This work was supported by DFG grant EH 192/5-1 (A.E.), the EU (E-rare-2) project Transposmart (A.E.), the UWH Forschungsf&#246;rderung (E.S. and W.Z), and the PhD programme of the University Witten/Herdecke (P.B.). J.L. was supported by a stipend of the Chinese Scholarship council and T.B. and M.G by the Else Kr&#246;ner-Fresenius foundation (EKFS).

<ol>
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저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

여기에 제시된 프로토콜은 전술 한 절차에 기초 4,12 인간 아데노 바이러스 형 5에 기초 HCAdV 벡터들의 정화를 허용한다. pAdFTC 플라스미드 내의 HCAdV 게놈은 모든 아데노 바이러스 유전자의 결여 만 5&#39;- 및 3&#39;- LTR에 및 포장 신호를 전달한다. 이 전략에서 HV AdNG163R-2 (4)는 트랜스 효율적인 바이러스 생산에 필요한 모든 유전자를 제공한다. 또는 아데노 관련 바이러스 (AAV) 기반 벡터 - 이것은 명확하게 제 1 및 제 2 세대 AdVs 또는 널리 사용되는 렌티 바이러스 (LV)을 outcompetes 최대 35킬로바이트의 포장 용량을 제공합니다. 특히 생체 내 (in vivo) 적용을위한 HCAdV의 두번째 장점은 제일 - 대조적 또는 2 세대 AdVs 그들이 세포 독성의 감소 된 수준과 5-8 바이러스 단백질의 발현으로 인한 면역 부작용을 표시한다는 점이다. 그럼에도 불구하고 여기에 설명 된 프로토콜이 시간이고다른 바이러스와 같은 LV- 같은 벡터 또는 AAV-벡터뿐만 아니라 1 세대 또는 2 세대 AdVs보다 많이 작동합니다. 가장 큰 장애물은 큰 유전자의 복제 및 바이러스 생산 플라스미드 PADV-FTC에 후속 전송입니다. 유도 엔도 뉴 클레아의 사용은 SceI 제한 I 및 I-CEU 내가 셔틀 플라스미드 pHM5에서 유전자의 정확하고 직접 삽입을 제공 PI-,하지만 강력하게 절단 된 DNA를 엄선 단점이있다. 복제 과정에서 plasmid- 삽입-DNA 준비 할 때 이러한 이유로 많은 페놀 - 클로로포름 정리 단계가 필요합니다. 따라서 엄격하게 제공하는 복제 프로토콜에 따라 엄격하게 권장합니다. HCAdV 게놈을 복제하는 것은 제한되지 I 의해 플라스미드 pAdFTC로부터 해제 된 후 효소 소화이어서 생산자 세포주에 형질. 최초의 형질 전환 효율이 충분한 바이러스의 증폭을 달성하기위한 매우 중요합니다. 중요한 프로토콜은 여러 단계를 구비하는 절차는 다음 단계가 실패 할 경우 다시 시작할 수 있습니다. 사전 - 증폭 동안 해물의 1/3 지점부터 다시 시작하는 과정을 이상의 바이러스를 제조해야하는 경우에, 반복을 단축 백업으로 저장 될 수있다. HCAdV, 큰 복잡하거나 여러 유전자 또는 특정 투표자의 DNA를 운반하는 것은 예상보다 느린 증폭 될 수있다. 따라서, 현탁 배양이 스피너 플라스크에서 성장 전에 반드시 사전 증폭 과정을 수행하는 것이 중요하다. 미리 증폭이 성공적이지 않으면, 절차는 정지하고 처음부터 다시 시작해야한다. 사전 - 증폭 비효율적 인 경우 바이러스의 양이 3 L 스피너 플라스크에서 배양 세포를 감염시킬 때까지 충분히 높은 추가 계대이 필요할 수있다. 스피너 플라스크로 현탁 배양에 대한 대안으로서, 20 (150) 내지 30mm 조직 배양 접시는 최종 통과를 위해 사용될 수있다. 그러나, 이것은 더 많은 시간하고 집중 작동 할 수 있습니다. <p이 극적으로 바이러스 역가를 감소하지 않으므로 CSCL 구배 원심 분리 동안 클래스 = &quot;jove_content은&quot;&gt; 두 개의 분획으로 스피너 플라스크에서 해물을 분할하고 개별적으로 회전하는 것이 유익 할 수있다. 즉시 감염 HCAdV가 성공적으로 생산되는으로 공동 감염 정제 된 바이러스 입자와 HV와 스피너 플라스크에서 부유 배양을하여 바이러스 주식을 다시 증폭하기가 상대적으로 쉽다. qPCR에 측정의 gDNA를 역시 여기에 언급 된 프로토콜 또는 배양 세포에서 gDNA를의 분리에 대한 시판 키트를 통해 정제 할 수있다. 시판되는 키트를 사용하여 프로토콜 하루 단축 할 수 있지만, 감염된 세포에 존재하는 HCAdV 게놈 사본의 변화 부분이 사용 키트에 따라, 정제 중에 손실 될 수있다. 따라서 HCAdV 게놈 단계 7.4에서 제시 한 방법)에 비해 Q-PCR 측정을 다음에 약간 과소 대표 될 것입니다. Obtai마지막 벡터 준비 네드 총 감염 역가가 1 × 10 5 × 10 11 감염성 입자 하나의 스피너 플라스크 범위에서 유래. 이 양은 시험 관내 실험에서 수많은 수행하기에 충분하다. 생체 내 실험에서 또한, 표적 세포에 의존하는 여러 실시 할 수있다. 예를 들어, 전신 투여 후 충분한 간 전달을 달성하기위한 1 × 109 감염성 입자가 요구된다. 요약하면, 광범위한 세포 친 화성 및 HCAdV의 개선 된 안전성 프로파일과 함께 캡시드 - 개질 된 아데노 바이러스를 생성 할 수있는 가능성은 모든 바이러스 유전자의 결여는 이러한 HCAdV 벡터 시스템 유전자 치료 응용을위한 매우 유용한 도구를 렌더링하는 벡터.

