J.H. is supported by NIH K99/R00 Pathway to Independence Award (5K99CA172700) and NCI Brain Cancer SPORE Career Development Award (2P50CA127001).

참고 :이 프로토콜의 모든 단계가 UT MD 앤더슨 암 센터에 의해 승인되었습니다. mTERT-ER 대립 유전자의 1 세대 <ol><li> 노크에 소개 ERT2-LBD (리간드 결합 도메인) 상류와 (인트론 2를 통해 엑손 1) mTERT 게놈 시퀀스 프레임과 훈제 연어 포함하는 벡터 대상 - 마우스 ES 세포에 훈제 연어 조각 (그림 1A) - PGK - 네오 전기와. </li><li> 문화 6~10일에 대한 네오 마이신의 ES 세포. 네오 마이신 내성 클론을 선택하고 48 웰 플레이트에서 확장합니다. 상용 키트를 사용하여 게놈 DNA를 추출하고 노크에 대립 유전자 남부 블롯을 확인합니다. </li><li> 거꾸로 현미경 C57BL에 미세 조작 키트 / 6 배반포를 95 % 이상 정상 핵형을 가진 두 개의 ES 라인을 주입한다. 대리모 (23)의 자궁에 배반포를 이식. C57BL / 6 FE에 고급 수컷 키메라 (70-90%)을 메이트남성. </li><li> 남부 오점으로 이형 mTERT-ERneo 동물의 유전자형을 확인합니다. </li><li> NeoR 카세트를 삭제 이형 mTERT-ERneo 동물과 EIIa-Cre 호텔 동물 메이트. 동질 접합체를 생성하기 위해 적어도 세 번 더 간 품종 이형 mTERT-ER 동물에 대한 C57BL / 6 동물 이형 동물 메이트. </li></ol> LSL - mTERT 대립 유전자의 2 세대 <ol><li> 노크에에 loxP를 포함하는 벡터를 대상으로 도입 - 트리플 스토퍼 - 네오 -에 loxP 조각 및 전기 (23)와 마우스 ES 세포로 (엑손 1 인트론 2, 그림 1B 사이) mTERT 게놈 시퀀스를. </li><li> 문화 6~10일에 대한 네오 마이신의 ES 세포. 네오 마이신 내성 클론을 선택하고 48 웰 플레이트에서 확장합니다. 상용 키트를 사용하여 게놈 DNA를 추출하고 남부 오 (23)에 의해 노크에 대립 유전자를 확인합니다. </li><li> 인제거꾸로 현미경 미세 조작 키트와 C57BL / 6 배반 포기에 95 % 이상 정상 핵형을 가진 CT 두 ES 라인. 대리모 (23)의 자궁에 배반포를 이식. C57BL / 6 암컷 고급 남성 키메라 (70-90%를) 메이트. </li><li> 남부 오점으로 이형 LSL - mTERT 동물의 유전자형을 확인합니다. </li><li> 적어도 3 회 C57BL / 6 동물 이형 동물 메이트, 또한 간 품종 이형 LSL - mTERT 동물 동질 접합체를 생성합니다. </li></ol> 생체 내에서 mTERT-ER 및 LSL - mTERT 마우스에서 텔로 머라 제의 3. 재 활성화 mTERT-ER의 경우 <ol><li> 주입하기 전에 모든 수술 도구를 소독. </li><li> 50 % (v / v)의 산소 / 50 % (v / v)의 일산화이 질소 가스 혼합물에 이소 플루 챔버 (유도 4 %, 2 %로 유지)으로 마취 된 마우스. 아니면 케타민 - 자일 라진 (xylazine) 혼합물에 의해 마우스 (100m 마취g / kg (체중) + 10 ㎎ / ㎏ 체중). </li><li> 깊은 마취에 도달하면, 유도 챔버로부터 마취 된 동물을 제거하고, 챔버 이소 플루 란 (2 %)에 접속 관내 그들의 머리를 유지한다. </li><li> 동물이 깊이 마취되어 있는지 확인하기 위해 쥐의 발 패드를 핀치. 마르지 눈을 방지하기 위해, 양쪽 눈에 연고를 넣어. 포비돈 요오드 용액으로 마우스의 뒷면을 닦습니다. </li><li> 뒷면의 피부 아래 정밀 투관침 (10 G)와 느린 방출 4-OHT 펠렛을 주입하고 두 어깨 사이의 중간 선에 펠릿을 끝까지 밀어 넣습니다. </li><li> 상처 클립 적용자와 절개를 밀봉하고 마취에서 회복 쥐를 모니터링 할 수 있습니다. 십일 나중에 클립을 제거합니다. 절차가 곧 완료되기 때문에 보충 열 필요가 없습니다. </li><li> 4- OHT 펠릿과 치료 기간은 연구의 목적에 따라 최적화되어야한다. </li></ol> LSL - mTERT 들어 &lt;OL&gt; <li> 타목시펜 (10 ㎎ / ㎖, 옥수수 기름에 용해) (200 UL / 25g / 일) 복강 이틀 연속 주입된다. </li></ol> 신경 줄기 세포를 체외에서 텔로 머라 제의 재 활성화 4. 분리 <ol><li> 마우스를 이산화탄소로 안락사 및 뇌를 제거한다. 제조 업체에 따라 시중에서 판매하는 신경 조직 해리 키트의 프로토콜을 따르십시오. </li><li> 와류를 수행하지 해결책 4.위한 세포 배양 배지 1 ㎖로 표지 된 해결책 4 바이알에서 동결 건조 분말을 재현 탁. 이 용액 분주 나중에 사용하기 위해 -20 ℃에서 보관해야한다. </li><li> 예열 사용 전에 15 분 동안 37 ° C에서 혼합물. </li><li> 해결 방법 1 (50 μL) 및 해결 방법 2 (1,900 μL) : 효소 믹스 1을 확인합니다. 해결 방법 3 (20 μL) 및 솔루션 4 (10 μL) : 효소 믹스 2를 확인합니다. </li><li> 최대 400 mg의 조직과 소용돌이를 위해 1950 μL 효소 믹스 하나를 준비합니다. 37 ℃에서 혼합물을 예열사용하기 전에 15 분. </li><li> 1 일 마우스의 뇌를 가지고, 후각 전구 및 소뇌를 제거하여 forebrains을 유지합니다. 4 ° C에서의 제거 및 저장하기 때문에 감기 배지 1 ㎖의 전뇌 조직을 유지합니다. 1 시간 내에서 신경 조직을 처리 할 수​​ 있는지 확인합니다. </li><li> 소화 당 400 mg의 한계를 초과하지 확인하기 위해 조직의 무게를 결정합니다. 35mm 직경 페트리 접시의 뚜껑에 뇌를 놓고 메스를 사용하여 뇌 호감. </li><li> HBSS 1 ㎖를 추가, 1 ml의 피펫 팁을 사용하여 (w / 칼슘 / 마그네슘 O) 다시 15 ML 튜브 피펫 조각. HBSS 린스 (w / 칼슘 / 마그네슘 O). 원심 분리기 실온에서 2 분 동안 300 × g에서 조심스럽게 뜨는을 대기음. </li><li> 예열 효소 믹스 1의 1,950 μL (솔루션 1, 2) 당 최대 400 mg의 조직을 추가합니다. 반전 또는 튜브를 5 분마다 흔들어 혼합, 37 ° C에서 15 분 동안 15ml의 튜브 부화. </li><li> 20 &amp; #을 추가하여 조직 샘플 30 μL 효소 믹스 2를 준비(956), 솔루션 (4)의 10 μL에 대한 해결 방법 3의 난 다음 샘플에 추가. 섞어 부드럽게 반전. 소용돌이하지 마십시오. </li><li> 기계적으로 천천히 피펫 아래로 10 배 넓은 팁, ​​화재 광택 파스퇴르 피펫을 사용하여 조직을 떼어 놓다. 공기 방울을 형성하지 마십시오. </li><li> 튜브를 3 분마다 반전, 10 분 동안 37 ℃에서 배양한다. </li><li> 단계 4.11을 반복하고 조직을 200 mg의보다 큰 경우 4.12 단계. </li><li> 50 ML 튜브에 배치 된 70 μm의 셀 스트레이너에 세포 현탁액을 적용합니다. 셀 스트레이너를 통해 PBS 10 ㎖를 적용합니다. 실온에서 20 분 동안 300g로 셀 스트레이너 원심 세포 현탁액을 버린다. 기음 완전히 뜨는. </li><li> 상기 애플리케이션에 필요한 용적 줄기 세포 배지로 세포를 재현 탁. </li><li> , LSL-mTERT NSCs의에서 텔로 머라 아제를 활성화 이틀 동안 100 μM 4-OHT와 세포를 치료합니다. 100 μM 4 배지에서 세포를 유지, mTERT-ER NSCs의에서 텔로 머라 아제를 활성화하려면-OHT. </li></ol> 5. 텔로미어의 FISH <ol><li> 배양 된 세포에서 중기 염색체를 준비합니다. </li><li> FFPE (포르말린 고정 파라핀 임베디드) 조직 절편, 크실렌과 deparaffinize 각 5 분 (100 %, 90 %, 70 %, 50 % 에탄올)과 5 분 동안 PBS 에탄올 시리즈 재수 들어. </li><li> 메탄올 후 수정 : 아세트산 (3 : 1) 1-2 시간 동안. 각각 5 분 (70 %, 90 %, 100 % 에탄올) 및 공기 건조를 위해 냉 에탄올 시리즈 탈수. 5 분 동안 37 ℃에서 1X PBS로 세척 하였다. </li><li> 2 분 동안 37 ° C에서 4 % 포름 알데히드 염색체 변성. 냉 에탄올 시리즈에서 각각 5 분 (70 %, 90 %, 100 % 에탄올) 및 공기 건조 탈수. </li><li> 각 슬라이드에 PNA 하이브리드 혼합물의 12-25 μl를 적용합니다. (하이브리드 믹스 : 70 % 포름 아미드, 0.06x의 SSC, 0.2 % BSA, 0.5 NG / μL의 tRNA, 0.5 NG / μL 텔로미어 (telomere) 또는 센트로 프로브) </li><li> 고무 시멘트와 커버 슬립을 밀봉합니다. 4m, 80 ℃에서 포스트 - 변성에 염색체 상태로 준비 및 조직 섹션인치 실온에서 잡종 또는 습기 챔버에 2-4 시간 동안 37 ° C. </li><li> 세척 버퍼 2 × 15 분으로 실온에서 씻으십시오. (워시 버퍼 : 70 % 포름 아미드, 0.06x의 SSC, pH를 7.2). PBST 실온에서 3 × 5 분을 씻으십시오. 현미경 검사에 대한 DAPI 또는 원적외선 형광와 카운터 얼룩 슬라이드. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

