해당 작가 모리스 동물 재단 (D15CA-907)에 의해 투자 되었다. 연구 캘리포니아 대학, 데이비스, 말 건강 센터 및 동반자 동물 건강을 위한 센터에서 기금에 의해 지원 되었다 (2016-24-F). 저자는 비디오와 함께 그녀의 지원에 대 한 수치와 응이 구 엔 그녀의 지원에 대 한 지 나 Ng를 인정 하 고 싶습니다.

여기에 설명 된 모든 방법을 기관 동물 관리 및 사용, 데이비스가 주 대학에 위원회에 의해 승인 했다 (번호를 프로토콜: 18338).
1. 혈액 컬렉션
<ol><li>21g 바늘을 사용 하 여 주사기 포부에 의해 두 부 또는 jugular 정 맥에서 혈액 10 mL을 그립니다.</li>
	<li>과도 한 전단 응력을 방지 하려면 나트륨 덤플링을 (75 USP)를 포함 하는 tube(s)로 혈액을 전송 하기 전에 주사기에서 바늘을 제거 합니다. 부드럽게 반전 튜브 몇 번 응고 제와 혈액의 적절 한 혼합 되도록. 혈전 또는 얼음에 샘플을 배치 하기 전에 레드 셀 집계를 확인 합니다.</li>
</ol>2. 호 중구 절연
<ol><li>얼음 처럼 차가운 Dubecco 인산 염 버퍼 식 염 수 (DPBS) (pH 7.4, divalent 양이온 없이)의 동등한 양으로 anticoagulated 혈액 희석. 8 mL 희석된 혈액의 포함 ( Leuconostoc 종 0.9% 염화 나트륨 용액에 녹아 있는)에서 3 %dextran 25 mL 50 mL 폴 리 프로필 렌 원뿔 관으로 전송 합니다. 튜브를 집계 및 적혈구의 침 강 30 분 동안 실내 온도에 똑바로 놓습니다.</li>
	<li>신중 하 게 14 mL 폴 리 프로필 렌 라운드 하단 튜브에 밀도 그라데이션 미디어의 5 mL 위에 백혈구 풍부한 혈장 (그림 1)의 5 mL를 계층. 2 솔루션11혼합에 아닙니다 조심 하십시오.</li>
	<li>400 x g 가속/감속을 실 온에서 30 분 동안 0 (브레이크) (A/D) 설정에서 튜브 원심</li>
	<li>5 mL를 사용 하 여 혈 청 학적인 피펫으로 플라즈마 및 주변 혈액 단 세포 (PBMC) 층 (그림 1)를 우회 하 여 granulocyte 셀 레이어를 수집 합니다. 오염을 최소화 하기 위해 새로운 피펫으로 각 시간을 사용 합니다.</li>
	<li>폴 리 프로필 렌 50 mL 원뿔 튜브에 polymorphnuclear (PMN) 세포 층의 4 ~ 6 mL를 배치 합니다. 적은 양의 적혈구 집계 PMN 레이어와 함께 발음 될 수 있습니다, 이후 1 mL 혈 청 학적인 피펫으로 사용 하 여 부드럽게 제거 적혈구 집계는 튜브의 하단에 정착.</li>
	<li>차가운 초순 물 20 mL와 나머지 적혈구 lyse 부드럽게 여러 번 30 ~ 60 대 한 튜브를 반전 차가운 1.8% 염화 나트륨 해결책의 동일한 볼륨을 추가 하기 전에 적절 한 lysing 되도록 s.</li>
	<li>4 ° C에서 10 분, 0 A/D 설정에 대 한 112 x g 에서 원심.</li>
	<li>이 펠 릿 나타나는 붉은 경우 적혈구 세포 단계를 반복 합니다. 혈 청 학적인 피펫으로와 신중 하 게 상쾌한 삭제 하 고 부드럽게 DPBS (5 mM 포도 당, 0.9 m m MgCl2, 1.9 m m CaCl2 와 1% 소 혈 청 알 부 민, pH 7.3)의 100 µ L에 펠 릿을 resuspend. 모든 resuspended 셀을 결합 하 고 얼음에.</li>
	<li>자동된 세포 분석기를 사용 하 여 셀 수를 수행 하 고는 hemocytometer에 의해 카운트를 확인. 필요한 경우, cytocentrifuge (1000 rpm, 5 분)를 사용 하 여 유리 슬라이드에 PMNs 집중 하 고 셀의 총 수에서 호 중구의 수를 계산 하 여 호 중구의 비율을 결정.</li>
	<li>Strober 그 외 여러분 에 의해 설명 된 대로 trypan 블루 제외 테스트를 수행 하 여는 호 중구의 생존 능력을 결정 12 성공적인 격리 95에서 100%는 생존을 산출 해야 한다 고 호 중구 95% 이상 이어야 한다.</li>
	<li>백분율 생존 및 호 중구 백분율 총 세포 수로 호 중구의 농도 결정 합니다. 성공적인 격리 6 x 106/mL을 1.5에서 호 중구의 농도 양보 한다.</li>
	<li>7.3으로 조정 하는 ph 5 mM 포도 당, 0.9 m m MgCl2, 1.9 m m CaCl2, 및 1% 소 혈 청 알 부 민을 포함 하는 DPBS와 호 중구 1 x 106/mL의 최종 농도에 희석.</li>
</ol>3. 라이브 호 중구의 형광 현미경
<ol><li>폴 리-L-리 신의 각 음에 호 중구 (1 x 106/mL)의 400 μ 장소 200 12-잘 문화 플레이트 코팅. 30 분 동안 37 ° C에서 세포를 배양 하 여 우물의 바닥에 준수 호 중구 수 있습니다.</li>
	<li>두 핵 산 염료 중 하나, 하나는 그대로 막 셀에 얼룩 및 투과성 멤브레인과 ( 재료의 표참조), 실 온에서 10 분에 대 한 셀에 얼룩 하나 1 μ M으로 핵 산을 라벨.</li>
	<li>100 μ g/mL lipopolysaccharide (LPS) (E. 콜라이 O55와 호 중구 활성화. B5), 100 nM phorbol myristate 12 13-아세테이트 (PMA) 긍정적인 통제, 또는 DPBS 180 분 37 ° c.에 대해 부정적인 컨트롤의 해당 볼륨</li>
	<li>이미지는 GFP를 사용 하 여 (여기: 470/22 nm, 방출: 525/50 nm) 및 텍사스 레드 채널 (여기: 585/29 nm, 방출: 628/32 nm) 다음 시간 지점에서 40 배 확대에 형광 현미경 검사 법에: 30, 90, 120, 및 180 분.</li>
</ol>4. NET 정량화 및 NET 구성 요소를 사용 하 여 면역 형광의 탐지
<ol><li>신중 하 게 12-잘 문화 접시의 우물에 18 m m 직경 폴 리-D-리 코팅 커버 전표를 놓습니다. 우물을 적절 하 게 레이블을 지정 합니다.</li>
	<li>씨앗 100 ~ 200 μ는 coverslips에 직접 neutrophils (1 x 106/mL) 절연 고 30 분 동안 37 ° C에서 세포를 배양 하 여 커버 전표를 준수 호 중구.</li>
	<li>3.3에 설명 된 대로 호 중구 활성화 합니다. 200 µΜ와 호 중구 pretreating 여 그물 형성 억제 Cl-amidine (15 분, 37 ° C) 리 외. 여 앞에서 설명한 활성화 이전 13 확인 적절 한 차량 제어 (DMSO)는 실험에 포함 됩니다.</li>
