포유 동물 병원체를 들어, 연구 프로파일 유전자 발현을 정확하게 감염 조직에서 병원균 유전자 성적 증명서를 정량화하는 기술적 인 문제에 의해 제한되고있다. 병원체 RNA는 감염된 조직 샘플에서 분리 된 총 RNA의 작은 부분을 구성한다. 마이크로 어레이 및 RNAseq 기술을 모두 믿을 약하게 표현 병원체 유전자 읽어 생성에 어려움이있다. 생체 내 증식의 감소와 돌연변이 병원체 균주는 더 큰 도전을 제기. 여기에서 우리는 매우 빠르고, 매우 민감하고 재현성있는 생체 내 유전자 발현 프로파일 링 프로토콜을 설명합니다. 우리는 혈행 성 전파 칸디다증의 쥐 모델에서 곰팡이 병원균 칸디다 알비 칸스의 우리의 조사 동안이 프로토콜을 개발했다. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 동적으로 조절 C의 시간 과정을 문서화 알비 칸스 유전자 신장 감염 동안 식, 그리고 예기치 않은 발견 기능유전자 발현 반응은 생체 내에서 약물을 치료하는 항진균제.

병원체의 유전자 발현은 생체 내에서 프로파일 링에 대한 하나의 주요 과제는 충분이 병원균 RNA로부터 읽어 얻는 것입니다. 총 RNA, 총 RNA의 다량 병원체 사체의 낮은 백분율 주어진 (&gt; 10 μg의)는 각 반응에 사용되어야한다. 플랫폼은 이러한 관점에서 고유 한 장점을 갖는다 : 그것은 포획 프로브 및 숙주 RNA의 절대적인 양이 큰 잡음 레벨을 발생하지 않도록, 특이성을 높이기 위해 보고서 프로브를 모두 사용한다. 두 감염된 조직 샘플 (파란색 점)에서 원시 카운트가 생성 된 모든 상기 (10) 식의 데이터가있는 동안 그림 1에 나타낸 바와 같이 (참조에서 적응. 6), 감염되지 않은 조직 샘플에서 배경 원시 카운트 (붉은 점), 모든 10의 밑에 있었다 이 프로토콜을 이용하여 높은 재현성이다. 그림 1에 나타낸 바와 같이 (참조에서 적응. 6), 원료 수를 두 생물 복제 (파란색 점, 48 시간 후 감염 신장 샘플)에서 매우 끈적 거리는했다R 제곱 값이 D의 상관 관계는 0.945 같습니다. 플랫폼은 또한 천연 생물학적 발현 수준 포함하도록 충분한 동적 범위를 제공한다 (도 1, 로우 카운트는 1 6 10 ~ 10였다). 초기 유전자 발현 응답 접종하고 12 시간 사이에 유의 한 차이 RNA 수준의 유전자를 포함하는 248 환경 대응 유전자를 지정하는 프로브 세트를 사용하여, 우리는 병원체 유전자 (. 참고 문헌에서 적응도 2, 6) 식의 두 단계를 식별 할 수 있었다 감염 후 샘플 (P &lt;0.05&gt; 식 2 배 변화), 및 후기 유전자 발현 반응은 48 시간 후 감염 샘플 (P에서 12 시간 시점 사이의 현저히 상이한 RNA 수준 유전자 &lt;0.05를 포함 과&gt; 2 배 발현의 변화). 이러한 결과는 것을 나타 C. 알비 칸스 유전자 발현 동적 침습 infectio시 규제포유류의 호스트 명. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53460/53460fig1.jpg" /> 그림 원시 감염과 감염되지 않은 신장 조직에서 계산 (1). (. 참고 문헌에서 6 개조) 프로브는 신장 샘플 분산으로 제시되는 두 개의 감염 (48 시간 게시물 감염, 블루 데이터 포인트) 한 감염되지 않은 (붉은 데이터 포인트)에 대한 계산 줄거리. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53460/53460fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53460/53460fig2.jpg" /> C의 그림 2. 표현 알비 칸스 환경에 반응하는 유전자는 침습성 감염시 (참조에서 적응. 6). 발현 수준의 변화를 248 C의 마우스 신장 침공 당시 알비 칸스 유전자 열 m에 제시AP 형식입니다. 생물학적 삼중의 평균 값은 최대 규제 (노란색)에 대한 표시되고 12, 24에서 유전자 (파란색), 48 시간 후 감염과 관련된 규제 아래 접종 수준 (0 시간)을 의미. 색상 채도 업 접거나 하향 조절 (10)의 전체 채도 식 변화의 정도를 나타냅니다. 열지도의 일부는 대표 일찍 조절 유전자 (위), 후반 유전자 (가운데), 초 아래로 조절 유전자 (아래)을 설명하기 위해 확장됩니다. 이 부분에서, 각각의 샘플은 재현성을 설명하기 위해 별도로 제공됩니다. 우리는 접종 12 시간 샘플 사이에 유의 한 차이가 일찍 발현 변화를 정의합니다. 우리는 12과 48 시간 샘플 사이에 유의 한 차이가 늦게 발현 변화를 정의합니다. 의미는&gt; 2 배 및 p 값 &lt;0.05의 변경을 의미합니다. 평균값이 계산되기 전에 각각의 샘플에 대한 데이터를 제어하는​​ 유전자 TDH3로부터 RNA 수준으로 표준화되었다. 우리의 지정 기준은 일부 dynamica 허용에서야 조절 유전자는 초기와 후기 발현 클래스 모두에 해당합니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53460/53460fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Gene Expression Profiling of Infecting Microbes Using a Digital Bar-coding Platform

