Special thanks to the personnel of the University of Georgia Health Center laboratory for their continuous support of our work on isolating human neutrophils. This work was supported by the start-up fund of Dr. Rada provided by UGA Office of Vice President for Research.

조지아 대학의 임상 시험 심사위원회는 건강한 지원자 (UGA 번호 2012-10769-06)에서 말초 혈액을 수집하는 인간 대상 연구를 승인했다. 5,7,8 자원 봉사자 혈액 그리기 전에 필요한 정보 동의서에 서명했다. 이 문서에서 수행 된 연구는 헬싱키 선언의 인체를 이용한 의학 연구에 대한 윤리 지침을 준수합니다. 주변 인간의 혈액에서 호중구의 1. 분리 (그림 1) 주 : 말초 혈액 호중구를 분리하는 방법에는 여러 가지가있다. 다음 프로토콜은 하나의 가능성을 제공합니다. 이 프로토콜은 외부 자극에 그물을 방출 할 수있는 비 - 활성화 인간 호중구 다수 산출한다. 40 ml의 정맥 천자에 의한 건강한 지원자에서 얻은 전체 혈액을 사용합니다. 7,9 <ol><li> 두 50 ML 원뿔 튜브로 나누어지는 20 ml의 혈액입니다. 10 ml의 6 % 덱스 트란을 추가합니다. 부드럽게 섞는다. </li><li> 20 분 이전 백혈구 후에 RIC깨끗한 50 ML 원뿔 튜브에 어떤 펠렛 적혈구를 복용하고, 멸균 PBS로를 작성하지 않고 시간 상위 단계입니다. </li><li> 400 XG에 10 분 원심 분리기. 4 용액에 재현 탁 펠렛은 PBS를 멸균. </li><li> 85 %의 5 단계 퍼콜 구배를 준비 -80 % -75 % -70 % -65 %이 15 ML 원뿔 튜브 및 레이어 2 ㎖의 백혈구 서스펜션의 각 그라데이션의 상단에. </li><li> 브레이크 해제와 함께 30 분 동안 원심 분리기 800 XG. </li><li> 모든 셀 75 % / 80 %에서 레이어 (호중구) 70 % / 75 % 인터페이스를 수집합니다. </li><li> PBS에 두 번 (350 XG, 10 분, RT)을 세포를 씻으과 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다. </li></ol> 마이크로 플레이트 형광 계를 사용하여 세포 외 DNA 자료의 속도론 2. 측정 참고 :이 방법은 막 불 투과성 DNA 결합 96 웰 마이크로 포맷에 DNA 자료를 나타내는 염료 (그림 2)의 형광의 변화를 측정 할 수 있습니다. <ol><li> + 분석 매체에서 호중구의 현탁액 (HBSS 준비2 × 106 세포 / ml의 농도에서 1 % (v / v)의자가 혈청 + 5 mM의 포도당). </li><li> 막 투과성 DNA 결합 염료의 5 μmol / L를 추가합니다. 부드럽게 섞는다. </li><li> 나누어지는 인간 호중구 (50 μL / 웰) 마이크로 96 웰 블랙, 투명 바닥 위에. 확인 분석 배지를 웰의 전체 바닥을 포함합니다. 그렇지 않은 경우, 측면에 부드럽게 판을 누릅니다. </li><li> 37 ° C에서 10 분간 플레이트 포함 호중구을 따뜻하게. </li><li> 한편 최종 농도의 두 배에 자극의 솔루션을 준비하는 것은 사용되는 (37 ° C 따뜻한 분석 매체에서). 긍정적 인 NET 컨트롤이 최대 NET 자료를 트리거하기 위해 4 시간 동안 100 나노 포르 - 미리 스테이트 아세테이트 (PMA)와 인간 호중구를 사용할 때 자발적 NET 형성이 낮은 5,8 남아있다. 4 시간 동안 5,8 PMA 자극은 최대 NET 자료를 보장합니다. </li><li> 측정 (4 시간, 37 ° C, 여기에 대한 530 nm의 및 배출을위한 590 ㎚)에 대한 마이크로 형광 계를 준비​​합니다. &lt;/ 리&gt; <li> 50 μL 호중구 현탁액 50 μL 자극 용액을 첨가하여 호중구를 자극한다. 최대 DNA 해제 신호를 측정하기 위해 잘 한 0.5 μg의 / ㎖ 사포닌을 사용합니다. </li><li> 리더 플레이트를 놓고없이 진탕 매 2 분에서 4 시간 동안 형광의 변화를 측정한다. </li><li> 데이터 분석을 위해, 시간에 따른 형광의 증가 정규화를 계산한다. <ol><li> 사포닌을 포함한 모든 우물 용 엔드 포인트 값에서 빼기 기준 형광 (그림 2A, B). 사포닌 형광 상승이 가장 높은 신호이어야한다. 이것은 &quot;DNA 최대 방출&quot;(도 2A)로 지칭된다. </li><li> 최대 DNA 릴리스 미지 시료의 형광의 증가를 분할하여 미지 시료에서 DNA 방출의 비율을 계산합니다. </li><li> 복제의 평균 결과는 &quot;최대 DNA의 출시 %&quot;(그림 2C)로 제시. </li></ol></li></ol> NET 양식 3. 정량MPO-DNA와 HNE-DNA ELISA 분석 실험에 의해 ATION 참고 : 우리의 실험실에서이 분석 수정 (MPO-DNA) 또는 설립 (HNE-DNA)를 MPO-DNA와 HNE-DNA 복합체의 수준을 측정하여 NET 형성을 정량 5. <ol><li> 코트 96 웰 높은 결합 하룻밤 캡처 항체 (50 μL / 웰) 용량 ELISA 플레이트 : 안티 - MPO (1 : 2,000 희석) 또는 안티 HNE (1 : 2,000). </li><li> PBS로 세척 ELISA 플레이트는 세 번 (200 μL / 웰)와 RT에서 2 시간 동안 5 % BSA 및 0.1 % 인간 혈청 알부민을 블록 (200 μL / 웰). PBS로 3 회 세척 할 것. </li><li> 시드 96 웰 마이크로 / 웰로 100 ㎕를 분석 배지 중 100,000 세포의 밀도로 호중구 및 NET 형성을 자극한다. 세포를 품어 : 37 ° C 4 시간. </li><li> 그들을 잘 혼합, 호중구 상층 액 2 U / ㎖ DNase를 추가하여 제한된 DNase의 소화를 수행합니다. 실온에서 보관하십시오. </li><li> 11 μL 25 밀리미터 EGTA (최종 농도 2.5 mm)를 추가하여 15 분 후 DNase의를 중지합니다. 잘 섞다. 스와 수집청소의 microfuge 튜브 pernatants. 스핀 샘플 RT에서 5 분 동안 300 XG에서 세포 파편을 제거한다. 청소의 microfuge 튜브에 자신의 상층 액을 전송합니다. 준비가 될 때까지 얼음에 보관하십시오. </li><li> 이전에 준비 &quot;NET 표준&quot;의 나누어지는을 사용합니다. 주 : NET-표준은 적어도 5 개의 다른 독립적 인 인간 공여자로부터 수득 PMA 자극 호중구의 DNase 소화 상등액의 혼합이다. <ol><li> 오랫동안 동일한 표준을 사용하여 수집하고 각 공여자로부터 호중구 상청액 대량 나누어지는한다. 예를 들어 PMA 자극 호중구의 DNase의 소화 상층 액을 2 ㎖를 수집하는 것은 200 분량 씩 200 ELISA 플레이트에 충분한 (10 μL 각)가 발생합니다. 인터넷 표준을 특성화 데이터는 그림 5에서 발견된다. </li><li> 4 시간 동안 100 nm의 PMA와 인간 호중구를 자극하고 DNase의이 단계 3.4-3.5있어서 자신의 상층 액을 소화 적용됩니다. </li><li> 수집, 수영장, 나누어지는 (10 μL) 무료ZE (-20 ° C) 호중구 상층 액. </li><li> 적어도 5 개의 개별 기증자로부터 획득 한 나누어지는 / 기증자 해동, &quot;표준 NET의&quot;를 준비하려면를 혼합하고 얼음에 보관하십시오. </li><li> 해동 샘플을 취소하고 다음 실험을 위해 신선한 것을 사용합니다. </li><li> PBS + EGTA에서 NET-표준의 2 용액을 희석 : 1을 준비합니다. </li></ol></li><li> DNase1 소화 시료 (표준 및 알 수없는 상층 액) PBS + EGTA 20 배 희석 캡처 항체로 코팅 된 ELISA 플레이트에 그들을 나누어지는. </li><li> 4 ° C에서 밤새 ELISA 플레이트를 품어 PBS로 세 번 씻는다. </li><li> 검출 항체 용액을 적용 (100 μL / 웰) : 말 래 디쉬 퍼 옥시다아제 접합 항 DNA 항체 (1 : 500, 마우스). 어둠 속에서 1 시간 동안 품어. </li><li> PBS와 네 세척 후 TMB 퍼 옥시 다제 기판을 추가 : 100 μL / 웰, 30 분. 블루 착색은 퍼 옥시 다제 활성 (현재 그물)에 대한 표시입니다. </li><li> 잘 100 μL / 1 M 염산을 첨가하여 반응을 중지합니다. 