This work was supported by NIH grants CA133402, CA152313 and Department of Energy Office of Science DE-SC0001271. We thank the University of California Davis Flow Cytometry Shared Resource Laboratory with funding from the NCI P30 CA0933730, and NIH NCRR C06-RR12088, S10 RR12964 and S10 RR 026825 grants and with technical assistance from Ms. Bridget McLaughlin and Mr. Jonathan Van Dyke for their help with the flow cytometry experiments.

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The authors declare that they have no competing financial interests.

다른 세포 내 소기관으로 향하는 단백질 마찬가지로 미토콘드리아 표적 단백질은 정교한 단백질 전좌 접지기 (21, 22)의 도움 소기관에 직접 일차 또는 이차 구조 내의 표적 신호를 갖는다. 이러한 COX8 같은 독점적으로 미토콘드리아 상주 단백질에서 얻은 시퀀스 (MTS)을 대상으로 미토콘드리아는 미토콘드리아 11,23,24에 특정 단백질을 대상으로하는 유전자 서열의 N 말단에 추가 할 수 있습니다. 여기에, CyclinB1과는 Cdk1 유전자 벡터를 포함 COX8의 MTS에 표현에 복제하고, 재조합 CyclinB1과는 Cdk1는 미토콘드리아로 현지화되었다. 이 방법의 장점은 전체 유전자의 발현을 변경하지 않고,이 경우 미토콘드리아에, 특정 서브 - 세포 구획에서 유전자 발현의 변형을 가능하게한다는 것이다. 이 전략으로, 미토콘드리아 특정 핵 키나제의 기능은는 Cdk1는 해제되었다termined. 마찬가지로 우성 네가티브는 Cdk1에 MTS를 추가하여, 아래는 Cdk1의 미토콘드리아 특정 기능 노크 미토콘드리아는 Cdk1 특정 대상의 식별을 허용하고는 Cdk1 기능 미토콘드리아 부재 기능적 결과의 분석을 가능하게하는, 달성 하였다. 따라서 미토콘드리아 및 핵 모두는 Cdk1의 강화 된 표현의 MTS 태그 결과를하지 않고는 Cdk1의 과발현, 그리고는 Cdk1의 미토콘드리아 특정 행동의 결과의 추가 조사를 복잡하게한다. 우리는 MTS 태그의 첨가를 통하여 미토콘드리아에 약간의 키나제 색에 몇 시도 실패를 경험하지만,이 방법은 모든 유전자 산물에 적합하지 않을 수있다. 일부 세포주에 형질 매우 저항성 일 수 있고, 최적의 프로토콜을 찾는 것은 시간 소모적 일 수있다. 세포가 건강하고, 형질 전환 형광 태그 단백질과 협력, 성공적인 경우에도 몇 가지 문제 SUC 전시집계, 잘못된 현지화, 비 기능 융합, 약한 신호와 같은 시간. 미토콘드리아와 mitoplasts의 분리의 주요 제한은 다른 세포 또는 하위 미토콘드리아 구획의 낮은 수율 및 오염 가능성을 포함한다. 이 부착 세포가 어려운 접착 세포 배양에서 미토콘드리아 높은 수량을 얻을 수있다, 따라서, 종래의 화학적 또는 기계적 방법에 의해 효율적으로 파열되지 않는 것을 제안한다. 여기, 우리는 MCF10A 세포의 부착 문화를 활용. 수득 약 30 - 50 μg의 미토콘드리아 단백질, (3)의 출발 량 - 5 X 107 세포를 사용 하였다. 균질화 단계는 미토콘드리아 준비의 최종 수율에 대한 또 다른 중요한 포인트입니다. 사용되는 세포주에 따라 스트로크 및 / 또는 균질화 시간의 수는 달라질 수있다. MCF10A 세포, 우리는 유리 / 유리 호모 게 나이저에 의해 균질의 10 분간이 필요한 것으로 관찰하면서 마우스 배아 fibrobla균질화의 5 분 - STS (MEF)는 만 3 필요합니다. 과도한 균질화가 미토콘드리아 막에 손상을 줄 수 있으며 미토콘드리아 성분의 방출을 유발할 수 있기 때문에, 각각의 세포주에 대한 표준 조건은 경험에 의해 결정되어야한다. 유리 - 유리 균질화 기의 사용은 유리 / 테플론 균질 비교 미토콘드리아 제제의 수율을 증가시킨다. 시작 세포의 양뿐만 아니라 세포의 동결 / 해동 오픈 세포를 파괴하는 데 필요한 스트로크의 수를 변경할 수 있습니다. 마지막으로, 단백질의 변성과 응집 인해 균질화 동안 샘플의 국부 가열에 발생할 수있다. 그것은 조직 분쇄기를 미리 진정이 절차를 수행하는 동안 얼음에 샘플을 유지에 따라서 필수적이다. 이 문서에서 제시하는 다른 방법은 실시간으로 세포주기를 모니터링 듀 라벨의 사용이다. EDU는 형광 밝은, 광 안정성 알렉사 플 루어 염료로 표지 된 수정 티미 딘 아날로그입니다. EDU는 effi입니다ciently 새로 합성 된 DNA에 통합. 이 방법은 뉴 클레오 시드 유사체, 브로 모데 옥시 우리 딘 (BrdU의)으로 세포 증식의 전통적인 표지의 사용에 더 나은 대안이다. BrdU의 활성 DNA 합성 동안 DNA에 포함된다. BrdU의 표지 DNA의 정량은 BrdU의 항체 결합에 대한 BrdU의 분자를 노출하는 높은 열 또는 높은 산도 상대적으로 가혹한 방법으로 DNA 변성이 필요합니다. DNA 변성의 가혹 샘플의 품질에 영향을주는 시간이 걸리고있다. 듀으로 세제 permeabilization는 DNA에 액세스하는 듀 검출 시약 일반적으로 충분하다. DNA 액세스 가혹한 화학 또는 열을 사용하지 않고도, 듀있어서 사용하기 쉽고보다 정확하게 일치한다. 그렇다 EDU 제공 이점에서 증식 공부 듀의 사용과 관련된 몇 가지 문제가 있었다. 듀 negl로 감소 될 수 72 시간 이상의 치료에서 약간의 항 증식 활성을 보였다igible 레벨 듀 펄스는 1 시간 25 ℃로 유지했을 때. 에듀 라벨로 사용 하나 수정은 고정 시간과 방법이다. 이 키트는 제공하는 고정 솔루션으로 15 분 고정을 제안했다. 그러나, 70 % 에탄올로 추가 고정은이 실험에 이용 하였다. 셀마다 2 시간을 수집하고, 시간 점 실험을 수행 하였다 1) 시간에 따른 세포주기 진행을 따르는 에탄올의 이용에는 두 가지 이유가있다. 세포 실험 시점이 모두 완료 될 때까지 4 O C에서 70 % 에탄올에 보관 하였다. 필요하다면, 실제로 세포 (개월 몇 주) 이상 70 % 에탄올로 유지 될 수있다. 2) 실험에 사용 된 세포는 안정적 GFP-태그는 Cdk1 및 / 또는 RFP-태그 CyclinB1로 형질 감염시켰다. GFP / RFP 형광로부터 EDU와 PI 신호를 분리하기 위해, 에탄올 고정는 GFP 및 RFP 단백질 변성, 따라서 듀를 수행하기 전에 자신의 형광을 소멸하기 위해 이용 된D PI 염색. 변성 GFP / RFP 단백질 본질적 완전히 비 - 형광 발색단 (26, 27)이 더 이상 담금질로부터 보호 아마도 때문이다. 미토콘드리아는 Cdk1의 타겟을 식별하기 위해 다양한 방식으로 기존의 2 차원 겔에 우수한 2D-DIGE 방법을 사용 하였다. 예를 들면, 2D-DIGE 뚜렷한 형광 염료, 사이클 3, 5, 2에서는, 한 겔 3 샘플까지 실행 표준 2D 겔처럼 복제를 실행할 필요없이 변동을 감소 허용 라벨 샘플로 사용된다. 2D-DIGE에 사용되는 형광 염료는 높은 자리 해상도와 함께, 2D-DIGE 겔 실행 단백질의 적은 양이 필요 따라서 100 NG / 자리에서 트리 페닐 메탄 염료에 비해 0.2 NG / 스팟의 매우 높은 감도를 가지고 출판 품질 겔 검색합니다. 자동화 된 소프트웨어가 감지 정량화 및 차등 발현 된 단백질을 정의하는 데 사용됩니다. 때문에 높은 자리 해상도, 샘플의 단백질 발현을 차등 캘리포니아n은 소프트웨어를 이용한 현장 정량을 사용하여 정확하게 비교; 10 %의 낮은 차이가 쉽게 번역 후 변형의 시각화를 가능하게 2D-DIGE 통해 검출 될 수있다. 의 사용 - 겔 분석은 또한 데이터의 빠른 수집을 가능하게 소프트웨어를 주었. 그러나, 장비 있기 때문에, 형광 스캐너로, 이미지 수집에 필요한이 방법의 사용은 추가 비용을 포함한다. 2D-DIGE의 다른 제한은 극단적 인 등전점 큰 분자량 28, 29와 가난한 소수성 단백질의 표현뿐만 아니라 단백질을 포함한다. 이러한 면역 세포 화학 또는 웨스턴 블롯과 같은 대체 기술을 사용하여 2 차원 DIGE 얻어진 결과의 추가 확인은 신규 발견을 확인하기 위해 필요하다.

