The authors would like to thank Dr. George Gittes for advice and expertise throughout this study. SSL was supported by an American Heart Association fellowship (11POST7330002). Further to this SSL and this study was supported by an NIDDK Mentored Research Scientist Development Award (DK096996) and by the Children&#8217;s Hospital of Pittsburgh.

참고 : 피츠버그 기관 동물 관리 및 사용위원회의 대학은 모든 실험을 승인했다. 초음파 미세 주입 장비 및 태아의 1. 준비 <ol><li> 단, 마운트 및 프로브 (그림 1)과 수술 도구 (그림 2)를 설정합니다. 37 ° C 온난화 목욕 장소 인산 완충 식염수 (PBS) 용액 (pH 7.4로). 그 자료를, 제 2가요 25 G 바늘에 부착 된 1 ML의 주사기를 사용하여, 미네랄 오일 전적으로 미세 주사 바늘을 입력합니다. </li><li> 회전에 바늘을 고정 마운트 암, 미네랄 오일 솔루션의 빈 바늘. TL 솔루션의 2.5 μL에 다시 입력합니다. 공기 방울이 주사 바늘 내에 존재 없는지 확인합니다. 멀리 단계에서, 벽을 향해 바늘 암을 돌립니다. </li><li> 이소 플루 란의 연속 주입을 통해 마취 실에서 임신 한 어머니를 마취. 어머니가 무의식 경우, C에 위치 코 튜브에 마취를 전송코 튜브의 주둥이와 앙와위에서 audal 무대의 측면, 그리고 장소 어머니는 완전히 마취 상태의 지속을 허용합니다. </li><li> 45 ° 각도에서, 또는 손과 발을 테이프 사지는 휴식과 솟다 ECG / 온도 모니터 탭에 위치. 이는 임신 댐 지속적 그 마취를 위해 모니터링하는 것이 중요 충분하며, 눈에인가에 해당 연고 건조 감소. </li><li> 부드럽게 초과 제품과 머리를 제거하기 위해 70 % 에탄올 포화 면봉으로 다시 마른 면봉으로 닦아하고, 어머니의 하복부에 걸쳐 머리 제거 제품을 적용합니다. 절개의 사이트 (그림 3)에서 모든 머리 떨어져 복부 피부를 청소해야합니다. </li><li> 미세 수술 집게와 가위를 사용하여 임신 어머니에 개복술을 수행합니다. 주요 혈관이나 내장 기관을 절단 않도록주의하십시오. 1.5 cm 질보다 먼저 표피의 직선 절개를하고 approximat 리브으로 잘라 계속엘리 2-3 cm. 내장 기관과 자궁 saccules 내부를 노출, 동일한 길이를 따라, 피하 막을 노출 원격 교육 알바 ( &quot;화이트 라인&quot;) (그림 3)를 찾아 초기 절개에 평행하게 잘라. </li></ol> 태아의 2. 추출 <ol><li> 어머니와 배아를 기동 6 인치 면봉을 사용합니다. 조심스럽게 절개 개방에서 처음으로 배아를 조작 할 수 주걱으로 피부에 (강제하지 않음) 누릅니다. 최초의 배아 saccule의 추출 후, 부드럽게 천천히 통해 어머니의 외부에 자궁 뿔의 나머지 부분을 잡아 당깁니다. 이 단계에서 절개를 통해 소장 또는 다른 장기를 당겨하지 마십시오. </li><li> 배아를 정량화하고 부드럽게 어머니로 다시 왼쪽 자궁 경적을 배치합니다. 그런 다음 뿔에 질에서 배아 saccule 멀리 시작하여 아래쪽으로 이동 다시 어머니에 오른쪽 자궁 경적을 배치 시작합니다. (두 개의 배아가 노출 남아 때까지 Fi 인터넷이 계속gure 4). 마지막으로, 위의 열 병렬로 위치 배아는 자궁 순환을 차단하지 인식되고, 선을 절개합니다. </li><li> 팔과 몸뿐만 아니라 다리와 꼬리 사이에 점토 블록과 위치를 놓습니다. 점토 표면이 개복 수술 절개와 약 수준 있는지 확인합니다. 37 ° C PBS로 유창 페트리 접시를 젖은. </li><li> 왼쪽 (배아 창호 병렬)와 오른손과 유창 페트리 접시와 연장 집게를 잡고 페트리 접시의 상단에서, 창호를 통해 폐쇄 집게 ~ 5 cm를 가져온다. 완전히 창호 메쉬를 찢어없이 열기 집게. </li><li> 배아 위에 손을 책략과 두 개의 배아 saccules에 시력을 초점을 맞추고있다. 없이 (또는 가볍게) 슬릿을 통해 슬라이드와 어머니의 복부에 페트리 접시를 설정, 창호 메쉬 또는 집게로 saccules을 터치. 집게가 계속 확장으로, (양쪽에 각각 배아의 기지에서 그것을 장착 할 때 그림 5 유창 메쉬를 조작 </st룽&gt;)과 슬릿 개방에서 집게를 잡아 당깁니다. </li><li> 다음으로, (그림 6) 곤란 또는 배아를 손상없이 페트리 접시에 벽을 포함하는 파란색 고무를 배치합니다. 