SN 및 MDD는 NIH K08 NS083740과 신경의 UCLA 부서의 지원을 받았다. AJG는 박사 미리 암과 셀던 아델슨 G. 의학 연구 재단과 래리 L. Hillblom 재단의 지원을 인정합니다. KLN은 기꺼이 미국 심장 협회 14BFSC17760005 ASA-Bugher 뇌졸중 센터에서 지원을 인정합니다. ILL, EGS와 STC는 NIH R01 NS071481에 의해 지원되었다. JDH는 NIH K08 NS083740의 지원을 인정합니다.

이 프로토콜에서 동물의 사용은 캘리포니아 로스 앤젤레스의 동물 보호 및 사용위원회의 대학 승인 절차에 따라 수행되었다. 참고 : 대상 쥐 인구를 식별하여 시작합니다. 이전 연구에서 유일한 수컷 야생형 C57 / BL6 마우스는 다양하지만 유전자 또는 녹아웃 마우스는 또한 사용될 수 있으며, 사용되어왔다. 정위 좌표가 C57 / BL6 해부학을 기반으로합니다. 각 사용자가 처음에 흰색 문제에 스트로크의 현지화를 확인하는 것이 좋습니다. 1. 흰색 물질 스트로크 유도 - 내측 각도 접근 <ol><li> 선단 직경이 15 내지 25 ㎛의 (11) 사이가되도록 0.5 mm 모세관을 이용하여 뽑아 유리 피펫을 제조함으로써 시작한다. </li><li> 멸균 0.9 % 생리 식염수에 27.4 ㎎ / ㎖ (130 μM)에서 - L-니오의 멸균 10 μL 나누어지는 ((1) -iminoethyl-L - 오르니 틴 염산 N (5))를 준비합니다. </li><li> 인출 된 유리 피펫을 사전 작성유리 피펫을 부착하여 L-니오 (2-5 μL)의 작은 부피를 진공 라인에 접속 튜빙. 벤치 위에 피펫 평면을 배치하고, L-니오 용액에 끌어 끝을 삽입합니다. <ol><li> 피펫의 0.5 mm 부의 최소 2 mm가 채워질 때까지 진공을 적용한다. 진공을 끄고 피펫을 철회. 단계 1.12까지 따로 보관 해 둡니다. </li></ol></li><li> 유도 챔버에 마우스를 위치시키고 표준 32 % 이소 플루 란을 이용하여 마우스를 마취 유도 증발기를 통해 유동 (5 L / 분 5 L / 분으로 산소를 0.5 L / 분으로 흡입 N 2) 1 분 또는 깊이 anesthesized까지. 정위 현미경이 장착 된 정위 장치에 마우스를 전송합니다. 기화기를 통해 흘러 32 % 이소 플루 란을 사용하여 유지 보수 마취를 제공하고 코 콘 (2 L / 분 5 L / 분의 산소와 0.5 L / min의 N 2 흡입). 발가락 핀치와 마취의 깊이를 확인합니다. </li><li> 36 °에 주입 팔을 조정합니다. </li><li> AffiXA 낮은 볼륨 압력 분사 시스템의 말단에 유리 피펫 홀더를 뽑아 정위 설정의 분사 아암에 부착. </li><li> 코트 두 눈을 통해 석유 젤리와 장소 인공 눈물 연고와 마취 된 동물의 수염. 머리 위에 5~10cm 개방과 동물의 머리 위에 멸균 드레이프를 배치하여 무균 수술 부위를 준비합니다. 두개골을 덮는 털을 면도하여 aspetic 수술 표면을 준비합니다. 교대 betadine 70 % 알코올 면봉으로 두피를 청소합니다. </li><li> 두개골 표면을 노출 멸균 미세 가위로 1.5 cm 중간 선 두피 절개를합니다. 멸균 면봉으로 두개골을 건조하고 1-3X 확대에 정위 현미경을 사용하여, 멸균 마이크로 포인트 도구를 사용하여 상부 골막 조직을 제거합니다. </li><li> 미세한 포인트 마커를 이용하여 기준점으로 브레 그마 표시. </li><li> 멸균 미세 STIP 외과 드릴 비트를 사용하여 2mm ellipitical 개두술을 드릴0; 브레 그마에서 후방 시작하여 전방 단지 중간 선 왼쪽으로 연장. 뼈 조각을 제거하고 대뇌 피질을 가시화 할 수 있도록 부드러운 조직 위에 놓인. </li><li> 간헐적으로 멸균 식염수 방울을 적용하여 수술 필드와 촉촉한 대뇌 피질의 표면을 유지합니다. </li><li> 정위 장치의 인젝터 팔에 뽑아 유리 피펫을 붙입니다. 브레 그마와 피펫의 선단을 맞추고 정위 좌표를 제로. </li><li> 첫 번째 전방 / 후방 (A / P)에 피펫을 발전 / 표 1에서 제공하는 좌표 (M / L) 측면을 내측. </li><li> 대뇌 피질의 표면에 피펫을 발전 지느러미 / 복부 (D / V) 측정을 제로. </li><li> 천천히 최초의 D / V 표 1에 좌표에 도달 할 때까지 뇌에 피펫을 전달합니다. </li><li> 뇌에 L-니오 100 NL 주입 환류 방지 5 분을 기다린 20 msec의 펄스를 20 psi에서 설정된 낮은 압력 볼륨 주입 시스템을 사용하여피펫 트랙입니다. <ol><li> 정위 현미경의 접안 렌즈와 3 배의 배율에서 교정 레티클을 사용합니다. </li><li> 따라서, 좌표들의 각각의 세트에 대한 뽑아 유리 피펫으로부터 (100 NL에 대응하는 0.5 mm 직경 피펫 0.5 mm 길이) 0.100 mm (3)의 총 변위. 십자선을 사용하여 측정하고 각각의 사용 확대 및 규모에 따라 달라집니다 설정 때문에 표준화. </li><li> 공기 유체 메 니스 커스가 시상을 갖도록 각 분사시 정확한 량 측정을 위해, 측으로부터 현미경으로 각진 피펫 접근. 메 니스 커스는 피펫의 내부 및 외부 벽 모두 같은 초점면에 표시됩니다. </li></ol></li><li> 천천히 피펫을 철회하고 단계를 반복 1.13-1.16.3 표 1에서 제공하는 좌표의 두 번째와 세 번째 세트에서. </li><li> 최종 주입 후, 피펫을 제거하고 개두술 사이트를 채우기에 충분한 뼈 왁스를 배치합니다. 에이두피 상처의 가장자리 pproximate 및 피부 접착제로 결합한다. </li><li> 두피 절개와 연관된 로컬 통증을 방지하는 방지 멸균 30 G 바늘을 이용하여 상처 마진으로 0.5 %에 마르케 0.1㎖를 주입한다. </li><li> 5 일간 마시는 물에 주택 공급 수술 후 항생제 동물 (0.48 ㎎ / ㎖ 트리 메소 프림 - 설파, 0.5 ㎎ / ㎖ 레보플록사신)를 돌려줍니다. </li></ol> 2. 흰색 물질 스트로크 유도 - 후방 각도 접근 <ol><li> 전치부 배향 45 도로 설정 정위의​​ 분사 암을 조정 제외한 중간 각도 접근 프로토콜과 1.1-1.12 단계를 수행한다. </li><li> 첫 번째 A / P에 피펫을 사전 및 M / L 표 2에 제공 좌표. </li><li> 전체 나머지 단계 측면 각도 접근 프로토콜과 같은 1.14-1.20. </li></ol> 3. 역행의 연결 라벨 <ol><li> 10 멸균 준비0.9 % 생리 식염수에 54.8 ㎎ / ㎖에서 L-니오의 μL 나누어지는. </li><li> 0.9 % 생리 식염수에 20 % Fluororuby (20 % 바이오틴 덱스 트란 아민 또는 2 % Fluorogold)의 멸균 나누어지는을 준비합니다. </li><li> 27.4 ㎎ / ㎖ L-니오 10 % Fluororuby의 최종 농도 1 : 함께 1 희석. </li><li> 단계 1.3-1.23에 위와 같이 스트로크 프로토콜을 수행합니다. </li><li> 이전 8 설명한대로 관류 고정, 냉동 절편 및 현미경으로 조직 섹션에서 기본적으로 형광 추적을 시각화합니다. </li></ol> 면역 형광 4. 조직 처리 <ol><li> 3 시간에서 스트로크 후 14 일까지 적절한 사후 행정 간격으로, 이소 플루 란 과다 복용 또는 로컬 IACUC를 통해 마우스 절차를 승인 안락사. </li><li> 각도 가위를 사용하여 흉강을 열고 좌심실로 23 G 나비 바늘을 삽입합니다. </li><li> 관류 액에 대한 유출을 추적 할 수 있도록 미세 가위를 사용하여 우심방에있는 작은 상처를 놓습니다. </li><li> 로 transcardially RT에서 10 ㎖ / 분의 속도로 차가운 4 % 파라 포름 알데히드의 30 내지 40 ml로 이어 차가운 인산 완충 식염수 용액으로 관류 30-40. </li><li> 마우스를 목을 벨과 후방 두개골을 열 멸균 가위를 사용하여 두뇌를 제거하고 부드럽게 24 시간 동안 차가운 4 % PFA로 뇌를 주걱으로 위에있는 두개골을 제거 배치하고 48 시간 동안 PBS의 30 % 자당로 전송 . </li><li> 그라 이오 스탯을 사용하여 마흔 미크론 부동 섹션을 준비하고 이전에 6-8 바와 같이 항체 처리를 수행합니다. 이 연구에서, 아래의 항체를 사용하여 토끼 항 - 신경 미세 섬유 (200) (1 : 500 희석); 토끼 항 멘틴 (1 : 500); 염소 항 GFAP (1 : 500); 토끼 항 년 Iba-1 (1 : 1000). </li></ol> 단백질이나 RNA 분석 5. 조직 처리 <ol><li> 3 시간에서 스트로크 후 14 일까지 적절한 사후 행정 간격으로, 이소 플루 란 과다 복용을 통해 안락사 또는 로컬 IACUC는 절차를 승인했다. </li><li> 목을 베다마우스 뒤쪽 두개골을 열 멸균 가위를 사용하여 뇌를 제거하고 부드럽게 주걱으로 위에있는 두개골을 제거합니다. </li><li> 후각 망울과 시신경을 절단하는 뇌의 전면에 멸균 4mm 주걱을 삽입합니다. 조심스럽게 두 개관에서 뇌를 들어 올려 (1 배 행크의 균형 소금 솔루션, 25 mM의 HEPES-KOH, pH를 7.4, 35 mM의 포도당, 4 mM의 중탄산 나트륨, 0.01 ㎎ / ㎖ 시클로 헥시 미드) 얼음처럼 차가운 해부 버퍼에 배치합니다. </li><li> 뇌 블록과 멸균 새 면도날을 사용하여 차가운 해부 버퍼 스트로크와 장소를 포함 2-3mm 석판을 준비합니다. </li><li> 해부 현미경에서 주입 된 반구의 백질 기본 운동 피질을 식별합니다. 이상 졸중 간격으로 상기 영역은 시각적 초점 괴사 미엘린 창백 의해 식별 될 수있다. (이전 후 뇌졸중 간격, 10 %의 1 μL와 혼합 L-니오의 주입에 빠른 그린은 뇌졸중의 시각적 식별을 허용 할 수 있습니다 참고 : <strong&gt;도 4a). </li><li> 해부 현미경의지도와 신선한 메스를 사용에서 신중하게 빠른 그린 라벨 또는 조직 손실 중 하나에 의해 식별 스트로크를 포함하는 흰색 물질의 영역을 해부하다. 원하는대로 상부 피질 및 기본 줄무늬를 제거합니다. </li></ol>