여기서 우리는 두 개의 유도 쥐의 텔로 머라 제의 대립 유전자 및 방법 생체 내 및 시험관 내에서 텔로 머라 제를 재 활성화하는 방법의 생성을보고합니다. mTERT-ER 활동을 재 활성화를위한 중요한 단계는 타목시펜의 연속 농도를 유지하는 것입니다, 그래서 우리는 미국의 혁신적인 연구에 의해 제조 된 4-OHT 시간 방출 펠렛을 사용하여 선택합니다. 펠릿을 최대 60 일간 1ng의 / ml의 정상 상태 혈중 농도에 4OHT 해제 유지. 이전 연구에서, 우리는이 전략 텔로 머라 제 활성을 재 활성화하는 등 줄기 세포 고갈, G4 mTERT ER / ER에서 텔로미어 기능 장애에 의해 유발 된 여러 장기에서 조직 손상 반응 및 장기 부전의 손상과 퇴행성 표현형을 개선 할 수였다 마우스 (20). 노화 텔로 머라 제의 기능을 연구 이외에,이 두 대립 유전자가 유도 성 텔로 머라 제는 또한 암을 연구하는데 사용될 수있다. 이전의 연구했다이러한 대립 유전자의 장점은 유전체를 형성하고 T 세포의 흉선 림프종 (21)와 전립선 암 (22)의 생물학에 영향을 미치지에서 텔로미어 (telomere)의 감소와 텔로 머라 아제 활성화의 역할을 탐구한다. 이 두 연구는 보여 주었다 후반 세대 G4 현금 지급기에서 텔로미어 기능 장애 - / - mTERT ER / ER 및 G4 PB-Cre4 PTEN을 L은 / L p53을은 L / L은 LSL - mTERT L은 / L 마우스는 조기 돌연변이 이벤트의 인수에 연료를 공급하는 메커니즘을 제공합니다 종양 개시, 아직 완전히 악성 종양의 진행을 방지한다. 텔로 머라 제는 말단 소립 장애 유발 게놈 불안정성, DNA 손상 체크 포인트 만연 염색체 불안정성의 컨텍스트에서 활성화되었을 때 전립선 암 (21)의 골전이 및 thymi의 뇌 침투 새로운 생물학적 성질을 가진 악성 종양의 전체의 진행을 허용하는 억제했다C 림프종 (21). 비슷한 현상은 대장 암과 췌장암 (박사. Haoqiang 잉, 아담 Boutin 로널드 DePinho와 개인 통신)을 포함한 다른 암 종류에서 관찰되었다. TERT-ER 단백질 용이 동물 타목시펜 또는 비히클로 처리 여부에 따라 온 상태 사이 끌 수 있으므로 mTERT-ER 대립 유전자에 의해 생성 된 종양 모델은 항 - 텔로 머라 요법을 시험하는데 이용 될 수있다. 이전 연구에서 종양이 G4 현금 지급기에서 생성 - / - mTERT ER / ER 동물 4-OHT에서 발표 된; 텔로 머라 고갈에, 종양은 결국 때문에 텔로미어 기능 장애에 의한 체크 포인트 (21)의 복귀로 감소했다. 그러나 응답에 저항을 획득 한 종양의 일부는 텔로미어 (ALT)기구의 대체 길어를 활성화하여 멸종 텔로 머라합니다. 이러한 ALT + 저항하는 종양의 또 다른 특성은 t을 보였다헤이 미토콘드리아 합성과 산화 방어 PGC-1β의 마스터 레귤레이터를 포함하여 미토콘드리아 생물학 및 산화 방어에 관여하는 유전자의 비정상적인 전사가있다. 텔로 머라 아제 + 종양 세포가 21 상대적으로 그대로 유지 유지하면서 PGC-1β 또는 SOD2 (산화 방어의 또 다른 레귤레이터)의 최저 크게 ALT + 종양 세포를 제거합니다. 이 두 노크에 대립 유전자의 한 가지 제한은 텔로 머라 제 유전자의 기본 궤적에 있기 때문에 그들은 단지 내생 수준에서 텔로 머라 아제의 활성화를 감당할 수 있다는 것입니다. 대부분의 인간의 암에서는 텔로 머라 제는 실제로 훨씬 더 높은 수준에서 과발현. 텔로 머라 제의 수준을 향상시키기 위해, 우리는 하나의 변형을 고려할 수는 Rosa26 궤적으로 PGK (포스 포 키나제) 프로모터 강한 프로모터 mTERT-ER 구조체를 삽입하는 것이다. 결론적으로,이 두 소설 유도 쥐의 텔로 머라 제의 대립 유전자는 전례없는 그 가죽을 제공IC 툴은 특히 미리 취득한 텔로미어 장애 유발 게놈 불안정성의 배경하에, 노화 및 조직 항상성뿐만 아니라 종양 진행에 텔로 머라 제의 기능을 연구. mTERT-ER 대립 유전자는 다른 종양 발생하기 쉬운 마우스 모델로 건너 방지 텔로 머라 제 요법을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