유전자 치료 응용 것이 바이러스 단백질의 발현, 유전자 자체 또는 수신 바이러스 단백질에 의한 세포 독성 및 면역 부작용을 방지하기 위해 매우 중요하다. 아데노 바이러스 벡터 (ADV)가 널리 도입 유전자 발현 1,2의 영향을 조사하기 위해 다양한 세포에 외래 DNA를 도입하기 위해 사용된다. ADV의 가장 진보 된 버전은 모든 바이러스 코딩 서열 3,4-함으로써 낮은 면역 원성 및 저독성 5-8 결합 35킬로바이트까지 패키징을 제공하는 능력이 결여 된 고용량 아데노 바이러스 벡터 (HCAdV)으로 표시된다. 때문에 높은 포장 용량 그들은 하나의 벡터 용량을 사용하여 크거나 여러 유전자의 전달을 할 수 있습니다. 따라서, 그들은 연구 지역 사회를위한 유용한 도구를 나타냅니다. 대조적으로, 제일 - 또는 VEC를 2 세대 ADV 쉽게 상업용 키트를 사용하여 제조 할 수있다 초기 유전자 E1 및 / 또는 E3 결여 할토르 HCAdV의 게놈 구조와 바이러스 생산은 더 복잡하다. HCAdV 게놈의 건설을위한 시스템은 모든 바이러스 코딩 시퀀스 및 셔틀 플라스미드 pHM5 9-12없는 HCAdV 게놈을 운반하는 플라스미드 pAdFTC을 기반으로합니다. 최대 14 킬로베이스 (KB)의 관심의 모든 유전자가 여러 복제 사이트가 인식에 의해 형벌되는 셔틀 벡터 pHM5에 복제 할 수 있습니다 / 원점 복귀 엔도 뉴 클레아의 사이트를 절단 SceI 제한 I 및 I-CEU I.를 PI- 따라서, 관심의 유전자를 클로닝 연속 PI- 및 I-SceI 제한 I- CEU I 의해 플라스미드에 함유 pAdFTC HCAdV 게놈에 존재하는 동일한 제한 부위에 관한 후속 삽입 소화 해제 될 수있다. pAdFTC에 PI- SceI 제한 I 및 I- CEU 난 부위를 절단 사이에 유전자 삽입 부위는 스터 DNA 및 5 &#39;및 3&#39;반전으로 말단 반복 게놈 패키징에 필요한 비 암호화하는 아데노 바이러스 서열 (LTR에)와 측면으로 접하고단부와 하류 5&#39;ITR 패키징 신호 모두에서. 추가 투표자 DNA는 바이러스 생산시 효율적인 포장을 보장하기 위해 27-36킬로바이트까지 최종 HCAdV 게놈의 최적 크기를 제공합니다. pAdFTC이 (삽입 된 유전자의 크기에 따라 다름)까지 45킬로바이트와 큰 플라스미드와 비교적 긴 DNA 인식 사이트와 유도 엔도 뉴 클레아의 사용을하기 때문에 결합 강한 DNA, 몇 가지 정리 단계 pHM5에서 유전자의 전송시 필요한 전시 pAdFTC에. 전단력을 피하고 취급에주의하는 것이 좋습니다. HCAdV 게놈은 LTR에 5&#39;ITR의 상류에 직접적으로 위치되고 3&#39;ITR (12)의 하류 없음 I 제한 효소 인식 부위에 의해 측면된다. 따라서, HCAdV 없음 내가 HCAdV 생산 세포주에 바이러스 게놈의 후속 형질 다이제스트에 의해 방출 될 수있다. 참고 제한 효소의 사용하지 I REL위한플라스미드 pAdFTC에서 바이러스 게놈의 용이성 삽입 유전자가 없음 I DNA 인식 부위의 결여 된 것을 의미한다. HEK293 세포 기반 생산 세포 (116 세포)를 안정적으로 Cre 호텔 재조합 효소를 표현한다. 바이러스 증폭 셀 (116)은 트랜스 -3,4-의 복제 및 패키징을 위해 필요한 모든 ADV 유전자를 제공하는 헬퍼 바이러스 (HV)와 공동 감염. HV 116 4 세포에서 발현 Cre 호텔 재조합 바이러스에 의해 증폭되는 동안 제거 floxed 포장 신호와 제 세대 ADV이다. 이것은 본래 패키징 신호를 포함 주로 HCAdV 게놈 encapsidated되도록. HCAdV의 사전 증폭 조직 배양 접시의 표면에 성장 (116) 세포에서 시리얼 계대 단계를 수행하여 수행됩니다. 각각의 통과 후 바이러스 입자는 세 개의 연속 동결 - 해동 단계를 수행하여 감염된 세포에서 방출된다. 세포의 수가 증가는 모든 통로로 감염된선행 통로에서 세포 용 해물의 1/3. 마지막 사전 증폭 단계는 대규모 증폭 스피너 플라스크에 정지에서 재배 생산 세포를 감염하는 데 사용됩니다에서 마지막으로 해물. 비리 온은 4,12 구배 염화 세슘 밀도에서 초 원심 분리를 수행하여 현탁 세포로부터 정제된다. 이 절차를 빈 입자와 완벽하게 조립 입자는 두 가지 대역으로 분리된다. 상기 HCAdV을 집중하는 제 2 비 - 점진적으로 초 원심 분리 단계가 수행되는 입자를 포함한다. 이어서 HCAdV 함유 얻어진 밴드 수거하고 생리 완충액에 대해 투석한다. 최종 제제는 벡터의 절대 바이러스 입자 감염성 입자 및 HV 오염 수준의 숫자에 대한 특징이다. 절대 바이러스 입자는 바이러스 입자를 용균 및 260 nm에서의 흡광도를 측정함으로써 또는 정량적 실시간 PCR (qPCR에) (12)을 수행하여 결정될 수있다. 끝까지 마음의 감염ified하게 바이러스 입자는 감염된 세포에서 3 시간의 감염 후 내에 존재 qPCR의 측정 HCAdV 게놈에 의해 결정될 수있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="896">
	<tbody>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:312px;">I-CeuI</td>
			<td style="width:147px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:123px;">R0699S</td>
			<td style="width:315px;">restriction digest</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">PI-SceI</td>
			<td style="width:147px;">New England Biolabs</td>
			<td>R0696S</td>
			<td>restriction digest</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:312px;">T4 Ligase</td>
			<td style="width:147px;">New Engand Biolabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td>ligation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:312px;">SwaI</td>
			<td style="width:147px;">New England Biolabs</td>
			<td>R0604S</td>
			<td>restriction digest</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:312px;">NotI</td>
			<td style="width:147px;">New England Biolabs</td>
			<td>R0189S</td>
			<td>restriction digest</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Calf Intestinal Alkaline Phosphatase (CIP)</td>
			<td style="width:147px;">New England Biolabs</td>
			<td>M0290S</td>
			<td>dephosphorylation of digested plasmids</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Hygromycin B</td>
			<td style="width:147px;">PAN Biotech</td>
			<td style="width:123px;">P02-015</td>
			<td>selection of CRE expressing 116 cells</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DMEM</td>
			<td style="width:147px;">PAN Biotech</td>
			<td>P04-03590&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Hek293T cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:312px;">Minimal Essential Medium (MEM) Eagle</td>
			<td style="width:147px;">PAN Biotech</td>
			<td style="width:123px;">P04-08500</td>
			<td>116 cell culture medium&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Dulbecco&#8217;s phosphate buffer saline (DPBS)</td>
			<td style="width:147px;">PAN Biotech</td>
			<td style="width:123px;">P04-36500</td>
			<td>washing of cells, resuspension of cells</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:312px;">250 ml storage bottle</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">CLS430281-24EA</td>
			<td>infection of 116 cells grown in suspension</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">500mL PP CentrifugeTubes</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">CLS431123-36EA</td>
			<td>sedimentation of cells from suspension culture</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:312px;">Spinner flask</td>
			<td style="width:147px;">Bellco</td>
			<td style="width:123px;">1965-61030</td>
			<td>growth of 116 cells in suspension</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:312px;">Ultra Clear Ultracentrifuge tubes</td>
			<td style="width:147px;">Beckmann Coulter</td>
			<td style="width:123px;">344059</td>
			<td>density gradient centrifugation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:312px;">Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:147px;">Beckmann Coulter</td>
			<td style="width:123px;">&#160;--</td>
			<td>density gradient centrifugation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:312px;">SW-41 rotor</td>
			<td style="width:147px;">Beckmann Coulter</td>
			<td style="width:123px;">&#160;--</td>
			<td>density gradient centrifugation</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:312px;">Spectrum Laboratories Spectrapor Membrane</td>
			<td style="width:147px;">VWR</td>
			<td style="width:123px;">132129</td>
			<td>dialysis tubing</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">ready-to-use dialysis cassettes&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Thermo</td>
			<td style="width:123px;">66383</td>
			<td>dialysis</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">one shot DH10B electrocompetent E. coli</td>
			<td style="width:147px;">invitrogen</td>
			<td>C4040-52</td>
			<td>transformation of ligation reactions</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">PureYield&#8482; Plasmid Midiprep System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A2495</td>
			<td>midiprep</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:312px;">peqGOLD Tissue DNA Mini Kit&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Peqlab</td>
			<td>12-3396-02</td>
			<td>isolation of genomic DNA</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">SuperFect Transfection Reagent</td>
			<td style="width:147px;">Qiagen</td>
			<td style="width:123px;">301305</td>
			<td>tranfection of 116 cells</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">opti MEM (10 % FBS)&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Gibco</td>
			<td>31985-062</td>
			<td>transfection of 116 cells</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">iQ SYBR Green Supermix</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>&#160;170-8882</td>
			<td>q-PCR</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:312px;">CFX 96 C1000 touch&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Biorad</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>qPCR machine</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:312px;">Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:123px;">A156.1</td>
			<td>purification of DNA</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:312px;">Cesium chloride</td>
			<td style="width:147px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:123px;">8627.1</td>
			<td>density gradient centrifugation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">sodium acetate 99%</td>
			<td style="width:147px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:123px;">6773.2</td>
			<td>DNA precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">LB medium&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:123px;">X968.3</td>
			<td>bakterial growth medium</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">ethanol&#160; 99,8% pure</td>
			<td style="width:147px;">Carl Roth</td>
			<td>9065.5&#160;</td>
			<td>DNA precipitation and washing</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">SDS 99,5%</td>
			<td style="width:147px;">Carl Roth</td>
			<td>2326.2</td>
			<td>lysis&#160; buffer</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">EDTA</td>
			<td style="width:147px;">Carl Roth</td>
			<td>8043.2</td>
			<td>lysis&#160; buffer</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Tris-HCl 99%</td>
			<td style="width:147px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:123px;">9090.3</td>
			<td>dialysis buffer/ lysis&#160; buffer</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:312px;">glycerol 99,5%</td>
			<td style="width:147px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:123px;">3783.1</td>
			<td>dialysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgCl2 98,5%</td>
			<td style="width:147px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:123px;">KK36.2</td>
			<td>dialysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">NaCl</td>
			<td style="width:147px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:123px;">3957.1</td>
			<td>optional dialysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:312px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:147px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:123px;">3904.2</td>
			<td>optional dialysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:312px;">sucrose</td>
			<td style="width:147px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:123px;">9286.1</td>
			<td>optional dialysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:312px;">Na2HPO4x2H2O</td>
			<td style="width:147px;">Carl Roth</td>
			<td>4984.2</td>
			<td>optional dialysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">1,5ml tubes</td>
			<td style="width:147px;">sarstedt</td>
			<td style="width:123px;">72,730,005</td>
			<td>storage of&#160; virus preparations at -80&#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cloning and large-scale production of high-capacity adenoviral vectors based on the human adenovirus type 5