<ol>
	<li>Go, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+disease+and+stroke+statistics--2014+update:+a+report+from+the+American+Heart+Association.">Heart disease and stroke statistics--2014 update: a report from the American Heart Association.</a> Circulation. 129, 28-292 (2014).</li><li>Saini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silent+stroke:+not+listened+to+rather+than+silent.">Silent stroke: not listened to rather than silent.</a> Stroke. 43, 3102-3104 (2012).</li><li>Koton, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burden+and+outcome+of+prevalent+ischemic+brain+disease+in+a+national+acute+stroke+registry.">Burden and outcome of prevalent ischemic brain disease in a national acute stroke registry.</a> Stroke. 44, 3293-3297 (2013).</li><li>Jiwa, N. S., Garrard, P., Hainsworth, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+models+of+vascular+dementia+and+vascular+cognitive+impairment:+a+systematic+review.">Experimental models of vascular dementia and vascular cognitive impairment: a systematic review.</a> J Neurochem. 115, 814-828 (2010).</li><li>Sozmen, E. G., Hinman, J. D., Carmichael, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+that+matter:+white+matter+stroke+models.">Models that matter: white matter stroke models.</a> Neurotherapeutics. 9, 349-358 (2012).</li><li>Sozmen, E. G., Kolekar, A., Havton, L. A., Carmichael, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+white+matter+stroke+model+in+the+mouse:+axonal+damage,+progenitor+responses+and+MRI+correlates.">A white matter stroke model in the mouse: axonal damage, progenitor responses and MRI correlates.</a> J Neurosci Methods. 180, 261-272 (2009).</li><li>Rosenzweig, S., Carmichael, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+exacerbation+of+white+matter+stroke+outcomes:+a+role+for+oxidative+damage+and+inflammatory+mediators.">Age-dependent exacerbation of white matter stroke outcomes: a role for oxidative damage and inflammatory mediators.</a> Stroke. 44, 2579-2586 (2013).</li><li>Hinman, J. D., Rasband, M. N., Carmichael, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+of+the+axon+initial+segment+after+focal+cortical+and+white+matter+stroke.">Remodeling of the axon initial segment after focal cortical and white matter stroke.</a> Stroke. 44, 182-189 (2013).</li><li>McCall, T. B., Feelisch, M., Palmer, R. M., Moncada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+N-iminoethyl-L-ornithine+as+an+irreversible+inhibitor+of+nitric+oxide+synthase+in+phagocytic+cells.">Identification of N-iminoethyl-L-ornithine as an irreversible inhibitor of nitric oxide synthase in phagocytic cells.</a> Brit j pharmacol. 102, 234-238 (1991).</li><li>Gadea, A., Aguirre, A., Haydar, T. F., Gallo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelin-1+regulates+oligodendrocyte+development.">Endothelin-1 regulates oligodendrocyte development.</a> J Neurosci. 29, 10047-10062 (2009).</li><li>Dean, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+(pulling)+of+needles+for+gene+delivery+by+microinjection.">Preparation (pulling) of needles for gene delivery by microinjection.</a> CSH prot. , (2006).</li><li>Hughes, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+lesions+in+the+rat+central+nervous+system+induced+by+endothelin-1.">Focal lesions in the rat central nervous system induced by endothelin-1.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 62, 1276-1286 (2003).</li><li>Whitehead, S. N., Hachinski, V. C., Cechetto, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+a+rat+model+of+cerebral+ischemia+and+beta-amyloid+toxicity:+inflammatory+responses.">Interaction between a rat model of cerebral ischemia and beta-amyloid toxicity: inflammatory responses.</a> Stroke. 36, 107-112 (2005).</li><li>Frost, S. B., Barbay, S., Mumert, M. L., Stowe, A. M., Nudo, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+animal+model+of+capsular+infarct:+endothelin-1+injections+in+the+rat.">An animal model of capsular infarct: endothelin-1 injections in the rat.</a> Behav Brain Res. 169, 206-211 (2006).</li><li>Horie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+of+focal+cerebral+ischemia+using+endothelin-1.">Mouse model of focal cerebral ischemia using endothelin-1.</a> J Neurosci Methods. 173, 286-290 (2008).</li><li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cognitive+deficits+and+delayed+neuronal+loss+in+a+mouse+model+of+multiple+microinfarcts.">Cognitive deficits and delayed neuronal loss in a mouse model of multiple microinfarcts.</a> Neuroscience. 32, 17948-17960 (2012).</li><li>Shih, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+smallest+stroke:+occlusion+of+one+penetrating+vessel+leads+to+infarction+and+a+cognitive+deficit.">The smallest stroke: occlusion of one penetrating vessel leads to infarction and a cognitive deficit.</a> Nat Neurosci. 16, 55-63 (2013).</li><li>Jung, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+endothelin+receptor+A+during+myelination+of+developing+oligodendrocytes.">The role of endothelin receptor A during myelination of developing oligodendrocytes.</a> J Korean Med Sci. 26, 92-99 (2011).</li></ol>