텔로 머라 제는 텔로미어 유지 관리를 담당하는 효소이다. 이것은 그들의 무결성을 보호 염색체의 말단 반복 서열이다. 텔로 머라 완전 효소의 핵심 구성 요소는 역전사 효소 촉매 서브 유닛 (TERT) 및 1,2- 텔로미어 반복을 추가하기위한 주형으로 작용 RNA 서브 유닛 (TERC)이다. 일반적으로 분화 된 체세포를 억제하면서, 텔로 머라 제는 강력한 활성을 나타내고, 생식 세포, 암 세포에서 중요한 역할을 담당하고 줄기 세포. mTERC 및 mTERT 녹아웃 마우스는 줄기 세포 및 암 모두에서 텔로 머라 제의 기능을 연구 생체 내 모델 시스템에서 큰 제공한다. mTERC 및 mTERT 쥐 (G1)를 마우스 3 텔로미어의 길이 예약에 의한 명백한 표현형을 보여주지 않았다 녹아웃. 그러나, 직렬 후반 세대 (G5-G6)에 mTERC 및 mTERT 녹아웃 쥐를 intercrossing는 결과결국 진보적 인 텔로미어의 침식과 매우 증식 조직 4의 심각한 퇴보를 불러 일으켰다. 늦은 세대 (G5-G6) mTERC는 - / - 마우스 인해 고환 및 생식 세포 고갈의 세포 사멸의 높은 속도로 불임이다. G5-G6 mTERC는 - / - 마우스는 또한 조직 줄기 / 전구 세포 구획 4의 세포 사멸 및 결함이있는자가 재생 능력의 높은 속도로 골수, 장과 피부를 포함하여 높은 증식 조직에 퇴행성 표현형을 나타낸다. 후반 세대의 골수에서 조혈 줄기 세포 mTERC - / - 마우스 증식 잠재력을 전시 손실, 손상자가 재생 능력, 향상된 세포 사멸하고, 결국 기능 고갈 5,6. - / - 마우스 7,8 마찬가지로, 장 지하실에서 점진적으로 증가 세포 사멸 몸은 G1-G6 mTERC 연속 된 각 세대에서 관찰되었다. 티그 역기능 텔로미어의 악영향이 심각 늦은 세대 (G4-G5)에 손상 시험관 성인 신경 줄기 세포의 증식 및 생체 내에서 신경 모두 보낸 높은 회전율 조직에 한정되는 mTERC을하지 않는 것 - / - 생쥐 9 . 줄기 세포에서 텔로 머라 아제의 역할은 더 어떤면에서는 10, 11 노화 조기 유사한 희귀 한 인간의 유전 질환의 dyskeratosis 선천성 (DKC)의 연구 결과에 의해 지원됩니다. DKC dyskerin는, 코어 텔로 머라 제 서브 유닛과 다른 관련 단백질 12 dyskerin 인코딩 TERC, TERT 돌연변이, 및 유전자에 의해 야기된다. 평균에서, DKC 환자에서 텔로미어는 나이 대조군의 짧은 99 % 이상이다. 질병의 주요한 이환율은 조혈 줄기 세포의 결함에 의해 발생되는 유지 재생 불량성 빈혈에 기인한다. 경구 백반증, 네일 이상증, 정신 retardati 같은 질병의 다른 측면고환 위축과 폐 합병증, 모든 텔로 머라 아제 녹아웃 마우스의 후반 세대에 조직 줄기 세포 및 전구 세포 (10), 그와 가까운 계약의 결과의 기능을 손상하는 것이 좋습니다. DKC 환자는 골수이 형성 증후군 경향이 악성 점막 종양의 증가 유병률이있다. 따라서, 인간 환자에서의 텔로 머라 아제 결핍 늦게 발생 텔로 녹아웃 마우스에서 관찰되는 줄기 세포의 기능 및 종양 소인의 결함을 되풀이. 짧은 텔로미어와 높은 텔로 머라 제 활성이 암의 특징입니다. 정상 또는 전 암성 세포 분열로, DNA 이중 가닥 나누기 (DSBs) (13)에 의해 유발 된 것과 유사한 텔로미어와 휴대 체크 포인트의 활성화의 최종 침식의 낮거나없는 텔로 머라 제 활성 결과. 고전 DSBs처럼 텔로미어 기능 장애는 이러한 노화 및 / 또는 apoptosi 같은 세포 반응을 p53의를 유도하기 위해 표시와 관련 된14, 15를에요. p53의 돌연변이의 불 활성화되면, 세포 순환 및 세포 생존은 전좌 및 지역 증폭 및 삭제 16, 17을 특징으로하는 프로 발암 뮤 테이터 메커니즘을 제공 텔로미어 기능 장애와 세포에서 향상됩니다. 동시에, 텔로미어 기능 장애 (심지어 p53의 널 (null) 세포) 관련 만연 염색체 불안정성을 계속 이러한 암의 전체 악성 진행을 제한 할 것으로 보인다. 예를 들어, 후반 세대 G4-G5 mTERC - / - Ink4a / ARF 파일 - / - 마우스 인해 텔로미어 (telomere)의 감소에 Ink4a / 멍멍 널 쥐에 비해 크게 감소 림프종 발생률을 보였다. 또 다른 연구에서는 G4 ​​mTERT에서 고급 선종 성 병변은 - / - APC 최소 마우스는 크게 인해 상당한 성장 정지 및 세포 사멸 (18, 19)에 APC 분 마우스에 비해 억제되었다.텔로미어 게놈 불안정성을 부전 유도한다는 관찰은 종양 진행이 텔로 머라 제의 활성화는 암 세포 생존 및 / 또는 중화 p53에 의존적 또는 -independent 체크 포인트 메커니즘과 호환 수준으로 게놈 불안정성을 진압에 의해 부분적으로 악성 진행을 가능하게 할 수 있다고 추측 프롬프트를 억제한다. 텔로 머라 아제의 활성화를 중지 또는 줄기 세포의 노화, 역 및 텔로 머라 아제 활성화는 게놈 불안정의 배경으로 종양을 촉진 할 수 있는지 여부를 할 수 있는지 여부를 연구하기 위해, 우리는 두 개의 유도 쥐의 텔로 머라 대립 유전자를 생성합니다. 첫 번째는 4 Hydroxytamoxifen (4-OHT) -inducible TERT-에스트로겐 수용체 (mTERT-ER) 융합 노크에 대립 유전자. 4- OHT의 부재에서 mTERT-ER (지정 mTERT ER / ER)에 대한 동형 접합성 마우스는 텔로 머라 제 활성이 결핍 된 종래 mTERT m 동일 또는 유전 학적 및 세포 표현형의 유지TERC 녹아웃 모델. 4- OHT 처리시 TERT-ER 단백질 활성은 네이티브 TERT 단백질 20, 21과 비교 레벨로 복원 될 수있다. 두 번째 대립 유전자는 신규 한 유도 TERT 노크에서 인트론에 loxP-스토퍼에 loxP 카세트를 함유하는 대립 유전자 (LSL-이고 mTERT); LSL의 절제를 Cre 호텔 - 중재에, mTERT 내생 발현 조절 메커니즘 (22)에서 다시 표현된다.