그만큼블루 솔루션은 노란색 (그림 5A)를 설정합니다. </li><li> 마이크로 광도계를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 참조하십시오. </li><li> 데이터 분석을 위해, NET 표준에 비해 MPO-DNA 또는 HNE-DNA 복합체의 양을 계산한다. <ol><li> 모든 샘플에서 분석 배지의 배경 광 밀도 값을 뺀다. </li><li> 상대 NET 콘텐츠 (Y 축) (도 5a)에 대한 희석하여 표준 시료의 흡광도 값 (X 축)을 그린다. </li><li> 이 표준 곡선의 nonsaturated 범위를 사용하면 (그림 5A) (사용되는 소프트웨어에서 최상의 지수 맞게 사용) 추세선을 설정합니다. 이 추세선 방정식 그물의 양을 양적하기 OD 값의 변환을 결정한다. </li><li> 인터넷 표준 (그림 5A)의 비율로 미지 시료에 그물의 양을 줄 것이다 3.13.3에서 추세 줄 식으로 미지의 측정 된 OD 값을 삽입합니다. </li><li> 계산하다복제 (삼중)의 평균 (그림 5C) &quot;MPO-DNA 또는 HNE-DNA 복합체 (표준의 %)의 양&quot;으로 최종 데이터를 제시한다. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303, 1532-1535 (2004).</li><li>Fuchs, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+cell+death+program+leads+to+neutrophil+extracellular+traps.">Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps.</a> J Cell Biol. 176, 231-241 (2007).</li><li>Kessenbrock, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Netting+neutrophils+in+autoimmune+small-vessel+vasculitis.">Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis.</a> Nat Med. 15, 623-625 (2009).</li><li>Leffler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradation+of+neutrophil+extracellular+traps+co-varies+with+disease+activity+in+patients+with+systemic+lupus+erythematosus.">Degradation of neutrophil extracellular traps co-varies with disease activity in patients with systemic lupus erythematosus.</a> Arthritis Res Ther. 15, R34 (2013).</li><li>Yoo, D. G., Floyd, M., Winn, M., Moskowitz, S. M., Rada, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NET+formation+induced+by+Pseudomonas+aeruginosa+cystic+fibrosis+isolates+measured+as+release+of+myeloperoxidase-DNA+and+neutrophil+elastase-DNA+complexes.">NET formation induced by Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis isolates measured as release of myeloperoxidase-DNA and neutrophil elastase-DNA complexes.</a> Immunol Lett. 160, 186-194 (2014).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+hypercitrullination+mediates+chromatin+decondensation+and+neutrophil+extracellular+trap+formation.">Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation.</a> J Cell Biol. 184, 205-213 (2009).</li><li>Pang, L., Hayes, C. P., Buac, K., Yoo, D. G., Rada, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudogout-associated+inflammatory+calcium+pyrophosphate+dihydrate+microcrystals+induce+formation+of+neutrophil+extracellular+traps.">Pseudogout-associated inflammatory calcium pyrophosphate dihydrate microcrystals induce formation of neutrophil extracellular traps.</a> J Immunol. 190, 6488-6500 (2013).</li><li>Yoo, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Release+of+cystic+fibrosis+airway+inflammatory+markers+from+Pseudomonas+aeruginosa-stimulated+human+neutrophils+involves+NADPH+oxidase-dependent+extracellular+DNA+trap+formation.">Release of cystic fibrosis airway inflammatory markers from Pseudomonas aeruginosa-stimulated human neutrophils involves NADPH oxidase-dependent extracellular DNA trap formation.</a> J. Immunol. 192, 4728-4738 (2014).</li><li>Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, ., Goosmann, U., Zychlinsky, C., A, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps,+how+to+generate+and+visualize+them.">Neutrophil extracellular traps, how to generate and visualize them.</a> J. Vis. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+DNA+in+the+serum+of+cancer+patients+and+the+effect+of+therapy.">Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy.</a> Cancer Res. 37, 646-650 (1977).</li><li>Raptis, L., Menard, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+and+characterization+of+plasma+DNA+in+normals+and+patients+with+systemic+lupus+erythematosus.">Quantitation and characterization of plasma DNA in normals and patients with systemic lupus erythematosus.</a> J Clin Invest. 66, 1391-1399 (1980).</li><li>Chang, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+cell-free+serum+DNA+detected+in+patients+with+myocardial+infarction.">Elevated cell-free serum DNA detected in patients with myocardial infarction.</a> Clin Chim Acta. 327, 95-101 (2003).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