확인 점토 블록을 단단히 페트리 접시, 배아, 고무 함유 벽을 균형되어 있는지 확인합니다. 유창 메쉬에서 누출을 제어하면서 배아가 완전히 (그림 6) 침수 될 때까지 마지막으로, 37 ° C PBS와 페트리 접시를 입력합니다. </li></ol> 3. 사출 절차 <ol><li> 다음 낮은 사출 어머니와 배아 다운 Z-레벨 조정 노브 (그림 1)를 사용하여 함께 무대 및 프로브 팁 왼쪽과 아래 바늘 ½ 센티미터로, 주사 바늘을 ​​회전하고 팔을 탑재하고 초음파 프로브와 직접 줄 (그림 7) . 45 ° 거리 프로브에서 바늘 팔 (안 바늘)을 밀어 넣습니다. 접시 또는 초음파 프로브 바늘의 끝 부분을 충돌하지 않도록주의하십시오. </li><li> 초음파 페이지로, 다시 원래의 높이에 주입 단계를 올립니다직접 배아 프로브 위의 옷은 약간 잠긴 배아 조직의 3-4mm 내에서해야합니다. 사용 X &amp; Y 단계 조절 노브 (그림 8)는 체계적으로 박동 배아 마음을 찾습니다 배아 / 어머니 / 무대 위치를 수정합니다. </li><li> 직접 초음파 화면의 중심이 그려진 검은 센터 대상 마커 (*)를 관찰한다. X &amp; Y 단계 조절 노브를 사용하여 좌심실 (바람직한) 또는 심방 (그림 8)를 찾은 후 올리거나 초음파 화면에 검은 센터 마커를 통해 정밀하게 분사 대상의 위치를 무대에 회전 노브를 사용하여 무대를 내려 놓습니다. </li><li> 초음파 화면 오프, 오른쪽으로 배아를 이동 X 단계 조절 노브를 사용합니다. ½의 거리에서 cm 및 초음파 프로브 90 ° (그림 7), 미세 주사 바늘의 위치를 변경하고 다시 제자리에 팔. </li><li> 미세 주입 명확하게 팁 등으로 조정 노브 (그림 9C-G), 위치 바늘을 장착하여중앙 마커 igned. 니들 팁 올바른 평면 집중되도록하고, X, Y, 및 미세 니들의 Z 벡터 (도 9C 및 EG의 손잡이를 사용하여) 사출 각도를 조정한다. 오직 &quot;주입&quot;노브 (그림 9F)를 사용하여 미세 주사 바늘을 ​​후퇴, 조심하지 다른 크기를 조정합니다. </li><li> 다시, 정확하게 초음파 화면 중심 표시 대상에서 다시 프로브하에 전적으로 X 미세 조정 스테이지 노브 배아 움직임을 이용하여. 좌심실 정확히 같은 X, Y 및 Z 평면에 지금 있는지 확인하십시오. </li><li> 미세 주입에 그냥 &quot;주입&quot;노브 마운트와 다음, 천천히 미세 주사 바늘로 배아에 구멍을 점차적으로 좌심실에 팁을 가져. 한 번 (그림 2A &amp; B)를 &quot;빈&quot;잡고 &quot;입력&quot;눌러 빈 경고음 소리 좌심실로 또는 때까지 TL 솔루션의 전체 2.5 μl를 주입한다. 이 때주사의 심장 챔버로 유입되는 TL (그림 10)는 바늘의 끝에서 나오는 그림자를 관찰한다. 반대로, 빠르게 주입이 완료되면 마이크로 인젝션에 &quot;주입&quot;노브 (도 9F)가 회전 마운트 마이크로 인젝션 니들을 후퇴. </li><li> 다음 배아에 계속 이러한 일련의 단계 다음 남은 배아에 대해이 절차를 반복하고 마지막으로 다시 댐의 복부에 최종 배아를 놓습니다. 챔버 상자로 마취를 전환하고 부드럽게 마지막 주입 시간에서 15 분 동안 여기에 어머니를 이동합니다. </li></ol> 4. 수확 배아 및 분석 <ol><li> 자궁 경부 전위를 통해 댐을 희생. 쉽게 어머니의 자궁 뿔을 제거하는 개복 수술 절개를 확장합니다. 자궁 주머니 내에서 배아를 유지합니다. 냉장 PBS에서 배아를 놓습니다. </li><li> (경우 유전자형에 필요한 수집 조직) 자궁 주머니에서 배아를 해부하고 전체 배아를 배치 전n은 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)는 하룻밤, 그 다음으로 30 % 자당 하룻밤, 매체 단면 저온 유지 장치에 고정. 그런 다음 동결 절단 (Cryosections)을 절감하고 면역 조직 화학 분석을위한 슬라이드에 배치합니다. 선택적으로, 조직에 대한 사용을 100 % 메탄올 탈수 4 % PFA로 고정을 수행하여 전체를 실장. </li><li> 면역 조직 화학 분석을 위해 OCT를 제거하기 위해 PBS에 저온부를 배치합니다. 그런 다음 30 분 동안 10 % 정상 당나귀 혈청 섹션을 차단합니다. 그런 다음 1 PECAM 차 항체를 추가 : 100 희석 4 박 ° C에서. 다음 날, 10 분 각각 PBT 3 번 슬라이드를 세척 및 보조 당나귀 안티 쥐 594를 추가하고 실온에서 1 시간 동안 배양한다. 참고 :이 초음파와 미세 주입의 최적화 및 조정을 필요로하는 매우 까다로운 기술이다. 이이 기술에 관련된 매우 가파른 학습 곡선이고 하나는 능숙되기 전에 멘토링 주사 4 ~ 6 주 정도가 필요합니다. </li></ol>

