Name: gene expression profiling of infecting microbes using a digital bar-coding platform
Uploaded: 2016-01-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
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Este trabalho foi apoiado em parte pelo NIH concede R21 DE023311 (APM), R56 AI111836 (APM &amp; SGF), R01 AI054928 (SGF), e R01 DE017088 (SGF).

Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidado Animal Institucional do Instituto de Pesquisa Biomédica de Los Angeles (protocolo 011000) e realizada de acordo com os Institutos Nacionais de Saúde (NIH) diretrizes para o tratamento ético dos animais. Os ratos foram engaiolados em uma instalação AAALAC credenciados localizado no campus de Porto-UCLA Instituto de Pesquisa e Educação. Um veterinário a tempo inteiro que se especializou em medicina de animais de laboratório supervisionou seus cuidados. Enjaulamento e pecuária foi fornecido de acordo com as diretrizes da publicação &quot;Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório&quot; Serviço de Saúde Pública dos Estados Unidos. Foi feito todos os esforços para tratar os ratos humanamente. A sobrevivência ea saúde dos ratos foi monitorado três vezes ao dia. Obviamente doentes, ratos letárgicos foram segregados do grupo e sacrificados para minimizar o sofrimento. Os ratinhos foram eutanizados por overdose de pentobarbital (210 mg / kg), como recomendado pelo Painel em Euthanasia da American Veterinary Medical Association. 1. Preparação de Tecidos e Reagentes e Instrumentos <ol><li> Use ratinhos macho Balb / c pesando 20-22 g para todos os estudos. Inocular três murganhos por grupo experimental por via intravenosa com 1 x 10 6 de levedura em fase C. células albicans. Sacrificar animais e rins colheita em momentos específicos pós-infecção. Coloque cada rim para um tubo de tampa de rosca, encaixe congelamento em nitrogênio líquido, e armazenar a -80 ° C para posterior extração de RNA 6. Nota: As experiências em animais foram realizados tal como descrito em detalhe em Xu et ai 6.. </li><li> Prepare os seguintes reagentes e instrumentos antes de retirar os rins do freezer -80 ° C: <ol><li> Abra um kit total de extração de RNA. Adicionar 2-mercaptoetanol (1% v / v) de tampão RLT e misturar bem (preparar 2 ml para cada amostra). </li><li> Prepare fenol: clorofórmio: álcool isoamílico 25: 24: 1 (600 ul precisa para cada amostra). </li><li> Etiqueta M-tipo tubos de homogeneização (M-tubo) e frio no gelo. </li><li> Etiqueta 2 ml tubos com tampas de parafuso, e adicionar cerca de 300 contas de Zirconia ul a cada tubo. </li><li> Verifique instrumentos estão disponíveis: Dissociator tecido, beadbeater, centrífuga de mesa com adaptadores para tubos de 50 ml e placas de 96 poços, fotômetro. </li></ol></li></ol> 2. Extracção de ARN a partir de tecidos infectados <ol><li> Remover tubos contendo rins de -80 ° C freezer e colocar no gelo. Adicionar 1,2 ml de tampão RLT com 2-mercaptoetanol para cada rim. Decantar rim com tampão em um tipo M tubos de homogeneização. </li><li> Homogeneizar o rim usando uma Dissociator tecido em ambiente pré-carregado RNA_02.01. </li><li> Centrifugar a 1.000 xg durante 1 min numa centrífuga de mesa à temperatura ambiente. </li><li> Transferir 600 ul homogeneizado para o tubo de tampa de rosca contendo esferas de zircônia. Salve o homogeneizado restante no gelo. </li><li> Adicionar 600 ul de fenol: clorofórmio: álcool isoamílico 25: 24: 1 aos tubos da etapa anterior. </li><li> Fechar as tampas firmemente e vortex em beadbeater por 3 min em um 4 ° C câmara fria. </li><li> Centrifugar os tubos a 15.000 xg durante 5 minutos numa sala fria a 4 ° C. </li><li> Transferir cuidadosamente a fase aquosa para um novo tubo de microcentrifugação de 1,5 mL, misturar bem com um volume igual de etanol a 70%, em seguida, carrega-se na coluna de centrifugação (de carga, duas vezes). </li><li> Lava-se a coluna de centrifugação uma vez com 700 ul de tampão RW, seguido por duas vezes com 500 ul de tampão de EPR. Centrifugar um minuto adicional em um tubo de recolha de seco para remover o líquido remanescente na coluna de centrifugação. Execute todas as etapas de centrifugação a 8000 x g. </li><li> Eluir com 50 ul de ARN H 2 O. Medir a concentração de OD de RNA em 260 utilizando um espectrofotómetro. </li></ol> 3. Perfil de expressão gênica Usando Digital Bar-codificante <ol><li> Codeset Thaw repórter (tubo de tampa verde) e captura de codeset (cinza tubo cap) em gelo. </li><li> Adicionar 130 ul de tampão de hibridação para a reporter codeset, inverta para misturar e spin down. </li><li> Adicionar 20 ul da mistura de cada um dos 12 tubos de reacção. </li><li> Adiciona-se 10 ug de ARN total dos tecidos (em um volume de 5 ul) a cada tubo. Misturar por pipetagem. </li><li> Adicionar 5 mL de captura codeset a cada tubo. Misture invertendo o tubo seguido por um giro rápido para baixo. </li><li> Incubam-se as reacções a 65 ° C num termociclador com tampa aquecida S / N (~ 18 horas). </li><li> Remova um cartucho de amostra de -20 ° C e deixe aquecer a RT. </li><li> Remover duas placas de reagentes a partir de 4 ° C e centrifugação a 670 xg durante 2 minutos numa centrífuga de mesa. </li><li> Configurar a estação prep seguindo as instruções passo-a-passo na tela, selecione a opção de alta sensibilidade. </li><li> Retirar as reacções do termociclador e carregar imediatamente na estação de preparação. Selecione para executar o programa de alta sensibilidade (3 h). </li><li> Quando o programa da estação prep for concluída, remova o cartucho e selar as pistas com uma fita adesiva transparente. Apcamada de óleo mineral para a parte inferior do cartucho (para a geração de uma única nCounter, gerações posteriores não requerem este passo), em seguida carregar o cartucho para o analisador digital. </li><li> Configure o analisador digital de acordo com as instruções passo-a-passo na tela, selecione a opção varredura de alta resolução. </li><li> Selecione a opção (600 campos) de alta resolução, execute o programa de digitalização (~ 4,5 horas). </li><li> Quando o programa de digitalização estiver concluída, baixar os resultados (ou optar por receber os resultados por e-mail) e importe os dados brutos em software do fabricante. O software irá automaticamente verificar a qualidade dos dados e levantar bandeiras se a qualidade dos dados cai fora da faixa normal. Execute ajustamento técnico utilizando a função built-in (opcional, siga as instruções do software), em seguida, exportar os dados como um arquivo do Excel. </li><li> Normalizar os dados utilizando um dos métodos seguintes: contagens totais de todos os genes no conjunto de códigos; um ou alguns genes de controlo interno; média geométricagenes de altamente expressos (ver discussão). </li><li> Calcular os valores médios de expressão para cada gene (se o experimento foi realizado em triplicado ou repetições), em seguida, calcular a relação entre os níveis de expressão entre diferentes grupos experimentais. </li><li> (opcional) analisar e visualizar os resultados de perfis de funções embutidas no software nSolver ou um programa de agrupamento, como MultiExperiment Visualizador 10. </li></ol>