피질 행정 이전 모델 번호 12-14 래트 및 마우스에서 내부 -6,15- 캡슐에 엔도 텔린 -1의 국소 주입, 피질 및 선조체 백질 포함 설명되었다. 작은 초점 스트로크의 최근 모델은 콜레스테롤 microemboli의 경동맥 (16)에 주입 한 번의 침투 세동맥 (17)의 photothrombotic 폐쇄를 활용하고있다. 이러한 모델은 각각 장단점 5를 모두 갖는다. 현재 기술 모델은 축삭 이상 손실, 수초 저하, 초점 괴사 코어와 최소이며, 7 세에 따라 상당히 빠른 회복을 보여 임상 적자를 포함하여 인간의 열공 경색을 모방 특성을 가지고 있습니다 병변을 생산하고 있습니다. 쥐의 흰색 물질을 표적으로하는 것은 기계적인 연구를 지원할 수있는 유전자 조작의 다양한 있습니다. 임계프로토콜의 단계에서는 정확한 정위 좌표를 이용 포함한다. 쥐의 흰색 물질의 크기가 작고 변형에 변형까지 다양하기 때문에, 정위 좌표의 개정은 사용 마우스의 연령과 변형에 따라 필요할 수 있습니다. 이 직접 경색의 크기를 상관 관계로 주입 볼륨의 제어는 중요하다. 큰 주사는 상부 피질과 기본 선조체에 잠식 큰 스트로크를 생성합니다. 여기에 설명 된 방법을 사용 ET-1의 초점 주입이보고되었지만 엔도 텔린-1은 뇌졸중 후 백질 생물학의 연구를 교란 희소 돌기 아교 세포의 분화 및 성숙 10,18에 직접 분비 효과가 나타났다. 반대로, L-니오 접근 타겟 내피 세포는 단독으로 동일한 병변 제조 부상 응답에 포함 된 셀의 모든 교란 분비 효과를 없앤다. L-니오 직접 세포 독성 및 SELEC 아니다테드 도즈는 도즈 예비 이관 실험에 의해 측정 하였다 (데이터는 보이지 않음). 후방 각도 접근 방식은보다 정확하게 일차 운동 피질에서 언더컷 축삭은 백질 손상에 기인 할 수있는 최대한의 행동 적자를 생산하기 위해 개발되었다. 또한 중간 각도 접근 방식은 손해 운동 피질의 축삭을하지만 더 옆으로 확장 및 기본 감각 피질의 기초가 축삭을 포함한다. 스트로크 병변는 제 24 시간에 걸쳐 비교적 빠르게 확장한다. 칠일으로, 경색의 크기가 최대이고 우리는이 시간을 초과하면 상당한 병변 성장이 관찰되지 않았다. 추가적인 이벤트 및 세포 축삭 퇴행이 초기 단계 이상 발생하지만 괴사 코어에 의해 측정 된 경색 크기가 개입의 부재 크게 변하지 않을 것이다. 스트로크시의 신경 해부학 추적자의 공동 주입은 허혈성 축삭 손상을 발생하는 신경 세포를 식별합니다. 사용 중 하나 의대IAL 또는 후방 각도의 접근 방식은, 손상된 축삭 돌기 신경 세포 기관은 무사히 남아있다. 이것은 중추 신경계의 신경 세포에 허혈 axotomy의 효과를 연구하는 데 유용한 모델을 만듭니다. 우리는 모두 뇌졸중 손상 축삭 우수 흡수를 보여 덱스 트란 아민, fluorogold을 포함하여 주로 역행 추적기를 사용했다. 유전자 변형 및 녹아웃 마우스 라인의 다양한 사용함으로써,이 프로토콜의 사용자는 백질 스트로크 부상 응답 및 수리에 관여하는 신경 세포의 유전자의 특정 역할을 조사 할 수 있습니다.