포유 동물에서 세포주기의 진행은 cyclins과 cyclin-dependent kinases (Cdks) 1에 의해 제어 높은 순서 이벤트에 따라 달라집니다. 그 세포질, 핵 및 centrosomal 지역화를 통해 CyclinB1 /는 Cdk1는 핵 봉투 고장 및 중심체 분리 2와 유사 분열에서 다양한 이벤트를 동기화 할 수 있습니다. CyclinB1 /는 Cdk1는 세포 사멸 (3)에 대해 유사 분열 세포를 보호하고 미토콘드리아 분열, 새로 형성된 딸 세포 4 미토콘드리아의 평등 한 분배를위한 중요한 단계를 촉진한다. 포유류 세포 증식에​​서 미토콘드리아 ATP 5 멀티 소단위 복합체로 구성되어 산화 적 인산화 (OXPHOS) 기계 (전자 전달계)를 통해 생성된다; 복잡한 I - 복잡한 V (CI-CV). 니코틴 아미드 아데닌 디 뉴클레오티드 (NADH) : 유비 퀴논 산화 환원 효소 복잡한 I (CI)는 다섯 단지 (5)의 이해 최대 규모 이상이다. 복잡한 C45 서브 유닛의 14 onsists는 촉매 코어를 형성한다. 일단 복합 한 팔이 매트릭스 내부의 막에 매립 -6,7- 다른 아암에 돌출하여 L 자형 구조를 가정 조립. CI 단위체의 돌연변이는 미토콘드리아 장애 8의 다양한 원인이다. OXPHOS에서 기능적으로 효율적 CI는 전체 미토콘드리아 호흡 9, 또한 성공적인 세포주기 진행 10뿐만 아니라 필요합니다. 건강과 질병이 막 결합 효소 복합체의 기능을 기본 메커니즘을 해결했습니다 것은 소설 진단 절차 및 고급 치료 전략의 개발을 가능하게 할 수있다. 최근 연구에서는 CyclinB1 /는 Cdk1 착체 셀 중 셀 증가 에너지 요구를 상쇄하기 위해 GAP (2) G2 / (유사 분열) M 단계에서 미토콘드리아에 전위 시키며 잠재적으로, 미토콘드리아의 에너지 생산을 향상 CI 소단위 인산화 것을 발견 사이클 11. 여기에서 우리는 쇼실험 절차와 달리 핵 / 세포질 키나제의 미토콘드리아 전위을 연구하는데 사용될 수있는 전략들은 미토콘드리아 기질뿐만 아니라 예를 들어 CyclinB1 /는 Cdk1을 사용하여 미토콘드리아 지역화 기능적 결과 wcase. 필요한 미토콘드리아 고유의 과발현이 단지의 최저의 연구를 묻는 메시지가 나타나면 CyclinB1 /는 Cdk1 단지가 미토콘드리아로으로 전위 것을 발견. 단백질의 미토콘드리아 - 특이 적 발현을 달성하기 위하여, 하나는 관심있는 단백질의 N 말단에 미토콘드리아 타겟팅 서열 (MTS)을 추가 할 수있다. 시퀀스를 대상으로 미토콘드리아는 일반적으로 12있는 미토콘드리아에 미토콘드리아 단백질의 정렬을 할 수 있습니다. 우리는 CyclinB1 또는 적색 형광을 -tagged 인간 시토크롬 C 산화 효소 서브 유닛 8A (COX8)의 전구체에서 파생 된 87베이스 미토콘드리아 대상 시퀀스를 사용하여 녹색 형광 단백질 (GFP)로 그것을 복제 한단백질 (RFP)는는 Cdk1 프레임에 플라스미드를 포함 -tagged. 이 방법은 특히 핵 풀에 영향을주지 않고 이들 단백질의 미토콘드리아 표현을 변경, 우리가 미토콘드리아에 CyclinB1과는 Cdk1를 대상으로 할 수있었습니다. 형광이 단백질에 태그를 추가함으로써, 우리는 실시간으로 자신의 위치 파악을 모니터링 할 수 있었다. 마찬가지로, 우리는 우리가 구체적으로는 Cdk1의 미토콘드리아 표현과 기능을 노크 할 수 RFP 태그가 지배적 인 부정적인는 Cdk1 포함하는 플라스미드로 MTS를 도입했습니다. 는 Cdk1 같은 듀얼 현지화를 키나제의 미토콘드리아 및 핵 기능을 구별하는 것이 필수적이다. 이러한 이중 기능성 키나제의 N 말단에 MTS 공학이 사용될 쉽고 효과적인 다양한 전략을 제공한다. 는 Cdk1은 세포주기 키나제이므로,는 Cdk1은 미토콘드리아에 국소 때 세포주기 진행을 결정하는 기본이다. 이를 위해, 우리는 새로운 운전 방식을 이용했다D는 세포의 DNA 함량을 모니터한다. 전통적인 방법은 티미 딘으로 대체하는 세포주기의 S 단계에서 새로 합성 된 DNA 내로 통합 BrdU (브로 모데 옥시 우리 딘), 티미 딘의 합성 유사체를 포함하여. 이어서 적극적으로 DNA를 복제 세포는 항 BrdU의 항체를 이용하여 검출 될 수있다. 이 방법의 하나의 단점은, 결과 (13, 14) 사이의 불일치가 발생할 수 산 또는 열처리 등 열악한 방법에 의해 BrdU의 항체에 대한 액세스를 제공하는 DNA의 변성이 필요하다는 것이다. 대안 적으로, 우리는 다른 티미 딘 유사체, 듀와 적극적 분할 셀을 모니터링하는 유사한 방법을 이용했다. 중성 세제를 처리 새로 합성 된 DNA에 EDU에 액세스 할 수있는 검출 시약을 가능으로 에듀 검출 거친 DNA 변성을 필요로하지 않습니다. 듀 방법보다 신뢰성 일관된 높은 처리량 분석 15 가능성이 입증되었다. 마지막으로, tO는 Cdk1의 미토콘드리아 기질을 결정, 우리는 고전 이차원 전기 영동의 향상된 버전 2D-DIGE라는 프로테오믹스 도구를 사용했다. 두 차원 전기 영동은 두 번째의 첫 번째 차원과 분자량에서의 등전점에 따라 단백질을 분리한다. 이러한 인산화와 같은 번역 후 변형은 단백질의 등전점과 분자량을 결정하므로, 2D 겔 상이한 샘플 내 단백질의 인산화 상태의 차이를 검출 할 수있다. 단백질의 크기 (면적 강도)는 다수의 샘플들 사이의 양적 비교를 허용하는 단백질의 발현 수준의 변화 스폿. 이 방법을 사용하여, 우리는 돌연변이 미토콘드리아 타겟팅는 Cdk1 발현 세포에 비해 야생형에서 인산화 단백질을 구별 할 수 있었다. 야생형에 보여하지만 미토콘드리아 타겟 돌연변이는 Cdk1 준비에 누락 된 특정 단백질 관광 명소 격리하고,질량 분석을 통해 확인 하였다. 전통적인 2D 젤에서 트리 페닐 메탄 염료 겔 단백질을 가시화하기 위해 사용된다. 2D-DIGE 단백질 전기 영동 이동성에 최소한의 효과 형광 단백질 라벨을 사용합니다. 다른 단백질 시료는 다른 형광 염료를 함께 혼합 한 겔 (16)상의 복수의 샘플 공동 전기 있도록, 동일한 겔에 의해 분리로 표지 될 수있다. 이 겔 기반 프로테오믹스 연구에서 중요한 문제이다 겔을 겔 변형을 최소화한다.