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	<li>Cairns, T., Minuzzi, F., Bignell, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host-infecting+fungal+transcriptome.">The host-infecting fungal transcriptome.</a> FEMS Microbiol Lett. 307 (1), 1-11 (2010).</li><li>Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+RNA-seq+of+pathogen+and+host.">Dual RNA-seq of pathogen and host.</a> Nat Rev Microbiol. 10 (9), 618-630 (2012).</li><li>Creecy, J. P., Conway, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+bacterial+transcriptomics+with+RNA-seq.">Quantitative bacterial transcriptomics with RNA-seq.</a> Curr Opin Microbiol. 23C, 133-140 (2015).</li><li>Geiss, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+multiplexed+measurement+of+gene+expression+with+color-coded+probe+pairs.">Direct multiplexed measurement of gene expression with color-coded probe pairs.</a> Nat Biotechnol. 26 (3), 317-325 (2008).</li><li>Malkov, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+measurements+of+gene+signatures+in+different+analytes+using+the+Nanostring+nCounter+Assay+System.">Multiplexed measurements of gene signatures in different analytes using the Nanostring nCounter Assay System.</a> BMC Res Notes. 2, 80 (2009).</li><li>Xu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+and+Alliance+of+Regulatory+Pathways+in+C.+albicans+during+Mammalian+Infection.">Activation and Alliance of Regulatory Pathways in C. albicans during Mammalian Infection.</a> PLoS Biology. 13, e1002076 (2015).</li><li>O'Meara, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cryptococcus+neoformans+Rim101+Transcription+Factor+Directly+Regulates+Genes+Required+for+Adaptation+to+the+Host.">The Cryptococcus neoformans Rim101 Transcription Factor Directly Regulates Genes Required for Adaptation to the Host.</a> Mol Cell Biol. 34 (4), 673-684 (2014).</li><li>Cheng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+Candida+albicans+Gene+Expression+During+Intra-Abdominal+Candidiasis+Identifies+Biologic+Processes+Involved+in+Pathogenesis.">Profiling of Candida albicans Gene Expression During Intra-Abdominal Candidiasis Identifies Biologic Processes Involved in Pathogenesis.</a> J Infect Dis. 208 (9), 1529-1537 (2013).</li><li>Fanning, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergent+Targets+of+Candida+albicans+Biofilm+Regulator+Bcr1+in+Vitro+and+In+Vivo.">Divergent Targets of Candida albicans Biofilm Regulator Bcr1 in Vitro and In Vivo.</a> Eukaryot Cell. 11 (7), 896-904 (2012).</li><li>Saeed, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TM4:+a+free,+open-source+system+for+microarray+data+management+and+analysis.">TM4: a free, open-source system for microarray data management and analysis.</a> Biotechniques. 34 (2), 374-378 (2003).</li></ol>

This protocol is developed in the laboratory of Dr. Aaron P. Mitchell at Carnegie Mellon University. The publication of this manuscript is sponsored by NanoString Technologies.