Stroke affecting the subcortical white matter is a common clinical entity, accounting for up to 25% of clinical strokes annually in the US 1. Ischemic damage to white matter also occurs silently at a significantly higher rate and contributes to the development of vascular dementia 2,3. Presently, patients with this form of cerebral ischemia have few, if any treatment choices. Despite the clinical importance of this disease, few clinically relevant animal models exist 4,5. 
The goal of this protocol is to produce a focal ischemic lesion within the murine white matter. This murine model of human disease allows the specific study of axonal injury response to stroke and how the cellular elements of white matter, namely oligodendrocytes and astrocytes along with axons, respond to and repair after stroke.
Previous reports have described a model of subcortical white matter stroke using endothelin-1 (ET-1) 6 that is similar to the one described here. Several key changes to the experimental protocol have been made thereby the potential uses of this model have expanded 7,8. This protocol provides a reliable and modifiable strategy to produce a focal stroke within mouse brain white matter. 
The major advantages of this model are the use of a chemical endothelial nitric oxide synthase (eNOS) inhibitor N(5)-(1)-iminoethyl-L-ornithine HCl (L-Nio) 9 with no known paracrine effects on cellular elements of white matter which had been a complication of models using endothelin-1 10. In addition, the stereotactic targeting of white matter in the mouse allows the use of any variety of transgenic or knockout strains, greatly expanding the available tools to determine the effect of stroke on brain white matter. Here, two variations on this technique are described and demonstrate some of the additional variations that can be utilized to enhance the understanding of axonal and white matter damage and repair after stroke.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="725">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">L-N5-(1-Iminoethyl)ornithine, Dihydrochloride</td>
			<td style="width:204px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:133px;">400600-20MG</td>
			<td style="width:81px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflurane</td>
			<td>Phoenix Pharmaceutical, Inc.</td>
			<td>NDC 57319-559-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Capillary tubes</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>50-821-807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Picospritzer</td>
			<td>Parker Instrumentation</td>
			<td>Picospritzer II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereotactic setup</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>KSC51725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pipette puller</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>Model 720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereomicroscope SZ51</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>88-124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine scissors</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>PY2 72-8547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Curved Forceps</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>PY2 72-8598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blunt dissection tool</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>10066-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Drill</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>8220-1/28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Drill bits</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>19007-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vetbond</td>
			<td>3M</td>
			<td>1469SB&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Marcaine</td>
			<td>HOSPIRA</td>
			<td>NDC 0409-1610-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trimethoprim-Sulfamethaxole</td>
			<td>STI Pharmacy</td>
			<td>NDC 54879-007-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluororuby</td>
			<td>Fluorochrome Inc</td>
			<td>30mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>O4042-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP220-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryostat</td>
			<td>Leica CM3050 S</td>
			<td>14047033518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-544-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fast Green&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7252-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissection microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">23 gauge butterfly needle</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-840-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10X Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14065056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1M HEPES-KOH, pH 7.4</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>16924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cyclohexamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>01810</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a versatile murine model of subcortical white matter stroke for the study of axonal degeneration and white matter neurobiology

뇌졸중 임상 스트로크 프리젠 테이션의 최대 25 %를 백질 계정에 영향을주지는 5 ~ 10 배 더 클 수있다 속도에서 자동으로 발생하고 혈관성 치매의 발전에 크게 기여하고있다. 초점 백질 행정의 몇 가지 모델이 존재하고 적절한 모델이 부족 뇌졸중 이러한 유형의 후 부상 응답 및 수리에 관련된 neurobiologic 메커니즘의 이해를 방해하고있다. 다른 피질 뇌졸중 모델의 주요 제한은 국소 적 백질에 경색을 제한하지 않거나 주로 비 뮤린 종 검증되었다는 것이다. 이것은 백질 행정 신경 생물학을 연구 쥐 연구 도구의 다양한 적용 할 수있는 능력을 제한한다. 여기에서 우리는 돌이킬 수없는 eNOS의 억제제의 지방 주입을 사용하여 쥐의 흰색 문제에 초점 뇌졸중의 안정적인 생산을위한 방법론을 제시한다. 우리는 또한이 독특한 정위를 포함하는 일반적인 프로토콜에 몇 가지 변화를 제시변화, 크게이 기술의 응용 가능성을 확장 역행의 연결을 추적뿐만 아니라 신선한 조직 라벨 및 해부. 여러 방법이 뇌졸중이 일반적이고 파악 하였다 형태의 neurobiologic 효과를 분석하는 이러한 변화 할 수 있습니다.