	<li>조심 스럽게 잘 집게와 커버 슬립을 제거. 4%의 2 ~ 3 방울을 얕은 웰 스를 만드는 테스트 튜브 스탠드 위에 파라핀 필름 시트를 레이어 PFA 각 잘10. 우물을 적절 하 게 분류 하 고 부드럽게 PFA 가득 우물에 거꾸로 커버 슬립을 하다. 20 분 동안 실내 온도에 고정 수를 셀 수 있습니다.</li>
	<li>한 음에서 다음 이동 하 여 3 회에서 5 분 동안 DPBS 셀을 씻어.</li>
	<li>Immunolabelling 호 중구 활성화 및 고정 후 수행할 수 없습니다, 경우 커버 전표 덮개 미 끄 러 짐 얼굴-최대 흡 광도 종이의 조각에 배치 하 여 건조 공기를 되도록 허용 합니다. 커버 슬립 추가 분석까지 4 ° C에서 이라는 12 잘 문화 접시에 최대 1 주 얼굴-최대 저장할 수 있습니다. 워시 DPBS 4.4 다음 단계로 진행 하기 전에에서 설명 된 대로 동일한 기술을 사용 하 여 1 분 동안에 3 번 셀.</li>
	<li>세포를 permeabilize를 부드럽게 커버 슬립 거꾸로에 하다 NP-40는 기술을 사용 하 여 1 분 동안 4.4에서 설명 하는 1%의 드롭. DPBS 로커에 1 분 동안 3 번을 씻어.</li>
	<li>임의로 숫자를 할당 하는 각 샘플 하 고는 coverslips를 따라 다이아몬드 포인트 마커를 사용 하 여.</li>
	<li>준비 고 레이블 개별 접시 파라핀 영화 늘어서 (버퍼 차단) 필름에 5% 염소 혈 청의 100 ~ 200 μ를 배치 합니다. 블로킹 버퍼에는 coverslips를 거꾸로 누워. 로커에 놓고 1 시간 37 ° c.에 대 한 품 어</li>
	<li>DPBS 로커에 5 분 동안 3 번을 씻어.</li>
	<li>1 차적인 항 체 희석 (1:400 토끼 polyclonal 안티-citrullinated 히스톤 H3 (citH3) 5% 염소 혈 청에서). 셀 파라핀 영화 늘어서 레이블이 접시에 품 어. 거꾸로 희석된 항 체 솔루션의 50 ~ 100 μ에 각 커버 슬립을 하다. 로커에 놓고 1 시간 37 ° c.에 대 한 품 어</li>
	<li>DPBS 로커에 5 분 동안 3 번을 씻어.</li>
	<li>희석 이차 항 체는 5% 염소 혈 청에 fluorophore (1: 200)을 활용. 셀 파라핀 영화 늘어서 레이블이 접시에 품 어. 거꾸로 희석된 항 체 솔루션의 50 ~ 100 μ에 각 커버 슬립을 하다. 로커에 놓고 어둠 속에서 37 ° C에서 1 시간을 품 어.</li>
	<li>어둠 속에서 로커에 5 분 동안 DPBS에 3 번을 씻어.</li>
	<li>Myeloperoxidase (MPO)의 동시 검출에 대 한 리 외. 에 설명 된 대로 수정된 더블 immunolabeling 프로토콜에 대 한 다음 단계에 따라 13
</li>
	<li>셀 파라핀 영화 늘어서 레이블이 접시에 품 어. 각 커버 슬립 거꾸로에 누워 10% 토끼의 100 ~ 200 μ 부드러운 락 (하룻밤, 4 ° C, 어둠 속에서)에서 혈 청.</li>
	<li>어둠 속에서 로커에 5 분 동안 DPBS에 3 번을 씻어.</li>
	<li>셀 50 μ g/mL 결합형된 염소 안티 토끼 팹 어둠 속에서 로커에 실 온에서 2 h에 대 한 조각에 품 어.</li>
	<li>어둠 속에서 로커에 5 분 동안 DPBS에 3 번을 씻어.</li>
	<li>1 차적인 항 체 (1: 200 토끼 polyclonal 항 인간의 MPO 항 체)에 5% 염소 혈 청을 희석. 셀 파라핀 영화 늘어서 레이블이 접시에 품 어. 거꾸로 희석된 항 체 솔루션의 50 ~ 100 μ에 각 커버 슬립을 하다. 로커에 놓고 어둠 속에서 37 ° C에서 1 시간을 품 어.</li>
	<li>5% 염소 혈 청에 fluorophore를 활용 된 이차 항 체를 희석 하 고 품 어 4.8에 설명 된 대로</li>
	<li>어둠 속에서 로커에 5 분 동안 DPBS에 3 번을 씻어.</li>
	<li>간섭 제어 두 번째 면역 라벨 단계에서 어느 주 항 체를 가진 외피를 제외 하 여 준비 되어야 한다.</li>
	<li>300 DNA를 얼룩 nM의 4' 6-Diamidion-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) 실 온에서 어둠 속에서 5 분.</li>
	<li>어둠 속에서 로커에 1 분 동안 DPBS에 3 번을 씻어.</li>
	<li>유리 슬라이드에 antifade mountant의 드롭 (~ 50 μ)을 적용 합니다. 부드럽게 거꾸로 셀으로 coverslip를 탑재 하기 전에 초과 버퍼를 제거 하는 흡수 성 종이에 coverslip의 가장자리를 누릅니다. 장착 매체는 coverslip와 유리 슬라이드 사이 얇은 층을 형성 한다. 공기 방울을 제거, 매우 부드럽게 누릅니다는 coverslip에 좋은 집게와.</li>
	<li>4 ° c.에 어둠 속에서 하룻밤 치료 샘플 허용 장착 매체 집중 렌즈와 현미경 분석에 대 한 강화 해야 합니다. 어둠 속에서 4 ° C에서 샘플을 저장 합니다.</li>
</ol>5. 호 중구 Extracellular 함정 정량화
<ol><li>수집 하 고 분석 하는 실험 조건에 현미경 이미지 operator(s) 장 님.</li>
	<li>40 X 확대에 형광 현미경을 사용 하 여, 걸릴 10 이미지 임의로 해당 채널에서 실험에서 각 coverslip의 다른 지구에서. 노출 시간, 밝기 및 대비 각 채널의 이미지의 인수에 걸쳐 일관성이 유지 됩니다 확인 하십시오.</li>
	<li>사용 가능한 소프트웨어 ImageJ (NIH) 등을 사용 하 여 이미지를 분석 합니다. CfDNA, citH3, MPO (그림 3A, B)의 공동 지역화에 따라 그물을 식별 합니다. 계량 그물과 각 실험 조건에 대 한 10 임의의 필드에서 호 중구의 수 있습니다. 그물의 숫자 발표 비율로 표현 될 수 있습니다 (그물의 번호: 호 중구의 총 수) 각 실험 조건에 대 한.</li>
	<li>세포내 citH3 식에 치료 효과 평가 하려면 계산 세포내 citH3와 호 중구의 수와 각 채널 ( 에서 40 배 확대에 10 임의의 필드에서 세포내 citH3 없이 호 중구 수가 그림 3, 빨간색 화살표). 세포내 citH3 식 세포내 citH3 세포내 citH3 없이 호 중구의 수와 호 중구 수의 비로 나타낼 수 있습니다.</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 없다.