Este protocolo é desenvolvido para otimizar o perfil transcricional de infectar micróbios usando uma plataforma nanoString nCounter. Todo o processo, desde a recolha de dados de expressão de tecido, requer menos do que 48 h. Os hands-on tempo é de cerca de 4 horas para 12 amostras. Uma variável-chave neste protocolo é a quantidade de RLT tampão adicionado ao tecido na primeira etapa. O excesso de tampão irá diluir o homogenato e levar a uma concentração mais baixa de ARN, enquanto muito pouco tampão pode levar à formação de géis viscosos após o passo de extracção com fenol clorofórmio e não deixam fase aquosa para a recuperação de ARN. Os volumes óptimos determinados empiricamente de RLT tampão para tecidos de ratinho (assumindo que os tamanhos típicos) são: rim (1,2 ml), a língua (1,0 ml) e pulmão (2,0 mL). Para patógenos microbianos, especialmente estes cultivadas em forma filamentosa, o passo-batendo talão ajuda a quebrar parede celular espessa para liberar totalmente conteúdo celular. No passo de eluição, a fim de aumentar o final de ARNconcentração, o primeiro eluato redonda pode ser adicionado de volta para a coluna, e elui-se uma segunda vez. Cerca de 100 ug de ARN total de tecido pode ser recuperada a partir de uma coluna de centrifugação RNeasy (~ 2 mg / mL x 50 mL). Se for maior quantidade de ARN é necessária, uma segunda preparação pode ser feita a partir do homogeneizado de tecido remanescente. Não descarte do homogeneizado restante até concentração de RNA foi medido, apenas no caso. Dependendo do modelo de infecção, o tamanho do inoculo e a estirpe de agente patogénico, a percentagem de ARN patógeno em ARN total dos tecidos varia de 0% a 2%, e cai tipicamente dentro da gama de 0,05% -0,5%. Por exemplo, 10? G de RNA total de tecido de C. albicans infectados rim poderia gerar contagens bruto igual a de 10 ng de puro C. albicans de ARN a partir de uma cultura in vitro (10 ng / 10 g = 0,1%). Uma vez que a percentagem de ARN patógeno no RNA total de tecido varia de uma vasta gama, é difícil saber a quantidade de pathogeARN n numa dada quantidade de ARN total. Para evitar o desperdício de conjunto de códigos (por 250 x 192 genes de reacções, o custo por reacção é de cerca de $ 200) em amostras de ARN com patógeno abaixo do nível de detecção, um passo de controlo de qualidade de ARN pode ser realizada para determinar o nível de ARN de agentes patogénicos no interior de cada amostra. Isto pode ser feito por qualquer uma das Q-RT-PCR ou um pequeno conjunto de códigos contendo alguns genes housekeeping. Normalização usando genes do patógeno é um passo crítico antes de os perfis de expressão podem ser comparados entre diferentes amostras. Existem três métodos comumente usados ​​para a normalização. 1. Use as contagens totais de todos os genes no conjunto de códigos. 2. Use um ou poucos genes &#39;limpeza&#39;. 3. Utilização da média geométrica (N ° raiz do produto de N números) de genes altamente expressos. Para um grande conjunto de código (&gt; 100 genes) contendo sondas seleccionadas aleatoriamente, utilizando as contagens totais para a normalização pode ser uma boa escolha, pois as contagens totais de um grande número de genes independentes podem férefletir completamente a quantidade de entrada RNA. Para um pequeno conjunto de códigos (&lt;100 genes) contendo sondas focados em um processo específico (como o crescimento de hifas, dado que os genes de crescimento de hifas tendem a ser co-regulado), a escolha de um ou alguns genes de limpeza como controle para a normalização é essencial. TDH3, um gene metabólico robustamente expressa, tem servido bem como o controle de muitas experiências. O terceiro método é um híbrido de método 1 e 2, com ênfase para a contribuição igual a partir de genes altamente expressos. Embora a plataforma nCounter não está à escala do genoma, que permite a quantificação do nível de expressão para 800 genes de um único ensaio. Portanto, a escolha dos genes mais informativos para analisar é crítico para o sucesso do perfil. Duas abordagens para selecionar para as sondas têm sido utilizados. A primeira abordagem é &quot;baseada no conhecimento&quot;. Informações de expressão publicados e dados funcionais é compilado para a tela para genes que são de interesse potencial para a correnteestudar, tais como os genes de resposta ambientais 6-9. Esta abordagem permite a fácil comparação de perfis de dados in vivo para muitos conjuntos de dados existentes, portanto, fornecendo contexto para interpretação dos dados. A segunda abordagem é &quot;exploração baseado&quot;. Uma categoria de genes no genoma de um microrganismo, tal como todos os genes que especificam os factores de transcrição ou proteínas, cinases de parede celular são escolhidos para sondas. Esta abordagem permite a identificação de novos fatores de virulência e descoberta de relações reguladoras novos com base no perfil de dados in vivo 6.