<table><tbody><tr><td>Leica AM6000 Micromanipulation Kit</td><td>Leica</td><td>Per quote</td><td></td></tr><tr><td>Leica DMI6000 B inverted microscope</td><td>Leica</td><td>Per quote</td><td></td></tr><tr><td>Neomycin</td><td>Life technologies</td><td>21810031</td><td></td></tr><tr><td>isoflurane vaporizer</td><td>Veterinary Anesthesia Systems</td><td>911103</td><td></td></tr><tr><td>isoflurane</td><td>Henry Schein</td><td>1005796</td><td></td></tr><tr><td>ketamine-xylazine mixture</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K113-10ML</td><td></td></tr><tr><td>4-OHT powder</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7904-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Tamoxfien</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5648-1G</td><td></td></tr><tr><td>4-OHT pellet</td><td>Innovative Research of America</td><td>Custermized</td><td></td></tr><tr><td>Precision Trochar (10 Gauge)</td><td>Innovative Research of America</td><td>MP-182</td><td></td></tr><tr><td>wound clip applier</td><td>Fischer Scientific</td><td>01-804</td><td></td></tr><tr><td>clip</td><td>Fischer Scientific</td><td>01-804-5</td><td></td></tr><tr><td>Neural Tissue Dissociation Kit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-628</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life technologies</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life technologies</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>xylene</td><td>Fischer Scientific</td><td>X3P-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>methanol</td><td>Fischer Scientific</td><td>A-433S4</td><td></td></tr><tr><td>acetic acid</td><td>Fischer Scientific</td><td>A38-500</td><td></td></tr><tr><td>ethanol</td><td>Fischer Scientific</td><td>22-032-104</td><td></td></tr><tr><td>formamide</td><td>Fischer Scientific</td><td>F84-1</td><td></td></tr><tr><td>PNA telomere probe</td><td>Panagene</td><td>F1001-5</td><td></td></tr><tr><td>PNA centromere probe</td><td>Panagene</td><td>F3003-5</td><td></td></tr><tr><td>20X SSC</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP1325-4</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153-10G</td><td></td></tr><tr><td>tRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R5636-1ML</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>rubber cement</td><td>Walmart</td><td>Elmer&#039;s</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr></tbody></table>

utilizing murine inducible telomerase alleles in the studies of tissue degeneration/regeneration and cancer