<ol>
	<li>Abrahamson, D. R., Robert, B., Hyink, D. P., St John, P. L., Daniel, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+and+formation+of+microvasculature+in+the+developing+kidney.">Origins and formation of microvasculature in the developing kidney.</a> Kidney international. Supplement. 67, S7-S11 (1998).</li><li>Sims-Lucas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Progenitors+Exist+within+the+Kidney+and+Lung+Mesenchyme.">Endothelial Progenitors Exist within the Kidney and Lung Mesenchyme.</a> PloS one. 8 (6), e65993 (2013).</li><li>Dressler, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+early+kidney+specification,+development+and+patterning.">Advances in early kidney specification, development and patterning.</a> Development. 136 (23), 3863-3874 (2009).</li><li>Costantini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+controls+and+cellular+behaviors+in+branching+morphogenesis+of+the+renal+collecting+system.">Genetic controls and cellular behaviors in branching morphogenesis of the renal collecting system.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1 (5), 693-713 (2012).</li><li>Costantini, F., Kopan , R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+a+complex+organ:+branching+morphogenesis+and+nephron+segmentation+in+kidney+development.">Patterning a complex organ: branching morphogenesis and nephron segmentation in kidney development.</a> Dev Cell. 18 (5), 698-712 (2010).</li><li>Das, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal-epithelial+crosstalk+regulates+kidney+progenitor+cell+differentiation.">Stromal-epithelial crosstalk regulates kidney progenitor cell differentiation.</a> Nat Cell Biol. 15 (9), 1035-1044 (2013).</li><li>Rymer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+blood+flow+and+oxygenation+drive+nephron+progenitor+differentiation.">Renal blood flow and oxygenation drive nephron progenitor differentiation.</a> Am J Physiol Renal Physiol. , (2014).</li><li>Shah, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+mouse+blood+flow+and+oxygen+correlate+with+early+pancreatic+differentiation.">Embryonic mouse blood flow and oxygen correlate with early pancreatic differentiation.</a> Developmental biology. 349 (2), 342-349 (2011).</li><li>Andres, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphB4+receptor+tyrosine+kinase+transgenic+mice+develop+glomerulopathies+reminiscent+of+aglomerular+vascular+shunts.">EphB4 receptor tyrosine kinase transgenic mice develop glomerulopathies reminiscent of aglomerular vascular shunts.</a> Mech Dev. 120 (4), 511-516 (2003).</li><li>Wagner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+imaging+of+kidney+vascular+corrosion+casts+with+Nano-CT.">High-resolution imaging of kidney vascular corrosion casts with Nano-CT.</a> Microsc Microanal. 17 (2), 215-219 (2011).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