<table><tbody><tr><td>&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P ATP&amp;nbsp;</td><td>PerkinElmer</td><td>BLU002001MC&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse secondary antibody</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>A-11003</td><td>Alexa-546 conjugated</td></tr><tr><td>Anti-rabbit secondary antibody</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>A11029</td><td>Alexa-488 conjugated</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Research Organics</td><td>1166A</td><td>For in vitro kinase assay</td></tr><tr><td>Cdk1 antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9112</td><td></td></tr><tr><td>Cdk1 kinase buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>P6020S</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit</td><td>Life Technologies</td><td>C10337</td><td>For cell cycle analysis with EdU labeling</td></tr><tr><td>COX IV antibody</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>4844S</td><td>For mitochondrial immunostaining</td></tr><tr><td>Cyclin B1 antibody</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-752</td><td></td></tr><tr><td>CyclinB1/Cdk1 enzyme complex</td><td>New England Biolabs</td><td>P6020S</td><td>Avoid freeze/thaw</td></tr><tr><td>CyDye DIGE Fluor Labeling Kit</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>25-8009-83</td><td></td></tr><tr><td>DIGE Gel and DIGE Buffer Kit</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-9480-26 AA</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylformamide&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>319937</td><td>DMF</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0611</td><td>DTT</td></tr><tr><td>dNTP</td><td>EMD Millipore</td><td>71004</td><td>For site-directed mutagenesis</td></tr><tr><td>Dpn I enzyme</td><td>Stratagene</td><td>200519-53</td><td>For site-directed mutagenesis</td></tr><tr><td>Dry Strip cover fluid</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-1335-01</td><td>Used as mineral oil</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>J.T. Baker</td><td>4040-03</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Acros Organics</td><td>409910250</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Vacufuge Concentrator</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-748-13</td><td>Used as vacuum centrifuge concentrator</td></tr><tr><td>Fluoromount G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td>Anti-fade mounting solution</td></tr><tr><td>Fortessa Flow Cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td>649908</td><td>For cell cycle analysis with EdU labeling</td></tr><tr><td>Histone H1</td><td>Calbiochem</td><td>382150</td><td>For in vitro kinase assay</td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>For purifying DNA fragments from agarose gels</td></tr><tr><td>Immobiline DryStrip Gels</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>18-1016-61</td><td>IEF (isoelectric focusing) strips</td></tr><tr><td>Immobilized Glutathione</td><td>Thermo Scientific</td><td>15160</td><td>Glutathione-agarose beads</td></tr><tr><td>Iodoacetamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I1149</td><td>IAA</td></tr><tr><td>IPGphor 3 Isoelectric Focusing Unit</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>11-0033-64</td><td>IPGphor strip holders</td></tr><tr><td>Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside&amp;nbsp;</td><td>RPI Corp</td><td>156000-5.0</td><td>IPTG</td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L9783</td><td>For cell lysis buffer</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668027</td><td>Transfection reagent</td></tr><tr><td>Lysine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L5501</td><td>For CyDye labeling</td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>EMD Chemicals</td><td>5960</td><td></td></tr><tr><td>Mitoctracker Red/Green</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>M7512/M7514</td><td>Mitochondrial fluorescent dyes</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>EMD Chemicals</td><td>6310</td><td></td></tr><tr><td>pEGFP-N1</td><td>Clonetech</td><td>6085-1</td><td>GFP-expressing vector</td></tr><tr><td>Pfu</td><td>Stratagene</td><td>600-255-52</td><td></td></tr><tr><td>pGEX-5X-1&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-9545-53</td><td>GST-expressing vector</td></tr><tr><td>Phenylmethylsulfonyl fluoride</td><td>Shelton Scientific</td><td>IB01090</td><td>PMSF</td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Life Technologies</td><td>14040</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Spectra/Por 4 dialysis tubing</td><td>Spectrum Labs</td><td>132700</td><td>as porous membrane tubing for dialysis</td></tr><tr><td>Pro-Q Diamond Phosphoprotein Gel Stain</td><td>Life Technologies</td><td>P-33300</td><td>For staining phosphoproteins on 2D gels</td></tr><tr><td>Proteinase inhibitor cocktail</td><td>Calbiochem</td><td>539134</td><td>For cell lysis buffer</td></tr><tr><td>QuikChange site-directed mutagenesis kit</td><td>Stratagene</td><td>200519-5</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>MiniPrep Plasmid Isolation Kit</td></tr><tr><td>RO-3306</td><td>Alexis Biochemicals</td><td>270-463-M001</td><td>Cdk1 inhibitor</td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>MP Biomedicals</td><td>150154</td><td>Complex I inhibitor</td></tr><tr><td>Sodium carbonate</td><td>Fisher Scientific</td><td>S93359</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>EMD Chemicals</td><td>SX0420-5</td><td>For cell lysis buffer</td></tr><tr><td>Sodium orthovanadate</td><td>MP Biomedicals</td><td>159664</td><td>For cell lysis buffer</td></tr><tr><td>Sodium pyrophosphate decahydrate</td><td>Alfa Aesar</td><td>33385</td><td>For cell lysis buffer</td></tr><tr><td>Sodium &amp;beta;-glycerophosphate</td><td>Alfa Aesar</td><td>L03425</td><td>For cell lysis buffer</td></tr><tr><td>SpectraMax M2e&amp;nbsp;</td><td>Molecular Devices</td><td>M2E</td><td>Microplate reader</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Grinder pestle</td><td>Kimble Chase</td><td>885301-0007</td><td>For mitochondria isolation</td></tr><tr><td>Tissue Grinder tube</td><td>Kimble Chase</td><td>885303-0007</td><td>For mitochondria isolation</td></tr><tr><td>Trichloroacetic acid solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T0699</td><td>TCA</td></tr><tr><td>Tris</td><td>MP Biomedicals</td><td>103133</td><td></td></tr><tr><td>Triton-x-100</td><td>Teknova</td><td>T1105</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Calbiochem</td><td>650211</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon Imager</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-9558-09</td><td>Laser gel scanner fro 2D-DIGE</td></tr><tr><td>Ubiquinone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7956</td><td></td></tr></tbody></table>