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high packaging capacity (up to 35 kb), low immunogenicity, and low toxicity. However, for many laboratories the use of HCAdV is hampered by the complicated procedure for vector genome construction and virus production. Here, a detailed protocol for efficient cloning and production of HCAdV based on the plasmid pAdFTC containing the HCAdV genome is described. The construction of HCAdV genomes is based on a cloning vector system utilizing homing endonucleases (I-CeuI and PI-SceI). Any gene of interest of up to 14 kb can be subcloned into the shuttle vector pHM5, which contains a multiple cloning site flanked by I-CeuI and PI-SceI. After I-CeuI and PI-SceI-mediated release of the transgene from the shuttle vector the transgene can be inserted into the HCAdV cloning vector pAdFTC. Because of the large size of the pAdFTC plasmid and the long recognition sites of the used enzymes associated with strong DNA binding, careful handling of the cloning fragments is needed. For virus production, the HCAdV genome is released by NotI digest and transfected into a HEK293 based producer cell line stably expressing Cre recombinase. To provide all adenoviral genes for adenovirus amplification, co-infection with a helper virus containing a packing signal flanked by loxP sites is required. Pre-amplification of the vector is performed in producer cells grown on surfaces and large-scale amplification of the vector is conducted in spinner flasks with producer cells grown in suspension. For virus purification, two ultracentrifugation steps based on cesium chloride gradients are performed followed by dialysis. Here tips, tricks, and shortcuts developed over the past years working with this HCAdV vector system are presented.