마이크로 인젝션 마취 시간 프레임 어머니의 마취에 관해서, 그것은 공기 흐름 상수 (2-3 L / 분)과 낮은 PSI에 유지하는 것이 필수적입니다. 진정제의 흐름 / 분 약 1.75-2 L에서 개최합니다. 동시에, 주사가 수행하는 시간대는 면밀히 관찰하고 각각의 쓰레기에 대한 제어되어야한다. 각 쓰레기를 들어 주사 과정은 45 분하에 유지되어야한다. 각각의 배아 체 관심 장기에 걸쳐 조절되고 불변 관류를 용이하게하기 위하여 일정한 정상 심박수 범위 내에서 유지되어야하기 때문에이 시간 제한의 중요성은, 실험에 가장 중요하다. 우리는 배아 사이의 관류 패턴의 모호한 결과와 변동에 주사 결과를 길게하고하는 것은 성공적인 주사 (즉, 느린 심장 박동, 심장 사망)의 비율을 낮추는 것으로 나타났습니다. 마지막으로, 깔짚 내의 최종 주사 후, 그것은 필수적인약 15 분을 허용하도록 각각의 배아 배아 내의 적절한 전체 관류를 용이하게 수확 전에. 절차 적 치료 및 배아의 관리 배아 추출하는 동안, 우리는 배아 추출시 전체의 건강과 자궁 라이닝과 배아의 무결성에 참석하여 수행되는 주사와 성공의 큰 비율을 발견했다. 자궁 주머니를 조작하고 기동 (PBS로 포화) 섬세한 면봉을 사용하고 saccules는 프로 시저를 통해 산모와 태아의 생존을 보장하기 위해 필수적이다. 첫째, 자궁 태반의 물리적 무결성을 적절히 유지하는 것이 중요하다. 배아 혈액의 흐름을 방해하거나 태반 혈류 공급 혈관 상당한 파손을 일으킬 것이다 방식 saccules contorting을 피한다. 이것은 maximu를 추출함으로써 달성 될 수있다한 번에 1-2 배아의 m (초기 카운트 전체 자궁 주머니를 추출하지 않는 한)과 태반의 기지에서 멀리 주요 혈관에서 어플리케이터를 배치하여. 배아 주사 부위의 위치 초음파 시스템과 적절한 위치에 마이크로 인젝션 니들을 안내하는 각 사출 시도 중요하다. 주의 깊은 관심은 센터 마커에 좌심실의 위치 선정과 중심에 부여해야합니다. 이 후, 바늘이 위치해야하고 동일한 X 및 Y 플랜 바늘과 주사 부위를 맞출뿐만 아니라 중앙에 정확하게 중심 마커. 이 작업이 완료되면, 천천히 주사 부위에 가까운 바늘 끝을 그리고 심낭 낭과 심장에 과도한 스트레스가 가해지지 않도록 해주십시오. 이것은 바늘 서서히 조직층 통과하게보다는 그들을 통해 바늘의 통로를 강제함으로써 수행된다. 주입하는 동안, 또한 L에 중요OOK 바늘 끝 (그림 10)에서 나오는 검은 그림자 밖으로. 이것은 심실 충전 TL 용액 나타낸다. 바늘 끝 위치가 올바른 경우, 그림자 연속적 나타나야와 TL이 대동맥으로 토출으로 사라진다. 심낭 캐비티 충혈 것 같으면 바늘 좌심실의 대상이 꺼지고 TL 용액 심장 주변 심낭 캐비티를 채우는 것을 그러나, 이것은 나타낸다. 이것은 쉽게 배아 내에서 여전히 바늘로 일어나고있는 약간의 조정과 함께, 그것의 X 및 Y 평면에 주사 바늘의 위치를​​ 바꾸 수정할 수있는 일반적인 실수이다. 이 단계에서 배아에서 바늘을 추출하지 마십시오. 생체 내 미세 주입 제한에 초음파를 유도 본질적으로, 마이크로 인젝션 초음파 근본적인 기술적 한계의 수를 보유하고있다. 무엇보다도 미세 주사 바늘 볼륨용량은 마우스의 E17.5에 주사의 연령 범위를 제한합니다. TL 솔루션의 2.5 μl를 완전히 E15.5에 배아를 관류하는 우리의 연구에서 밝혀졌다. 그러나, 바로이 시점 다음, 혈액 부피비 TL은 소문자 효과적으로 주연 신장 내피 세포막에 태그하기 위해 희석된다. 따라서, 혈류의 감소 픽처 이후 시점 주사 존재한다. 또한, 태아의 뼈와 연골의 형성을 따라서 길게 주입 시간과 니들 머리에 자주 균열로 이어지는, 바늘 끝위한 자연 장벽을 만듭니다. 이러한 제한은 더 큰 바늘 강도 및 부피 용량으로 주사 신규 한 시스템을 이용하여 극복 될 수있다. 대안 배아 혈류 맵핑 기법 현재까지, 마우스 배아 매핑 혈류의 다른 방법은 수지의 구현 캐스트, 면역 조직 화학 염색 및 고 resolut 포함<html> 이온 초음파 촬상. (고급 영상 기술의 통합) 수지 캐스팅은 가장 인기있는 대안으로, 이것은 아래에서 상세히 설명 될 것이다. 수지 캐스트는 출생 후 기관 내에서 흐름의 정확한 입체 표현의 창조를 위해 수 있습니다. 그러나 작은 성공으로 인해 해상도 다공성 혈액 혈관 및 제한 사항에 대한 이미지 태아 신장 조직으로했다되었습니다. 비교하여, 공액 TL 얼룩 정밀도 높은 수준에 이르는 막 항원 내피 결합을 가능하게한다. 다른 경우에는, 캐스팅 점도 조기 배율이 높을수록 임상 제한을 만드는 사구체 혈관과 작은 모세관 침대로 흘러 자릅니다. 낮은 배율에서,이 기술은 개발 도상국 관련 흐름 패턴을 설정 가능한에서 명확하다. 반대로, TL은 세포 수준에서 발달 구조 혈류 상대적인 고해상도 분석을 허용한다. ENT &quot;&gt; 미래 응용 프로그램 및 방향 우리의 데이타는 혈류와 산소가 선조 네프론 분화에 관하여 중요한 요인이라는 것을 시사한다. 더 신장 개발에 자신의 역할을 규명하기 위해, 미래의 조사는이 생리 학적 과정을 침전 기본 해부학 적 메커니즘을 묘사뿐만 아니라뿐만 아니라 이러한 현상을 매개 전사 신호 전달 경로를 조사해야합니다. 현상기구 사이의 교량에 관해서 한가지 가설은, 평활근 세포 및 혈관 주위 세포 응집체 현상 장기의 줄기 세포 영역으로의 혈류를 일시적 절단 도출해 기여 역할을한다는 것이다. 이를 테스트하기 위해, 추가로 면역 염색과 분석은 신원 성 영역의 국경에서 이러한 세포 유형에 초점을 수행해야합니다. 신호 전달 경로를 기본의 미래 연구의 관점에서, 우리는 저산소증 유도 인자와의 역할을 탐구하고 싶습니다폰 Hippen 린다는 신호 전달 경로. 이 두 가지 모두 크게 각각 (산소의 가장 필요로하는 분야) 줄기 세포 (주로 저산소로 본) 지역과 차별화의 영역 내 저산소증과 산소 환경을 유지하는 중요한 유도 역할을 수행으로 문학 전반에 걸쳐 연루되어있다. 또한, 우리는 신장 혈관의 개발 과정에서 혈관 신생과 혈관 생성의 과정을 매개로 에리트로 포이 에틴 (EPO)의 역할을 심문하고 싶습니다. EPO는 내피 세포의 분화 및 유지 관리에 중요한 역할을한다 신장 당 단백질이다. 혈액 매개 내피 세포의 분화에서의 역할은 크게 알려져 있지 않다. 마지막으로, 우리는 또한 이러한 조사의 유효성을 강화하기 위해 혈관 확장 화합물과 생체 마이크로 인젝션 실험에서 수행하고자한다.