Dinâmica de expressão gênica detém informações vitais sobre como uma célula responde às mudanças ambientais. No caso de um microorganismo infectante, dados de expressão de genes pode fornecer informações clinicamente relevantes sobre como um agente patogénico se adapta ao ambiente infecção e causa danos ao hospedeiro. Nas últimas duas décadas, estudos de expressão gênica in vitro e in vivo têm gerado grande quantidade de dados e estabeleceu uma base para a compreensão da biologia da infecção 1-3. No entanto, as tecnologias de perfis atuais, incluindo microarray e RNAseq, não são ideais para criação de perfis de expressão gênica do patógeno durante a infecção. Host ARN constitui uma porção esmagadora (normalmente&gt; 99%) do ARN total isolado a partir de amostras de tecido infectado. O ARN do hospedeiro contribui para a elevada interferência de fundo em microarrays, e domina sequência lê a partir RNAseq. Isolamento de células patógeno de tecidos infectados, em teoria, pode ajudar a enriquecer a RNA patógeno, mas coloca dissoproblemas AL: ele requer grandes quantidades de tecido infectado; o procedimento pode ser tedioso; e mais importante ainda, é difícil conservar o estado nativo ou a integridade do RNA durante o processo demorado. De modo a gerar dados mais completos e precisos sobre a expressão gênica do patógeno durante infecções reais, nos propusemos a desenvolver um protocolo que permite a quantificação confiável e rentável de espécies de RNA minoria em uma população mista RNA. NanoString nCounter é uma plataforma recentemente desenvolvido que torna a medição multiplexado directa da expressão do gene utilizando pares de sondas de código de barras digital de 4, 5. Esta plataforma tem um nível de sensibilidade comparável à de qRT-PCR, mas não requer amplificação enzimática. A tecnologia não está à escala do genoma, que permite a detecção de até 800 genes diferentes em cada ensaio. Portanto, é fundamental para selecionar genes informativos como sondas para profiling. Aqui usamos perfil de expressão gênica estudo de uma grande humum patógeno, Candida albicans, durante uma infecção invasiva como um exemplo, para demonstrar: 1) As características técnicas dos procedimentos experimentais (protocolo), 2) A sensibilidade, reprodutibilidade e faixa dinâmica deste método (resultados representativos), e 3) Importante Considerações para a concepção e realização de experimentos baseados neste protocolo (discussão). Este protocolo pode ser facilmente adaptado para vários patogénios e tem sido aplicado com sucesso num número de modelos de infecção de 6-9.

<table><tbody><tr><td>gentleMACS Dissociator</td><td>Miltenyl Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>gentelMACS M tube</td><td>Miltenyl Biotec</td><td>130-093-236</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M-3148</td><td></td></tr><tr><td>Phenol:CHCl&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;:IAA</td><td>Sigma</td><td>P-2069</td><td></td></tr><tr><td>Zirconia beads</td><td>Biospec Products</td><td>11079110zx</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Beadbeater-16</td><td>Biospec Products</td><td>607</td><td></td></tr><tr><td>nCounter Analysis system</td><td>nanoString Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>nCounter Gene Expression Codesets</td><td>nanoString Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>nSolver Analysis tool</td><td>nanoString Technologies</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

gene expression profiling of infecting microbes using a digital bar-coding platform

Para a maioria de agentes patogénicos de mamíferos, a expressão do gene profiling estudos têm sido limitados por dificuldades técnicas de quantificar com precisão a partir de transcritos de genes patógeno tecidos infectados. Hospedeiro ARN constitui uma pequena porção do ARN total isolado a partir de amostras de tecido infectado. Ambos microarray e tecnologias RNAseq tem dificuldades em gerar lê confiável para genes do patógeno fracamente expressas. Estirpes mutantes de patógenos com redução na proliferação vivo representar um desafio ainda maior. Aqui, descrevemos uma expressão in vivo do gene protocolo de perfil que é muito rápido, sensível e extremamente altamente reprodutível. Nós desenvolvemos este protocolo durante a nossa investigação dos fungos Candida albicans patógeno num modelo murino de candidíase hematologicamente disseminada. Usando este protocolo, temos documentado os períodos de C. dinamicamente reguladas expressão gênica albicans durante infecção nos rins, e características inesperadas descobertas derespostas de expressão gênica para tratamento da droga antifúngica in vivo.