텔로미어 노화 동안 조직 변성을 일으킬 노포 드라이버 게놈 무결성과 연관된 DNA 손상 체크 포인트 시그널링 및 응답의 손실이다 부전 유도. 발생률이 크게 연령 증가와 암은, 짧은 텔로미어 길이와 높은 텔로 머라 제 활성을 특징으로한다. 노화와 암의 텔로미어 기능 장애와 텔로 머라 아제 활성화의 역할을 연구하기 위해, 프로토콜은 두 쥐의 유도 텔로 머라 아제를 생성하는 방법을 보여줍니다 노크에 대립 유전자 4 Hydroxytamoxifen (4-OHT) -inducible TERT-에스트로겐 수용체 (mTERT-ER)과 훈제 연어 -Stopper - 훈제 연어 TERT (LSL-mTERT). 이 프로토콜은 텔로미어 기능 장애를 유도하고 생체 내에서 mTERT-ER 및 LSL - mTERT 생쥐에서 텔로 머라 제 활성을 활성화하는 절차에 대해 설명합니다. 대표 데이터는 텔로 머라 제 활성의 활성화가 텔로미어 기능 장애에 의해 유발 된 조직 퇴행성 표현형을 개선 할 수 있음을 보여준다. ORD에서어이 종양에 텔로 머라 아제 활성화의 영향을 결정하기 위해, 우리는 전립선을 생성 종양 모델 G4의 PB-Cre4 PTEN을 L / L p53을 L / L LSL - mTERT L / L 및 흉선 T 세포 림프종 모델 G4 현금 지급기 - / - mTERT ER / ER . 대표적인 데이터는 크게 종양을 향상시킬 수 있습니다 텔로미어 기능 장애에 의해 유발 유전자 불안정성의 배경에 그 텔로 머라 아제의 활성화를 표시합니다. 이 프로토콜은 또한 신경 줄기 세포 mTERT-ER 및 LSL - mTERT 마우스에서 (NSCs의)를 분리하고 체외에서 NSCs의에서 텔로 머라 제 활성을 활성화하는 데 사용되는 절차를 설명합니다. 대표 데이터는 텔로 머라 제의 활성화는 시험 관내에서자가 재생산 능력과 신경을 향상시킬 수 있음을 보여준다. 마지막으로, 프로토콜이 모두 마우스 FFPE에 텔로미어 FISH (제자리 교잡 형광)을 수행하기위한 절차를 설명합니다 (포르말린 고정 및 Paraf핀 임베디드) 뇌 조직 배양 세포의 중기 염색체.

전략은 쥐 mTERT-ER을 생성하고 LSL - mTERT 녹아웃에 대립 그림 1A 및 1B에 설명했다. 특히,에 loxP - 트리플 스토퍼 - 네오는 -에 loxP 단편 LSL - mTERT 대립 유전자를 생성하기 위해 엑손 1 mTERT 궤적의 엑손 2 사이에 삽입되었다. mTERT-ER 대립 유전자를 생성하려면, mTERT 유전자 프레임에서 ERT2-LBD 도메인은 우리가 보여 엑손 1의 N 말단에 삽입하는 텔로 머라 제는 일시적으로 4 4-OHT 펠렛로 처리하여 텔로미어 기능 부전 마우스에 활성화 될 때 주, 퇴행성 표현형은 여러 뇌 (그림 2A)와 같은 기관과 고환 (그림 2B)로 개선 될 수있다. 늦게 발생 G4 LSL-mTERT mTERT 및 G4에서 생체 외에서 배양 된 세포의 텔로 머라 제의 활성화에 미치는 영향을 결정하기 위해, 우리는 절연 신경줄 기세포 (NSCs의)-ER 마우스. 우리는 텔로 머라 아제가 텔로미어 기능 장애 NSCs의 재 활성화 될 때, NSCs의자가 재생산 능력이 크게 유의하게 (그림 3B) 강화되었다 (그림 3A)를 증가 및 체외 신경에 된 것으로 나타났다. 텔로미어 부전의 맥락에서 종양 발생에 텔로 머라 제 활성화에 미치는 영향을 결정하기 위해 우리가 생성 PB-Cre4 PTEN을 L / L에서의 p53 L / L의 LSL-mTERT L / L (전립선 암 모델) 및 ATM - / - mTERT ER / ER (흉선 T 세포 림프종 모델) 늦게 발생 코호트. 텔로 머라 제는 8주 (도 4B)에 대한 분사를한다 (도 4A) 또는 4-OHT 펠렛 이들 마우스에서 타목시펜 처리에 의해 활성화 된 경우, 종양은 크게 두 전립선 암 모델 (도 4a)과 흉선의 T 세포 림프종 모델에서 향상시켰다 ( <strong&gt; 그림 4B). 마지막으로, 우리는 FFPE 마우스 뇌 조직에 텔로미어 FISH을 수행하는 프로토콜 (그림 5)와 중기 염색체 (그림 5, 삽입)을보고했다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig1.jpg" /> 그림 1 : (A) mTERT-ER 노크에 전략을. 벡터를 대상으로 TV,; WT, 야생형 대립 유전자; KI, 노크에 대립 유전자; LA, 왼쪽 팔; RA, 오른쪽 팔; E1, 엑손 1; E2, 엑손 2; 신, PGK의 네오 마이신 내성 유전자를 프로모터 중심; ER, 수정 에스트로겐 수용체 (ERT2) 리간드 결합 도메인; DT, dyphteria 독소 유전자. (B) LSL-mTERT 노크의 전략. 벡터를 대상으로 TV,; WT, 야생형 대립 유전자; KI, 노크에 대립 유전자; LA, 왼쪽 팔; RA, 오른쪽 팔; E1, 엑손 1; E2, 엑손 2; 신, PGK의 네오 마이신 내성 유전자를 프로모터 중심; 스토퍼, 세 반복적 전사 정지 시퀀스; DT, dyphteria 독소 유전자. <pFO 클래스 = &quot;jove_content&quot;유지 - together.within 페이지 = &quot;항상&quot;&gt; <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig2.jpg" /> 그림 2 : 대표 데이터가 텔로 머라 아제 활성화를 표시하는이 기관의 퇴행성 표현형을 완화시키는 뇌의 대표 이미지 (왼쪽). 및 고환 (오른쪽) 위약 또는 4 주 동안 4 OHT으로 처리 G0와 G4 mTERT-ER 마우스. 스케일 바는 50 μm의를 나타냅니다. 다시 인쇄 (20)의 허가. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52599/52599fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig3.jpg" /> 그림 3 :. 대표 데이터가 텔로 머라 아제 활성화를 표시하는 자기 갱신과 체외에서 신경 줄기 세포의 신경을 ​​강화 (A) 신경 줄기 세포의 대표 이미지G4의 LSL - mTERT에서 분리 S (상판) 및 G4 mTERT-ER (하판) 차량 또는 4-OHT 치료 줄기 세포 매체에서 성장. (B) 분화 배지에서 배양 G4 mTERT-ER로부터 단리 신경 줄기 세포의 시험 관내 신경 (Tuj1 +)의 대표적인 이미지는 (1 % FBS 포함) 차량 또는 4-OHT으로 처리 하였다. 스케일 바는 100 μm의를 나타냅니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig4.jpg" /> 그림 4 :. 텔로 머라 아제의 활성화를 보여주는 대표적인 데이터가 게놈 불안정의 배경으로 종양을 향상 (A) / L p53을 L / L LSL - mTERT G0 PB-Cre4 PTEN을 L 해부 전립선 종양의 대표 이미지 +/-, G4 솔더 (Soler) Cre4 PTEN을 L / L p53을 L / L의 LSL - mTERT- / -, 및 G4 PB-Cre4 PTEN을 L / L p53을의 L은 / L LSL - mTERT L / L 타목시펜으로 치료. (22) 허가를 다시 인쇄 할 수 있습니다. (B) G0 기압의 해부 흉선의 T 세포 림프종의 대표적인 이미지 - / - mTERT + / ER, G4 현금 지급기 - / - mTERT ER / ER 차량으로 처리하고 G4 현금 지급기 - / - mTERT ER / ER 4- 처리 팔주에 대한 OHT. 스케일 바는 1cm를 나타냅니다. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig5.jpg" /> 그림 5 : FFPE 마우스 뇌 조직과 중기 (삽입)에 텔로미어와 센트로 FISH의 대표 이미지. 빨간색 녹색 텔로미어 (telomere) 염색을 나타냅니다, DNA를 나타내고, 시안은 CE를 나타냅니다ntromere 염색. 스케일 바는 1mm를 나타냅니다.