복제, 증폭 및 HCAdV 준비 정화용 여기에 대표적인 예는 표시됩니다. 효소 소화 제한에 의해 복제 전략의 개요 (그림 1)과 복제에 대한 대표적인 예와 HCAdV 게놈의 릴리스는 (그림 2)이 제공된다. 소화 나는 PI- SceI 제한 I 및 I-CEU에 의해 pHM5에서 GOI-발현 카세트 및 후속 페놀 - 클로로포름 추출 및 EtOH로 침전의 출시 후 일반적인 제한 패턴 (그림 2A)를 표시된다 (도 1.2 ~ 1.5 단계). 일반적 pHM5 플라스미드 백본 및 GOI의 발현 카세트에 대응하는 제 2 대역에 대응 ~ 3킬로바이트 밴드를 관찰 할 수있다. GOI 발현 카세트를 함유하는 밴드이어서, 아가 로스 겔로부터 정제한다. 정제 된 GOI-발현 카세트는 정제, 탈 인산화 pAdVFTC와 함께 아가 로스 젤에 분석 W 그정확한 크기를 확인하고 이후 결찰 (도 2B)에 대한 분자의 상대적 양을 추정하기 위해 I-SceI 제한 PI- 및 I- CEU 각각 I (단계 1.7)로 분해로. 결찰 후 암피실린에 선택 나는 포경 pAdFTC 이후 페놀 - 클로로포름 추출 및 EtOH로 침전 (1.9 단계), 결찰 제품은 박테리아와 클론로 변환 제거 소화 페놀 - 클로로포름 추출 및 EtOH로 침전과 SWA 다음 (단계 1.8 참조) LB- 한천 플레이트를 포함. 일반적으로 클론의 수백 수십 5- 10 클론 플라스미드 DNA 미니 준비에 대한 준비가되어있는, 얻을 수있다. 함께 음성 대조군 (도 1.10 단계 참조) 빈 pAdFTC와 긍정적이고 부정적인 클론의 분석 Hinc II 다이제스트의 제한 패턴 (그림 2C) 표시됩니다. 여기에 긍정적 인 클론 빈 pAdFTC과 부정 복제 및 1.7 kb의 단편이 표시에 존재 5킬로바이트 밴드를 표시하지 않습니다즉, 빈 pAdFTC 음의 클론에 존재하지 않습니다. 이 각각의 GOI를 들어이 그쪽으로 복제가 성공을 나타냅니다. midiprep를 통해 정제 된 긍정적 인 클론은 pAdVFTC-GOI (단계 2.2)에서 GOI를 들고 HCAdV 게놈을 해제 없음 TI로 소화했다. 마지막 아니오 TI는 IST 회 116 세포 내로 형질 감염에 대한 후속 DNA의 높은 순도를 보장하는 페놀 - 클로로포름 추출 및 침전을 EtOH를 사용하여 정제 DNA를 소화되지. 아니오 TI의 작은 분획의 분석은 아가 로스 겔상에서 pAdVFTC-GOI 소화 pAdFTC 플라스미드 백본 (GOI 발현 카세트의 크기에 따라) ~ 최대 36킬로바이트의 큰 대역에 대응 ~ 9킬로바이트 대역을 도시 HCAdV 게놈 (그림 2D)에 해당. 증폭 및 정제 파이프 라인의 개요를 개략적으로 (도 3)를 나타낸다. 벡터 사전 증폭 프로세스 모니터링의 대표적인 예들이 제공된다 ( <stronG&gt; 그림 4). 바이러스 해물의 일련 계대에 의해 사전 증폭 과정에서 바이러스 게놈의 전형적인 증폭 곡선, HV (섹션 2)와 coinfecting 때마다이, 그이 qPCR에 (섹션 3)에 의해 측정 하였다 (그림 4A)에 표시됩니다. 벡터 게놈의 수는 일반적으로 첫 번째 구절 중에 descreases 강하게 이후 구절에 증가합니다. 10 (6)의 벡터의 카피 수 - 15000 10 7 세포 당 3 리터 스피너 플라스크에서 대규모 생산을위한 116 세포를 감염시키기에 충분하다. HCAdV 벡터 게놈 내에서 GOI가 GFP 발현 카세트를 포함하는 경우, 사전 증폭 과정 (2 절)도 형광 현미경으로 모니터링 할 수 있습니다. 각 통로의 대표 사진 (그림 4B) 표시됩니다. GFP 양성 세포의 수는 보통 첫번째 통로 중에 감소하고 강하게 늦은 통로에서 증가합니다. GFP 양성 세포의 수는 ~ 100 %에 도달하면, 벡터 suff 증폭시켰다iciently 3 리터 스피너 플라스크에 대규모 생산을위한 116 세포를 감염합니다. HCAdV 함유 GFP 발현 카세트의 대규모 증폭 프로세스는 조직 배양 접시에 스피너 플라스크로 옮겼다 된 배양 배지 및 세포의 현미경 분석에 의해 모니터링 하였다. 현탁 배양에 HCAdV을 생산하는 세포의 현미경 사진 (4.4 및 4.11 단계 참조) (그림 4C)를 제공한다. 세포가 선행하는 세포의 성장이 충분하고 세포가 건강을 나타내는 대단히 짧은 시간에 성장하고 있습니다. 이러한 세포의 형광 현미경 ~ 100 %를 사용하는 경우하면 생물 반응기하고 효율적인 벡터 생산 정지 세포의 효율적인 전달을 나타내는, GFP 양성이었다. 벡터 입자는 협동 학습 초 원심 분리에 의한 매체와 3리터의 현탁 배양 세포에서 정제 하였다. CSCL 밀도 구배 초 원심 분리를 이용하여 HCAdV 벡터 정화의 대표 이미지 (그림 5) 표시됩니다. 후N 협동 학습 단계 구배를 사용하여 초기 원심 분리는 일반적으로 두 밴드가 관찰된다. 낮은 대역의 DNA가 포함 벡터 입자 (단계 5.4- 5.5) (그림 5A)로 구성되는 반면 상위 대역 부분 캡시드의 빈 포함되어 있습니다. 벡터 입자를 함유하는 DNA는이어서 (단계 5.6)을 수확 벡터 입자를 집중 초 초 원심 분리 단계에 대한 풀링된다. 이 마지막 단계는 일반적으로 후속 투석 (단계 5.7- 5.8) (도 5b)에 대한 수확 벡터 DNA 함유 입자의 단일 밴드 초래한다. 투석 벡터 제제는 절대 입자 감염성 입자 및 HV 오염 수 측정을 특징으로 하였다. 적정 절차 (섹션 6 및 7)의 개략적 인 개요 (도 6)가 제공된다. 최종 벡터 준비의 특성에 대한 대표 결과 (그림 7) 표시됩니다. 막대 차트는 일반적인 벡터 입자 번호를 표시이 프로토콜에서 설명하는 절차에 의해 얻어진. 벡터 입자의 절대 입자 번호는 광학 밀도 (제 6 조), 감염성 벡터 입자와 HV 오염에 의해 결정 하였다는 qPCR에 (7) (그림 7A)에 의해 측정 하였다. 경험 OD 역가 바이러스 입자의 수​​를 과대 평가 것을 보여준다. (OD)에 의해 측정 된 절대 바이러스 입자는 Q-PCR로 측정 감염성 바이러스 입자보다 500 배 높은 20이 될 수 있습니다. 모두 Q-PCR (7 항)에 의해 측정했을 때 감염성 벡터 입자는 usally 절대 입자의 10 5 % 사이의 범위. 벡터의 제조는 매우 좋은 품질을 가지고있는 경우, 절대 입자의 20 % 이상은 감염성이다. HV 및 전염성 HCAdV 입자 (단계 7.14) 사이의 전형적인 비율은 일반적으로 감염성 입자의 1-5% (그림 7B) 사이의 범위. HV 복제 결핍으로이 허용됩니다. 그럼에도 불구하고 가능한 한 적게 HV 오염 등 (&lt;감염성 입자의 1 %) 것선호. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52894/52894fig1.jpg" /> pAdFTC에 GOI를 복제 그림 1. 순서도. GOI는 pHM5 셔틀 플라스미드의 MCS로 복제됩니다. 