Um desafio principal para a expressão do gene profiling patógeno in vivo é conseguir o suficiente lê a partir de RNA patógeno. Dada a baixa percentagem de transcritos de ARN total em organismos patogénicos, grande quantidade de ARN total (&gt; 10 ug) tem de ser utilizado em cada reacção. A plataforma tem uma vantagem única nesta perspectiva: utiliza tanto uma sonda de captura e uma sonda de relatório para aumentar a especificidade, de modo a que a enorme quantidade de ARN do hospedeiro não causa um significativo nível de ruído. Como mostrado na Figura 1 (adaptado a partir de Ref. 6), as contagens de fundo a partir de uma amostra em bruto de tecido não infectado (pontos vermelhos) foram todos inferiores a 10, enquanto que as contagens a partir de matérias duas amostras de tecidos infectados (pontos azuis) foram todos acima 10. Os dados gerados Expressão usando este protocolo são altamente reprodutível. Como mostrado na Figura 1 (adaptado a partir de Ref. 6), as contagens de matérias de duas réplicas biológicas (pontos azuis, 48 hr amostras de rim pós-infecção) tinha viscosidade muitocorrelação d, com valor de R ao quadrado é igual a 0,945. A plataforma também prevê uma gama dinâmica suficiente para abranger os níveis de expressão biológicas naturais (Figura 1, a contagem de matérias variou entre 10 e 10 1 6). Usando um conjunto de sonda especificando 248 genes de resposta ambiental, fomos capazes de discernir duas fases de expressão gênica do patógeno (Figura 2, adaptada de Ref. 6): um gene de expressão resposta precoce compreende genes com níveis de RNA significativamente diferentes entre o inóculo e 12 hr amostras pós-infecção (p &lt;0,05&gt; mudança de 2 vezes na expressão), e uma expressão de resposta de um gene tardio compreende genes com níveis de ARN que são significativamente diferente entre o ponto de tempo de 12 h a amostras de pós-infecção de 48 h (P &lt;0,05 e&gt; mudança na expressão de 2 vezes). Estes resultados indicam que a C. a expressão do gene é regulada albicans dinamicamente durante INFECTIO invasivan de um hospedeiro mamífero. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53460/53460fig1.jpg" /> Figura 1. Raw conta a partir de tecidos renais infectados e não infectados (adaptado de Ref. 6). Probe conta para dois infectado (48 horas pós-infecção, pontos de dados azul) e um não infectados (pontos de dados vermelhos) amostras de rim são apresentados como uma dispersão enredo. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53460/53460fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53460/53460fig2.jpg" /> Figura 2. Expressão de C. albicans genes ambientalmente sensíveis durante a infecção invasiva (adaptado de Ref. 6). As alterações nos níveis de expressão durante a invasão do rim do rato para 248 C. albicans genes são apresentados em um calor mformato ap. Os valores médios de triplicados biológicas são mostrados para up-regulação (amarelo) e sub-regulação (azul) de genes, às 12, 24 e 48 horas após a infecção em relação à média dos níveis de inóculo (0 h). Saturação de cor representa a extensão da mudança de expressão, com saturação completa em 10 vezes para cima ou para baixo-regulação. Partes do mapa de calor são expandidos para ilustrar representante início de up-regulamentados genes (em cima), genes tardios (meio) e genes cedo para baixo-regulado (em baixo). Nestas porções, as amostras individuais são apresentados separadamente para ilustrar a reprodutibilidade. Nós definimos as mudanças de expressão adiantados como diferenças significativas entre o inóculo e 12 amostras h. Nós definimos as mudanças de expressão final como diferenças significativas entre os 12 e 48 amostras h. Significância refere-se a alterações de&gt; 2 vezes e um valor de p &lt;0,05. Os dados para cada amostra foram normalizadas para os níveis de ARN de controlo do gene TDH3 antes de os valores médios foram calculados. Nossos critérios de atribuição permitem que alguns Dynamically genes regulados a cair em ambas as classes de expressão precoce e tardio. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53460/53460fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Gene Expression Profiling of Infecting Microbes Using a Digital Bar-coding Platform

We developed a protocol that is fast, sensitive and reproducible for pathogen gene expression profiling during an infection.

Gene Expression Profiling de micróbios Contaminando utilizando uma plataforma digital de codificação em barra

For most mammalian pathogens, gene expression profiling studies have been limited by technical difficulties to accurately quantify pathogen gene ...

gene-expression-profiling-infecting-microbes-using-digital-bar-coding

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.0K visualizações.  Carnegie Mellon University. We developed a protocol that is fast, sensitive and reproducible for pathogen gene expression profiling during an infection.