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Utilizing Murine Inducible Telomerase Alleles in the Studies of Tissue Degeneration/Regeneration and Cancer

Telomere and telomerase play essential roles in ageing and tumorigenesis. The goal of this protocol is to show how to generate two murine inducible telomerase knock-in alleles and how to utilize them in the studies of tissue degeneration/regeneration and cancer.

조직의 변성 / 재생 및 암의 연구에서 설치류 유도 성 텔로 머라 대립 유전자를 활용

Telomere dysfunction-induced loss of genome integrity and its associated DNA damage signaling and checkpoint responses are well-established drivers that ...

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Nanyang Technological University

Research

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Medicine

10.1K 조회수.  UT MD Anderson Cancer Center. Telomere and telomerase play essential roles in ageing and tumorigenesis. The goal of this protocol is to show how to generate two murine inducible telomerase knock-in alleles and how to utilize them in the studies of tissue degeneration/regeneration and cancer. 

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Transduction-Transplantation Mouse Model of Myeloproliferative Neoplasm

Transduction-transplantation is a quick and efficient way to model human hematologic malignancies in mice. This technique results in expression of the gene of interest in hematopoietic cells and can be used to study the gene's role in normal and/or malignant hematopoiesis. This protocol provides a detailed description on how to perform transduction-transplantation using calreticulin (CALR) mutations recently identified in myeloproliferative neoplasm (MPN) as an example. In this protocol whole bone marrow cells from 5-flurouracil (5-FU) treated donor mice are transduced with a retrovirus encoding mutant CALR and transplanted into lethally irradiated syngeneic hosts. Donor cells expressing mutant CALR are marked with green fluorescent protein (GFP). Transplanted mice develop an MPN phenotype including elevated platelets in the peripheral blood, expansion of megakaryocytes in the bone marrow, and bone marrow fibrosis. We provide a step-by-step account of how to generate retrovirus, calculate viral titer, transduce whole bone marrow cells, and transplant into irradiated recipient mice.

This manuscript provides a description of the methodology used to establish transduction-transplantation mouse models. A detailed account is given of technical errors to avoid when performing bone marrow transplants. A clear understanding should be gained of the importance of high viral titer, transfection/transduction, and irradiation.

골수 증식 종양의 전달-이식 마우스 모델

Transduction-transplantation is a quick and efficient way to model human hematologic malignancies in mice. This technique results in expression of the ...

연구

암 연구학

Identification and Characterization of Metastatic Factors by Gene Transfer into the Novel RIP-Tag; RIP-tva Murine Model

Metastatic cancer accounts for 90% of deaths in patients with solid tumors. There is an urgent need to better understand the drivers of cancer metastasis and to identify novel therapeutic targets. To investigate molecular events that drive the progression from primary cancer to metastasis, we have developed a bitransgenic mouse model, RIP-Tag; RIP-tva. In this mouse model, the rat insulin promoter (RIP) drives the expression of the SV40 T antigen (Tag) and the receptor for subgroup A avian leukosis virus (tva) in pancreatic &#946; cells. The mice develop pancreatic neuroendocrine tumors with 100% penetrance through well-defined stages that are similar to human tumorigenesis, with stages including hyperplasia, angiogenesis, adenoma, and invasive carcinoma. Because RIP-Tag; RIP-tva mice do not develop metastatic disease, genetic alterations that promote metastasis can be identified easily. Somatic gene transfer into tva-expressing, proliferating pancreatic &#946; premalignant lesions is achieved through intracardiac injection of avian retroviruses harboring the desired genetic alteration. A titer of &#62;1 x 108 infectious units per ml is considered appropriate for in vivo infection. In addition, avian retroviruses can infect cell lines derived from tumors in RIP-Tag; RIP-tva mice with high efficiency. The cell lines can also be used to characterize the metastatic factors. Here we demonstrate how to utilize this mouse model and cell lines to assess the functions of candidate genes in tumor metastasis.

Identification and Characterization of Metastatic Factors by Gene Transfer into the Novel RIP-Tag; RIP-tva Murine Model

We present a protocol to demonstrate a novel somatic gene transfer system utilizing RIP-Tag; RIP-tva mouse model to study the function of genes in metastasis. The avian retroviruses are delivered intracardiacally to ensure gene transfer into pre-malignant, noninvasive lesions of pancreatic &#946; cells in adult mice.

식별 및 태그-소설 RIP;으로 유전자 이동에 의해 전이성 요인의 특성 RIP-tva Murine 모델

Metastatic cancer accounts for 90% of deaths in patients with solid tumors. There is an urgent need to better understand the drivers of cancer metastasis ...

Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells

Telomeres are transcribed, giving rise to telomeric repeat-containing long noncoding RNAs (TERRA), which have been proposed to play important roles in telomere biology, including heterochromatin formation and telomere length homeostasis. Recent findings revealed that TERRA molecules also interact with internal chromosomal regions to regulate gene expression in mouse embryonic stem (ES) cells. In line with this evidence, RNA fluorescence in situ hybridization (RNA-FISH) analyses have shown that only a subset of TERRA transcripts localize at chromosome ends. A better understanding of the dynamics of TERRA molecules will help define their function and mechanisms of action. Here, we describe a method to label and visualize single-telomere TERRA transcripts in cancer cells using the MS2-GFP system. To this aim, we present a protocol to generate stable clones, using the AGS human stomach cancer cell line, containing MS2 sequences integrated at a single subtelomere. Transcription of TERRA from the MS2-tagged telomere results in the expression of MS2-tagged TERRA molecules that are visualized by live-cell fluorescence microscopy upon co-expression of a MS2 RNA-binding protein fused to GFP (MS2-GFP). This approach enables researchers to study the dynamics of single-telomere TERRA molecules in cancer cells, and it can be applied to other cell lines.