그물 그물의 문학은 지속적으로, 생물학,기구 및 규제에서의 역할에 관한 몇 가지 중요한 질문이 불분명 남아 자신의 발견 이후 지난 10 년에 걸쳐 확대되고 있지만 병원균을 죽인다. 1 호중구하는 매혹적인 새로운 메커니즘을 나타냅니다. 적절한 방법은 그물이 매우 독특한 항균 메카니즘을 측정하기 위해 개발되어야한다. 이 문서는 높은 처리량 방식으로 그물을 정량하는 데 사용할 수있는 방법을 설명합니다. 첫 번째 분석은 막 불 투과성 DNA 결합 염료의 형광 반응 속도를 다음과 같습니다. 이 분석은 슬로프 및 호중구에서 DNA 방출 속도에 많은 양의 정보를 제공한다. 이 정보는 NET 형성으로 이어지는 초기 신호 이벤트를 연구 조사에 매우 중요합니다. 모든이 정보는 인큐베이션의 끝에 DNA 분리 측정 종료점 분석에서 손실된다. 세포 외 DNA 염료 계 분석은 그물에 특이하지 않다. 이것단지 DNA 자료를 측정한다. 그물을 확인하기 위해 널리 NET-형성 호중구에 면역을 수행하고 과립 마커 (MPO, HNE) 또는 히스톤 중 하나와 DNA의 공동 현지화를 보여 허용됩니다. 면역 형광 데이터의 정량하지만 매우 지루하고 주관적이다. 여기서, MPO-DNA 복합체를 검출하기 이전에 개발 된 ELISA 분석의 변형이 제공된다. 특정 NET 조치를 나타내는 유사한 ELISA 어 세이 측정 HNE-DNA 복합체가 또한 설명된다. 3,5- 두 분석의 상세한 것을 특징으로하고있다. 5 MPO-DNA와 HNE-DNA ELISA 분석법 동시에 특정 NET 정량되고 . (5) 이러한 기능은 다른 현재의 방법으로 충족되지 않습니다. 분석법이 수행하고 재생 가능한 데이터를 제공하기 쉽습니다. 직접 호중구에 그물의 신속하고 표준화 된 처리를 보장 제한된 DNase의 소화 단계가 포함되어 있습니다 (5). (5) 이러한 분석은 COM에 적합동시에 여러 샘플을 깎다. 새로운 제어 측정에서는 그 동결 / 해동 사이클을 표시하고 단백질 분해 효소는 MPO-DNA와 HNE-DNA 분석의 결과에 영향을주지 않습니다. 그것은 알려진 단백질이 이러한 분석을 방해 1,11 (히스톤과 LL-37 포함) 그물에 DNA에 결합 할 것인지, 그러나, 알 수 없습니다. 제시된 프로토콜의 중요한 단계는 다음과 같다. 휴식, 정지 상태에있는 자발적으로 그물의 큰 금액을 공개하지 않습니다 호중구를 수확하는 것이 중요하다. 제시된 호중구 분리 프로토콜에서 적혈구를 제거하는 저장성 용해 단계의 부족은 비 활성화 된 호중구를 얻는 것이 중요하다. 세포를 정제 된 후 호중구 활성화를 억제하기 위해, 자신의 도너 자신 혈청을 함유하는 배지에 재현 탁 호중구을하는 것도 중요하다. 대기 세포를 얻기 위해 또한 호중구 준비하는 동안 pyrogen- 오염이없는 시약을 사용하는 것이 중요하다. Sponta세포 외 DNA 자료 분석 중 호중구의 neous NET 버전도 발생할 수 있습니다. 분석 배지에 1 %자가 혈청을 추가하는 것을 방지하는 것이 중요하다. 자가 혈청 높거나 낮은 용량은 최적의 결과를 얻기 위해 테스트 할 수 있습니다. 그것은 DNase의 소화를 통해-는 신호의 완전한 손실이 발생하기 때문에 DNA가 안 발표 MPO-DNA와 HNE-DNA ELISA 분석시 중요합니다. 따라서, 최적 투여 량은 각 새로운 DNase의 배치에 대해 결정되어야한다. DNA를 분해의 매개 변수는 약간 높은 ELISA 가능한 신호를 얻기 위해 변경 될 수있다. 또한 DNase의가 DNA에 대한 명확한 액세스 할 수 있는지 확인하기 위해 DNase를 철저하게 그물을 혼합하는 것이 중요합니다. 소화 그물을 수확 할 때, 모든 그물을 수집하기 위해 광범위하게 잘 씻는다. MPO-DNA와 HNE-DNA 분석법의 DNA의 검출 한계는 약 10-20 NG / ㎖ DNA (도 5B)이다. 단절의 혈청 및 혈장 무료 DNA 수준알 십만 ng 내지 / ㎖가 비정상 NET 형성과 연관되어 질병 (암, 전신성 홍 반성 루푸스, 심근 감염)에보고되었다. 12-14이 MPO-DNA와 HNE-DNA ELISA 분석법도 가능성이 있음을 시사 인간의 임상 샘플에서 그물을 정량 할 수있다. MPO-DNA와 HNE-DNA ELISA 분석이 미래의 응용 프로그램은 정량적으로 질병의 발병 기전에 그물을 연결 할 수 있습니다.