Vídeo: Gene Expression Profiling of Infecting Microbes Using a Digital Bar-coding Platform

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in a single reaction. The miRNA assay counts transcripts by directly imaging and digitally counting miRNA molecules that are labeled with color-coded fluorescent barcoded probe sets (a reporter probe and a capture probe). Barcodes are hybridized directly to mature miRNAs that have been elongated by ligating a unique oligonucleotide tag (miRtag) to the 3&#39; end. Reverse transcription and amplification of the transcripts are not required. Reporter probes contain a sequence of six color positions populated using a combination of four fluorescent colors. The four colors over six positions are used to construct a gene-specific color barcode sequence. Post-hybridization processing is automated on a robotic prep station. After hybridization, the excess probes are washed away, and the tripartite structures (capture probe-miRNA-reporter probe) are fixed to a streptavidin-coated slide via the biotin-labeled capture probe. Imaging and barcode counting is done using a digital analyzer. The immobilized barcoded miRNAs are visualized and imaged using a microscope and camera, and the unique barcodes are decoded and counted. Data quality control (QC), normalization, and analysis are facilitated by a custom-designed data processing and analysis software that accompanies the assay software. The assay demonstrates high linearity over a broad range of expression, as well as high sensitivity. Sample and assay preparation does not involve enzymatic reactions, reverse transcription, or amplification; has few steps; and is largely automated, reducing investigator effects and resulting in high consistency and technical reproducibility. Here, we describe the application of this technology to identifying circulating miRNA perturbations in irritable bowel syndrome.

We describe the use of a multiplexed high-throughput gene expression platform that quantitates gene expression by barcoding and counting molecules in biological substrates without the need for amplification. We used the platform to quantitate microRNA (miRNA) expression in whole blood in subjects with and without irritable bowel syndrome.

Perturbações de circulação miRNAs na Síndrome do Cólon Irritável detectada usando um multiplexado de alta capacidade: Plataforma Gene Expression

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

Genética

Multiplex Detection of Bacteria in Complex Clinical and Environmental Samples using Oligonucleotide-coupled Fluorescent Microspheres

Bacterial vaginosis (BV) is a recurring polymicrobial syndrome that is characterized by a change in the "normal" microbiota from Lactobacillus-dominated to a microbiota dominated by a number of bacterial species, including Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, and others1-3. This condition is associated with a range of negative health outcomes, including HIV acquisition4, and it can be difficult to manage clinically5. Furthermore, diagnosis of BV has relied on the use of Gram stains of vaginal swab smears that are scored on various numerical criteria6,7. While this diagnostic is simple, inexpensive, and well suited to resource-limited settings, it can suffer from problems related to subjective interpretations and it does not give a detailed profile of the composition of the vaginal microbiota8. Recent deep sequencing efforts have revealed a rich, diverse vaginal microbiota with clear differences between samples taken from individuals that are diagnosed with BV compared to those individuals that are considered normal9,10, which has resulted in the identification of a number of potential targets for molecular diagnosis of BV11,12. These studies have provided a wealth of useful information, but deep sequencing is not yet practical as a diagnostic method in a clinical setting. We have recently described a method for rapidly profiling the vaginal microbiota in a multiplex format using oligonucleotide-coupled fluorescent beads with detection on a Luminex platform13. This method, like current Gram stain-based methods, is rapid and simple but adds the additional advantage of exploiting molecular knowledge arising from sequencing studies in probe design. This method therefore provides a way to profile the major microorganisms that are present in a vaginal swab that can be used to diagnose BV with high specificity and sensitivity compared to Gram stain while providing additional information on species presence and abundance in a semi-quantitative and rapid manner. This multiplex method is expandable well beyond the range of current quantitative PCR assays for particular organisms, which is currently limited to 5 or 6 different assays in a single sample14. Importantly, the method is not limited to the detection of bacteria in vaginal swabs and can be easily adapted to rapidly profile nearly any microbial community of interest. For example, we have recently begun to apply this methodology to the development of diagnostic tools for use in wastewater treatment plants.

We describe a multiplex method for the detection of microorganisms within a sample using oligonucleotide-coupled fluorescent beads. Amplicon from all organisms within a sample is hybridized to a panel of probe-coupled beads. A Luminex or Bio-Plex instrument is used to query each bead for bead type and hybridization signal.

Detecção de multiplex de bactérias em amostras clínicas e Complexo Ambiental utilizando Oligonucleotídeos-coupled microesferas fluorescentes

Bacterial vaginosis (BV) is a recurring polymicrobial syndrome that is characterized by a change in the "normal" microbiota from Lactobacillus-dominated ...

Imunologia e Infecção

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to perform and its ability to standardize the fitness of many strains to a wild-type organism. The technique is limited, however, by available phenotypic markers and the number of strains that can be assessed simultaneously, creating the need for a great number of replicate experiments. Concurrent with large numbers of experiments, the labor and material costs for quantifying bacteria based on phenotypic markers are not insignificant. To overcome these negative aspects while retaining the positive aspects, we have developed a molecular-based approach to directly quantify microorganisms after engineering genetic markers onto bacterial chromosomes. Unique, 25 base pair DNA barcodes were inserted at an innocuous locus on the chromosome of wild-type and mutant strains of Salmonella. In vitro competition experiments were performed using inocula consisting of pooled strains. Following the competition, the absolute numbers of each strain were quantified using digital PCR and the competitive indices for each strain were calculated from those values. Our data indicate that this approach to quantifying Salmonella is extremely sensitive, accurate, and precise for detecting both highly abundant (high fitness) and rare (low fitness) microorganisms. Additionally, this technique is easily adaptable to nearly any organism with chromosomes capable of modification, as well as to various experimental designs that require absolute quantification of microorganisms.