Here, we present a protocol to generate cancer cell clones containing a MS2 sequence tag at a single subtelomere. This approach, relying on the MS2-GFP system, enables visualization of the endogenous transcripts of telomeric repeat-containing RNA (TERRA) expressed from a single telomere in living cells.

Telomeric 반복 포함 된 RNA 테라에서 살아있는 세포에서 단일 Telomere 표현 시각화 하 암 세포 클론의 세대

Telomeres are transcribed, giving rise to telomeric repeat-containing long noncoding RNAs (TERRA), which have been proposed to play important roles in ...

유전학

DNA Vector-based RNA Interference to Study Gene Function in Cancer

RNA interference (RNAi) inhibits gene expression by specifically degrading target mRNAs. Since the discovery of double-stranded small interference RNA (siRNA) in gene silencing1, RNAi has become a powerful research tool in gene function studies. Compared to genetic deletion, RNAi-mediated gene silencing possesses many advantages, such as the ease with which it is carried out and its suitability to most cell lines. Multiple studies have demonstrated the applications of RNAi technology in cancer research. In particular, the development of the DNA vector-based technology to produce small hairpin RNA (shRNA) driven by the U6 or H1 promoter has made long term and inducible gene silencing possible2,3. Its use in combination with genetically engineered viral vectors, such as lentivirus, facilitates high efficiencies of shRNA delivery and/or integration into genomic DNA for stable shRNA expression. 
We describe a detailed procedure using the DNA vector-based RNAi technology to determine gene function, including construction of lentiviral vectors expressing shRNA, lentivirus production and cell infection, and functional studies using a mouse xenograft model. 
Various strategies have been reported in generating shRNA constructs. The protocol described here employing PCR amplification and a 3-fragment ligation can be used to directly and efficiently generate shRNA-containing lentiviral constructs without leaving any extra nucleotide adjacent to a shRNA coding sequence. Since the shRNA-expression cassettes created by this strategy can be cut out by restriction enzymes, they can be easily moved to other vectors with different fluorescent or antibiotic markers. Most commercial transfection reagents can be used in lentivirus production. However, in this report, we provide an economic method using calcium phosphate precipitation that can achieve over 90% transfection efficiency in 293T cells. Compared to constitutive shRNA expression vectors, an inducible shRNA system is particularly suitable to knocking down a gene essential to cell proliferation. We demonstrate the gene silencing of Yin Yang 1 (YY1), a potential oncogene in breast cancer4,5, by a Tet-On inducible shRNA system and its effects on tumor formation. Research using lentivirus requires review and approval of a biosafety protocol by the Biosafety Committee of a researcher's institution. Research using animal models requires review and approval of an animal protocol by the Animal Care and Use Committee (ACUC) of a researcher's institution.

RNA interference (RNAi) possesses many advantages over gene knockout and has been broadly used as a tool in gene functional studies. The invention of DNA vector-based RNAi technology has made long term and inducible gene knockdown possible, and also increased the feasibility of gene silencing in vivo.

암 관련 유전자 기능을 연구하기 DNA를 벡터 기반의 RNA 간섭

RNA interference (RNAi) inhibits gene expression by specifically degrading target mRNAs. Since the discovery of double-stranded small interference RNA ...

의학

Spatial and Temporal Control of Murine Melanoma Initiation from Mutant Melanocyte Stem Cells

Cutaneous melanoma is well known as the most aggressive skin cancer. Although the risk factors and major genetic alterations continue to be documented with increasing depth, the incidence rate of cutaneous melanoma has shown a rapid and continuous increase during recent decades. In order to find effective preventative methods, it is important to understand the early steps of melanoma initiation in the skin. Previous data has demonstrated that follicular melanocyte stem cells (MCSCs) in the adult skin tissues can act as melanoma cells of origin when expressing oncogenic mutations and genetic alterations. Tumorigenesis arising from melanoma-prone MCSCs can be induced when MCSCs transition from a quiescent to active state. This transition in melanoma-prone MCSCs can be promoted by the modulation of either hair follicle stem cells&#39; activity state or through extrinsic environmental factors such as ultraviolet-B (UV-B). These factors can be artificially manipulated in the laboratory by chemical depilation, which causes transition of hair follicle stem cells and MCSCs from a quiescent to active state, and by UV-B exposure using a benchtop light. These methods provide successful spatial and temporal control of cutaneous melanoma initiation in the murine dorsal skin. Therefore, these in vivo model systems will be valuable to define the early steps of cutaneous melanoma initiation and could be used to test potential methods for tumor prevention.

The following procedure describes a method for spatial and temporal control of melanocytic tumor initiation in murine dorsal skin, using a genetically engineered mouse model. This protocol describes macroscopic as well as microscopic cutaneous melanoma initiation.

돌연변이 멜 뮤 린 줄기 세포에서 시작 하는의 공간적 및 시간적 제어

Cutaneous melanoma is well known as the most aggressive skin cancer. Although the risk factors and major genetic alterations continue to be documented ...

A Murine Cell Line Based Model of Chronic CDK9 Inhibition to Study Widespread Non-Genetic Transcriptional Elongation Defects (TEdeff) in Cancers

We have previously reported that a subset of cancers is defined by global transcriptional deregulations with widespread deficiencies in mRNA transcription elongation (TE)&#8212;we call such cancers as TEdeff. Notably, TEdeff cancers are characterized by spurious transcription and faulty mRNA processing in a large set of genes, such as interferon/JAK/STAT and TNF/NF-&#954;B pathways, leading to their suppression. The TEdeff subtype of tumors in renal cell carcinoma and metastatic melanoma patients significantly correlate with poor response and outcome in immunotherapy. Given the importance of investigating TEdeff cancers&#8212;as it portends a significant roadblock against immunotherapy&#8212;the goal of this protocol is to establish an in vitro TEdeff mouse model to study these widespread, non-genetic transcriptional abnormalities in cancers and gain new insights, novel uses for existing drugs, or find new strategies against such cancers. We detail the use of chronic flavopiridol mediated CDK9 inhibition to abrogate phosphorylation of serine 2 residue on the C-terminal repeat domain (CTD) of RNA polymerase II (RNA Pol II), suppressing the release of RNA Pol II into productive transcription elongation. Given that TEdeff cancers are not classified under any specific somatic mutation, a pharmacological model is advantageous, and best mimics the widespread transcriptional and epigenetic defects observed in them. The use of an optimized sublethal dose of flavopiridol is the only efficacious strategy in creating a generalizable model of non-genetic widespread disruption in transcription elongation and mRNA processing defects, closely mimicking the clinically observed TEdeff characteristics. Therefore, this model of TEdeff can be leveraged to dissect, cell-autonomous factors enabling them in resisting immune-mediated cell attack.