experimental approaches to study mitochondrial localization and function of a nuclear cell cycle kinase, cdk1

Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The nuclear-encoded proteins are transported into mitochondria guided by their mitochondria targeting sequences (MTS); however, a majority of mitochondrial localized proteins lack an identifiable MTS. Nevertheless, the fact that MTS can instruct proteins to go into the mitochondria provides a valuable tool for studying mitochondrial functions of normally nuclear and/or cytoplasmic proteins. We have recently identified the cell cycle kinase CyclinB1/Cdk1 complex in the mitochondria. To specifically study the mitochondrial functions of this complex, mitochondrial overexpression and knock-down of this complex without interfering with its nuclear or cytoplasmic functions were essential. By tagging CyclinB1/Cdk1 with MTS, we were able to achieve mitochondrial overexpression of this complex to study its mitochondrial targets as well as functions. Via tagging dominant-negative Cdk1 with MTS, inhibition of Cdk1 activity was accomplished particularly in the mitochondria. Potential mitochondrial targets of CyclinB1/Cdk1 complex were identified using a gel-based proteomics approach. Unlike traditional 2D gel analysis, we employed 2-dimensional difference gel electrophoresis (2D-DIGE) technology followed by phosphoprotein staining to fluorescently label differentially phosphorylated proteins in mitochondrial Cdk1 expressing cells. Identification of phosphoprotein spots that were altered in wild type versus dominant negative Cdk1 bearing mitochondria revealed the identity of mitochondrial targets of Cdk1. Finally, to determine the effect of CyclinB1/Cdk1 mitochondrial localization in cell cycle progression, a cell proliferation assay using a synthetic thymidine analogue EdU (5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine) was used to monitor the cells as they go through the cell cycle and replicate their DNA. Altogether, we demonstrated a variety of approaches available to study mitochondrial localization and activity of a cell cycle kinase. These are advanced, yet easy to follow methods that will be beneficial to many cell biology researchers.