NET formation is a novel mechanism by which neutrophils fight pathogens.1 The core of NETs is nuclear DNA.1 This DNA network is associated with neutrophil granule proteins and histones.1 The main form of NET formation requires the death of neutrophils characterized by chromatin decondensation, disappearance of granular and nuclear membranes, translocation of neutrophils elastase to the nucleus, citrullination of histones and finally the spill of DNA-based NETs.2 NETs entrap and kill a wide variety of microbes and are an essential part of the innate immune weapon repertoire. Uncontrolled NET formation has, however, been linked to numerous autoinflammatory diseases.3,4 Despite their increasingly established relevance, little is known about the mechanism and regulation of NET release. 
Neutrophils dying by releasing NETs are different from apoptotic or necrotic neutrophils.3,5 NET-releasing neutrophils show several features that are characteristic for NET formation. Granule components are associated with DNA in NETs.1 Myeloperoxidase (MPO) and human neutrophil elastase (HNE) are both found in primary granules in resting cells but are translocated to the nucleus to bind to DNA in NETs.1 MPO-DNA and HNE-DNA complexes are specific for NETs, do not occur in apoptotic or necrotic neutrophils.1,3,5 Chromatin decondensation is another feature typical for NETosis.2 NET release also requires citrullination of histones by peptidyl aminidase 4 (PAD4).6 Citrullinated histones are hallmarks of neutrophils that underwent NET release.6
Here three methods are introduced that in combination provide excellent tools to quantitate NETs on a high-throughput scale. The first assay has been used on the field with different changes and quantitates extracellular DNA release in a microplate format. The second and third assays provide confirmation of NETs by measuring NET-specific MPO-DNA and HNE-DNA complexes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-Human Neutrophil Elastase&#160; Rabbit Ab&#160;</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>481001</td>
			<td>1:2000X coated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Myeloperoxidase Ab (Rabbit)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>07-496</td>
			<td>1:2000X coated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase-1</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10-104-159-001</td>
			<td>1ug/ml used for digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20mM EGTA/ PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5 mM EGTA/PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell death detection ELISA Anti-DNA POD</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11544675001</td>
			<td>1:500X&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eon Microplate Spectrophotometer</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gen5 All-in-One microplate software</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td>analytical tool (ELISA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sytox orange</td>
			<td>Life Technology</td>
			<td>S11368</td>
			<td>0.2% final concentration/volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M Hepes</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>25-060-Cl</td>
			<td>Use 10 mM final concentration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>Use 5 mM final concentration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-023-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Varioskan Flash Ver.2.4.3</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P 8139</td>
			<td>100nM final used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA Plate</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>655061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes 15ml</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical tubes 50ml</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll (pH 8.5-9.5)&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P 1644</td>
			<td>Sodium Chloride, Sigma, S7653-250G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>D1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 media</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>17-105-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well assay plate black plate clear bottom</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3603</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high throughput measurement of extracellular dna release and quantitative net formation in human neutrophils in vitro

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils developed several antimicrobial mechanisms including phagocytosis, degranulation and formation of neutrophil extracellular traps (NETs). NETs consist of a DNA scaffold decorated with histones and several granule markers including myeloperoxidase (MPO) and human neutrophil elastase (HNE). NET release is an active process involving characteristic morphological changes of neutrophils leading to expulsion of their DNA into the extracellular space. NETs are essential to fight microbes, but uncontrolled release of NETs has been associated with several disorders. To learn more about the clinical relevance and the mechanism of NET formation, there is a need to have reliable tools capable of NET quantitation. 
Here three methods are presented that can assess NET release from human neutrophils in vitro. The first one is a high throughput assay to measure extracellular DNA release from human neutrophils using a membrane impermeable DNA-binding dye. In addition, two other methods are described capable of quantitating NET formation by measuring levels of NET-specific MPO-DNA and HNE-DNA complexes. These microplate-based methods in combination provide great tools to efficiently study the mechanism and regulation of NET formation of human neutrophils.