A Murine Cell Line Based Model of Chronic CDK9 Inhibition to Study Widespread Non-Genetic Transcriptional Elongation Defects TEdeff in Cancers

The protocol details an in vitro murine carcinoma model of non-genetic defective transcription elongation. Here, chronic inhibition of CDK9 is used to repress productive elongation of RNA Pol II along pro-inflammatory response genes to mimic and study the clinically observed TEdeff phenomenon, present in about 20% of all cancer types.

만성 CDK9 억제의 뮤린 세포주 기반 모델은 암에서 광범위한 비 유전 적 전사 신장 결점 (TE확실히)을연구합니다.

We have previously reported that a subset of cancers is defined by global transcriptional deregulations with widespread deficiencies in mRNA transcription ...

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and lifespan. In addition, telomerase protects the mitochondria from oxidative stress and confers resistance to apoptosis, suggesting its possible importance for the surviving of non-mitotic, highly active cells such as neurons. We previously demonstrated the ability of novel telomerase activators to increase telomerase activity and expression in the various mouse brain regions and to protect motor neurons cells from oxidative stress. These results strengthen the notion that telomerase is involved in the protection of neurons from various lesions. To underline the role of telomerase in the brain, we here compare the activity of telomerase in male and female mouse brain and its dependence on age. TRAP assay is a standard method for detecting telomerase activity in various tissues or cell lines. Here we demonstrate the analysis of telomerase activity in three regions of the mouse brain by non-denaturing protein extraction using CHAPS lysis buffer followed by modification of the standard TRAP assay.
In this 2-step assay, endogenous telomerase elongates a specific telomerase substrate (TS primer) by adding TTAGGG 6 bp repeats (telomerase reaction). The telomerase reaction products are amplified by PCR reaction creating a DNA ladder of 6 bp increments. The analysis of the DNA ladder is made by 4.5% high resolution agarose gel electrophoresis followed by staining with highly sensitive nucleic acid stain.
Compared to the traditional TRAP assay that utilize 32P labeled radioactive dCTP&#39;s for DNA detection and polyacrylamide gel electrophoresis for resolving the DNA ladder, this protocol offers a non-toxic time saving TRAP assay for evaluating telomerase activity in the mouse brain, demonstrating the ability to detect differences in telomerase activity in the various female and male mouse brain region.

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol TRAP Assay

Telomerase is expressed in the neonatal brain and also in distinct regions of the adult brain. We present a non-toxic time saving TRAP assay for the analysis of telomerase activity in various regions of the mouse brain and detection of differences in telomerase activity between male and female mouse brains.

마우스 뇌의 다양한 지역에서 텔로 머라 제 활동 : 비 방사성 텔로 머라 제는 증폭 프로토콜을 반복 (TRAP) 분석

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

신경과학

Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected from skin or muscle biopsy tissue available during the patient&#8217;s diagnostic workup. In this protocol, we describe a technique for live cell isolation from small amounts of muscle or skin tissue for primary cell culture. Additionally, we provide a technique for the immortalization of myogenic cell lines and fibroblast cell lines from primary cells. Once cell lines are immortalized, substantial expansion of patient-derived cells can be achieved. Immortalized cells are amenable to many downstream applications, including drug screening and in vitro correction of the genetic mutation. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

This protocol describes techniques for live cell isolation and primary culture of myogenic and fibroblast cell lines from muscle or skin tissue. A technique for the immortalization of these cell lines is also described. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

질병 모델링을위한 근육 조직 검사에서 환자 유래 세포주의 분리 및 멸화

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively. The vast array of TCRs proves studying a specific antigenic response difficult. Therefore, TCR transgenic mice were made to study positive and negative selection in the thymus as well as peripheral T cell activation, proliferation and tolerance. However, relatively few TCR transgenic mice have been generated specific to any given antigen. Thus, studies involving TCRs of varying affinities for the same antigenic peptide have been lacking. The generation of a new TCR transgenic line can take six or more months. Additionally, any specific backcrosses can take an additional six months. In order to allow faster generation and screening of multiple TCRs, a protocol for retroviral transduction of bone marrow was established with stoichiometric expression of the TCR&#945; and TCR&#946; chains and the generation of retrogenic mice. Each retrogenic mouse is essentially a founder, virtually negating a founder effect, while the length of time to generate a TCR retrogenic is cut from six months to approximately six weeks. Here we present a rapid and flexible alternative to TCR transgenic mice that can be expressed on any chosen background with any particular TCR.

We present a rapid and flexible protocol for a single T cell receptor (TCR) retroviral-based in vivo expression system. Retroviral vectors are used to transduce bone marrow progenitor cells to study T cell development and function of a single TCR in vivo as an alternative to TCR transgenic mice.

골수 전구 세포의 레트로 바이러스 형질 도입은 T 세포 수용체 Retrogenic 마우스를 생성하는

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

면역학 및 감염병학

Retroviral Infection of Murine Embryonic Stem Cell Derived Embryoid Body Cells for Analysis of Hematopoietic Differentiation

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for investigating the development of early hematopoietic progenitor cells (HPCs). Gene expression in ESCs can be manipulated by several techniques that allow the role for individual molecules in development to be determined. One difficulty is that expression of specific genes often has different phenotypic effects dependent on their temporal expression. This problem can be circumvented by the generation of ESCs that inducibly express a gene of interest using technology such as the doxycycline-inducible transgene system. However, generation of these inducible cell lines is costly and time consuming. Described here is a method for disaggregating ESC-derived embryoid bodies (EBs) into single cell suspensions, retrovirally infecting the cell suspensions, and then reforming the EBs by hanging drop. Downstream differentiation is then evaluated by flow cytometry. Using this protocol, it was demonstrated that exogenous expression of a microRNA gene at the beginning of ESC differentiation blocks HPC generation. However, when expressed in EB derived cells after nascent mesoderm is produced, the microRNA gene enhances hematopoietic differentiation. This method is useful for investigating the role of genes after specific germ layer tissue is derived.

Manipulating temporal gene expression in differentiating embryonic stem cells (ESCs) can be achieved using inducible gene systems. However, generation of these cell lines is costly and time consuming. This protocol achieves rapid expression of a transgene in differentiating ES-derived cells and subsequent analysis of downstream hematopoietic differentiation.

쥐과 배아의 레트로 바이러스 감염은 조혈 분화 분석을위한 세포 유래 배아 바디 줄기 세포

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for ...