배아 개발하는 동안 두 개의 분리 된, 그러나 동시에, 혈관 프로세스는 자리를 차지할 : 혈관 신생을, 과정을 선박이 주거 내피 전구 세포 1,2에서 선박의 새로이 형성이 큰 기존의 선박 및 혈관 형성에서 성장된다. 후자는 주로 그것의 부재하에 일어날 것으로 생각되는 반면, 각각 전자는 혈류와 동의어이다. 혈관 형성에 동시, 신장 전구 세포 합성, 증식, 분화의 순환과 역동적 인 과정은 배아 일 9.5 (E9.5)에 전개하기 시작한다. 이 시점에서 ureteric 버드 (UB)는 metanephric 중간 엽 (MM)를 주변에 등쪽에 침입, 출생 3 때까지 계속됩니다. 빠르게 metanephric 캡 중간 엽 응축에 UB의 분기에 반복 신장의 기능 단위, 네프론의 형성을 시작합니다. UB와 neph의 모든 새로운 세대와 함께론은, 이전 세대들은 다음 주로 혈관 밀도가 높은 환경에서 더욱 성숙과 분화를 거쳐 내부 피질과 수질 지역으로 변위. 레슬러 외. (3)에 의해 입증되는 바와 같이,이 프로세스는 예컨대 배아 UB 및 MM, 및 세포 외 인자 3-6의 무수 간의 크로스 토크로, 시그널링 유도하여 침전된다. 두 최근 조사 외 개발 췌장 내 요인과 신장 산소 긴장과 혈액의 흐름 7,8를 포함한다. 후자는 신장 개발과 관련하여 이하​​에서 더 상세히 설명 될 것이다. 혈류 잠재적 네프론 전구 세포 분화뿐만 아니라 다른 기관 형성 공정, 배아 혈류 맵핑의 정밀하고 정확한 방법으로 재생되는지 유도 역할을 노출하기 위해 필수적이다. 혈류 이징의 다른 방법은 UL의 처방을 포함trasound 이미징 및 수지는 9,10을 캐스팅합니다. 결론적으로, 이러한 모드는 동시에 본래 혈류 간의 공간적 병치을 공개하고 세포 분화 줄기 능력이 부족한 것으로 밝혀졌다. 수지 캐스팅은, 예를 들면, 그러나 배아 시점과 같은 미성숙 용기에, 성인 조직 내의 혈관 패턴의 유효한 모델을 제공하는, 선박 조잡한 외교적 누설이다. 따라서, 수지, 자주 다공성, 작은 혈관 내에 유지하는 데 실패 캐스트. 이러한 명백한 장애물, 다른 사람의 사이에서, 우리는 초음파 유도 신장 개발의 우리의 조사에 생체 내 심장 배아 토마토 렉틴 (TL) microinjections에 통합하기로 결정했습니다. 이 절차에서는 동기 E11.5, E13.5, E15.5, E17.5 및 시점에 마우스 배아 좌심실 TL 용액 2.5 μL를 가득 탑재 마이크로 피펫을 안내하는 바늘 초음파 프로브를 이용한다. E17바늘이 더 발달 된 배아를 관통 할만큼 강하지으로 0.5 최신 개발 시대입니다. 이 미세 주입 방법의 장점은 풍부하다. 초음파 유도 미세 주사는 정확한 배아 좌심실 내 주사 바늘의 위치, 동물, 심장 손상을 최소화하고 주변 조직의 고동 치는 심장에 솔루션의 수동 및 제어 추방, 갑자기 심장 장애의 회피와 죽음을 수 있습니다 배아 전신 관류 전에. FITC 표지 된 TL를 이용하여, 임의의 관류는 혈관 내피 세포의 정단 막 따라 마커를 유지할 것이다. 면역 함께, PECAM (CD31, 혈소판 내피 세포 접착 분자) 및 기타 다양한 혈관 마커를 이용하여 알기 쉽게 할 수있는 관류 비 - 관류 용기 구별뿐만 아니라 주변 조직의 모든 비정상적인 얼룩을 특성화.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="981">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:292px;">Company</td>
			<td style="width:164px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:225px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DAPI</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>022M4004V</td>
			<td>concentration 1:5000</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pecam</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553370</td>
			<td>concentration 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FITC-Tomato Lectin</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>FL-1321</td>
			<td>concentration 2.5&#181;L / embryo</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alexa Fluor-594 (Donkey Anti-Rat )</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>712-585-150</td>
			<td>concentration 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microinjection Needle</td>
			<td>Origio Mid Atlantic Devices</td>
			<td>C060609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mineral Oil</td>
			<td style="width:292px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:164px;">BP26291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mL syringe</td>
			<td style="width:292px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:164px;">03-377-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;Clay Blocks</td>
			<td style="width:292px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:164px;">HR4-326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Surgical Tape</td>
			<td style="width:292px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:164px;">18-999-380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS</td>
			<td style="width:292px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:164px;">NC9763655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hair Removal Product</td>
			<td style="width:292px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:164px;">NC0132811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Surgical Scissors</td>
			<td style="width:292px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:164px;">14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fine Forceps</td>
			<td style="width:292px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:164px;">11064-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;Surgical Marking Pen</td>
			<td style="width:292px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:164px;">18000-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;Right angle forceps (for hysterectomy)</td>
			<td style="width:292px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:164px;">11151-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in utero intra-cardiac tomato-lectin injections on mouse embryos to gauge renal blood flow