이 원고의 수치. 호중구 격리, 실험 절차 및 데이터 분석의 설명과 함께 현재 대표적인 결과의 방법을 서술 한 인간 호중구 준비의 순차적 인 단계를 보여줍니다. 이 프로토콜은 호중구 격리의 하나의 가능한 방법을 나타냅니다. 그것은 자극에 그물을 방출 할 수있는 호중구 휴식의 많은 양을 산출한다. 형광 기반의 DNA 자료 분석의 작동 방식 2는 그림. 인간의 호중구는 웰 (96) 마이크로의 준수에 DNA 자료의 형광 마이크로 플레이트 리더 반응 속도를 사용하여. 그림 3은 데이터 분석의 각 단계를 설명합니다. 먼저, 사포닌 (도 3a)으로 처리 호중구의 최대 DNA 신호를 계산한다. 형광의 증가는 항상 최고 형광 값 및 배경 형광 레벨 (차이로서 계산된다 <strong&gt;도 3a). 이는 각 웰에 대해 계산된다. 이 예는 인간의 호중구의 대표적인 데이터가 비 자극 또는 PMA 또는 P. 활성화 왼쪽 표시 녹농균 (PAO1) (그림 3B). P. 녹농균은 5,8,10. 인간의 백혈구에서 NET 형성을 트리거는 여러 P.으로 밝혀졌다 녹농균은 (호중구없이) 혼자 박테리아가 사용되는 DNA 검출 염료를 결합하지 않는 PAO1 포함 균주. 8 PAO1 P.를 1 (도 3b, C, 4B : 녹농균을 분석 배지로 세척하고 감염 다중도 10의 (MOI)로 호중구를 자극하는 데 사용 후기 지수 단계에서 수확, 루리아 - 베르 타니 배지에서 밤새 배양 ATCC로부터 얻은 C). 복제 우물의 형광 증가의 평균은 최대 형광 (사포닌)에 표준화 된 계산과 &quot;DNA 자료 (최대의 %)&quot;(그림 3C)로 표현된다. 그림 3D 대표 fluores를 보여줍니다치료 또는 PMA 자극 호중구의 cence 이미지. 도 4a는도 4b는 nonstimulated PMA- 및 PAO1 활성화 인간 호중구의 대표적인 면역 형광 이미지를 나타낸다. MPO-DNA-DNA와 HNE ELISA 분석의 원리를 설명하는 방식을 도시한다. 세포 외 DNA가 전형적인 NET 형태를 보여주고 MPO 및 시트룰린 히스톤 H4, NET 형성의 마커와 공동 지역화. 6 그림 4c는도 3B, 3C와 같은 같은, 이전의 조건에서 인간의 호중구의 MPO-DNA와 HNE-DNA 출시 (보여준다 및 (b)). IThe는 &quot;NET&quot;ELISA 방법은 이전에 특징되었습니다. 실온에서 15 분 동안 5 간단히, 2 U / ㎖ DNase를 처리 (사용의 DNase의 / ml의 농도가 1 μg의 동일) 가장 높은 MPO-DNA와 HNE-DNA 신호 결과 . 아가로 오스 겔 5 실행 샘플 (100 NG / 차선) 그 DNA의 길이를 밝혀낮은 킬로바이트 범위 수율 최적의 ELISA 신호. 5 DNA의 overdigestion 캡처 또는 검출 항체 중 하나는 ELISA 신호를 폐지 생략하거나 (DNase의보다 높은 20 U / ml의 투여 량). (5) 또한, 여기에 분석하고 &quot;네트 표준&quot;더 특성화 (도 5a)이다. 인터넷 표준 평균 19.5 μg의 / ml의 세포 외 (공지의 DNA 농도가 표준을 사용하여 측정) DNA, 399 ng의 / ㎖ MPO 및 103.4 NG / ㎖의 HNE (상업적 ELISAkits)에 포함 된 (N = 8). MPO (84 kDa의)와 HNE (29.5 kDa의) 총 분자량 및 1 μg의 DNA가 9.91 × 10 14 개 뉴클레오티드가 포함되어 있다는 사실에 기초하여, NET 표준 109 HNE 분자 1000 뉴클레오티드 당 147 MPO 분자 (KB의 DNA를 포함 ). 인터넷 표준의 두 배의 일련의 희석 실험에서 MPO-DNA-DNA와 HNE 모두 ELISA 분석의 동적 범위 사이에있는 것으로 밝혀 19.0-609.0 NG /ml의 DNA 농도 (도 5b). 보다 높은 1,024 배의 희석이 배경 (그림 5B)에서 차이가 없었다 반면 NET 표준의 32 배 이하의 희석은 포화 결과. 프로테아제 억제제와 NET 표준 치료 프로테아제 이러한 분석 (도 5C)과 간섭하지 않는 것을 나타내는 MPO-DNA와 HNE-DNA 분석법에 의해 얻어진 결과는 변경하지 않았다. 따라서, 결과는 서로 강하게 (그림 5D)와 상관 관계 분석 MPO-DNA 또는 HNE-DNA ELISA에 의해 같은 NET-표준 시료에서 얻어진. 효율 손실없이 고정 된 PMN 상청액은 이러한 분석에서 사용될 수 있음을 표시하기 위해, NET-표준 방치 하였다 또는 다른 -20 ° C 또는 수행 한 두 냉동 / 해동주기에 노출되어 -80 ° C의 일부 분취 (1 시간 간격). 동결 / 해동 치료 없음은 MPO-DNA 또는 HNE-DNA 결과 (그림 5E)에 영향을받지 않습니다. 요약하면,NET-표준은 독립적 인 실험 사이 NET 결과의 정량적 비교를 가능 이러한 NET-정량 분석​​의 신뢰성 기준점을 제공한다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52779/52779fig1.jpg" /> 그림 1 :. 인간 호중구 호중구 과립구의 분리는 설명 프로토콜에 따라 자원 봉사자의 말초 혈액에서 분리 하였다. 혈액 포함 항응고제는 덱스 트란 침강 및 그라데이션 원심 분리하여 중성 백혈구를 분리하는 데 사용되었다. 항응고제가없는 혈액의 혈청을 제조 하였다. 호중구 준비의 생존은 트리 판 블루 배제 분석에 의해 평가된다. 호중구 순도가 cytospin에 의해 평가 또는 유동 세포 계측법된다 (CD16가 두 번 양성 세포를 CD66abcd). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52779/52779fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52779/52779fig2.jpg" /> 그림 2. 외 DNA 자료 분석의 원리 (A)는 그 형광 플라즈마 핵막 손상되었고 막 투과성 DNA 결합 염료가 DNA에 결합 할 수있는 호중구를 얻을 수있다. (B) 분석법은 마이크로 플레이트 형광 계를 사용하여 마이크로 플레이트 검정 96 웰에 대해 수행된다. (C)는 형광 계 각 웰에 실시간 형광 곡선을 기록한다. 도시의 한 대표적인 결과. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52779/52779fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52779/52779fig3.jpg" /> 그림 3 : DNA 릴리스 데이터의 분석 (. <stroNG&gt; A) 사포닌은 전적으로 호중구를 lyses 자신의 DNA를 노출하기 때문에 최대 값을 만드는 데 사용됩니다. 사포닌 유도 형광 반응 속도가 도시되어있다. PMA (100 ㎚) 및 박테리아 (녹농균 PAO1, 10 MOI)에 의해 유도 된 호중구 DNA 자료의 (B) 속도론. (C)는 정규화 quadriplicates를 사용하여 하나의 실험에서 얻어진 DNA 분리 된 데이터를 요약 하였다. (D) 치료 및 PMA 자극 인간 호중구의 대표적인 형광 이미지 (SYTOX 오렌지, 4 시간 배양). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52779/52779fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52779/52779fig4.jpg" /> 그림 4 : MPO-DNA와 HNE-DNA ELISA 분석 실험 :. 원리 및 대표 결과 (A) 계획 설명보내고 어떻게 MPO-DNA와 HNE-DNA ELISA 분석 작업. (B) 100 나노 PMA 또는 P.에 노출 된 인간의 호중구에 준비 면역 형광 이미지의 대표 결과 녹농균의 PAO1 변형 4 시간 (10 MOI). 세포 외 DNA (DAPI, 청색) MPO (녹색)과 시트룰린 히스톤 H4 (빨간색)와 그물에 공동-지역화. 하나의 대표적인 결과, N = 3 (C)는 NET 릴리스는 MPO-DNA-DNA와 HNE ELISA 분석법 이상과 같은 자극에 노출 된 인간의 호중구로 측정 하였다. 평균 ± SEM, N = 3 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52779/52779fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/52779/52779fig5.jpg" /> 그림 5 :.은 &quot;NET-표준&quot;(A) 직렬 희석의 특성 (1 : 2) NET 표준의 준비 하였다및 MPO-DNA ELISA를 실시. 측정 된 OD 값은 NET-표준 콘텐츠 %의 역모를 꾸몄다됩니다. 빨간색 &quot;X&quot;는 미지 시료의 측정 된 OD 값을 나타냅니다. 회색 화살표는 미지 시료의 &quot;NET 농도&quot;(청색 &quot;X&quot;)은 피팅 된 표준 곡선의 중심 범위를 사용하여 결정되는 방법을 나타낸다. 순차적으로 희석 NET 표준 시료 (B) DNA 농도를 측정하고, MPO-DNA-DNA 또는 HNE ELISA 분석법의 측정 된 OD 값에 대해 도시 하였다. 회색 영역은 분석의 동적 범위를 나타냅니다. (C) 프로테아제 억제제 치료 (프로테아제 억제제 칵테일, 1 %)이 MPO-DNA 또는 HNE-DNA 분석 (NET-표준)의 결과에 영향을주지 않습니다. , ± SEM을 의미 N = MPO-DNA와 직렬로 자신의 동적 범위 (5B 참조)에서 &quot;NET-표준&quot;샘플을 희석의 HNE-DNA 결과 (OD 450 ㎚) 2. (D)의 상관 관계. (E) 냉동 및 해동 사이클 (-20 ° C 또는 -80 ° C를, 오) 북동 또는 두 N = 2)., MPO-DNA와 HNE-DNA 분석 (NET-표준의 결과에 영향을 미칠 SEM ± 의미하지 않는다 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52779/52779fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High throughput assays are presented that in combination provide excellent tools to quantitate NET release from human neutrophils.