플라스미드 pAdFTC 및 pHM5-GOI은 I-CEU I 및 PI- SceI 제한 I로 분해 페놀 - 클로로포름 추출 및 EtOH를 침전에 의해 정제된다. 소화 pAdFTC 플라스미드 탈 인산화 반면 소화 pHM5은 관심 유전자 (또한 단계 1.5 참조) 정제 제조용 아가 로스 겔에 로딩한다. 이어서 CIP 처리 pAdFTC와 연결 반응과 트랜스 유전자 발현 카세트를 설정한다 (단계 1.8 참조) 완료 후, 페놀 - 클로로포름 추출 및 침전을 EtOH로 정제한다. 페놀 - 클로로포름 추출 및 침전을 EtOH이어서 결찰 생성물의 후속 SWA I 다이제스트 삽입없이 pAdFTC 운반 클론의 성장을 방지한다. 블랙 트리각도는 제한 효소 인식 부위를 나타낸다; 회색 상자가 AdV5 터미널 반복 반전 표시 (ITR), Ψ로 표시된 흰색 상자가 AdV5 포장 신호를 표시, 빨간색 화살표는 프로모터를 나타내고, 녹색 상자 (관심의 유전자, GOI)로 표현되는 유전자를 표시, 파란색 상자는 폴리아 데 닐화 신호, 오렌지 나 블루를 표시 화살표 플라스미드 백본의 항생제 내성 유전자를 표시, 각각. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52894/52894fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52894/52894fig2.jpg" /> 그림 pAdVFTC에서 HCAdV 게놈의 복제 절차 및 자료 2. 대표 결과. PI- SceI 제한 I 및 I-CEU 나는 다이제스트 (도 1.2 ~ 1.5 단계 참조) pHM5에서 GOI-발현 카세트의 (A) 릴리스. (B) </stroNG&gt; PI- SceI 제한 I 및 I-CEU 각각 I (단계 1.7)로 분해 GOI-발현 카세트 및 정제, 탈 인산화 pAdVFTC를 정제 하였다. (C)와 GOI (또한 1.10 단계 참조)없이 pAdVFTC 클론의 분석 Hinc II 다이제스트. 아니 TI 다이제스트에 의해 pAdVFTC-GOI에서 GOI를 들고 HCAdV - 게놈 (단계 2.2)의 (D) 릴리스 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52894/52894fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52894/52894fig3.jpg" /> . 고용량 아데노 바이러스 벡터 증폭 및 정제를위한도 3 개략도 (A) HCAdV의 DNA 형질 감염 및 헬퍼 바이러스 (HV) 감염 : HCAdV 프로듀서 세포주에 GOI 운반 선형화 HCAdV 게놈의 형질 감염 (116 세포 [4]) 및 SUHV AdNG163R-2 bsequent 감염 [4]. &#160; (B) HCAdV 증폭 : 사전 증폭 단계 후에 연속적으로 새로운 조직 배양 접시에 세포 용 해물을 전송 및 HV와 공동 감염시켜, 대규모 생산을 3 L의 현탁 배양에서 수행된다 (C) HCAdV 정화 :. 들어 정제, 바이러스는 염화 세슘 구배를 사용하여 초 원심 분리에 의해 단리된다 (D) 투석 :. 정제 HCAdV 입자는 2 L 저장 완충액에 대해 투석한다. HCAdV, 고용량의 아데노 바이러스 벡터; ITR, 아데노 바이러스 혈청 형 5 터미널 반복 반전; Ψ, 포장 신호; HV, 헬퍼 바이러스; MOI, 감염의 다양성은. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52894/52894fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52894/52894fig4.jpg" /> &lt;BR /&gt; 증폭 과정 qPCR에를 사용하여 바이러스 게놈의 증폭에 의해 사전 증폭 과정 (A) 모니터링의 그림 4. 대표 결과 (또한 제 3 절 참조). (B)는 GOI이 유전자로 GFP가 포함되어있는 경우, 사전 - 증폭 과정은 형광 현미경에 의해 모니터 될 수있다. (C)는 스피너 플라스크에서 대규모 증폭 과정의 대표 결과 HCAdV 부호화 GFP위한 examplified. 왼쪽 패널은 스피너 플라스크에서 감염된 116 세포의 현미경 사진을 보여줍니다. 배지 및 세포 시료를 60mm 조직 배양 접시에 옮겼다. 증폭 된 세포 덩어리가 볼 수 있습니다. 오른쪽 패널은 형광 현미경을 사용하여 같은 그림을 보여줍니다. 세포의 거의 100 % HCAdV는 GFP를 운반하는 형질 도입된다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52894/52894fig4large.jpg" target="_blank">여기를 클릭하십시오</a>이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/52894/52894fig5.jpg" /> CSCL 구배 원심 분리 한 후 그림 5. 대표 결과 (A) 단계 구배 (도 5.5 단계 참조)을 수행 후,.. 연속 그라데이션 (또한 5.7 단계) 후에 (B)를 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52894/52894fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/52894/52894fig6.jpg" /> 적정 절차의 개요 제 도식도. 감염성 입자의 (A) 측정 : 멀티 웰 플레이트의 세포가 정제 된 바이러스의 서로 다른 볼륨에 감염된 세포 펠렛으로 수집 (B) 측정 오.절대 입자 F : Unifected 세포를 트립신 처리하고 원심 분리에 의해 수집되는 멀티 웰을 형성한다. 부유 정제 바이러스가 추가되고 게놈 DNA가 고립 된 후. 게놈 DNA의 (C) 분리. (D) 정량 PCR (Q-PCR)을 수행 바이러스 게놈 사본 번호를 정량화하기. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52894/52894fig6large.jpg" target="_blank">이의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 그림.</a> <img alt="그림 7" src="/files/ftp_upload/52894/52894fig7.jpg" /> 최종 벡터 준비의 특성 7. 대표 결과 그림. (A) 다른 방법으로 결정될 제시된 프로토콜에 따라 벡터 제제의 입자의 절대 번호 :. OD 역가가 qPCR의 (7)에 의해 측정 된 광학 밀도 (6 장), 전염성 역가 HV 오염에 의해 측정 한 (B)qPCRs (7 항)에 의해 측정 된 총 감염 HCAdV 입자와 HV 오염 레벨 사이의 비율. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52894/52894fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