형성 및 (떨어져 사구체) 신장 혈관의 관류 현상 understudied 크게된다. 혈관은 수지 캐스트, 생체 초음파 이미징 및 마이크로 해부와 같은 관류 매핑 기술 사이의 친밀한 관계를 입증 제한되었습니다 (드 노보 혈관 형성)과 혈관 생성 (주요 혈관의 떨어져 분기 인) 혈관을 통해 개발로 배아 내에서이 두 가지 프로세스와 개발 신 구조. 여기서 우리는 신장 관류의 개체 발생을 측정하기 위해 마우스 배아에 자궁 내 심장 초음파 유도 FITC 표지 토마토 렉틴 microinjections에서의 절차를 설명합니다. 토마토 렉틴 (TL)를 수확 배아 신장에 걸쳐 관류했다. 네프론 전구 세포, 네프론 구조, ureteric 상피 세포 및 혈관 : 조직을 포함, 다양한 신장의 구조에 대해 공동으로 염색 하였다. E13.5 구경이 큰 혈관에서 시작하는 것은, 그러나 말초 관류선박 unperfused 남아 있었다. E15.5 및 E17.5으로 작은 말초 혈관뿐만 아니라 사구체 관류 될 시작했다. 이러한 실험 방법은 배아 발생 동안 혈관 혈류의 역할을 연구하는데 중요하다.