세포 외 DNA 릴리스의 높은 처리량 측정 및 인간 호중구의 양적 NET 형성<em&gt; 체외</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

high-throughput-measurement-extracellular-dna-release-quantitative

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

13.0K 조회수.  University of Georgia. High throughput assays are presented that in combination provide excellent tools to quantitate NET release from human neutrophils.

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Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an effective gas exchange must be maintained, while at the same time avoiding infection by the multiple pathogens that are inhaled 
during normal breathing. To achieve this, a superb set of defense strategies combining humoral and cellular immune mechanisms exists. One of the most 
effective measures for acute defense of the lung is the recruitment of neutrophils, which either phagocytose the inhaled pathogens or kill them by 
releasing cytotoxic chemicals. A recent addition to the arsenal of neutrophils is their explosive release of extracellular DNA-NETs by which bacteria 
or fungi can be caught or inactivated even after the NET releasing cells have died. We present here a method that allows one to directly observe neutrophils, 
migrating within a recently infected lung, phagocytosing fungal pathogens as well as visualize the extensive NETs that they have produced throughout the 
infected tissue. The method describes the preparation of thick viable lung slices 7 hours after intratracheal infection of mice with conidia of the mold 
Aspergillus fumigatus and their examination by multicolor time-lapse 2-photon microscopy. This approach allows one to directly investigate antifungal 
defense in native lung tissue and thus opens a new avenue for the detailed investigation of pulmonary immunity.