A protocol for generation of high-capacity adenoviral vectors lacking all viral coding sequences is presented. Cloning of transgenes contained in the vector genome is based on homing endonucleases. Virus amplification in producer cells grown as adherent cells and in suspension relies on a helper virus providing viral genes in trans.

인간 아데노 바이러스 유형 5를 기반으로 대용량 아데노 바이러스 벡터의 클로닝 및 대규모 생산

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.3K 조회수.  University Witten/Herdecke. A protocol for generation of high-capacity adenoviral vectors lacking all viral coding sequences is presented. Cloning of transgenes contained in the vector genome is based on homing endonucleases. Virus amplification in producer cells grown as adherent cells and in suspension relies on a helper virus providing viral genes in trans. 

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Synthetic Spider Silk Production on a Laboratory Scale

As society progresses and resources become scarcer, it is becoming increasingly important to cultivate new technologies that engineer next generation biomaterials with high performance properties. The development of these new structural materials must be rapid, cost-efficient and involve processing methodologies and products that are environmentally friendly and sustainable. Spiders spin a multitude of different fiber types with diverse mechanical properties, offering a rich source of next generation engineering materials for biomimicry that rival the best manmade and natural materials. Since the collection of large quantities of natural spider silk is impractical, synthetic silk production has the ability to provide scientists with access to an unlimited supply of threads. Therefore, if the spinning process can be streamlined and perfected, artificial spider fibers have the potential use for a broad range of applications ranging from body armor, surgical sutures, ropes and cables, tires, strings for musical instruments, and composites for aviation and aerospace technology. In order to advance the synthetic silk production process and to yield fibers that display low variance in their material properties from spin to spin, we developed a wet-spinning protocol that integrates expression of recombinant spider silk proteins in bacteria, purification and concentration of the proteins, followed by fiber extrusion and a mechanical post-spin treatment. This is the first visual representation that reveals a step-by-step process to spin and analyze artificial silk fibers on a laboratory scale. It also provides details to minimize the introduction of variability among fibers spun from the same spinning dope. Collectively, these methods will propel the process of artificial silk production, leading to higher quality fibers that surpass natural spider silks.

Despite the outstanding mechanical and biochemical properties of spider silks, this material cannot be harvested in large quantities by conventional means. Here we describe an efficient strategy to spin artificial spider silk fibers, which is an important process for investigators studying spider silk production and their use as next-generation biomaterials.

실험실 규모의 합성 거미의 실크 생산

As society progresses and resources become scarcer, it is becoming increasingly important to cultivate new technologies that engineer next generation ...

연구

생체공학

Multi-analyte Biochip (MAB) Based on All-solid-state Ion-selective Electrodes (ASSISE) for Physiological Research

Lab-on-a-chip (LOC) applications in environmental, biomedical, agricultural, biological, and spaceflight research require an ion-selective electrode (ISE) that can withstand prolonged storage in complex biological media 1-4. An all-solid-state ion-selective-electrode (ASSISE) is especially attractive for the aforementioned applications. The electrode should have the following favorable characteristics: easy construction, low maintenance, and (potential for) miniaturization, allowing for batch processing. A microfabricated ASSISE intended for quantifying H+, Ca2+, and CO32- ions was constructed. It consists of a noble-metal electrode layer (i.e. Pt), a transduction layer, and an ion-selective membrane (ISM) layer. The transduction layer functions to transduce the concentration-dependent chemical potential of the ion-selective membrane into a measurable electrical signal.
The lifetime of an ASSISE is found to depend on maintaining the potential at the conductive layer/membrane interface 5-7. To extend the ASSISE working lifetime and thereby maintain stable potentials at the interfacial layers, we utilized the conductive polymer (CP) poly(3,4-ethylenedioxythiophene) (PEDOT) 7-9 in place of silver/silver chloride (Ag/AgCl) as the transducer layer. We constructed the ASSISE in a lab-on-a-chip format, which we called the multi-analyte biochip (MAB) (Figure 1).
Calibrations in test solutions demonstrated that the MAB can monitor pH (operational range pH 4-9), CO32- (measured range 0.01 mM - 1 mM), and Ca2+ (log-linear range 0.01 mM to 1 mM). The MAB for pH provides a near-Nernstian slope response after almost one month storage in algal medium. The carbonate biochips show a potentiometric profile similar to that of a conventional ion-selective electrode. Physiological measurements were employed to monitor biological activity of the model system, the microalga Chlorella vulgaris.
The MAB conveys an advantage in size, versatility, and multiplexed analyte sensing capability, making it applicable to many confined monitoring situations, on Earth or in space.
Biochip Design and Experimental Methods
The biochip is 10 x 11 mm in dimension and has 9 ASSISEs designated as working electrodes (WEs) and 5 Ag/AgCl reference electrodes (REs). Each working electrode (WE) is 240 &mu;m in diameter and is equally spaced at 1.4 mm from the REs, which are 480 &mu;m in diameter. These electrodes are connected to electrical contact pads with a dimension of 0.5 mm x 0.5 mm. The schematic is shown in Figure 2.
Cyclic voltammetry (CV) and galvanostatic deposition methods are used to electropolymerize the PEDOT films using a Bioanalytical Systems Inc. (BASI) C3 cell stand (Figure 3). The counter-ion for the PEDOT film is tailored to suit the analyte ion of interest. A PEDOT with poly(styrenesulfonate) counter ion (PEDOT/PSS) is utilized for H+ and CO32-, while one with sulphate (added to the solution as CaSO4) is utilized for Ca2+. The electrochemical properties of the PEDOT-coated WE is analyzed using CVs in redox-active solution (i.e. 2 mM potassium ferricyanide (K3Fe(CN)6)). Based on the CV profile, Randles-Sevcik analysis was used to determine the effective surface area 10. Spin-coating at 1,500 rpm is used to cast ~2 &mu;m thick ion-selective membranes (ISMs) on the MAB working electrodes (WEs).
The MAB is contained in a microfluidic flow-cell chamber filled with a 150 &mu;l volume of algal medium; the contact pads are electrically connected to the BASI system (Figure 4). The photosynthetic activity of Chlorella vulgaris is monitored in ambient light and dark conditions.