제시된 모델을 사용하여, 백질 기본 앞다리 감각 피질 확실 타겟팅 될 수있다. 일반적으로 인간의 열공 경색에서 알 수 있듯이이 화학적으로 유도 된 뇌졸중 모델은 초점 축삭과 수초 손실, astrocytosis 및 microgliosis (그림 1)을 생성한다. 세 주사를 이용하여 임상 적으로 유용한 모델 앞다리 모터 태스크 7에 이른 장애 및 뇌 조직 경험 작지만 상당한 부분 확립 면역 조직 화학, 면역 형광 및 생화학 기술이 양적 레벨에서 가능하고 신뢰할 수 있다는 허혈. 뇌졸중 유도 후 이른 시점 (HR)에서 축삭 분자 조직 변경 (도 2)을 검출 할 수있다. 칠일에서, 스트로크는 축삭 손실 (그림 1a)의 외접 영역의 성숙을 완료합니다. 우리의 손,이 방법은 초점 백질 병변 approxima을 생산tely 800 μm의 수평 직경과 뇌량의 전후방 축 방향으로 약 1mm 연장. 칠일으로 평균 전체 경색 크기가 약 0.200 mm (3)이고, 타원형 형상을 가질 것이다. 우리는 동물 사이 섹션, 타원의 부분이 발생하는 위치에 따라 사이에 두 스트로크의 크기는 약 10 %의 변화를 관찰했다. 경색의 크기 또한 증가는 거의 칠일 이상 보이지 않는다. 축삭 행정의 영역을 돌출 (그림 3)이 층 5 층 (6) 신경 세포 기관에 상당한 신경 라벨에 덱스 트란 아민 결과의 동시 주입의 추가. 절차 (미세 바늘의 통로)의 가짜 측면에 의해 손상되지 상부 대뇌 피질의 신경 세포는 말초 축삭 손상을 받아야하고, L-니오 준비와 추적의 포함으로 식별 할 수 있습니다. 이 방법은 사용했다<html> D는 스트로크 (8) 후 축삭 초기 세그먼트의 역동적 인 변화를 설명한다. 스트로크 영향 조직 영역의 작은 크기는 2,3,5- 트리 페닐 테트라 졸륨 클로라이드 (TTC) 염색과 같은 다른 일반적인 기술의 사용을 제한하는 반면, 백질 스트로크 영역 신선한 조직에서 발견 될 수있다. 이러한 빠른 그린 등의 일반적인 염료의 첨가는 해부 현미경 해부 될 수있는 조직의 식별 영역 (도 4)을 생성한다. 해부하는이 조직은 웨스턴 블롯 또는 면역, 또는 RNA 분리 및 분석 (그림 4C) 용으로 단백질 분석에 사용할 수 있습니다되면. 다양한 유전자 도입 마우스 라인의 사용을 통해, 혁신적인 접근법의 다양한 세포의 운명 맵핑 연구 레이저 캡처 미세 절제 (도 4C)을 포함 초점 백질 뇌졸중 후 신경 생물학을 연구 할 수있다. 1 &quot;&gt; :&quot;유지 - together.within 페이지 = FO &quot;십t <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53404/53404fig1.jpg" /> 그림 1 :. 내측 및 후방 각도 접근 방법 모두를 사용하여 초점 백질 스트로크 neurofilaments에 대한 면역 형광 라벨 (A, 적색) 내측 접근법을 사용하여 칠일 뇌졸중 후 축삭 손실의 정도를 보여줍니다. 후방 경사 방식을 사용하여, 백질 스트로크 병변 단지 뇌실 (B, C) ​​상기 타겟 강렬한 소교 (B)과의 반응성 성상 세포 (C)를 ​​도시한다. 두 성상 세포 중간 필라멘트 마커, 멘틴 (빨간색)와 아교 섬유 성 산성 단백질 (녹색 GFAP는) 두 뇌졸중 (C) 후 백질 (섬유) 성상 세포의 형태 변화를 알 수있다. 스케일 바 = 500 μm의. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53404/53404fig1large.jpg" target="_blank">버전 큰 보려면 여기를 클릭하십시오</a>이 그림의 시온. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53404/53404fig2.jpg" /> 그림 2 :. 흰색 물질 스트로크 변경합니다 축삭 마이크로 도메인 조직 contactin 관련 단백질에 의해 표시 베타-IV의 스펙 트린 (빨간색)와 paranode에 의해 표시된 노드에서 백질 스트로크 유도, 축삭 마이크로 도메인 조직, 3 시간 (caspr 내에서, 녹색), 중단된다 (화살표, B). 동측 흰색 물질이 손실 axoglial 접점 (B와 D)와 축삭의 전형적인 노드와 paranodal 신장을 나타내고있다 반대측 백질 축삭 일반 노드, paranodal 및 juxtaparanodal 조직 (A 및 C)를 보여줍니다. 스케일 바 = 5 μm의. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53404/53404fig3.jpg" /> 그림 3 : 역행 신경 Labelin흰색 물질 스트로크와 g는 축삭 손상과 개별 뉴런을 식별합니다. 스트로크 유도시 형광 덱스 트란 아민 (적색)의 공동 주입 뇌졸중 부상으로 축삭 개별 뉴런의 식별을 할 수 있습니다. 라벨의 대부분은 5 층에서 축삭과 스트로크를 덮는 기본 감각 피질에서 6 뉴런에서 발생합니다. 이미지는 뇌졸중 후 7 일을 나타냅니다. 스케일 바 = 500 μm의. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53404/53404fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/53404/53404fig4.jpg" /> 그림 4 :. 스트로크 유도시의 빠른 그린의 생화학 및 전사 분석 실험 공동 주입에있는 사용을위한 흰색 물질 스트로크 병변의 이외에 Microdissection은 24 시간 (A, 상단 패널)에서 부상당한 지역의 조기 발견 할 수 있습니다. Immunoblotti특정 축삭 단백질 NG 단독 스트로크 (A, 하부 패널)의 영역에서의 감소를 보여주기 위해 수행 될 수있다. 이상 시점에서, 백질 스트로크 (왼쪽 패널)의 영역을 국소 적 고유 라벨 (B)없이 절개 될 수있다. 오른쪽 하단 패널은 스트로크 (B)를 포함하는 흰색 물질의 해부 영역을 표시하는 동안 오른쪽 상단 패널 해부 영역의 제거 후 백질의 영역을 보여줍니다. 흰색 물질 (C)에서 해부 지역에서 분리 된 RNA를 사용하여 희소 돌기 아교 세포 특이 유전자에 대한 PCR. IL은 동측를 =; CL = 반대측; C = 제어; S = 스트로크. <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 주입 </td><td> 전방 / 후방 </td><td> 중간 / 측면 </td><td> 지느러미 / 복부 </td></tr><tr height="21"><td align="right" heigHT = &quot;21&quot;스타일 = &quot;높이 : 21px;&quot;&gt; (1) </td><td align="right"> 0.22 </td><td align="right"> 0.22 </td><td align="right"> -2.10 </td></tr><tr height="21"><td align="right" height="21" style="height:21px;"> 이 </td><td align="right"> 0.70 </td><td align="right"> 0.15 </td><td align="right"> -2.16 </td></tr><tr height="21"><td align="right" height="21" style="height:21px;"> 삼 </td><td align="right"> 1.21 </td><td align="right"> 0.15 </td><td align="right"> -2.18 </td></tr></tbody></table> 표 1 : (mm 단위) 측면 각도 접근에 대한 정위 좌표. <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 주입 </td><td> 전방 / 후방 </td><td> 중간 / 측면 </td><td> 지느러미 / 복부 </td></tr><tr height="21"><td align="right" height = &quot;21&quot;스타일 = &quot;높이 : 21px;&quot;&gt; (1) </td><td align="right"> -0.75 </td><td align="right"> -0.96 </td><td align="right"> -2.10 </td></tr><tr height="21"><td align="right" height="21" style="height:21px;"> 이 </td><td align="right"> -1.00 </td><td align="right"> -0.96 </td><td align="right"> -2.05 </td></tr><tr height="21"><td align="right" height="21" style="height:21px;"> 삼 </td><td align="right"> -1.25 </td><td align="right"> -0.96 </td><td align="right"> -2.00 </td></tr></tbody></table> 표 2 : (mm)에 후방 각도 접근에 대한 정위 좌표.