선물이 여기 생활 개 neutrophils 셀 permeant 염료와 셀 impermeant 염료를 사용 하 여에 핵 구조 및 cfDNA 출시를 프로토콜. 이 분석 결과의 주요 장점은 수 있다는 그물 형성의 실시간 탐지에 대 한 고해상도 현미경 셀 고정 없이 라이브 호 중구에 의해 따라서 관찰 하는 그물 형성 체 외에 는 간단 하 고 유용한 도구를 제공. 이 분석 결과 NET 구성 요소 검색에 대 한 항 체를 필요로 하지 않습니다, 때문에, 종의 항 체의 제한 된 가용성과 종에서 NETosis를 공부 하 고 이상적입니다. 이 분석 결과 사용 하 여, 저자 개 호 중구에서 LPS 또는 PMA chromatin decondensation 받아야 시연 NETosis13이전 자극. 이 기술의 주요 단점은 특정 NETosis에 대 한는 것입니다. 셀 impermeant 염료는 또한 회 저 성 세포에서 핵 산 또는 lysed 호 중구에서 발표 하는 핵 산 얼룩, 때문에 cfDNA 또는 셀 impermeant 긍정적인 세포 그물 또는 NETosing neutrophils 잘못 해석 될 수 있다. 또는, PMA 또는 LPS 활성화 neutrophils PAD4 억제제, Cl-amidine와 청소용는 포함 하 여 NETosis의 특이성을 늘릴 수 있습니다. 우리가 시연 여기 무 균과 오염으로 격리 프로세스를 통해 호 중구의 적절 한 처리의 중요성 및 순전히 수 있다 생체 외에서 괴 사로 이어질 세력과 세포 세포의 용 해. 또한 좋습니다 프로토콜 내내 적절 한 온도 준수 하 고 장기화 방지 (> 1 분) 침투성 세포. 확인 하 고 격리 된 호 중구 초과의 생존, Trypan 블루 제외 테스트로 unstimulated 호 중구로 구성 된 부정적인 제어는 좋습니다.
셀 스며들 지 않는 핵 산 염료에 의해 감지 하는 cfDNA NETosis에 대 한 특정 하지 않습니다, 때문에 우리는 그물 형성 체 외에서 고 개 호 중구에서 세포내 citH3 식 측정에 대 한 이중-immunolabeling 프로토콜을 개발 했다. 호 중구 extracellular 공간으로 cfDNA와 citH3 MPO 같은 세분화 된 단백질을 출시, cfDNA, citH3, MPO의 공동 지역화에 따라 NET 정량화는 더 구체적인 cfDNA, nucleosomes 등 DNA MPO 복잡 한 다른 분석 실험에 비해 14. 개 단백질 cross-react 항 체의 한정 된 가용성으로 인해 사용 하는 다른 종 (토끼)에서 시작 되는 1 차 항 체. 잔여 무료 바인딩 사이트 착 과정의 어느 단계에서 2 차 항 체에 의해 1 차 항 체의 캡처를 방지 하려면 우리는 먼저 무료 바인딩 사이트 포화 결합형된 Fab 조각 뒤 토끼 혈 청 활용. 이 절차의 1 개의 중요 한 단계 면역 글로불린 및 관심의 두 번째 단백질의 검출을 방해할 수 있는 놀라 우 파편의 초과 바인딩 방지 하기 위해 적절 한 세척 하는 것입니다. 일반적인 바인딩 및 방해를 최소화 하기 위해 1 차 및 이차 항 체의 다른 희석을 테스트 것이 좋습니다. Immunolabelling 단계 중에서 2 차 항 체 그것의 1 차 항 체에 결속 되도록 조사 2 다른 컨트롤을 두 번째 immunolabelling 단계에서 어느 1 차적인 항 체를 제외를 포함 해야 합니다. 비 특정 바인딩 두 이차 항 체에서 신호 감지 될 때 발생 합니다.
히스톤 citrullination 또는 효소 peptidylarginine deminase 4 (PAD4)에 의해 촉매 탈 쥐와 인간15,16NETosis 박테리아 관련에 필수적 이다. 이 분석 결과 사용 하 여, 개에 NETosis LPS 유발도에서는 히스톤 H3 citrullination 패드13확인할 수 있었습니다. PAD4 활성화 하 여 NETosis을 유도 하는 관심의 자극 여부를 테스트 하려면 PMA 또는 칼슘 ionophore, A2318717처럼 알려진된 PAD4 활성 제를 사용 하 여 긍정적인 컨트롤의 포함을 하는 것이 좋습니다. 호 중구 쇼 부정적인 긍정적인 컨트롤 샘플에서 citH3에 대 한 얼룩, 결과 충분 한 긍정적인 얼룩 때까지 프로토콜 개정 해야 합니다. Unstimulated 호 중구 또는 Cl-amidine 패드 억제제로 치료 하는 호 중구로 구성 된 생물 부정적인 컨트롤의 포함을 좋습니다.
뚜렷한 그물 구조의 정확한 식별이이 기술을 사용 하 여 도전적 될 수 있다. NETotic 이벤트의 과소 이어질 수 있는 여러 인접 한 호 중구에서 발표 하는 그물 구조의 병합이 특히 광범위 한 NETosis와 어려운 될 수 있습니다. 이 분석 결과의 결과 개 호 중구에 사용 하기 위해 검증 되지 아직 cytometry 또는 ELISA, 같은 다른 더 객관적인 분석으로 상관 될 수 있습니다. Confluent 그물 구조 형성을 피하기 위해, 조사자 셀의 낮은 농도 시드할 수 있습니다. 또는, 총 보육 시간 감소 광범위 한 NETosis 및 그물 구조의 병합 피할 수 있다. 저자의 경험에 따라 다른 종에서 NETosis를 조사 하기 위해이 프로토콜을 사용할 수 있지만 호 중구 응답 LPS 또는 PMA는 종 중에서 크게 달라질 수 있습니다.
개 그물의 발견 NETosis 미생물 감염과 질병 면역 중재 동안 타고 난 면제의 보존된 메커니즘입니다 강조 표시 합니다. 여기에 제시 된 분석 실험은 개와 다른 종에 있는 NETosis의 연구에 대 한 유용한 도구가 될 수 있습니다. 패 혈 증 유발 NETosis의 더 나은 이해는 패 혈 증에 대 한 새로운 치료 전략의 개발에 추가 연구를 촉진 한다.