We developed a protocol that is fast, sensitive and reproducible for pathogen gene expression profiling during an infection.

디지털 바 코딩 플랫폼을 사용에 감염 미생물의 유전자 발현 프로파일 링

For most mammalian pathogens, gene expression profiling studies have been limited by technical difficulties to accurately quantify pathogen gene ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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비디오: Gene Expression Profiling of Infecting Microbes Using a Digital Bar-coding Platform

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in a single reaction. The miRNA assay counts transcripts by directly imaging and digitally counting miRNA molecules that are labeled with color-coded fluorescent barcoded probe sets (a reporter probe and a capture probe). Barcodes are hybridized directly to mature miRNAs that have been elongated by ligating a unique oligonucleotide tag (miRtag) to the 3&#39; end. Reverse transcription and amplification of the transcripts are not required. Reporter probes contain a sequence of six color positions populated using a combination of four fluorescent colors. The four colors over six positions are used to construct a gene-specific color barcode sequence. Post-hybridization processing is automated on a robotic prep station. After hybridization, the excess probes are washed away, and the tripartite structures (capture probe-miRNA-reporter probe) are fixed to a streptavidin-coated slide via the biotin-labeled capture probe. Imaging and barcode counting is done using a digital analyzer. The immobilized barcoded miRNAs are visualized and imaged using a microscope and camera, and the unique barcodes are decoded and counted. Data quality control (QC), normalization, and analysis are facilitated by a custom-designed data processing and analysis software that accompanies the assay software. The assay demonstrates high linearity over a broad range of expression, as well as high sensitivity. Sample and assay preparation does not involve enzymatic reactions, reverse transcription, or amplification; has few steps; and is largely automated, reducing investigator effects and resulting in high consistency and technical reproducibility. Here, we describe the application of this technology to identifying circulating miRNA perturbations in irritable bowel syndrome.

We describe the use of a multiplexed high-throughput gene expression platform that quantitates gene expression by barcoding and counting molecules in biological substrates without the need for amplification. We used the platform to quantitate microRNA (miRNA) expression in whole blood in subjects with and without irritable bowel syndrome.

과민성 대장 증후군에서의 miRNAs 순환의 교란은 멀티 플렉스 높은 처리량 유전자 발현 플랫폼을 사용하여 감지

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

연구

유전학

Multiplex Detection of Bacteria in Complex Clinical and Environmental Samples using Oligonucleotide-coupled Fluorescent Microspheres