Watch this Scientific Journal Video about A Versatile Murine Model of Subcortical White Matter Stroke for the Study of Axonal Degeneration and White Matter Neurobiology at JoVE.com

A Versatile Murine Model of Subcortical White Matter Stroke for the Study of Axonal Degeneration and White Matter Neurobiology

Here we present methodology for the production of a focal stroke in murine white matter by local injection of an irreversible endothelial nitric oxide synthase (eNOS) inhibitor (L-Nio). Presented are two stereotactic variations, retrograde neuronal tracing, and fresh tissue labeling and dissection that expand the potential applications of this technique.

축삭 변성과 백질 신경 생물학의 연구를위한 다목적 쥐 모델 피질의 흰색 물질 스트로크

Stroke affecting white matter accounts for up to 25% of clinical stroke presentations, occurs silently at rates that may be 5-10 fold greater, and ...

a-versatile-murine-model-subcortical-white-matter-stroke-for-study

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

8.0K 조회수.  University of California, Los Angeles. Here we present methodology for the production of a focal stroke in murine white matter by local injection of an irreversible endothelial nitric oxide synthase (eNOS) inhibitor (L-Nio). Presented are two stereotactic variations, retrograde neuronal tracing, and fresh tissue labeling and dissection that expand the potential applications of this technique.

비디오: A Versatile Murine Model of Subcortical White Matter Stroke for the Study of Axonal Degeneration and White Matter Neurobiology

A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize their blood glucose levels, islet transplantation has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes 1,2. More recently, advances in human islet transplantation have further strengthened this view 1,3. However, two major limitations prevent islet transplantation from being a widespread clinical reality: (a) the requirement for large numbers of islets per patient, which severely reduces the number of potential recipients, and (b) the need for heavy immunosuppression, which significantly affects the pediatric population of patients due to their vulnerability to long-term immunosuppression. Strategies that can overcome these limitations have the potential to enhance the therapeutic utility of islet transplantation.
Islet transplantation under the mouse kidney capsule is a widely accepted model to investigate various strategies to improve islet transplantation. This experiment requires the isolation of high quality islets and implantation of islets to the diabetic recipients. Both procedures require surgical steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol. We also briefly discuss different transplantation models: syngeneic, allogeneic, syngeneic autoimmune, and allogeneic autoimmune.

Transplantation of isolated islets has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes. Here we describe a method to isolate islets from mouse pancreata and transplant them to the subcapsular space of the kidney.

Murine 아일릿 절연 및 Subcapsular 신장 이식을위한 방법

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize ...

연구

의학

Biomarkers in an Animal Model for Revealing Neural, Hematologic, and Behavioral Correlates of PTSD

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for objective diagnosis but also for the evaluation of therapeutic efficacy and resilience to trauma. Ongoing research is directed at identifying molecular biomarkers for PTSD, including traumatic stress induced proteins, transcriptomes, genomic variances and genetic modulators, using biologic samples from subjects' blood, saliva, urine, and postmortem brain tissues. However, the correlation of these biomarker molecules in peripheral or postmortem samples to altered brain functions associated with psychiatric symptoms in PTSD remains unresolved. Here, we present an animal model of PTSD in which both peripheral blood and central brain biomarkers, as well as behavioral phenotype, can be collected and measured, thus providing the needed correlation of the central biomarkers of PTSD, which are mechanistic and pathognomonic but cannot be collected from people, with the peripheral biomarkers and behavioral phenotypes, which can.
Our animal model of PTSD employs restraint and tail shocks repeated for three continuous days - the inescapable tail-shock model (ITS) in rats. This ITS model mimics the pathophysiology of PTSD 17, 7, 4, 10. We and others have verified that the ITS model induces behavioral and neurobiological alterations similar to those found in PTSD subjects 17, 7, 10, 9. Specifically, these stressed rats exhibit (1) a delayed and exaggerated startle response appearing several days after stressor cessation, which given the compressed time scale of the rat's life compared to a humans, corresponds to the one to three months delay of symptoms in PTSD patients (DSM-IV-TR PTSD Criterian D/E 13), (2) enhanced plasma corticosterone (CORT) for several days, indicating compromise of the hypothalamopituitary axis (HPA), and (3) retarded body weight gain after stressor cessation, indicating dysfunction of metabolic regulation.
The experimental paradigms employed for this model are: (1) a learned helplessness paradigm in the rat assayed by measurement of acoustic startle response (ASR) and a charting of body mass; (2) microdissection of the rat brain into regions and nuclei; (3) enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for blood levels of CORT; (4) a gene expression microarray plus related bioinformatics tools 18. This microarray, dubbed rMNChip, focuses on mitochondrial and mitochondria-related nuclear genes in the rat so as to specifically address the neuronal bioenergetics hypothesized to be involved in PTSD.