CyclinB1과는 Cdk1의 하위 미토콘드리아 현지화 탄산나트륨 추출 단백질이 미토콘드리아의 내부 또는 외부 표면, 즉, 외막에 위치하는지 여부를 결정하는데 사용된다. 단백질이 미토콘드리아 안에 지역화 도시되면 서브 미토콘드리아 지역화 상기 판정 프로테아제 소화 결합 mitoplasting 통해 이루어질 수있다. CyclinB1 또는는 Cdk1의 서브 미토콘드리아 현지화를 지정하려면 mitoplasts 25 밀리미터에 200 밀리미터의 삼투압 자당의 농도를 감소와 저장성 버퍼의 미토콘드리아를 희석하여 분리 하였다. 내막은 자당의 25 mM의 (그림 1A)의 최종 농도가 될 때까지 그대로 유지하면서 외막은 자당 150 밀리미터에서 파열하기 시작합니다. mitoplasting와 조합 프로테아제 보호 tryps 분석법을 사용하여 수행 될 수있다의 외부 막 파열 다음 노출 된 단백질을 소화한다. 이 막간 공간 단백질의 소화가 발생합니다. 관심의 단백질을 트립신 소화로부터 보호되는 경우,이 단백질의 미토콘드리아 매트릭스 현지화를 나타낸다. 이 도면에서 대표적인 미토콘드리아 매트릭스 단백질 Hsp60에 한 막간 공간 단백질 Timm13는 서브 미토콘드리아 파악 마커로서 사용 하였다. Hsp60에와 있지만 Timm13, CyclinB1과는 Cdk1 달리 유사은 자신의 미토콘드리아 매트릭스 현지화 (그림 1B)를 나타내는, 트립신 소화으로부터 보호 하였다. MTS- 및 GFP - 태그 CyclinB1과는 Cdk1 단백질의 미토콘드리아 식 MTS는 C 말단에 GFP 또는 RFP 태그가 CyclinB1는 Cdk1 또는 유전자의 N 말단에서 프레임 클로닝된다. 생성 된 재조합 단백질은 GFP- 또는 RFP-태그 사이 영상 미토콘드리아 타겟이다clinB1 또는는 Cdk1. 생성 본 연구에 사용 된 구문 목록이 도시​​되어있다. 이러한 구조 달성 된 미토콘드리아에서 CyclinB1 및 / 또는는 Cdk1의 과잉 발현, 분리 된 미토콘드리아 분획의 서쪽 블로 팅에 의해 여기에 표시된 (그림 2)를 사용. 2D-DIGE에 의해 결정 CyclinB1 /는 Cdk1의 잠재적 인 미토콘드리아 대상 CDK1은 (P)를 프롤린하는 ATP에서 인산의 이동을 촉진 키나제 가족이 S 또는 T 잔류 물을 배향 세린 / 트레오닌 (S / T)에 속한다. 는 Cdk1 (D146N)의 위치 (146)에 아스파라긴 (N)와 아스 파르 테이트 (D) 잔류 물을 대체하는 점 돌연변이는 지배적 인 부정 (DN)는 Cdk1 돌연변이 (19)를 생성한다. 미토콘드리아는 Cdk1의 기능을 연구하기 위해 미토콘드리아 타겟팅는 Cdk1-DN 단백질은 플라스미드 구축에 의해 생성 된 (pERFP-N1-MTS-는 Cdk1-DN) 29 아미노산 경도를 포함RFP-태그 DN-는 Cdk1에 연결된 인간 사이토 크롬 C 산화 효소의 보조 유닛 VIII로부터 유도 g의 미토콘드리아 타겟팅 서열 (MTS). 미토콘드리아 타겟팅 ERFP 단백질 생산 pERFP-N1-MTS는 빈 벡터 대조군으로 사용 하였다. G2의 미토콘드리아 phosphoproteins은 / 모두 제물로 형질 M 세포의 pH 4-10 겔 스트립 2D 젤 분석을 프로파일 하였다. 빈 벡터 형질 (그림 3, 상단 패널)에 비해 미토콘드리아 phosphoproteins의 그룹은 분명히 결석 또는는 Cdk1-DN 형질 (그림 3, 낮은 패널) 감소 하였다. 검출 된 스폿의 질량 분석 분석 미토콘드리아는 Cdk1 의해 인산화 단백질의 아이덴티티를 결정. 듀 펄스 체이스 분석과 상 길이의 세포주기 진행과 결정 세포주기 갔지의 진행을 알아보고자N 미토콘드리아 CyclinB1은 /는 Cdk1 수준 증가, 티미 딘 유사체를 사용하여 펄스 - 체이스 표지 실험은,에 티닐 우리 딘 (EDU)은 DNA 합성 (20)을받는 세포 집단 라벨을 수행 하였다. 이 방법은 세포가 S 및 G2 / M 단계를 통해 진행하고 G1 단계에서 축적 할 때 에듀 양성 인구를 추적하여 22 시간 창을 통해 촬영 된 세포주기의 시각화 할 수 있습니다. 결과는 벡터 제어 돌연변이 CyclinB1 / 형질 세포에서 6 시간에 비해 표시된 S 상 세포, G2 / M 단계를 통해 진행하고 야생형 미토콘드리아 CyclinB1 /는 Cdk1를 발현하는 세포에 4 시간만큼 빠르게 G1 단계에서 나타난 보여 CDK1 (도 4a), 미토콘드리아 CyclinB1의 향상을 나타내는 /는 Cdk1 세포주기 진행을 가속화. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53417/53417fig1.jpg" /> 그림 1. 미토콘드리아 CyclinB1 / mitoplasting 및 단백질 분해 효소 보호 분석법에 의해 검출 된 매트릭스. (AB) CyclinB1과는 Cdk1의 하위 미토콘드리아 현지화에는 Cdk1 지역화는 그림은 왕 외. 2014 년 11에서 수정되었습니다. 합계 (T), 펠릿 (P) 및 상청액 (S) 분획을 나타낸 항체 웨스턴 블롯 분석을 실시 하였다. TIMM13 (간 공간 단백질), 및 HSP60 (매트릭스 단백질). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53417/53417fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53417/53417fig2.jpg" /> 미토콘드리아는 Cdk1를 구축 그림 2. 식입니다. 미토콘드리아 타겟 CyclinB1 및 / 또는 야생형 또는 지배적 인 부정적인 돌연변이는 Cdk1로 형질 세포에서 분리 된 미토콘드리아 분획의 웨스턴 블로 팅은 (플라스미드가 표시됩니다<html> 하단 11. 및 pEGFP-N1-MTS와 pERFP-N1-MTS 벡터가 각각 MTS-CyclinB1 및 MTS-는 Cdk1) 빈 벡터 제어했다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53417/53417fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53417/53417fig3.jpg" /> 그림 3.는 Cdk1의 잠재적 인 미토콘드리아 기질. 미토콘드리아 타겟 빈 벡터 (pERFP-N1-MTS, 상단 패널) 또는 돌연변이는 Cdk1 (pERFP-N1-MTS-는 Cdk1-DN로 형질 G2 / M-정점 세포에서 추출한 미토콘드리아 단백질, 하부 패널)의 2-D 겔에 의해 분리하고 인산화 단백질 인 단백질 색소 (적색)로 염색하고, Cy5에 (녹색)로 표지 하였다. 이 수치는 왕 외. 2014 11에서 수정되었습니다.&quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/53417/53417fig4.jpg" /> 그림 4. 미토콘드리아는 Cdk1 강화합니다의 G2 / M 전환 및 전체 사이클 진행. 듀 펄스 추적 라벨과 세포주기 분석. 에듀 표지 세포의 분산 형 플롯 히스토그램은 DNA 함량 (X 축)와 EDU (Y 축)에 대해 그려졌다. 각 패널의 낮은 수치는 EDU의 평균 형광 강도가 핵을 표시 보여줍니다. 시점은 에듀 펄스 (11) 후 시간에 표시했다. 모든 시점 들어, 다음 인구를 표시 게이트 그려진 : G0 / G1, S, 및 G2 / M을. 6, 8, 및 10 시간 시점 들어 EDU-는 G1 *를 S / G2에 * 및 G2 / M *의 인구가 도시되어 표지. 이 수치는 왕 등의 알에서 수정되었습니다. 2014 년 11. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53417/53417fig4large.jpg" target="_blank">를 클릭하십시오</a>여기이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다. <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td colspan="6"> 사용 자당 농도 </td></tr><tr height="43"><td> 어떤 트립신 없습니다 </td><td> 25 mM의 </td><td> 50 mM의 </td><td> 100 밀리미터 </td><td> 150 밀리미터 </td><td> 200 밀리미터 </td></tr><tr height="43"><td> + 트립신 </td><td> 25 mM의 </td><td> 50 mM의 </td><td> 100 밀리미터 </td><td> 150 밀리미터 </td><td> 200 밀리미터 </td></tr></tbody></table> 단계 4.2에 사용되는 표 1. 저압 성 자당 버퍼 <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> 1 단계 </td><td> 30 V </td><td> 12 시간 </td><td> 단계 및 보류 </td></tr><tr><td> 2 단계 </td><td> 300 V </td><td> 0.5 시간 </td><td> 단계 및 보류 </td></tr><tr><td height="21" style="height:21px;"> 3 단계 </td><td> 1000 V </td><td> 0.5 시간 </td><td> 구배 </td></tr><tr><td heigHT = &quot;21&quot;스타일 = &quot;높이 : 21px;&quot;&gt; 4 단계 </td><td> 5000 V </td><td> 1.33 시간 </td><td> 구배 </td></tr><tr><td height="21" style="height:21px;"> 5 단계 </td><td> 5000 V </td><td> 20,000 V의 시간 </td><td> 단계 및 보류 </td></tr></tbody></table> 표 2 등전 프로토콜 단계 6.4.5에 사용

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Experimental Approaches to Study Mitochondrial Localization and Function of a Nuclear Cell Cycle Kinase, Cdk1

Here, we outline how to study mitochondrial localization of a (cell cycle) kinase, and how to determine its sub-mitochondrial location as well as potential mitochondrial substrates/targets. Forced expression of proteins into the mitochondria provides a useful tool for studying the functional consequences of mitochondrial localization of a protein of interest.