We show, how to use 2-photon microscopy for the observation of the dynamics of neutrophil granulocytes in infected lungs while they phagocytose pathogens or produce neutrophil extracellular traps (NETs).

2 광자 현미경을 사용하여 감염된 폐의 Neutrophils에 의해 Phagocytosis와 NET - 형성의 직접 관측

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an ...

연구

면역학 및 감염병학

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

A complex interaction between the immune response and host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in particular, is known to occur as a response to infection in mammals 1 and has also recently been described in Drosophila melanogaster2. It is generally accepted that sleep is beneficial to the host during an infection and that it is important for the maintenance of a robust immune system3,4. However, experimental evidence that supports this hypothesis is limited4, and the function of excess sleep during an immune response remains unclear. We have used a multidisciplinary approach to address this complex problem, and have conducted studies in the simple genetic model system, the fruitfly Drosophila melanogaster. We use a standard assay for measuring locomotor behavior and sleep in flies, and demonstrate how this assay is used to measure behavior in flies infected with a pathogenic strain of bacteria. This assay is also useful for monitoring the duration of survival in individual flies during an infection. Additional measures of immune function include the ability of flies to clear an infection and the activation of NF&kappa;B, a key transcription factor that is central to the innate immune response in Drosophila. Both survival outcome and bacterial clearance during infection together are indicators of resistance and tolerance to infection. Resistance refers to the ability of flies to clear an infection, while tolerance is defined as the ability of the host to limit damage from an infection and thereby survive despite high levels of pathogen within the system5. Real-time monitoring of NF&kappa;B activity during infection provides insight into a molecular mechanism of survival during infection. The use of Drosophila in these straightforward assays facilitates the genetic and molecular analyses of sleep and the immune response and how these two complex systems are reciprocally influenced.

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

To understand a link between the immune response and behavior, we describe a method to measure locomotor behavior in Drosophila during bacterial infection as well as the ability of flies to mount an immune response by monitoring survival, bacterial load, and real-time activity of a key regulator of innate immunity, NF&kappa;B.

면역 반응과 수면에서의 양적 측정<em&gt; Drosophila</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

T 세포 양적 높은 처리량 단일 세포 세포 독성 분석

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable alternative to animal model systems for the study of a specific step of microbial pathogen infection. A human monocytic cell line THP-1 which, upon phorbol ester treatment, is differentiated into macrophages, has previously been used to study virulence strategies of many intracellular pathogens including Mycobacterium tuberculosis. Here, we discuss a protocol to enact an in vitro cell culture model system using THP-1 macrophages to delineate the interaction of an opportunistic human yeast pathogen Candida glabrata with host phagocytic cells. This model system is simple, fast, amenable to high-throughput mutant screens, and requires no sophisticated equipment. A typical THP-1 macrophage infection experiment takes approximately 24 hr with an additional 24-48 hr to allow recovered intracellular yeast to grow on rich medium for colony forming unit-based viability analysis. Like other in vitro model systems, a possible limitation of this approach is difficulty in extrapolating the results obtained to a highly complex immune cell circuitry existing in the human host. However, despite this, the current protocol is very useful to elucidate the strategies that a fungal pathogen may employ to evade/counteract antimicrobial response and survive, adapt, and proliferate in the nutrient-poor environment of host immune cells.

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

The current article outlines a protocol to establish an in vitro cell culture model system to study the interaction of a facultative intracellular human fungal pathogen Candida glabrata with human macrophages which will be a useful tool to advance our knowledge of fungal virulence mechanisms.

설립<em&gt; 체외</em&gt; 시스템의 세포 내 행동을 연구하는<em&gt; 칸디다 글라 브라</em&gt; 인간 THP-1 식세포에

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

정량<em&gt; 체외</em정적 조건에서 활성화 된 기본 인간의 미세 혈관 내피 세포에 호중구 부착을 측정하는&gt; 분석

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins can give insights into their function by determining their localization within the cell and enabling interaction partner identification. We recently published a fast and scalable method to generate Trypanosoma brucei cell lines that express a tagged protein from the endogenous locus. The method was based on a plasmid we generated that, when coupled with long primer PCR, can be used to modify a gene to encode a protein tagged at either terminus. This allows the tagging of dozens of trypanosome proteins in parallel, facilitating the large-scale validation of candidate genes of interest. This system can be used to tag proteins for localization (using a fluorescent protein, epitope tag or electron microscopy tag) or biochemistry (using tags for purification, such as the TAP (tandem affinity purification) tag). Here, we describe a protocol to perform the long primer PCR and the electroporation in 96-well plates, with the recovery and selection of transgenic trypanosomes occurring in 24-well plates. With this workflow, hundreds of proteins can be tagged in parallel; this is an order of magnitude improvement to our previous protocol and genome scale tagging is now possible.

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.

높은 처리량 유전자 태그에<em&gt; 트리파노소마 (Trypanosoma) brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of lipids. The function of lipids (e.g., in host-pathogen interactions or host entry) has been reported to play a crucial role in cellular processes. Here, we show a method to determine lipid composition, with a focus on the cholesterol level of primary blood-derived neutrophils, by HPTLC in comparison to high performance liquid chromatography (HPLC). The aim was to investigate the role of lipid/cholesterol alterations in the formation of neutrophil extracellular traps (NETs). NET release is known as a host defense mechanism to prevent pathogens from spreading within the host. Therefore, blood-derived human neutrophils were treated with methyl-&#946;-cyclodextrin (M&#946;CD) to induce lipid alterations in the cells. Using HPTLC and HPLC, we have shown that M&#946;CD treatment of the cells leads to lipid alterations associated with a significant reduction in the cholesterol content of the cell. At the same time, M&#946;CD treatment of the neutrophils led to the formation of NETs, as shown by immunofluorescence microscopy. In summary, here we present a detailed method to study lipid alterations in neutrophils and the formation of NETs.