We describe a rat model of post traumatic stress disorder (PTSD) that reveals the persistent alterations in neuroendocrine function and the delayed long-term, exaggerated fear response, characteristic of PTSD patients. The animal model and methods described here are useful for correlating biomarkers in brain nuclei, which are mechanistic but cannot be measured in patients, with biomarkers in peripheral white blood cells, which can.

PTSD의, 신경 Hematologic, 그리고 행동 상관 관계를 누설하는 행위에 대해서는 동물 모델에서 생체

Identification of biomarkers representing the evolution of the pathophysiology of Post Traumatic Stress Disorder (PTSD) is vitally important, not only for ...

A Murine Model of Stent Implantation in the Carotid Artery for the Study of Restenosis

Despite the considerable progress made in the stent development in the last decades, cardiovascular diseases remain the main cause of death in western countries. Beside the benefits offered by the development of different drug-eluting stents, the coronary revascularization bears also the life-threatening risks of in-stent thrombosis and restenosis. Research on new therapeutic strategies is impaired by the lack of appropriate methods to study stent implantation and restenosis processes. Here, we describe a rapid and accessible procedure of stent implantation in mouse carotid artery, which offers the possibility to study in a convenient way the molecular mechanisms of vessel remodeling and the effects of different drug coatings.

A model of stent implantation in mouse carotid artery is described. Compared to other similar methods, this procedure is very rapid, simple and accessible, offering the possibility to study in a convenient way the vascular wall reaction to different drug-eluting stents and the molecular mechanisms of restenosis.

재 협착의 연구에 대한 경동맥 스텐트 시술의 쥐과 모형

Despite  the considerable progress made in the stent development in the last decades,  cardiovascular diseases remain the main cause of death in western ...

A Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage

In this video publication a standardized mouse model of subarachnoid hemorrhage (SAH) is presented. Bleeding is induced by endovascular Circle of Willis perforation (CWp) and proven by intracranial pressure (ICP) monitoring. Thereby a homogenous blood distribution in subarachnoid spaces surrounding the arterial circulation and cerebellar fissures is achieved. Animal physiology is maintained by intubation, mechanical ventilation, and continuous on-line monitoring of various physiological and cardiovascular parameters: body temperature, systemic blood pressure, heart rate, and hemoglobin saturation. Thereby the cerebral perfusion pressure can be tightly monitored resulting in a less variable volume of extravasated blood. This allows a better standardization of endovascular filament perforation in mice and makes the whole model highly reproducible. Thus it is readily available for pharmacological and pathophysiological studies in wild type and genetically altered mice.

A standardized mouse model of subarachnoid hemorrhage by intraluminal Circle of Willis perforation is described. Vessel perforation and subarachnoid bleeding are monitored by intracranial pressure monitoring. In addition various vital parameters are recorded and controlled to maintain physiologic conditions.

지주막 하 출혈의 생쥐 모델

In this video publication a standardized mouse model of subarachnoid  hemorrhage (SAH) is presented. Bleeding is induced by endovascular Circle of  Willis ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As such, primary or &#39;neuronal-like&#39; cell culture systems are commonly utilized. While&#160;these systems are relatively easy to work with, and are useful model systems in which various functional outcomes (such as cell death) can be readily quantified, the examined outcomes and pathways in cultured immature neurons (such as excitotoxicity-mediated cell death pathways) are not necessarily the same as those observed in mature brain, or in intact tissue. Therefore, there is the need to develop models in which cellular mechanisms in mature neural tissue can be examined. We have developed an in vitro technique that can be used to investigate a variety of molecular pathways in intact nervous tissue. The technique described herein utilizes rat cortical tissue, but this technique can be adapted to use tissue from a variety of species (such as mouse, rabbit, guinea pig, and chicken) or brain regions (for example, hippocampus, striatum, etc.). Additionally, a variety of stimulations/treatments can be used (for example, excitotoxic, administration of inhibitors, etc.). In conclusion, the brain slice model described herein can be used to examine a variety of molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

We have developed a brain slice model which can be used to examine molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.&#160;This technique generates viable mature brain tissue and reduces animal numbers required for experimentation, whilst keeping the neuronal circuitry, cellular interactions, and postsynaptic compartments partly intact.

같은 뇌 Microslices의 흥분 독성 자극<em&gt; 체외</em&gt; 스트로크의 모델

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

DTI of the Visual Pathway - White Matter Tracts and Cerebral Lesions

DTI is a technique that identifies white matter tracts (WMT) non-invasively in healthy and non-healthy patients using diffusion measurements. Similar to visual pathways (VP), WMT are not visible with classical MRI or intra-operatively with microscope. DTI will help neurosurgeons to prevent destruction of the VP while removing lesions adjacent to this WMT. We have performed DTI on fifty patients before and after surgery between March 2012 to January 2014. To navigate we used a 3DT1-weighted sequence. Additionally, we performed a T2-weighted and DTI-sequences. The parameters used were, FOV: 200 x 200 mm, slice thickness: 2 mm, and acquisition matrix: 96 x 96 yielding nearly isotropic voxels of 2 x 2 x 2 mm. Axial MRI was carried out using a 32 gradient direction and one b0-image. We used Echo-Planar-Imaging (EPI) and ASSET parallel imaging with an acceleration factor of 2 and b-value of 800 s/mm&#178;. The scanning time was less than 9 min.
The DTI-data obtained were processed using a FDA approved surgical navigation system program which uses a straightforward fiber-tracking approach known as fiber assignment by continuous tracking (FACT). This is based on the propagation of lines between regions of interest (ROI) which is defined by a physician. A maximum angle of 50, FA start value of 0.10 and ADC stop value of 0.20 mm&#178;/s were the parameters used for tractography.
There are some limitations to this technique. The limited acquisition time frame enforces trade-offs in the image quality. Another important point not to be neglected is the brain shift during surgery. As for the latter intra-operative MRI might be helpful. Furthermore the risk of false positive or false negative tracts needs to be taken into account which might compromise the final results.

Diffusion tensor imaging (DTI) was performed to try to depict the major parts of the visual pathway. The goal was to use an FDA approved standard commercial workstation which could be used for everyday routine in order to try to reduce postoperative damage of the visual pathway in the patients.