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

This molecular-based approach for determining bacterial fitness facilitates precise and accurate detection of microorganisms using unique genomic DNA barcodes that are quantified via digital PCR. The protocol describes calculating the competitive index for Salmonella strains; however, the technology is readily adaptable to protocols requiring absolute quantification of any genetically-malleable organism.

Índice competitivo baseado em PCR digital para análise de alta produtividade de aptidão em Salmonella

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to ...

Multiplexed Barcoding Image Analysis for Immunoprofiling and Spatial Mapping Characterization in the Single-Cell Analysis of Paraffin Tissue Samples

Multiplexed imaging technology using antibody barcoding with oligonucleotides, which sequentially detects multiple epitopes in the same tissue section, is an effective methodology for tumor evaluation that improves the understanding of the tumor microenvironment. The visualization of protein expression in formalin-fixed, paraffin-embedded&#160;tissues is achieved when a specific fluorophore is annealed to an antibody-bound barcode via complementary oligonucleotides and then sample imaging is performed; indeed, this method allows for the use of customizable panels of more than 40 antibodies in a single tissue staining reaction. This method is compatible with fresh frozen tissue, formalin-fixed, paraffin-embedded tissue, cultured cells, and peripheral blood mononuclear cells, meaning that researchers can use this technology to view a variety of sample types at single-cell resolution. This method starts with a manual staining and fixing protocol, and all the antibody barcodes are applied using an antibody cocktail. The staining fluidics instrument is fully automated and performs iterative cycles of labeling, imaging, and removing spectrally distinct fluorophores until all the biomarkers have been imaged using a standard fluorescence microscope. The images are then collected and compiled across all the imaging cycles to achieve single-cell resolution for all the markers. The single-step staining and gentle fluorophore removal not only allow for highly multiplexed biomarker analysis but also preserve the sample for additional downstream analysis if desired (e.g., hematoxylin and eosin staining). Furthermore, the image analysis software enables image processing-drift compensation, background subtraction, cell segmentation, and clustering-as well as the visualization and analysis of the images and cell phenotypes for the generation of spatial network maps. In summary, this technology employs a computerized microfluidics system and fluorescence microscope to iteratively hybridize, image, and strip fluorescently labeled DNA probes that are complementary to tissue-bound, oligonucleotide-conjugated antibodies.

Multiplexed barcoding image analysis has recently improved the characterization of the tumor microenvironment, permitting comprehensive studies of cell composition, functional state, and cell-cell interactions. Herein, we describe a staining and imaging protocol using the barcoding of oligonucleotide-conjugated antibodies and cycle imaging, which allows for the use of a high-dimensional image&#160;analysis technique.

Análise de Imagem de Código de Barras Multiplexado para Caracterização de Imunoprofiling e Mapeamento Espacial na Análise Unicelular de Amostras de Parafina

Multiplexed imaging technology using antibody barcoding with oligonucleotides, which sequentially detects multiple epitopes in the same tissue section, is ...

Pesquisa do câncer

Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental biology. It has been successfully used to identify rare cell populations, discover novel marker genes, and decode spatial and temporal developmental information. The single cell method has also evolved from the microfluidic based Fluidigm C1 technology to the droplet-based solutions in the last two to three years. Here we used the heart as an example to demonstrate how to profile the mouse embryonic tissue cells using the droplet based scRNA-Seq method. In addition, we have integrated two strategies into the workflow to profile multiple samples in a single experiment. Using one of the integrated methods, we have simultaneously profiled more than 9,000 cells from eight heart samples. These methods will be valuable to the developmental biology field by providing a cost-effective way to simultaneously profile single cells from different genetic backgrounds, developmental stages, or anatomical locations.

Here we presented a multiplexed single cell mRNA sequencing method to profile gene expression in mouse embryonic tissues. The droplet-based single cell mRNA sequencing (scRNA-Seq) method in combination with multiplexing strategies can profile single cells from multiple samples simultaneously, which significantly reduces reagent costs and minimizes experimental batch effects.

Análise multiplexada do sequenciamento de mRNA celular único de células embrionárias de camundongos

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental ...

Biologia do Desenvolvimento

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of cellular heterogeneity in biological systems. However, single-cell sequencing of large populations has been hampered by limitations in processing genomes for sequencing. In this paper, we describe a method for single-cell genome sequencing (SiC-seq) which uses droplet microfluidics to isolate, amplify, and barcode the genomes of single cells. Cell encapsulation in microgels allows the compartmentalized purification and tagmentation of DNA, while a microfluidic merger efficiently pairs each genome with a unique single-cell oligonucleotide barcode, allowing &gt;50,000 single cells to be sequenced per run. The sequencing data is demultiplexed by barcode, generating groups of reads originating from single cells. As a high-throughput and low-bias method of single-cell sequencing, SiC-seq will enable a broader range of genomic studies targeted at diverse cell populations.