호 중구는 짧은 granulocytes 병원 체 침입에 대 한 초기 방어에 대 한 책임. 먹어서, degranulation, 반응성 산소 종 (선생님)1세대에 의해 미생물을 제거 하는 호 중구, 감염의 사이트에 보충. 세균 또는 독, 있을 때 호 중구 릴리스 호 중구 extracellular 함정 (그물), extracellular chromatin의 구성된 장식 히스톤 elastase myeloperoxidase 같은 세분화 된 단백질 (MPO)2. 그물을가지고 있지만 필수적인 항균 속성, 패 혈 증 동안 불타 그물 형성 여러 장기 부전 및 죽음3,4, 으로 이어질 수 있습니다 제안 실험 및 임상 증거 증가 5 , 6.
그물 개에 유사한 병 태 생리 역할을 재생할 수 있습니다, 때문에 치료 개입을 방지 하거나 감소 그물 형성 정화 조 동물에 비 발한 치료 전략으로 봉사 할지도 모른다. 이러한 이유로, 평가 하 고 NETosis와 개에 있는 NET 구성 요소를 계량 하는 신뢰할 수 있는 기술에 대 한 필요가 있다. NET 구성 요소 셀 무료 DNA (cfDNA) 등 nucleosomes 개 호 중구 및 임상 개7,,89에서 플라즈마에 이전 평가 않았습니다. 형광 분석 실험을 사용 하 여, Goggs 및 Letendre 발견 정화 조 개 건강 개8보다 cfDNA의 더 높은 수준이 있다. 비록 이러한 기술은 매우 객관적이 고 정량적 인 NETosis의 표식으로 cfDNA 및 nucleosomes의 측정은 NETosing neutrophils 이외의 회 저 성 세포에서 파생 될 수 있기 때문에 일반적인입니다. 여기는 라이브 NETosing 호 중구의 행동 검사에 형광 현미경 검사 법을 활용 하는 기술에 설명 합니다. 우리는 또한 주관적으로 계량 그물과 MPO 등10개 호 중구에서 citH3 그들의 구성 요소를 더블-immunolabeling를 사용 하 여 수정 된 프로토콜을 선발.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dextran from Leuconostoc spp.</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>31392</td>
			<td>Molecular weight 450,000 &#8211; 650,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque PLUS</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>17144002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1285801</td>
			<td>With divalent cations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14190136</td>
			<td>Without divalent cations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli O55:B5</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Orange Fluorescent Nucleic Acid Stain</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S11368</td>
			<td>5 mM in DMSO; stains in cells with permeable membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTO Green 16 Fluorescent Nucleic Acid Stain</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S7578</td>
			<td>1 mM in DMSO; stains in cells with intact membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surface-Amps NP-40</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>28324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine coated coverslips</td>
			<td>neuVitro</td>
			<td>H-12-pdl</td>
			<td>12 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-citrullinated histone H3 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab5103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unconjugated goat anti-rabbit Fab fragments</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>111-007-003</td>
			<td>Specificity: IgG (H+L)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti- Myeloperoxidase antibody</td>
			<td>Dako</td>
			<td>A0398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI)</td>
			<td>Life Technologies Corporation</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro canine neutrophil extracellular trap formation: dynamic and quantitative analysis by fluorescence microscopy