혈관 형성은 신장을 개발 흐름을 선행 (신장 포함) 배아 조직의 대부분은 심지어 초기 배아 시점에서, 조밀 한 혈관 (unperfused 및 관류 모두)가 포함되어 있습니다. 개발 신장 내에서 더 나은 게이지 분석 혈액의 흐름에 우리는 자궁 내 배아 심장 내 microinjections의 방법을 이용했다. 개복술을 통해 추출 번의 자궁 saccule 노출 다음 E17.5 통해 E11.5에서 배아 심장을 식별하는 고해상도 초음파의 사용과 함께, 우리는 TL 2.5 μl를 주입 할 수 있었다 (형광 염료 (FITC))은 π 공역. 우리는 각각 약 90 % ~ 80 %의 성공률 중 최고의 주입 E13.5 및 E15.5 태아 시점을 발견 하였다. 때문에 E11.5에서 상대적으로 미성숙 한 마음의 존재와 E17.5에서 조밀 한 연골과 뼈의 형성의 존재, 외곽 TI의저 중간 점 배아 시간 지점에 비해 실질적으로 성공의 낮은 확률로, 주입하는 비교적 어렵다. 하나는 각각 E11.5 및 E17.5 시간 점 ~ 30 %의 성공률을 ~ 적어도 50 %를 예상하고있다. PECAM (CD31), 보편적 인 내피 세포 마커와 공동 라벨링 조직함으로써, 우리는 질적으로 세 그룹으로 형광 혈관과 조직을 분류 할 수있다 : 관류 혈관 (PECAM 양성 및 TL 긍정적), unperfused 혈관 (PECAM 긍정적 인), 그리고 비정상적으로 관류 구조 (TL 긍정적). 이 특별한 염색 패턴은 우리가 공간적으로 관류 및 취소 관류 (그림 11)의 영역을 구별 할 수 있습니다. E11.5에서, 우리는 관류 선박이 실제로 기관 (그림 12B)에 관통하지 않고 웹과 같은 패턴으로 개발 신장을 캡슐화 것을 발견했다. E13.5으로 주요 혈관은 이하의 몇 관류TL (도 12c)로 염색 액세서리 선박. ureteric 상피 세포의 일부는,이 중 이미 관류 또는 인해 초기 배아 혈관의 고유 leakiness하는 사구체에서 할 수있다 걸쳐 염색도 볼 수있다. E15.5 주요 혈관 관류으로 사구체 그러나 많은 수의 또한 중요한 필터링 (그림 12D)를 발생 제안, TL 얼룩을 들고 관찰 할 수있다. 신원 성 외측 영역의 상당 부분은 혈류의 결여 된 것으로 나타나지만 또한이 때, 표시는 작은 구경으로 관류 용기 번호를 가리. 마지막으로, 그러나, E17.5에 의해 신장의 대부분은 따라서 주변 지역에서 혈관 신생의 부재를 나타내는 관류 주로없는 인 신원 성 영역 (PECAM 긍정적 인 혈관 그러나 밀도)의 혈관을 제외하고 관류했다. 작은 구경 혈관 TL을 포함하고 관류 사구체의 평균 수는 극적에있다초기 시점 (도 12E)에 비해 주름. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52398/52398fig1.jpg" /> 그림 1. 초음파 프로브, 수술 단계, 미세 주입 시스템, 철도 시스템 및 ECG / 온도 모니터 기본 설정입니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52398/52398fig2.jpg" /> 그림 2. 필요한 수술 장비, 솔루션 및 장치. (A) 면봉. (B) (반지) 집게를 확장. (C) 외과 용 가위. (D) 집게를 블런트 팁. (E) 미세 집게. (F) 미세 주입 바늘 (Origio, # 1 C060609). (H) 사출 / 컨트롤러를 입력합니다. (I) 인산 완충 생리 식염수 (PBS). (J) 미네랄 오일 (시그마 알드리치). <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52398/52398fig3.jpg" /> 그림 3. 2 cm의 개복 수술은 자궁 위의 피하 층 (복벽)를 노출, 마취 어머니 수행됩니다. 수술 가위 및 미세 집게를 이용, 원격 교육 알바를 노출하고 표피 인하 절개 평행합니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52398/52398fig3large.jpg" target="_blank">여기를 클릭하십시오 그림의 더 큰 버전을 확인합니다.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52398/52398fig4.jpg" /> 그림 4. 1-2 E15.5 자궁 saccules이 개복 수술 절개를 통해 추출 노출. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52398/52398fig4large.jpg" target="_blank">더 큰 보려면 여기를 클릭하십시오</a>그림의 버전입니다. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/52398/52398fig5.jpg" /> 그림 5. 노출 된 자궁 saccules은 연장 집게를 사용 유창 페트리 접시에 슬릿을 통해 안내. 유창은 saccules의 기지에서 snuggly에 좌석을 물리는. <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/52398/52398fig6.jpg" /> 그림 6. 자궁 saccules의 오른쪽에 배치 블루 포함 된 벽. 페트리 접시는 배아 때까지 37 ° C PBS로 채워진 벽을 함유 완전히 침수된다. 점토 블록은 팔과 몸과 다리와 꼬리 사이의 페트리 접시 / 배아에서 안전하게 배치했다. <img alt="그림 7" src="/files/ftp_upload/52398/52398fig7.jpg" /> 도 7. 사출 시스템하여 위치 될<html> 네드 ½ cm 왼쪽 아래, 초음파 프로브 90 ° ~. <img alt="그림 8" src="/files/ftp_upload/52398/52398fig8.jpg" /> 도 8. 스테이지의 X 및 Y 조정기구. <img alt="그림 9" src="/files/ftp_upload/52398/52398fig9.jpg" /> 그림 9. 빈 / 장치, 미세 주사 시스템을 작성하고 마운트를 준비. (A) 버튼을 입력합니다. (B) 버튼을 주입한다. (C) 원형 바늘 각도 조절 손잡이. (E) X 미세 조정 노브. (F) &quot;주입&quot;노브. (G) 코스 X 조정 노브. (H) 단계 높이 조절 노브를 회전. <html> 98fig10.jpg &quot;/&gt; 그림 10. E15.5의 내 심장 TL 미세 주입. 바늘 끝의 초음파 이미지가 심장 챔버 내에 위치, TL 솔루션은 두 개의 챔버 내에서 검은 그림자로 표시됩니다. 심막과 심낭 공동 쉽게 차별화된다. <img alt="그림 11" src="/files/ftp_upload/52398/52398fig11.jpg" /> 그림 11. 관류, unperfusion 및 식별 비정상적인 염색 사이의 영역은. 첫 번째 패널은 PECAM 얼룩을 보여줍니다. 가운데 패널은 조직의 동일한 영역에 걸쳐 TL 얼룩을 표시합니다. Ureteric 새싹 비정상적으로 스테인드이다 주요 혈관 흰색 점선으로 싸여있다. 마지막 패널은 병합입니다. 흰색 화살표는 혈관 누출을 나타내고, 회색 화살표는 용기쪽으로 천이 관류되는 것을 보여준다. 노란색 구조는 완전히 관류 혈관을 나타냅니다.OAD / 52398 / 52398fig11large.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt; 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 12" src="/files/ftp_upload/52398/52398fig12.jpg" /> 그림 12. 배아 신장 관류 개체 발생을 조사한다. (A) 전체 E11.5 배아가 관류, TL을 들고 머리와 꼬리 영역 내에서 매우 말초 혈관으로. (B)는 주변 혈관 관류 본하지만 웹 형상의 패턴에 현상 E11.5 신장에 도입되지 않은,이 시점에서 확산 염색 상당히 많은 양의도있다. (C) E13.5 신장 주요, 구경이 큰 선박이 신원 성 영역 (흰색 점선) 내 결석 관류와, 신장 (흰색과 노란색 화살표)에 걸쳐 관류 보여줍니다. (D) E15.5 신장이 작은 구경에 걸쳐 관류를 보여, 말초 혈관 (노란색 화살표)일부 사구체 (흰색 화살표), 다시 주변 신장 벽난로에서 관류의 부재에서. (E) E17.5 신장은 사구체 (흰색 화살표)에 걸쳐 광대 한 관류 작은 구경 용기 (노란색 화살표)를 보여줍니다. 신원 성 영역이 확대에서 신장의 나머지 부분과 구별이다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52398/52398fig12large.jpg" target="_blank">그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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In Utero Intra-cardiac Tomato-lectin Injections on Mouse Embryos to Gauge Renal Blood Flow