실험 접근법은 미토콘드리아 현지화 및 핵 세포주기 키나제,는 Cdk1의 기능을 연구하는

Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The ...

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11.8K 조회수.  University of California, Davis. Here, we outline how to study mitochondrial localization of a (cell cycle) kinase, and how to determine its sub-mitochondrial location as well as potential mitochondrial substrates/targets. Forced expression of proteins into the mitochondria provides a useful tool for studying the functional consequences of mitochondrial localization of a protein of interest. 

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Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; however, the number of identified targets for Cdk1, particularly in human cells is still low. The identification of Cdk1-specific phosphorylation sites is important, as they provide mechanistic insights into how Cdk1 controls the cell cycle. Cell cycle regulation is critical for faithful chromosome segregation, and defects in this complicated process lead to chromosomal aberrations and cancer.
Here, we describe an in vitro kinase assay that is used to identify Cdk1-specific phosphorylation sites. In this assay, a purified protein is phosphorylated in vitro by commercially available human Cdk1/cyclin B. Successful phosphorylation is confirmed by SDS-PAGE, and phosphorylation sites are subsequently identified by mass spectrometry. We also describe purification protocols that yield highly pure and homogeneous protein preparations suitable for the kinase assay, and a binding assay for the functional verification of the identified phosphorylation sites, which probes the interaction between a classical nuclear localization signal (cNLS) and its nuclear transport receptor karyopherin &#945;. To aid with experimental design, we review approaches for the prediction of Cdk1-specific phosphorylation sites from protein sequences. Together these protocols present a very powerful approach that yields Cdk1-specific phosphorylation sites and enables mechanistic studies into how Cdk1 controls the cell cycle. Since this method relies on purified proteins, it can be applied to any model organism and yields reliable results, especially when combined with cell functional studies.

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is activated in the G2 phase of the cell cycle and regulates many cellular pathways. Here, we present a protocol for an in vitro kinase assay with Cdk1, which allows the identification of Cdk1-specific phosphorylation sites for establishing cellular targets of this important kinase.

 종속 키 1의 시험관에서 키에 의해 인 산화 특정 사이트 분석 결과

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

연구

생화학

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

Kinase activity is crucial for a plethora of cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration, and apoptosis. During early embryonic development, kinase activity is highly dynamic and widespread across the embryo. Pharmacological and genetic approaches are commonly used to probe kinase activities. Unfortunately, it is challenging to achieve superior spatial and temporal resolution using these strategies. Furthermore, it is not feasible to control the kinase activity in a reversible fashion in live cells and multicellular organisms. Such a limitation remains a bottleneck for achieving a quantitative understanding of kinase activity during development and differentiation. This work presents an optogenetic strategy that takes advantage of a bicistronic system containing photoactivatable proteins Arabidopsis thaliana cryptochrome 2 (CRY2) and the N-terminal domain of cryptochrome-interacting basic-helix-loop-helix (CIBN). Reversible activation of the mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathway is achieved through light-mediated protein translocation in live cells. This approach can be applied to mammalian cell cultures and live vertebrate embryos. This bicistronic system can be generalized to control the activity of other kinases with similar activation mechanisms and can be applied to other model systems.

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

This protocol describes an optogenetic strategy to modulate mitogen-activated protein kinase (MAPK) activity during cell differentiation and Xenopus embryonic development. This method allows for the reversible activation of the MAPK signaling pathway in mammalian cell culture and in multicellular live organisms, like Xenopus embryos, with high spatial and temporal resolution.

세포 분화 동안 미토 겐 활성 단백질 키나아제 경로의 광 매개 가역적 변조<em&gt; Xenopus</em&gt; 배아 발달

Kinase activity is crucial for a plethora of cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration, and apoptosis. During early ...

발생학

An In Vitro Approach to Study Mitochondrial Dysfunction: A Cybrid Model

Deficiency of the mitochondrial respiratory chain complexes that carry out oxidative phosphorylation (OXPHOS) is the biochemical marker of human mitochondrial disorders. From a genetic point of view, the OXPHOS represents a unique example because it results from the complementation of two distinct genetic systems: nuclear DNA (nDNA) and mitochondrial DNA (mtDNA). Therefore, OXPHOS defects can be due to mutations affecting nuclear and mitochondrial encoded genes.
The groundbreaking work by King and Attardi, published in 1989, showed that human cell lines depleted of mtDNA (named rho0) could be repopulated by exogenous mitochondria to obtain the so-called &#34;transmitochondrial cybrids.&#34; Thanks to these cybrids containing mitochondria derived from patients with mitochondrial disorders (MDs) and nuclei from rho0 cells, it is possible to verify whether a defect is mtDNA- or nDNA-related. These cybrids are also a powerful tool to validate the pathogenicity of a mutation and study its impact at a biochemical level. This paper presents a detailed protocol describing cybrid generation, selection, and characterization.

An In Vitro Approach to Study Mitochondrial Dysfunction: A Cybrid Model

Transmitochondrial cybrids are hybrid cells obtained by fusing mitochondrial DNA (mtDNA)-depleted cells (rho0 cells) with cytoplasts (enucleated cells) derived from patients affected by mitochondrial disorders. They allow the determination of the nuclear or mitochondrial origin of the disease, evaluation of biochemical activity, and confirmation of the pathogenetic role of mtDNA-related variants.

미토콘드리아 기능 장애를 연구하기위한 체외 접근법 : Cybrid 모델

Deficiency of the mitochondrial respiratory chain complexes that carry out oxidative phosphorylation (OXPHOS) is the biochemical marker of human ...