병원 균 침입에 대 한 응답, 중 성구 호 중구 extracellular 함정 (그물), 장식 된 히스톤과 항균 단백질 DNA의 세포 외 네트워크를 릴리스 합니다. 과도 한 네트워크 형성 (NETosis) 및 패 혈 증 동안 citH3 자료 여러 기관 역 기능 및 쥐와 인간 사망 관련 된 하지만 개 그 의미를 알 수 있습니다. 여기, 우리가 개 neutrophils 관찰과 NETosis의 정량화에 대 한 전체 혈액에서 분리 하는 기술을 설명 합니다. Dextran 침전에 의해 생성 된 백혈구 풍부한 플라즈마 상용 밀도 그라데이션 분리 미디어로 구분 되 고 granulocytes 수집 세포 수 및 생존 능력 테스트. 관찰 하기 위해 라이브 호 중구에서 실시간으로 NETosis, permeant 셀 및 셀 impermeant 형광 핵 산 얼룩 호 중구 활성화 lipopolysaccharide (LPS) 또는 phorbol myristate 12 13-아세테이트 (PMA)에 추가 됩니다. 핵 형태학 및 NET 형성 변화는 시간이 지남에 형광 현미경 검사 법에 의해 관찰 된다. 생체 외에서 NETosis 공동-colocalization의 세포 없이 DNA (cfDNA), myeloperoxidase (MPO) 및 citrullinated 히스톤 H3 (citH3) 수정된 더블-immunolabelling 프로토콜을 사용 하 여 추가 특징 이다. 그물 그물 형성 및 citH3 식 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 객관적으로 계량을 하 고 citH3 양성 세포는 사용 가능한 소프트웨어를 사용 하 여 멀게 방식에서 계량. 이 기술은 체 외에서 의 용량 개 호 중구 NETosis을 평가 하는 특정 분석 결과 이다.