시각 통로의 DTI - 흰색 물질 책자 및 뇌 병변

DTI is a technique that identifies white matter tracts (WMT) non-invasively in healthy and non-healthy patients using diffusion measurements. Similar to ...

Isolation and Excision of Murine Aorta; A Versatile Technique in the Study of Cardiovascular Disease

Cardiovascular disease is a broad term describing disease of the heart and/or blood vessels. The main blood vessel supplying the body with oxygenated blood is the aorta. The aorta may become affected in diseases such as atherosclerosis and aneurysm. Researchers investigating these diseases would benefit from direct observation of the aorta to characterize disease progression as well as to evaluate efficacy of potential therapeutics. The goal of this protocol is to describe proper isolation and excision of the aorta to aid investigators researching cardiovascular disease. Isolation and excision of the aorta allows investigators to look at gross morphometric changes as wells as allowing them to preserve and stain the tissue to look at histologic changes if desired. The aorta may be used for molecular studies to evaluate protein and gene expression to discover targets of interest and mechanisms of action. This technique is superior to imaging modalities as they have inherent limitations in technology and cost. Additionally, primary isolated cells from a freshly isolated and excised aorta can allowing researchers to perform further in situ and in vitro assays. The isolation and excision of the aorta has the limitation of having to sacrifice the animal however, in this case the benefits outweigh the harm as it is the most versatile technique in the study of aortic disease.

Pathology of the aorta can lead to severe morbidity and mortality, therefore research of disease progression and potential therapies is warranted. Here, we present a protocol to isolate and excise the murine aorta to aid researchers in their investigation of cardiovascular disease.

분리 및 설치류 대동맥 절제; 심혈관 질환의 연구에 다목적 기술

Cardiovascular disease is a broad term describing disease of the heart and/or blood vessels. The main blood vessel supplying the body with oxygenated ...

A Simple Critical-sized Femoral Defect Model in Mice

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all limb bone fractures fail to heal completely due to the extent of the trauma, disease, or age of the patient. Our ability to improve bone regenerative strategies is critically dependent on the ability to mimic serious bone trauma in test animals, but the generation and stabilization of large bone lesions is technically challenging. In most cases, serious long bone trauma is mimicked experimentally by establishing a defect that will not naturally heal. This is achieved by complete removal of a bone segment that is larger than 1.5 times the diameter of the bone cross-section. The bone is then stabilized with a metal implant to maintain proper orientation of the fracture edges and allow for mobility. 
Due to their small size and the fragility of their long bones, establishment of such lesions in mice are beyond the capabilities of most research groups. As such, long bone defect models are confined to rats and larger animals. Nevertheless, mice afford significant research advantages in that they can be genetically modified and bred as immune-compromised strains that do not reject human cells and tissue.
Herein, we demonstrate a technique that facilitates the generation of a segmental defect in mouse femora using standard laboratory and veterinary equipment. With practice, fabrication of the fixation device and surgical implantation is feasible for the majority of trained veterinarians and animal research personnel. Using example data, we also provide methodologies for the quantitative analysis of bone healing for the model.

Animal models are frequently employed to mimic serious bone injury in biomedical research. Due to their small size, establishment of stabilized bone lesions in mice are beyond the capabilities of most research groups. Herein, we describe a simple method for establishing and analyzing experimental femoral defects in mice.

마우스의 간단한 임계 크기의 대퇴 결함 모델

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all ...

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic cerebrovascular accidents account for 80% of all strokes. A common cause of IR injury is the rapid inflow of fluids following an acute/chronic occlusion of blood, nutrients, oxygen to the tissue triggering the formation of free radicals.
Ischemic stroke is followed by blood-brain barrier (BBB) dysfunction and vasogenic brain edema. Structurally, tight junctions (TJs) between the endothelial cells play an important role in maintaining the integrity of the blood-brain barrier (BBB). IR injury is an early secondary injury leading to a non-specific, inflammatory response. Oxidative and metabolic stress following inflammation triggers secondary brain damage including BBB permeability and disruption of tight junction (TJ) integrity.
Our protocol presents an in vitro example of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) on rat brain endothelial cell TJ integrity and stress fiber formation. Currently, several experimental in vivo models are used to study the effects of IR injury; however they have several limitations, such as the technical challenges in performing surgeries, gene dependent molecular influences and difficulty in studying mechanistic relationships. However, in vitro models may aid in overcoming many of those limitations. The presented protocol can be used to study the various molecular mechanisms and mechanistic relationships to provide potential therapeutic strategies. However, the results of in vitro studies may differ from standard in vivo studies and should be interpreted with caution.

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is associated with a high rate of morbidity and mortality. The goal of the in vitro model of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) described here is to assess the effects of ischemia reperfusion injury on a variety of cells, particularly in blood-brain barrier (BBB) endothelial cells.

같은 산소 포도당 박탈과 재산 소화<em&gt; 체외</em&gt; 허혈 - 재관류 손상 모델 공부 뇌 혈관 장벽 부전

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic ...

An Anesthesia, Surgery, and Harvest Method for the Evaluation of Transpedicular Screws Using an In Vivo Porcine Lumbar Spine Model

Pedicle screw fixation is the gold standard for the treatment of spinal diseases. However, many studies have reported the issue of loosening pedicle screws after spinal surgery, which is a serious concern. To address this problem, diverse types of pedicle screws have been examined to identify those with good fixation strength and osseointegration in spine bone. The porcine spine is a good alternative for the human spine in the evaluation of pedicle screws due to the anatomical size, mechanical characteristics, and cost. Although several studies have reported that pedicle screws are efficient in the porcine model, no study has described detailed protocols for the evaluation of a pedicle screw using the porcine model. Here, we describe a detailed method for evaluating transpedicular screws using an in vivo porcine lumbar spine model. The technical details for anesthesia, spine surgery, and harvest provided here will facilitate with the evaluation of the transpedicular screw fixation model.

An Anesthesia, Surgery, and Harvest Method for the Evaluation of Transpedicular Screws Using an In Vivo Porcine Lumbar Spine Model

Here, we introduce a method to evaluate transpedicular screws by using an in vivo porcine lumbar spine model.

수술 용 나사를 이용한 마취, 수술 및 수확 방법<em&gt; In Vivo</em&gt; 돼지의 허리 척추 모델

Pedicle screw fixation is the gold standard for the treatment of spinal diseases. However, many studies have reported the issue of loosening pedicle ...