Bacterial vaginosis (BV) is a recurring polymicrobial syndrome that is characterized by a change in the "normal" microbiota from Lactobacillus-dominated to a microbiota dominated by a number of bacterial species, including Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, and others1-3. This condition is associated with a range of negative health outcomes, including HIV acquisition4, and it can be difficult to manage clinically5. Furthermore, diagnosis of BV has relied on the use of Gram stains of vaginal swab smears that are scored on various numerical criteria6,7. While this diagnostic is simple, inexpensive, and well suited to resource-limited settings, it can suffer from problems related to subjective interpretations and it does not give a detailed profile of the composition of the vaginal microbiota8. Recent deep sequencing efforts have revealed a rich, diverse vaginal microbiota with clear differences between samples taken from individuals that are diagnosed with BV compared to those individuals that are considered normal9,10, which has resulted in the identification of a number of potential targets for molecular diagnosis of BV11,12. These studies have provided a wealth of useful information, but deep sequencing is not yet practical as a diagnostic method in a clinical setting. We have recently described a method for rapidly profiling the vaginal microbiota in a multiplex format using oligonucleotide-coupled fluorescent beads with detection on a Luminex platform13. This method, like current Gram stain-based methods, is rapid and simple but adds the additional advantage of exploiting molecular knowledge arising from sequencing studies in probe design. This method therefore provides a way to profile the major microorganisms that are present in a vaginal swab that can be used to diagnose BV with high specificity and sensitivity compared to Gram stain while providing additional information on species presence and abundance in a semi-quantitative and rapid manner. This multiplex method is expandable well beyond the range of current quantitative PCR assays for particular organisms, which is currently limited to 5 or 6 different assays in a single sample14. Importantly, the method is not limited to the detection of bacteria in vaginal swabs and can be easily adapted to rapidly profile nearly any microbial community of interest. For example, we have recently begun to apply this methodology to the development of diagnostic tools for use in wastewater treatment plants.

We describe a multiplex method for the detection of microorganisms within a sample using oligonucleotide-coupled fluorescent beads. Amplicon from all organisms within a sample is hybridized to a panel of probe-coupled beads. A Luminex or Bio-Plex instrument is used to query each bead for bead type and hybridization signal.

Oligonucleotide - 결합 형광등 Microspheres를 사용하여 복잡한 임상 및 환경 샘플에서 박테리아의 멀티 플렉스 감지

Bacterial vaginosis (BV) is a recurring polymicrobial syndrome that is characterized by a change in the "normal" microbiota from Lactobacillus-dominated ...

면역학 및 감염병학

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to perform and its ability to standardize the fitness of many strains to a wild-type organism. The technique is limited, however, by available phenotypic markers and the number of strains that can be assessed simultaneously, creating the need for a great number of replicate experiments. Concurrent with large numbers of experiments, the labor and material costs for quantifying bacteria based on phenotypic markers are not insignificant. To overcome these negative aspects while retaining the positive aspects, we have developed a molecular-based approach to directly quantify microorganisms after engineering genetic markers onto bacterial chromosomes. Unique, 25 base pair DNA barcodes were inserted at an innocuous locus on the chromosome of wild-type and mutant strains of Salmonella. In vitro competition experiments were performed using inocula consisting of pooled strains. Following the competition, the absolute numbers of each strain were quantified using digital PCR and the competitive indices for each strain were calculated from those values. Our data indicate that this approach to quantifying Salmonella is extremely sensitive, accurate, and precise for detecting both highly abundant (high fitness) and rare (low fitness) microorganisms. Additionally, this technique is easily adaptable to nearly any organism with chromosomes capable of modification, as well as to various experimental designs that require absolute quantification of microorganisms.

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

This molecular-based approach for determining bacterial fitness facilitates precise and accurate detection of microorganisms using unique genomic DNA barcodes that are quantified via digital PCR. The protocol describes calculating the competitive index for Salmonella strains; however, the technology is readily adaptable to protocols requiring absolute quantification of any genetically-malleable organism.

살모넬라에서 피트니스의 높은 처리량 분석을 위한 디지털 PCR 기반 경쟁 지수

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to ...

Multiplexed Barcoding Image Analysis for Immunoprofiling and Spatial Mapping Characterization in the Single-Cell Analysis of Paraffin Tissue Samples