라이브 셀 이미징의이 프로토콜을 사용 하 여, 조사 핵 형태학, 원형질 막 무결성과 생활 호 중구에서 cfDNA의 존재를 확인할 수 있습니다. 손상 된 세포 막에 포함 된 셀에 셀 impermeant 핵 염색 얼룩 핵 산 레드. 다른 셀 permeant 염료, 라벨 그대로 플라즈마 멤브레인과 살아있는 세포에서 세포내 핵 산. 그들의 치료에 모든 그대로 neutrophils 녹색 표시 되 고 자극 (그림 2A) 후 0 ~ 30 분 특성 lobulated 핵을 전시 한다. PMA 처리 호 중구의 핵 약 60 분 lobulated 그들의 모습을 잃게 되 고 cfDNA (그림 2B)의 출시 될 때까지 decondense를 계속 시작 합니다. LPS, 느리고 더 생리 흥분 제 개 호 중구의 일반적으로 되지는지 않습니다 chromatin decondensation 또는 NETosis에 90 분까지 자극 (그림 2B) 후. 120 분, LPS와 PMA 활성화 neutrophils 볼 수 있습니다 cfDNA에 의해 둘러싸여. LPS에 비해, 더 PMA 활성화 neutrophils 셀 impermeant 염료 (그림 2C)에 의해 레드 스테인드는 그들로 그들의 원형질 막 무결성 손실. Lobulated 핵과 잠복기 (그림 2A-C)에 걸쳐 그대로 플라즈마 막 unstimulated neutrophils (DPBS 제어) 유지 해야 합니다.
NET 구성 요소 cfDNA 구성 된, citH3 및 MPO과 립 이중 immunolabeling 프로토콜을 사용 하 여 검색 됩니다. CfDNA의 공동 지역화를 기반으로 하는 그물, 식별의 출시, citH3 및 LPS와 PMA MPO 각각 그림 3A 와 3B에 나와 있습니다. 180 분 LPS에 의해 자극된 호 중구 근처 neutrophils (그림 3A)에 가까운 근접에서 그물의 개별 웹 같은 건설 기계 생산. 반면에, PMA 활성화 호 중구 지역 (그림 3B, D)에 눈에 띄게 큰 있던 그물의 방대한 생산. Citrullination 히스톤 H3, 효소 peptidylarginine deiminase (패드)에 의해 촉매의 NETosis의 특징은. PMA, 패드의 강력한 자극 제 셀 표현 세포내 citH3 unstimulated와 LPS 자극 호 중구 (그림 3E)에 비해 높은 수 발생 합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58083/58083fig1.jpg"> 그림 1: 개 호 중구 분리의 단계를 보여주는 회로도. 적혈구 (RBC)의 침전에 대 한 3% dextran heparinized 전체 혈액 희석된 혼합 처음입니다. 백혈구-풍부한 혈장 수집 그리고 상용 밀도 그라데이션 분리 미디어의 동일 볼륨에 계층 이다. 원심 분리 (400 x g, 30 분), 다음 RBC granulocyte 레이어 추출 하 고 나머지 Rbc 침투성 세포에 의해 제거 된다. 1.8%의 추가 후에 NaCl, granulocytes 스핀 다운 (112 x g, 5 분)와 전용된 버퍼에서 resuspended. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58083/58083fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58083/58083fig2.jpg"> 그림 2: 라이브 개 호 중구의 대표적인 형광 이미지. 격리 된 호 중구 100 µ g/mL LPS로 활성화 되었다, Dubecco의 인산 염 버퍼 식 염 수 (DPBS) 라이브 그대로 호 중구에서 180 분 핵 산의 총에 대 한 부정적인 제어로의 100 nM, PMA 또는 볼륨 셀 permeant를 사용 하 여 그린 스테인드 했다 염색 약 cfDNA 및 손상 된 세포 막과 호 중구 레드 셀 impermeant 염료와 스테인드 했다 하는 동안 (A, D) 모든 DPBS LPS 처리 neutrophils lobulated 핵 (별표)로 그대로 세포 막 유지. (A, E) PMA 활성화 호 중구의 핵 decondensation (화살촉)를 받아야 하기 시작 했다. (B, F) 90 분, LPS 또는 PMA 활성화 호 중구에서 대부분 핵 lobulated 모습 (파란색 화살표)을 잃었습니다. (C) 후 120 분, 모든 PMA 활성화 neutrophils 침투성 플라즈마 막 LPS 활성화 neutrophils (화살표)의 작은 수를 둘러싼 cfDNA를 볼 수 있는 하는 동안 cfDNA에 의해 포위 했다. Unstimulated 호 중구 cfDNA을 생성 하지 않았다도 아니다 세포 막 (A C) 언제 든 지 시간을 손상 했다. (A-B) 원래 40 X 확대. 눈금 막대 = 100 µ m. (D-F) 80 X 확대. 눈금 막대 = 30 µ m. 실험은 3 다른 기증자 로부터 격리 하는 호 중구에서 두 번 복제. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58083/58083fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58083/58083fig3.jpg"> 그림 3: 그물 형성. (A C) 체 외에 그물에서 형성의 대표적인 immunofluorescent 이미지. 단일 기증자 로부터 격리 된 호 중구 고정 했다, permeabilized 및 myeloperoxidase (MPO, 녹색) 및 citrullinated 히스톤 H3 dna (파란색), 물 (citH3, 빨간색) (A) 100 µ g/mL LPS, (B) 100으로 자극 후 PMA 또는 (C) DPBS nM 180 분에 대 한 그물, cfDNA, MPO 및 citH3, 공동 현지화로 식별 개요 (점선) (A) LPS-및 (B) PMA 활성화 호 중구에 있습니다. CitH3의 세포내 표현의 예는 빨간색 화살표로 표시 됩니다. (C) 그물도 세포내 citH3 unstimulated 호 중구에서 볼 수 있습니다. 눈금 막대 = 100 µ m. (D, E) 대표 상자와 수염 음모 그물 형성 및 세포내 citH3 식 4 개에서 분리 하는 호 중구에의. 상자 25번째 에서 75번째 백분위 확장 및 수염 스팬 작은에서 가장 큰 값을. 중요 한 (D) 그물 형성 (E) 세포내 citH3 식 unstimulated 호 중구에 비해 LPS와 PMA 자극 당하고. + 의미 하는 나타냅니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58083/58083fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

우리 개 neutrophils 전체 혈액에서 분리 하 고 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 라이브 호 중구에서 그물 형성을 시각화 하는 방법을 설명 합니다. 프로토콜 네트워크 형성 및 citrullinated 히스톤 H3 계량 하는 설명 (citH3) 식 면역 형광 검사 현미경 검사 법을 사용 하 여.

생체 외에서 형광 현미경 검사 법에 의해 개 호 중구 Extracellular 함정 형성: 역동적이 고 양적 분석

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

in-vitro-canine-neutrophil-extracellular-trap-formation-dynamic

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

8.6K 조회수.  University of California, Davis. 우리 개 neutrophils 전체 혈액에서 분리 하 고 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 라이브 호 중구에서 그물 형성을 시각화 하는 방법을 설명 합니다. 프로토콜 네트워크 형성 및 citrullinated 히스톤 H3 계량 하는 설명 (citH3) 식 면역 형광 검사 현미경 검사 법을 사용 하 여.

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Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them intracellularly when their antimicrobial granules fuse with the phagosome. We found that neutrophils have an additional way of killing microorganisms: upon activation, they release granule proteins and chromatin that together form extracellular fibers that bind pathogens. These novel structures, or Neutrophil Extracellular Traps (NETs), degrade virulence factors and kill bacteria1, fungi2 and parasites3. The structural backbone of NETs is DNA, and they are quickly degraded in the presence of DNases. Thus, bacteria expressing DNases are more virulent4. Using correlative microscopy combining TEM, SEM, immunofluorescence and live cell imaging techniques, we could show that upon stimulation, the nuclei of neutrophils lose their shape and the eu- and heterochromatin homogenize. Later, the nuclear envelope and the granule membranes disintegrate allowing the mixing of NET components. Finally, the NETs are released as the cell membrane breaks. This cell death program (NETosis) is distinct from apoptosis and necrosis and depends on the generation of Reactive Oxygen Species by NADPH oxidase5. 
Neutrophil extracellular traps are abundant at sites of acute inflammation. NETs appear to be a form of innate immune response that bind microorganisms, prevent them from spreading, and ensure a high local concentration of antimicrobial agents to degrade virulence factors and kill pathogens thus allowing neutrophils to fulfill their antimicrobial function even beyond their life span. There is increasing evidence, however, that NETs are also involved in diseases that range from auto-immune syndromes to infertility6.
We describe methods to isolate Neutrophil Granulocytes from peripheral human blood7 and stimulate them to form NETs. Also we include protocols to visualize the NETs in light and electron microscopy.