유전학

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A mitochondrial genome of baker&#8217;s yeast encodes eight proteins: three subunits of the cytochrome c oxidase (Cox1p, Cox2p, and Cox3p), three subunits of the ATP synthase (Atp6p, Atp8p, and Atp9p), a subunit of the ubiquinol-cytochrome c oxidoreductase enzyme, cytochrome b (Cytb), and mitochondrial ribosomal protein Var1p. The purpose of the method described here is to specifically label these proteins with 35S methionine, separate them by electrophoresis and visualize the signals as discrete bands on the screen. The procedure involves several steps. First, yeast cells are cultured in a galactose-containing medium until they reach the late logarithmic growth stage. Next, cycloheximide treatment blocks cytoplasmic translation and allows 35S methionine incorporation only in mitochondrial translation products. Then, all proteins are extracted from yeast cells and separated by polyacrylamide gel electrophoresis. Finally, the gel is dried and incubated with the storage phosphor screen. The screen is scanned on a phosphorimager revealing the bands. The method can be applied to compare the biosynthesis rate of a single polypeptide in the mitochondria of a mutant yeast strain versus the wild type, which is useful for studying mitochondrial gene expression defects. This protocol gives valuable information about the translation rate of all yeast mitochondrial mRNAs. However, it requires several controls and additional experiments to make proper conclusions.

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Baker&#8217;s yeast mitochondrial genome encodes eight polypeptides. The goal of the current protocol is to label all of them and subsequently visualize them as separate bands.

베이커효모사카로미세스 세레비시아에 미토콘드리아 게놈 발현 제품의 라벨링 및 시각화

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A ...

Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such probes typically consist of variants of CFP and YFP, intervened by a phosphorylatable sequence and a phospho-binding domain. Upon phosphorylation, the probe changes conformation, which results in a change of the distance or orientation between CFP and YFP, leading to a change in FRET efficiency (Fig 1). Several probes have been published during the last decade, monitoring the activity balance of multiple kinases and phosphatases, including reporters of PKA2, PKB3, PKC4, PKD5, ERK6, JNK7, Cdk18, Aurora B9 and Plk19. Given the modular design, additional probes are likely to emerge in the near future10. 
Progression through the cell cycle is affected by stress signaling pathways 11. Notably, the cell cycle is regulated differently during unperturbed growth compared to when cells are recovering from stress12.Time-lapse imaging of cells through the cell cycle therefore requires particular caution. This becomes a problem particularly when employing ratiometric imaging, since two images with a high signal to noise ratio are required to correctly interpret the results. Ratiometric FRET imaging of cell cycle dependent changes in kinase and phosphatase activities has predominately been restricted to sub-sections of the cell cycle8,9,13,14.
Here, we discuss a method to monitor FRET-based probes using ratiometric imaging throughout the human cell cycle. The method relies on equipment that is available to many researchers in life sciences and does not require expert knowledge of microscopy or image processing.

FRET-based reporters are increasingly used to monitor kinase and phosphatase activities in live cells. Here we describe a method on how to use FRET-based reporters to assess cell cycle-dependent changes in target phosphorylation.

안달 Ratiometric하여 세포주기를 통해 키나제와 인산 가수 분해 효소 활동을 모니터링

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such ...

생물학

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies during chromosome separation are a hallmark of malignancy and associated with progressive disease 2-4. The spindle assembly checkpoint (SAC) is a mitotic surveillance mechanism that holds back cells at metaphase until every single chromosome has established a stable bipolar attachment to the mitotic spindle1. The SAC exerts its function by interference with the activating APC/C subunit Cdc20 to block proteolysis of securin and cyclin B and thus chromosome separation and mitotic exit. Improper attachment of chromosomes prevents silencing of SAC signaling and causes continued inhibition of APC/CCdc20 until the problem is solved to avoid chromosome missegregation, aneuploidy and malignant growths1.
Most studies that addressed the influence of improper chromosomal attachment on APC/C-dependent proteolysis took advantage of spindle disruption using depolymerizing or microtubule-stabilizing drugs to interfere with chromosomal attachment to microtubules. Since interference with microtubule kinetics can affect the transport and localization of critical regulators, these procedures bear a risk of inducing artificial effects 5.
To study how the SAC interferes with APC/C-dependent proteolysis of cyclin B during mitosis in unperturbed cell populations, we established a histone H2-GFP-based system which allowed the simultaneous monitoring of metaphase alignment of mitotic chromosomes and proteolysis of cyclin B 6.
To depict proteolytic profiles, we generated a chimeric cyclin B reporter molecule with a C-terminal SNAP moiety 6 (Figure 1). In a self-labeling reaction, the SNAP-moiety is able to form covalent bonds with alkylguanine-carriers (SNAP substrate) 7,8 (Figure 1). SNAP substrate molecules are readily available and carry a broad spectrum of different fluorochromes. Chimeric cyclin B-SNAP molecules become labeled upon addition of the membrane-permeable SNAP substrate to the growth medium 7 (Figure 1). Following the labeling reaction, the cyclin B-SNAP fluorescence intensity drops in a pulse-chase reaction-like manner and fluorescence intensities reflect levels of cyclin B degradation 6 (Figure 1). Our system facilitates the monitoring of mitotic APC/C-dependent proteolysis in large numbers of cells (or several cell populations) in parallel. Thereby, the system may be a valuable tool to identify agents/small molecules that are able to interfere with proteolytic activity at the metaphase to anaphase transition. Moreover, as synthesis of cyclin B during mitosis has recently been suggested as an important mechanism in fostering a mitotic block in mice and humans by keeping cyclin B expression levels stable 9,10, this system enabled us to analyze cyclin B proteolysis as one element of a balanced equilibrium 6.

Metaphase to anaphase transition is triggered through anaphase-promoting complex (APC/C)-dependent ubiquitination and subsequent destruction of cyclin B. Here, we established a system which, following pulse-chase labeling, allows monitoring cyclin B proteolysis in entire cell populations and facilitates the detection of interference by the mitotic checkpoint.

전체 세포 인구의 단일 셀 수준에서 Cyclin B의 Proteolysis 유학

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC regulates mitochondrial function and cellular energy status. Numerous reports demonstrated that the activation of PKC-a and PKC-&epsilon; improves mitochondrial function in the ischemic heart and mediates cardioprotection. In contrast, we have demonstrated that PKC-&alpha; and PKC-&epsilon; are involved in nephrotoxicant-induced mitochondrial dysfunction and cell death in kidney cells. Therefore, the goal of this study was to develop an in vitro model of renal cells maintaining active mitochondrial functions in which PKC isozymes could be selectively activated or inhibited to determine their role in regulation of oxidative phosphorylation and cell survival. Primary cultures of renal proximal tubular cells (RPTC) were cultured in improved conditions resulting in mitochondrial respiration and activity of mitochondrial enzymes similar to those in RPTC in vivo. Because traditional transfection techniques (Lipofectamine, electroporation) are inefficient in primary cultures and have adverse effects on mitochondrial function, PKC-&epsilon; mutant cDNAs were delivered to RPTC through adenoviral vectors. This approach results in transfection of over 90% cultured RPTC.
Here, we present methods for assessing the role of PKC-&epsilon; in: 1. regulation of mitochondrial morphology and functions associated with ATP synthesis, and 2. survival of RPTC in primary culture. PKC-&epsilon; is activated by overexpressing the constitutively active PKC-&epsilon; mutant. PKC-&epsilon; is inhibited by overexpressing the inactive mutant of PKC-&epsilon;. Mitochondrial function is assessed by examining respiration, integrity of the respiratory chain, activities of respiratory complexes and F0F1-ATPase, ATP production rate, and ATP content. Respiration is assessed in digitonin-permeabilized RPTC as state 3 (maximum respiration in the presence of excess substrates and ADP) and uncoupled respirations. Integrity of the respiratory chain is assessed by measuring activities of all four complexes of the respiratory chain in isolated mitochondria. Capacity of oxidative phosphorylation is evaluated by measuring the mitochondrial membrane potential, ATP production rate, and activity of F0F1-ATPase. Energy status of RPTC is assessed by determining the intracellular ATP content. Mitochondrial morphology in live cells is visualized using MitoTracker Red 580, a fluorescent dye that specifically accumulates in mitochondria, and live monolayers are examined under a fluorescent microscope. RPTC viability is assessed using annexin V/propidium iodide staining followed by flow cytometry to determine apoptosis and oncosis.
These methods allow for a selective activation/inhibition of individual PKC isozymes to assess their role in cellular functions in a variety of physiological and pathological conditions that can be reproduced in in vitro.