Multiplexed imaging technology using antibody barcoding with oligonucleotides, which sequentially detects multiple epitopes in the same tissue section, is an effective methodology for tumor evaluation that improves the understanding of the tumor microenvironment. The visualization of protein expression in formalin-fixed, paraffin-embedded&#160;tissues is achieved when a specific fluorophore is annealed to an antibody-bound barcode via complementary oligonucleotides and then sample imaging is performed; indeed, this method allows for the use of customizable panels of more than 40 antibodies in a single tissue staining reaction. This method is compatible with fresh frozen tissue, formalin-fixed, paraffin-embedded tissue, cultured cells, and peripheral blood mononuclear cells, meaning that researchers can use this technology to view a variety of sample types at single-cell resolution. This method starts with a manual staining and fixing protocol, and all the antibody barcodes are applied using an antibody cocktail. The staining fluidics instrument is fully automated and performs iterative cycles of labeling, imaging, and removing spectrally distinct fluorophores until all the biomarkers have been imaged using a standard fluorescence microscope. The images are then collected and compiled across all the imaging cycles to achieve single-cell resolution for all the markers. The single-step staining and gentle fluorophore removal not only allow for highly multiplexed biomarker analysis but also preserve the sample for additional downstream analysis if desired (e.g., hematoxylin and eosin staining). Furthermore, the image analysis software enables image processing-drift compensation, background subtraction, cell segmentation, and clustering-as well as the visualization and analysis of the images and cell phenotypes for the generation of spatial network maps. In summary, this technology employs a computerized microfluidics system and fluorescence microscope to iteratively hybridize, image, and strip fluorescently labeled DNA probes that are complementary to tissue-bound, oligonucleotide-conjugated antibodies.

Multiplexed barcoding image analysis has recently improved the characterization of the tumor microenvironment, permitting comprehensive studies of cell composition, functional state, and cell-cell interactions. Herein, we describe a staining and imaging protocol using the barcoding of oligonucleotide-conjugated antibodies and cycle imaging, which allows for the use of a high-dimensional image&#160;analysis technique.

파라핀 조직 샘플의 단일 세포 분석에서 면역 프로파일링 및 공간 매핑 특성 분석을 위한 멀티플렉스 바코드 이미지 분석

Multiplexed imaging technology using antibody barcoding with oligonucleotides, which sequentially detects multiple epitopes in the same tissue section, is ...

암 연구학

Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental biology. It has been successfully used to identify rare cell populations, discover novel marker genes, and decode spatial and temporal developmental information. The single cell method has also evolved from the microfluidic based Fluidigm C1 technology to the droplet-based solutions in the last two to three years. Here we used the heart as an example to demonstrate how to profile the mouse embryonic tissue cells using the droplet based scRNA-Seq method. In addition, we have integrated two strategies into the workflow to profile multiple samples in a single experiment. Using one of the integrated methods, we have simultaneously profiled more than 9,000 cells from eight heart samples. These methods will be valuable to the developmental biology field by providing a cost-effective way to simultaneously profile single cells from different genetic backgrounds, developmental stages, or anatomical locations.

Here we presented a multiplexed single cell mRNA sequencing method to profile gene expression in mouse embryonic tissues. The droplet-based single cell mRNA sequencing (scRNA-Seq) method in combination with multiplexing strategies can profile single cells from multiple samples simultaneously, which significantly reduces reagent costs and minimizes experimental batch effects.

마우스 배아 세포의 다중화 단세포 mRNA 염기서열 분석

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental ...

발생학

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of cellular heterogeneity in biological systems. However, single-cell sequencing of large populations has been hampered by limitations in processing genomes for sequencing. In this paper, we describe a method for single-cell genome sequencing (SiC-seq) which uses droplet microfluidics to isolate, amplify, and barcode the genomes of single cells. Cell encapsulation in microgels allows the compartmentalized purification and tagmentation of DNA, while a microfluidic merger efficiently pairs each genome with a unique single-cell oligonucleotide barcode, allowing &gt;50,000 single cells to be sequenced per run. The sequencing data is demultiplexed by barcode, generating groups of reads originating from single cells. As a high-throughput and low-bias method of single-cell sequencing, SiC-seq will enable a broader range of genomic studies targeted at diverse cell populations.

Single-cell sequencing reveals genotypic heterogeneity in biological systems, but current technologies lack the throughput necessary for the deep profiling of community composition and function. Here, we describe a microfluidic workflow for sequencing &gt;50,000 single-cell genomes from diverse cell populations.