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) are an important innate immune mechanism to fight pathogenic bacteria, fungi and parasites. Here we describe methods to isolate neutrophil granulocytes from human blood and to activate them to form NETs. We present preparation techniques to visualize NETs in light and electron microscopy.

호중구 세포 트랩 : 그들을 생성 및 시각화하는 방법

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

연구

면역학 및 감염병학

Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the postcapillary venules of inflamed tissue, leukocytes initially tether and roll on the luminal surface of venular wall. Rolling leukocytes arrest on endothelium and undergo firm adhesion in response to chemokine or other chemoattractants on the venular surface. Many adherent leukocytes relocate from the initial site of adhesion to the junctional extravasation site in endothelium, a process termed intraluminal crawling3. Following crawling, leukocytes move across endothelium (transmigration) and migrate in extravascular tissue toward the source of chemoattractant (chemotaxis)4. Intravital microscopy is a powerful tool for visualizing leukocyte-endothelial cell interactions in vivo and revealing cellular and molecular mechanisms of leukocyte recruitment2,5. In this report, we provide a comprehensive description of using brightfield intravital microscopy to visualize and determine the detailed processes of neutrophil recruitment in mouse cremaster muscle in response to the gradient of a neutrophil chemoattractant. To induce neutrophil recruitment, a small piece of agarose gel (~1-mm3 size) containing neutrophil chemoattractant MIP-2 (CXCL2, a CXC chemokine) or WKYMVm (Trp-Lys-Tyr-Val-D-Met, a synthetic analog of bacterial peptide) is placed on the muscle tissue adjacent to the observed postcapillary venule. With time-lapsed video photography and computer software ImageJ, neutrophil intraluminal crawling on endothelium, neutrophil transendothelial migration and the migration and chemotaxis in tissue are visualized and tracked. This protocol allows reliable and quantitative analysis of many neutrophil recruitment parameters such as intraluminal crawling velocity, transmigration time, detachment time, migration velocity, chemotaxis velocity and chemotaxis index in tissue. We demonstrate that using this protocol, these neutrophil recruitment parameters can be stably determined and the single cell locomotion conveniently tracked in vivo.

We describe a protocol of brightfield intravital microscopy for measuring dynamic neutrophil-endothelial cell interactions during neutrophil recruitment in response to the source of a neutrophil chemoattractant in vivo. Neutrophil intraluminal crawling, transendothelial migration and chemotaxis in mouse cremaster muscle tissue are visualized with time-lapsed video photography and tracked with ImageJ.

추적 호중구 Intraluminal 크롤링, Intravital 비디오 현미경에 의한 조직의 Transendothelial 마이 그 레이션 및 Chemotaxis

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

정량<em&gt; 체외</em정적 조건에서 활성화 된 기본 인간의 미세 혈관 내피 세포에 호중구 부착을 측정하는&gt; 분석

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils developed several antimicrobial mechanisms including phagocytosis, degranulation and formation of neutrophil extracellular traps (NETs). NETs consist of a DNA scaffold decorated with histones and several granule markers including myeloperoxidase (MPO) and human neutrophil elastase (HNE). NET release is an active process involving characteristic morphological changes of neutrophils leading to expulsion of their DNA into the extracellular space. NETs are essential to fight microbes, but uncontrolled release of NETs has been associated with several disorders. To learn more about the clinical relevance and the mechanism of NET formation, there is a need to have reliable tools capable of NET quantitation. 
Here three methods are presented that can assess NET release from human neutrophils in vitro. The first one is a high throughput assay to measure extracellular DNA release from human neutrophils using a membrane impermeable DNA-binding dye. In addition, two other methods are described capable of quantitating NET formation by measuring levels of NET-specific MPO-DNA and HNE-DNA complexes. These microplate-based methods in combination provide great tools to efficiently study the mechanism and regulation of NET formation of human neutrophils.

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High throughput assays are presented that in combination provide excellent tools to quantitate NET release from human neutrophils.

세포 외 DNA 릴리스의 높은 처리량 측정 및 인간 호중구의 양적 NET 형성<em&gt; 체외</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or neutralize the ingested material, or to present it as antigens and initiate adaptive immune responses. The pH of phagosomes is a critical parameter regulating fission or fusion with endomembranes and activation of proteolytic enzymes, events that allow the phagocytic vacuole to mature into a degradative organelle. In addition, translocation of H+ is required for the production of high levels of reactive oxygen species (ROS), which are essential for efficient killing and signaling to other host tissues. Many intracellular pathogens subvert phagocytic killing by limiting phagosomal acidification, highlighting the importance of pH in phagosome biology. Here we describe a ratiometric method for measuring phagosomal pH in neutrophils using fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled zymosan as phagocytic targets, and live-cell imaging. The assay is based on the fluorescence properties of FITC, which is quenched by acidic pH when excited at 490 nm but not when excited at 440 nm, allowing quantification of a pH-dependent ratio, rather than absolute fluorescence, of a single dye. A detailed protocol for performing in situ dye calibration and conversion of ratio to real pH values is also provided. Single-dye ratiometric methods are generally considered superior to single wavelength or dual-dye pseudo-ratiometric protocols, as they are less sensitive to perturbations such as bleaching, focus changes, laser variations, and uneven labeling, which distort the measured signal. This method can be easily modified to measure pH in other phagocytic cell types, and zymosan can be replaced by any other amine-containing particle, from inert beads to living microorganisms. Finally, this method can be adapted to make use of other fluorescent probes sensitive to different pH ranges or other phagosomal activities, making it a generalized protocol for the functional imaging of phagosomes.

Phagosomal pH influences phagosome maturation, oxidant production, phagosomal killing as well as antigen presentation. Here we describe a ratiometric method for measuring time-course and endpoint pH changes in individual phagosomes in living phagocytes using fluorescence microscopy.