The effects of activation of protein kinase C (PKC) isozymes on mitochondrial functions associated with respiration and oxidative phosphorylation and on cell viability are described. The approach adapts adenoviral technique to selectively overexpress PKC isozymes in primary cell culture and a variety of assays to determine mitochondrial functions and energy status of the cell.

신장 세포 Overexpressing 단백질 키나제 C Isozymes에 Mitochondrial 기능 및 세포 생존 능력의 평가

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC ...

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Fluorescence microscopy is an indispensable tool for the direct assessment of mitochondrial structure and function in live cells and for studying the mitochondrial structure-function relationship, which is primarily modulated by the molecules governing fission and fusion events between mitochondria. This paper describes and demonstrates specific methods for studying mitochondrial structure and function in live as well as in fixed tissue in the model organism Drosophila melanogaster. The tissue of choice here is the Drosophila ovary, which can be isolated and made amenable for ex vivo live confocal microscopy. Furthermore, the paper describes how to genetically manipulate the mitochondrial fission protein, Drp1, in Drosophila ovaries to study the involvement of Drp1-driven mitochondrial fission in modulating the mitochondrial structure-function relationship. The broad use of such methods is demonstrated in already-published as well as in novel data. The described methods can be further extended towards understanding the direct impact of nutrients and/or growth factors on the mitochondrial properties ex vivo. Given that mitochondrial dysregulation underlies the etiology of various diseases, the described innovative methods developed in a genetically tractable model organism, Drosophila, are anticipated to contribute significantly to the understanding of the mechanistic details of the mitochondrial structure-function relationship and to the development of mitochondria-directed therapeutic strategies.

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Specific methods for studying mitochondrial structure and function in live and fixed Drosophila ovaries are described and demonstrated in this paper.

에서 미토콘드리아의 구조와 기능을 연구<em&gt; 초파리</em&gt; 난소

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial ...

Combining Mitotic Cell Synchronization and High Resolution Confocal Microscopy to Study the Role of Multifunctional Cell Cycle Proteins During Mitosis

Study of the various regulatory events of the cell cycle in a phase-dependent manner provides a clear understanding about cell growth and division. The synchronization of cell populations at specific stages of the cell cycle has been found to be very useful in such experimental endeavors. Synchronization of cells by treatment with chemicals that are relatively less toxic can be advantageous over the use of pharmacological inhibitory drugs for the study of consequent cell cycle events and to obtain specific enrichment of selected mitotic stages. Here, we describe the protocol for synchronizing human cells at different stages of the cell cycle, including both in S phase and M phase with a double thymidine block and release procedure for studying the functionality of mitotic proteins in chromosome alignment and segregation. This protocol has been extremely useful for studying the mitotic roles of multifunctional proteins which possess established interphase functions. In our case, the mitotic role of Cdt1, a protein critical for replication origin licensing in G1 phase, can be studied effectively only when G2/M-specific Cdt1 can be depleted. We describe the detailed protocol for depletion of G2/M-specific Cdt1 using double thymidine synchronization. We also explain the protocol of cell fixation, and live cell imaging using high resolution confocal microscopy after thymidine release. The method is also useful for analyzing the function of mitotic proteins under both physiological and perturbed conditions such as for Hec1, a component of the Ndc80 complex, as it enables one to obtain large sample sizes of mitotic cells for fixed and live cell analysis as we show here.&#160;&#160;

We present a protocol for double thymidine synchronization of HeLa cells followed by analysis using high resolution confocal microscopy. This method is key to obtaining large number of cells that proceed synchronously from S phase to mitosis, enabling studies on mitotic roles of multifunctional proteins which also possess interphase functions.

유사 분열 동안 다기능 세포 주기 단백질의 역할을 연구 하기 Mitotic 세포 동기화와 고해상도 Confocal 현미경 검사 법

Study of the various regulatory events of the cell cycle in a phase-dependent manner provides a clear understanding about cell growth and division. The ...

Live Cell Imaging to Assess the Dynamics of Metaphase Timing and Cell Fate Following Mitotic Spindle Perturbations

Live cell time-lapse imaging is an important tool in cell biology that provides insight into cellular processes that might otherwise be overlooked, misunderstood, or misinterpreted by the fixed-cell analysis. While the fixed cell imaging and analysis is robust and sufficient to observe cellular steady-state, it can be limited in defining a temporal order of events at the cellular level and is ill-equipped to assess the transient nature of dynamic processes including mitotic progression. In contrast, live cell imaging is an eloquent tool that can be used to observe cellular processes at the single-cell level over time and has the capacity to capture the dynamics of processes that would otherwise be poorly represented in fixed cell imaging. Here we describe an approach to generate cells carrying fluorescently labeled markers of chromatin and microtubules and their use in live cell imaging approaches to monitor metaphase chromosome alignment and mitotic exit. We describe imaging-based techniques to assess the dynamics of spindle formation and mitotic progression, including the identification of cells at various stages in mitosis, identification&#160;and tracking of mitotic defects, and analysis of spindle dynamics and mitotic cell fate following the treatment with mitotic inhibitors.

Here we present a protocol to assess the dynamics of spindle formation and mitotic progression. Our application of time-lapse imaging enables the user to identify cells at various stages of mitosis, track and identify mitotic defects, and analyze spindle dynamics and mitotic cell fate upon exposure to anti-mitotic drugs.

미토틱 스핀들 교란에 따른 메타페이즈 타이밍 및 세포 운명의 역학을 평가하기 위한 라이브 셀 이미징

Live cell time-lapse imaging is an important tool in cell biology that provides insight into cellular processes that might otherwise be overlooked, ...

실험 접근법은 미토콘드리아 현지화 및 핵 세포주기 키나제,는 Cdk1의 기능을 연구하는

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