단일 셀 게놈 시퀀싱 초고 처리량 미세 플랫폼

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

생체공학

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

Barcoded 효모 게놈 라이브러리의 경쟁력 화면

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

생물학

High-Throughput Transcriptome Analysis for Investigating Host-Pathogen Interactions

Pathogens can cause a wide variety of infectious diseases. The biological processes induced by the host in response to infection determine the severity of the disease.&#160;To study such processes, researchers can use high-throughput sequencing techniques (RNA-seq) that measure the dynamic changes of the host transcriptome at different stages of infection, clinical outcomes, or disease severity.This investigation can lead to a better understanding of the diseases, as well as uncovering potential drug targets and treatments. The protocol presented here describes a complete pipeline to analyze RNA-sequencing data from raw reads to functional analysis. The pipeline is divided into five steps: (1) quality control of the data; (2) mapping and annotation of genes; (3) statistical analysis to identify differentially expressed genes and co-expressed genes; (4) determination of the molecular degree of the perturbation of samples; and (5) functional analysis. Step 1 removes technical artifacts that may impact the quality of downstream analyses. In step 2, genes are mapped and annotated according to standard library protocols.&#160;The statistical analysis in step 3 identifies genes that are differentially expressed or co-expressed in infected samples, in comparison with non-infected ones. Sample variability and the presence of potential biological outliers are verified using the molecular degree of perturbation approach in step 4. Finally, the functional analysis in step 5 reveals the pathways associated with the disease phenotype. The presented pipeline aims to support researchers through the RNA-seq data analysis from host-pathogen interaction studies and drive future&#160;in vitro or in vivo experiments, that are essential to understand the molecular mechanism of infections.

The protocol presented here describes a complete pipeline to analyze RNA-sequencing transcriptome data from raw reads to functional analysis, including quality control and preprocessing steps to advanced statistical analytical approaches.

호스트-병원체 상호 작용을 조사하기 위한 고처리량 전사 분석

Pathogens can cause a wide variety of infectious diseases. The biological processes induced by the host in response to infection determine the severity of ...

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the long-lasting gold standards is to sequence 16S ribosomal RNA (rRNA) gene amplicons generated by domain-level PCR reactions amplifying from genomic DNA. Traditionally, this was performed by cloning and Sanger (capillary electrophoresis) sequencing of PCR amplicons. The advent of next-generation sequencing has tremendously simplified and increased the sequencing depth for 16S rRNA gene sequencing. The introduction of benchtop sequencers now allows small labs to perform their 16S rRNA sequencing in-house in a matter of days. Here, an approach for 16S rRNA gene amplicon sequencing using a benchtop next-generation sequencer is detailed. The environmental DNA is first amplified by PCR using primers that contain sequencing adapters and barcodes. They are then coupled to spherical particles via emulsion PCR. The particles are loaded on a disposable chip and the chip is inserted in the sequencing machine after which the sequencing is performed. The sequences are retrieved in fastq format, filtered and the barcodes are used to establish the sample membership of the reads. The filtered and binned reads are then further analyzed using publically available tools. An example analysis where the reads were classified with a taxonomy-finding algorithm within the software package Mothur is given. The method outlined here is simple, inexpensive and straightforward and should help smaller labs to take advantage from the ongoing genomic revolution.

Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.

16S 리보솜 RNA 유전자 증폭 산물의 차세대 시퀀싱

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery of fluorescent proteins and their genes have enabled the engineering of protein fusions for localization, the analysis of transcriptional activation and translation of proteins of interest, or the general tracking of individual cells and cell populations. The use of fluorescent protein genes in combination with retroviral technology has further allowed the expression of these proteins in mammalian cells in a stable and reliable manner. Shown here is how one can utilize these genes to give cells within a population of cells their own biosignature. As the biosignature is achieved with retroviral technology, cells are barcoded &#180;indefinitely&#180;. As such, they can be individually tracked within a mixture of barcoded cells and utilized in more complex biological applications. The tracking of distinct populations in a mixture of cells is ideal for multiplexed applications such as discovery of drugs against a multitude of targets or the activation profile of different promoters. The protocol describes how to elegantly develop and amplify barcoded mammalian cells with distinct genetic fluorescent markers, and how to use several markers at once or one marker at different intensities. Finally, the protocol describes how the cells can be further utilized in combination with cell-based assays to increase the power of analysis through multiplexing.

Since the discovery of the green fluorescent protein gene, fluorescent proteins have impacted molecular cell biology. This protocol describes how expression of distinct fluorescent proteins through genetic engineering is used for barcoding individual cells. The procedure enables tracking distinct populations in a cell mixture, which is ideal for multiplexed applications.

멀티 플렉스 애플리케이션을위한 형광 단백질 유전자 바코드

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...