비례 형광 현미경으로 Phagosome 산도 측정

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

호중구의 분리 및 분석 치료제에 림프종 세포 감도에서 자신의 역할을 확인하는 방법

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of lipids. The function of lipids (e.g., in host-pathogen interactions or host entry) has been reported to play a crucial role in cellular processes. Here, we show a method to determine lipid composition, with a focus on the cholesterol level of primary blood-derived neutrophils, by HPTLC in comparison to high performance liquid chromatography (HPLC). The aim was to investigate the role of lipid/cholesterol alterations in the formation of neutrophil extracellular traps (NETs). NET release is known as a host defense mechanism to prevent pathogens from spreading within the host. Therefore, blood-derived human neutrophils were treated with methyl-&#946;-cyclodextrin (M&#946;CD) to induce lipid alterations in the cells. Using HPTLC and HPLC, we have shown that M&#946;CD treatment of the cells leads to lipid alterations associated with a significant reduction in the cholesterol content of the cell. At the same time, M&#946;CD treatment of the neutrophils led to the formation of NETs, as shown by immunofluorescence microscopy. In summary, here we present a detailed method to study lipid alterations in neutrophils and the formation of NETs.

Lipids are known to play an important role in cellular functions. Here, we describe a method to determine the lipid composition of neutrophils, with emphasis on the cholesterol level, by using both HPTLC and HPLC to gain a better understanding of the underlying mechanisms of neutrophil extracellular trap formation.

방법은 지질 호중구의 변경 및 호중구 세포 외 트랩의 후속 형성을 연구하기 위해

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although a component of the innate immune response, NETs are implicated in a range of disease processes including autoimmunity and thrombosis. This protocol describes a simple method for canine neutrophil isolation and quantification of NETs using a microplate fluorescence assay. Blood is collected using conventional venipuncture techniques. Neutrophils are isolated using dextran sedimentation and a density gradient using conditions optimized for dog blood. After allowing time for attachment to the wells of a 96 well plate, neutrophils are treated with NET-inducing agonists such as phorbol-12-myristate-13-acetate or platelet activating factor. DNA release is measured by the fluorescence of a cell-impermeable nucleic acid dye. This assay is a simple, inexpensive method for quantifying NET release, but NET formation rather than other causes of cell death must be confirmed with alternative methods.

Neutrophil extracellular traps (NETs) are networks of DNA, histones and neutrophil proteins. Although a component of the innate immune response, NETs are implicated in autoimmunity and thrombosis. This protocol describes a simple method for canine neutrophil isolation and quantification of NETs using a microplate fluorescence assay.

개 호중구 세포 외 트랩 릴리스의 정량화를위한 ​​간단한 형광 분석

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling and cellular processes that control efferocytosis. This quantification can be difficult to perform as apoptotic cells are often efferocytosed piecemeal, thus necessitating methods which can accurately delineate between the efferocytosed portion of an apoptotic target versus residual unengulfed cellular fragments. The approach outlined herein utilizes dual-labeling approaches to accurately quantify the dynamics of efferocytosis and efferocytic capacity of efferocytes such as macrophages. The cytosol of the apoptotic cell is labeled with a cell-tracking dye to enable monitoring of all apoptotic cell-derived materials, while surface biotinylation of the apoptotic cell allows for differentiation between internalized and non-internalized apoptotic cell fractions. The efferocytic capacity of efferocytes is determined by taking fluorescent images of live or fixed cells and quantifying the amount of bound versus internalized targets, as differentiated by streptavidin staining. This approach offers several advantages over methods such as flow cytometry, namely the accurate delineation of non-efferocytosed versus efferocytosed apoptotic cell fractions, the ability to measure efferocytic dynamics by live-cell microscopy, and the capacity to perform studies of cellular signaling in cells expressing fluorescently-labeled transgenes. Combined, the methods outlined in this protocol serve as the basis for a flexible experimental approach that can be used to accurately quantify efferocytic activity and interrogate cellular signaling pathways active during efferocytosis.

Efferocytosis, the phagocytic removal of apoptotic cells, is required to maintain homeostasis and is facilitated by receptors and signaling pathways that allow for the recognition, engulfment, and internalization of apoptotic cells. Herein, we present a fluorescence microscopy protocol for the quantification of efferocytosis and the activity of efferocytic signaling pathways.

단일 세포 형광 현미경 검사 법에 의해 Efferocytosis의 정량화

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

A High-throughput Assay to Assess and Quantify Neutrophil Extracellular Trap Formation

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. NETs have been demonstrated to serve as an important host defense mechanism that traps and kills microorganisms. On the other hand, they have been implicated in diverse systemic autoimmune diseases. NETs are immunogenic and toxic structures that contain a pool of relevant autoantigens including anti-neutrophil cytoplasmic antibodies (ANCA)-associated vasculitis (AAV) and systemic lupus erythematosus (SLE). Different forms of NETs can be induced depending on the stimulus. The amount of NETs can be quantified using different techniques including measuring DNA release in supernatants, measuring DNA-complexed with NET-molecules like myeloperoxidase (MPO) or neutrophil elastase (NE), measuring the presence of citrullinated histones by fluorescence microscopy, or flow cytometric detection of NET-components which all have different features regarding their specificity, sensitivity, objectivity, and quantity. Here is a protocol to quantify ex vivo NET formation in a highly-sensitive, high-throughput manner by using three-dimensional immunofluorescence confocal microscopy. This protocol can be applied to address various research questions about NET formation and degradation in health and disease.

This protocol describes a highly sensitive and high throughput neutrophil extracellular trap (NET) assay for the semi-automated quantification of ex vivo NET formation by immunofluorescence three-dimensional confocal microscopy. This protocol can be used to evaluate NET formation and degradation after different stimuli and can be used to study potential NET-targeted therapies.

평가 하 고 호 중구 Extracellular 함정 대형 계량 높은 처리량 분석 결과

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. ...