Multi-analyte Biochip MAB Based on All-solid-state Ion-selective Electrodes ASSISE for Physiological Research

All-solid-state ion-selective electrodes (ASSISEs) constructed from a conductive polymer (CP) transducer provide several months of functional lifetime in liquid media. Here, we describe the fabrication and calibration process of ASSISEs in a lab-on-a-chip format. The ASSISE is demonstrated to have maintained a near-Nernstian slope profile after prolonged storage in complex biological media.

생리 연구를위한 모든 고체 이온 선택성 전극 (ASSISE)를 기반으로 다중 분석 바이오칩 (MAB)

Lab-on-a-chip (LOC) applications in environmental, biomedical, agricultural, biological, and spaceflight research require an ion-selective electrode (ISE) ...

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(&#949;-caprolactone) Electrospun Yarns

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell number. While researchers commonly reference their seeding density this does not necessarily indicate the actual number of cells that have adhered to the material in question. This is particularly the case for materials, or scaffolds, that do not cover the base of standard cell culture well plates. This study investigates the initial attachment of human mesenchymal stem cells seeded at a known number onto electrospun poly(&#949;-caprolactone) yarn after 4 hr in culture. Electrospun yarns were held within several different set-ups, including bioreactor vessels rotating at 9 rpm, cell culture inserts positioned in low binding well plates and polytetrafluoroethylene (PTFE) troughs placed within petri dishes. The latter two were subjected to either static conditions or positioned on a shaker plate (30 rpm). After 4 hr incubation at 37&#160;oC, 5% CO2, the location of seeded cells was determined by cell DNA assay. Scaffolds were removed from their containers and placed in lysis buffer. The media fraction was similarly removed and centrifuged &#8211; the supernatant discarded and pellet broken up with lysis buffer. Lysis buffer was added to each receptacle, or well, and scraped to free any cells that may be present. The cell DNA assay determined the percentage of cells present within the scaffold, media and well fractions. Cell attachment was low for all experimental set-ups, with greatest attachment (30%) for yarns held within cell culture inserts and subjected to shaking motion. This study raises awareness to the actual number of cells attaching to scaffolds irrespective of the stated cell seeding density.

This article describes a range of set-ups for seeding human mesenchymal stem cells onto materials, in this case electrospun yarns, that do not cover the base of standard culture well plates in order to maximize and quantify the number of cells that initially attach compared to the known seeding density.

폴리 (ε 카프로 락톤) 전기 방사 원사에 인간 중간 엽 줄기 세포의 첨부 파일을 최적화

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell ...

Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product to demonstrate how regulating nutrient levels can improve cell yields. In previous studies, bioreactors facilitated increased culture volumes over static cultures, but no increase in cell yields were observed. Limitations in key nutrients such as glucose, which were consumed between batch feedings, can lead to limitations in cell expansion. Large fluctuations in glucose levels were observed, despite the increase in glucose concentrations in the media. The use of continuous feeding systems eliminated fluctuations in glucose levels, and improved cell growth rates when compared with batch fed static and SSB culture methods. Additional increases in growth rates were observed by adjusting the feed rate based on calculated nutrient consumption, which allowed the maintenance of physiological glucose over three weeks in culture. This method can also be adapted for other cell types.

Nutrient regulation using continuous growth adjusted feeding improves growth rates of mammalian cell spheroids compared to intermittent batch feeding for cultures in stirred suspension bioreactors. This study demonstrates the methods required for establishing simple adjusted rate fed cultures.

회전 타원체의 포유 동물 세포의 대규모 확장을위한 지속적인 공급함으로써 영양 규정

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product ...

Evaluation of Keratinocyte Proliferation on Two- and Three-dimensional Type I Collagen Substrates

Type I collagen, useful as a substrate for cell culture, exists in two forms: the two-dimensional, non-fibrous form and three-dimensional, fibril form. Both forms can be prepared with the same type I collagen. In general, the non-fibrous form promotes cell adhesion and proliferation. The fibril form (gels) provides more physiological conditions in many types of cells; therefore, gel culture is useful for examining physiological behaviors of cells, such as drug efficacy.
Researchers can select the appropriate form according to the purpose of its use. For example, in the case of keratinocytes, on-gel culture has been used as a wound healing model. FEPE1L-8, a keratinocyte cell line cultured on the non-fibrous form of type I collagen, promote cell adhesion. Notably, keratinocyte proliferation is slower on the fibril form than the non-fibrous form. Protocols for the preparation of type I collagen for cell culture are simple and have wide applications depending on the experimental needs.

Here, we present a protocol for the preparation of two different forms of culture substrates utilizing type I collagen. Depending on how collagen is handled, collagen molecules either maintain two-dimensional, non-fibrous form or reassemble into three-dimensional, fibril form. Cell proliferation on type I collagen is drastically affected by fibril formation.

Keratinocyte 확산에 2-및 3 차원의 평가 유형 I 교원 질 기판

Type I collagen, useful as a substrate for cell culture, exists in two forms: the two-dimensional, non-fibrous form and three-dimensional, fibril form. ...

Cerebral Blood Flow-Based Resting State Functional Connectivity of the Human Brain using Optical Diffuse Correlation Spectroscopy

To obtain a comprehensive understanding of the human brain, utilization of cerebral blood flow (CBF) as a source of contrast is desired because it is a key hemodynamic parameter related to cerebral oxygen supply. Resting state low frequency fluctuations based on oxygenation contrast have been shown to provide correlations between functionally connected regions. The presented protocol uses optical diffuse correlation spectroscopy (DCS) to assess blood flow-based resting state functional connectivity (RSFC) in the human brain. Results of CBF-based RSFC in human frontal cortex indicate that intra-regional RSFC is significantly higher in the left and right cortices compared to inter-regional RSFC in both cortices. This protocol should be of interest to researchers who employ multi-modal imaging techniques to study human brain function, especially in the pediatric population.

This protocol demonstrates how to measure resting state functional connectivity in the human prefrontal cortex using a custom-made diffuse correlation spectroscopy instrument. The report also discuss practical aspects of the experiment as well as detailed steps for analyzing the data.

광학 확산 상관 분광법을 사용하여 인간의 뇌의 대뇌 혈류 기반 휴식 상태 기능 적 연결

To obtain a comprehensive understanding of the human brain, utilization of cerebral blood flow (CBF) as a source of contrast is desired because it is a ...