Lipids are known to play an important role in cellular functions. Here, we describe a method to determine the lipid composition of neutrophils, with emphasis on the cholesterol level, by using both HPTLC and HPLC to gain a better understanding of the underlying mechanisms of neutrophil extracellular trap formation.

방법은 지질 호중구의 변경 및 호중구 세포 외 트랩의 후속 형성을 연구하기 위해

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular disease (CVD). The structure and function of HDL rather than HDL-C may more accurately predict atherosclerosis. Several HDL protein and lipid compositional changes that impair HDL function occur in inflammatory states such as atherosclerosis. HDL function is usually determined by cell based assays such as cholesterol efflux assay but these assays have numerous drawbacks lack of standardization. Cell-free assays may give more robust measures of HDL function compared to cell-based assays. HDL oxidation impairs HDL function. HDL has a major role in lipid peroxide transport and high amount of lipid peroxides is related to abnormal HDL function. Lipid-probe interactions should be considered when interpreting the results of non-enzymatic fluorescence assays for measuring the lipid oxidative state. This motivated us to develop a cell-free biochemical enzymatic method to assess HDL lipid peroxide content (HDLox) that contributes to HDL dysfunction. This method is based on the enzyme horseradish peroxidase (HRP) and the fluorochrome Amplex Red that can quantify (without cholesterol oxidase) the lipid peroxide content per mg of HDL-C. Here a protocol is describedfor determination of HDL-lipid peroxidation using the fluorochrome reagent. Assay variability can be reduced by strict standardization of experimental conditions. Higher HDLox values are associated with reduced HDL antioxidant function. The readout of this assay is associated with readouts of validated cell-based assays, surrogate measures of cardiovascular disease, systemic inflammation, immune dysfunction, and associated cardiovascular and metabolic risk phenotypes. This technical approach is a robust method to assess HDL function in human disease where systemic inflammation, oxidative stress and oxidized lipids have a key role (such as atherosclerosis).

We describe here a fluorometric cell-free biochemical assay for determination of HDL-lipid peroxidation. This rapid and reproducible assay can be used to determine HDL function in large scale studies and can contribute to our understanding of HDL function in human disease.

고밀도 지단백에 지질 과산화의 높은 처리량 측정을 위한 생 화 확 적인 세포-무료 Fluorometric 효소 분석 결과

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with histones and antimicrobial proteins. Excessive NET formation (NETosis) and citH3 release during sepsis is associated with multiple organ dysfunction and mortality in mice and humans but its implications in dogs are unknown. Herein, we describe a technique to isolate canine neutrophils from whole blood for observation and quantification of NETosis. Leukocyte-rich plasma, generated by dextran sedimentation, is separated by commercially available density gradient separation media and granulocytes collected for cell count and viability testing. To observe real-time NETosis in live neutrophils, cell permeant and cell impermeant fluorescent nucleic acid stains are added to neutrophils activated either by lipopolysaccharide (LPS) or phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA). Changes in nuclear morphology and NET formation are observed over time by fluorescence microscopy. In vitro NETosis is further characterized by co-colocalization of cell-free DNA (cfDNA), myeloperoxidase (MPO) and citrullinated histone H3 (citH3) using a modified double-immunolabelling protocol. To objectively quantify NET formation and citH3 expression using fluorescence microscopy, NETs and citH3-positive cells are quantified in a blinded manner using available software. This technique is a specific assay to evaluate the in vitro capacity of canine neutrophils to undergo NETosis.

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

We describe methods to isolate canine neutrophils from whole blood and visualize NET formation in live neutrophils using fluorescence microscopy. Also described are protocols to quantify NET formation and citrullinated histone H3 (citH3) expression using immunofluorescence microscopy.

생체 외에서 형광 현미경 검사 법에 의해 개 호 중구 Extracellular 함정 형성: 역동적이 고 양적 분석

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In response to these damages, complex molecular machineries rapidly reseal the plasma membrane to restore its barrier function and maintain cell survival. Despite 60 years of research in this field, we still lack a thorough understanding of the cell resealing machinery. With the goal of identifying cellular components that control plasma membrane resealing or drugs that can improve resealing, we have developed a fluorescence-based high-throughput assay that measures the plasma membrane resealing efficiency in mammalian cells cultured in microplates. As a model system for plasma membrane damage, cells are exposed to the bacterial pore-forming toxin listeriolysin O (LLO), which forms large 30-50 nm diameter proteinaceous pores in cholesterol-containing membranes. The use of a temperature-controlled multi-mode microplate reader allows for rapid and sensitive spectrofluorometric measurements in combination with brightfield and fluorescence microscopy imaging of living cells. Kinetic analysis of the fluorescence intensity emitted by a membrane impermeant nucleic acid-binding fluorochrome reflects the extent of membrane wounding and resealing at the cell population level, allowing for the calculation of the cell resealing efficiency. Fluorescence microscopy imaging allows for the enumeration of cells, which constitutively express a fluorescent chimera of the nuclear protein histone 2B, in each well of the microplate to account for potential variations in their number and allows for eventual identification of distinct cell populations. This high-throughput assay is a powerful tool expected to expand our understanding of membrane repair mechanisms via screening for host genes or exogenously added compounds that control plasma membrane resealing.

Here we describe a high-throughput fluorescence-based assay that measures the plasma membrane resealing efficiency through fluorometric and imaging analyses in living cells. This assay can be used for screening drugs or target genes that regulate plasma membrane resealing in mammalian cells.

포유류 세포에서 효율 Resealing 원형질 막의 높은 처리량 측정

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

세포 외 DNA 릴리스의 높은 처리량 측정 및 인간 호중구의 양적 NET 형성

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