Single-cell sequencing reveals genotypic heterogeneity in biological systems, but current technologies lack the throughput necessary for the deep profiling of community composition and function. Here, we describe a microfluidic workflow for sequencing &gt;50,000 single-cell genomes from diverse cell populations.

Uma plataforma Microfluidic de ultra alta taxa de transferência para o sequenciamento do genoma de célula única

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

Bioengenharia

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

Competitiva Screens Genomic de Bibliotecas Yeast Barcoded

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Biologia

High-Throughput Transcriptome Analysis for Investigating Host-Pathogen Interactions

Pathogens can cause a wide variety of infectious diseases. The biological processes induced by the host in response to infection determine the severity of the disease.&#160;To study such processes, researchers can use high-throughput sequencing techniques (RNA-seq) that measure the dynamic changes of the host transcriptome at different stages of infection, clinical outcomes, or disease severity.This investigation can lead to a better understanding of the diseases, as well as uncovering potential drug targets and treatments. The protocol presented here describes a complete pipeline to analyze RNA-sequencing data from raw reads to functional analysis. The pipeline is divided into five steps: (1) quality control of the data; (2) mapping and annotation of genes; (3) statistical analysis to identify differentially expressed genes and co-expressed genes; (4) determination of the molecular degree of the perturbation of samples; and (5) functional analysis. Step 1 removes technical artifacts that may impact the quality of downstream analyses. In step 2, genes are mapped and annotated according to standard library protocols.&#160;The statistical analysis in step 3 identifies genes that are differentially expressed or co-expressed in infected samples, in comparison with non-infected ones. Sample variability and the presence of potential biological outliers are verified using the molecular degree of perturbation approach in step 4. Finally, the functional analysis in step 5 reveals the pathways associated with the disease phenotype. The presented pipeline aims to support researchers through the RNA-seq data analysis from host-pathogen interaction studies and drive future&#160;in vitro or in vivo experiments, that are essential to understand the molecular mechanism of infections.

The protocol presented here describes a complete pipeline to analyze RNA-sequencing transcriptome data from raw reads to functional analysis, including quality control and preprocessing steps to advanced statistical analytical approaches.

Análise de transcriptome de alto rendimento para investigar interações host-pathogen

Pathogens can cause a wide variety of infectious diseases. The biological processes induced by the host in response to infection determine the severity of ...

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the long-lasting gold standards is to sequence 16S ribosomal RNA (rRNA) gene amplicons generated by domain-level PCR reactions amplifying from genomic DNA. Traditionally, this was performed by cloning and Sanger (capillary electrophoresis) sequencing of PCR amplicons. The advent of next-generation sequencing has tremendously simplified and increased the sequencing depth for 16S rRNA gene sequencing. The introduction of benchtop sequencers now allows small labs to perform their 16S rRNA sequencing in-house in a matter of days. Here, an approach for 16S rRNA gene amplicon sequencing using a benchtop next-generation sequencer is detailed. The environmental DNA is first amplified by PCR using primers that contain sequencing adapters and barcodes. They are then coupled to spherical particles via emulsion PCR. The particles are loaded on a disposable chip and the chip is inserted in the sequencing machine after which the sequencing is performed. The sequences are retrieved in fastq format, filtered and the barcodes are used to establish the sample membership of the reads. The filtered and binned reads are then further analyzed using publically available tools. An example analysis where the reads were classified with a taxonomy-finding algorithm within the software package Mothur is given. The method outlined here is simple, inexpensive and straightforward and should help smaller labs to take advantage from the ongoing genomic revolution.

Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.

O sequenciamento de próxima geração de 16S RNA ribossomal Gene amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery of fluorescent proteins and their genes have enabled the engineering of protein fusions for localization, the analysis of transcriptional activation and translation of proteins of interest, or the general tracking of individual cells and cell populations. The use of fluorescent protein genes in combination with retroviral technology has further allowed the expression of these proteins in mammalian cells in a stable and reliable manner. Shown here is how one can utilize these genes to give cells within a population of cells their own biosignature. As the biosignature is achieved with retroviral technology, cells are barcoded &#180;indefinitely&#180;. As such, they can be individually tracked within a mixture of barcoded cells and utilized in more complex biological applications. The tracking of distinct populations in a mixture of cells is ideal for multiplexed applications such as discovery of drugs against a multitude of targets or the activation profile of different promoters. The protocol describes how to elegantly develop and amplify barcoded mammalian cells with distinct genetic fluorescent markers, and how to use several markers at once or one marker at different intensities. Finally, the protocol describes how the cells can be further utilized in combination with cell-based assays to increase the power of analysis through multiplexing.

Since the discovery of the green fluorescent protein gene, fluorescent proteins have impacted molecular cell biology. This protocol describes how expression of distinct fluorescent proteins through genetic engineering is used for barcoding individual cells. The procedure enables tracking distinct populations in a cell mixture, which is ideal for multiplexed applications.

Barcoding Genetic com proteínas fluorescentes para Aplicações Multiplexados

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...