An Efficient Method for Adenovirus Production

Adenoviral transduction has the advantage of a strong and transient induction of the expression of the gene of interest into a broad variety of cell types and organs. However, recombinant adenoviral technology is laborious, time-consuming, and expensive. Here, we present an improved protocol using the pAdEasy system to obtain purified adenoviral particles that can induce a strong green fluorescent protein (GFP) expression in transduced cells. The advantages of this improved method are faster preparation and decreased production cost compared to the original method developed by Bert Vogelstein. The main steps of the adenoviral technology are: (1) the recombination of pAdTrack-GFP with the pAdEasy-1 plasmid in BJ5183 bacteria; (2) the packaging of the adenoviral particles; (3) the amplification of the adenovirus in AD293 cells; (4) the purification of the adenoviral particles from cell lysate and culture medium; and (5) the viral titration and functional testing of the adenovirus. The improvements to the original method consist of (i) the recombination in BJ5183-containing pAdEasy-1 by chemical transformation of bacteria; (ii) the selection of recombinant clones by &#8220;negative&#8221; and &#8220;positive&#8221; PCR; (iii) the transfection of AD293 cells using the K2 transfection system for adenoviral packaging; (iv) the precipitation with ammonium sulfate of the viral particles released by AD293 cells in cell culture medium; and (v) the purification of the virus by one-step cesium chloride discontinuous gradient ultracentrifugation. A strong expression of the gene of interest (in this case, GFP) was obtained in different types of transduced cells (such as hepatocytes, endothelial cells) from various sources (human, bovine, murine). Adenoviral-mediated gene transfer represents one of the main tools for developing modern gene therapies.

Here, we present a protocol for adenovirus production using the pAdEasy system. The technology includes the recombination of the pAdTrack and pAdEasy-1 plasmids, the adenovirus packaging and amplification, the purification of the adenoviral particles from cell lysate and culture medium, the viral titration, and the functional testing of the adenovirus.

아데노바이러스 생산을 위한 효율적인 방법

Adenoviral transduction has the advantage of a strong and transient induction of the expression of the gene of interest into a broad variety of cell types ...

Cultivating a Three-dimensional Reconstructed Human Epidermis at a Large Scale

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process and the characterization of the model is described. Neonatal primary keratinocytes are grown submerged on permeable polycarbonate inserts and lifted to the air-liquid interface three days after seeding. After fourteen days of stimulation with defined growth factors and ascorbic acid in high calcium culture medium, the model is fully differentiated. Histological analysis revealed a completely stratified epidermis, mimicking the morphology of native human skin. To characterize the model and its barrier functions, protein levels and localization specific for early-stage keratinocyte differentiation (i.e., keratin 10), late-stage differentiation (i.e., involucrin, loricrin, and filaggrin) and tissue adhesion (i.e., desmoglein 1), were assessed by immunofluorescence. The tissue barrier integrity was further evaluated by measuring transepithelial electrical resistance. Reconstructed human epidermis was responsive to proinflammatory stimuli (i.e., lipopolysaccharide and tumor necrosis factor alpha), leading to increased cytokine release (i.e., interleukin 1 alpha and interleukin 8). This protocol represents a straightforward and reproducible in vitro method to cultivate reconstructed human epidermis as a tool to assess environmental effects and a broad range of skin-related studies.

This protocol describes a straightforward method to cultivate three-dimensional reconstituted human epidermis in a reproducible and robust manner. Additionally, it characterizes the structure-function relationship of the epidermal barrier model. The biological responses of the reconstituted human epidermis upon proinflammatory stimuli are also presented.

대규모로 3차원 재건 된 인간 표피 를 육성

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process ...

Production of Membrane-Filtered Phase-Shift Decafluorobutane Nanodroplets from Preformed Microbubbles

There are many methods that can be used for the production of vaporizable phase-shift droplets for imaging and therapy. Each method utilizes different techniques and varies in price, materials, and purpose. Many of these fabrication methods result in polydisperse populations with non-uniform activation thresholds. Additionally, controlling the droplet sizes typically requires stable perfluorocarbon liquids with high activation thresholds that are not practical in vivo. Producing uniform droplet sizes using low-boiling point gases would be beneficial for in vivo imaging and therapy experiments. This article describes a simple and economical method for the formation of size-filtered lipid-stabilized phase-shift nanodroplets with low-boiling point decafluorobutane (DFB). A common method of generating lipid microbubbles is described, in addition to a novel method of condensing them with high-pressure extrusion in a single step. This method is designed to save time, maximize efficiency, and generate larger volumes of microbubble and nanodroplet solutions for a wide variety of applications using common laboratory equipment found in many biological laboratories.

This protocol describes a method of generating large volumes of lipid encapsulated decafluorobutane microbubbles using probe-tip sonication and subsequently condensing them into phase-shift nanodroplets using high-pressure extrusion and mechanical filtration.

미리 형성된 마이크로버블에서 멤브레인 여과 위상 시프트 데카플루오로부탄 나노방울의 생산

There are many methods that can be used for the production of vaporizable phase-shift droplets for imaging and therapy. Each method utilizes different ...

Microtubule Plus-End Dynamics Visualization in Huntington's Disease Model based on Human Primary Skin Fibroblasts

Transfection with a fluorescently labeled marker protein of interest in combination with time-lapse video microscopy is a classic method of studying the dynamic properties of the cytoskeleton. This protocol offers a technique for human primary fibroblast transfection, which can be difficult because of the specifics of primary cell cultivation conditions. Additionally, cytoskeleton dynamic property maintenance requires a low level of transfection to obtain a good signal-to-noise ratio without causing microtubule stabilization. It is important to take measures to protect the cells from light-induced stress and fluorescent dye fading. In the course of our work, we tested different transfection methods and protocols as well as different vectors to select the best combination of conditions suitable for human primary fibroblast studies. We analyzed the resulting time-lapse videos and calculated microtubule dynamics using ImageJ. The dynamics of microtubules' plus-ends in the different cell parts are not similar, so we divided the analysis into subgroups - the centrosome region, the lamella, and the tail of fibroblasts. Notably, this protocol can be used for in vitro analysis of cytoskeleton dynamics in patient samples, enabling the next step towards understanding the dynamics of the various disease development.

This protocol is dedicated to the microtubule plus-end visualization by EB3 protein transfection to study their dynamic properties in primary cell culture. The protocol was implemented on human primary skin fibroblasts obtained from Huntington's disease patients.

인간 1차 피부 섬유아세포를 기반으로 한 헌팅턴 병 모델의 마이크로튜블러 플러스 엔드 다이내믹스 시각화

Transfection with a fluorescently labeled marker protein of interest in combination with time-lapse video microscopy is a classic method of studying the ...