This manuscript describes a technique for visualization of the developing vasculature. Here we utilized in utero intra-cardiac FITC-labeled tomato lectin microinjections on mouse embryos. Using this technique, we delineate the perfused and unperfused vessels throughout the embryonic kidney.

마우스 배아의 자궁 내 인트라 심장 토마토 렉틴 주사에서 신장 혈류를 측정하기 위해

The formation and perfusion of developing renal blood vessels (apart from glomeruli) are greatly understudied. As vasculature develops via angiogenesis ...

in-utero-intra-cardiac-tomato-lectin-injections-on-mouse-embryos-to

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Utero Intra-cardiac Tomato-lectin Injections on Mouse Embryos to Gauge Renal Blood Flow

9.6K 조회수.  Children's Hospital of Pittsburgh of UPMC. This manuscript describes a technique for visualization of the developing vasculature. Here we utilized in utero intra-cardiac FITC-labeled tomato lectin microinjections on mouse embryos. Using this technique, we delineate the perfused and unperfused vessels throughout the embryonic kidney.

비디오: In Utero Intra-cardiac Tomato-lectin Injections on Mouse Embryos to Gauge Renal Blood Flow

Contrast Imaging in Mouse Embryos Using High-frequency Ultrasound

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted applications, facilitate the detection and measure of vascular biomarkers at the molecular level. Within the mouse embryo, this noninvasive technique may be used to uncover basic mechanisms underlying vascular development in the early mouse circulatory system and in genetic models of cardiovascular disease. The mouse embryo also presents as an excellent model for studying the adhesion of microbubbles to angiogenic targets (including vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR2) or &#945;v&#946;3) and for assessing the quantitative nature of molecular ultrasound. We therefore developed a method to introduce ultrasound contrast agents into the vasculature of living, isolated embryos. This allows freedom in terms of injection control and positioning, reproducibility of the imaging plane without obstruction and motion, and simplified image analysis and quantification. Late gestational stage (embryonic day (E)16.6 and E17.5) murine embryos were isolated from the uterus, gently exteriorized from the yolk sac and microbubble contrast agents were injected into veins accessible on the chorionic surface of the placental disc. Nonlinear contrast ultrasound imaging was then employed to collect a number of basic perfusion parameters (peak enhancement, wash-in rate and time to peak) and quantify targeted microbubble binding in an endoglin mouse model. We show the successful circulation of microbubbles within living embryos and the utility of this approach in characterizing embryonic vasculature and microbubble behavior.

Here, we present a protocol to inject ultrasound microbubble contrast agents into living, isolated late-gestation stage murine embryos. This method enables the study of perfusion parameters and of vascular molecular markers within the embryo using contrast-enhanced high-frequency ultrasound imaging.

고주파 초음파를 사용하여 마우스 태아에 대비 이미징

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted ...

연구

발생학

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical and molecular methods provides information of potential target genes and signaling pathways. To further elucidate specific regulatory mechanisms requires a system allowing the manipulation of only a small number of cells of a specific tissue by either overexpression, ablation or re-introduction of specific genes and follow their fate during development. To achieve this ex utero electroporation of hippocampal structures, especially the dentate gyrus, followed by organotypic slice culture provides such a tool. Using this system to generate mosaic deletions allows determining whether the gene of interest regulates cell-autonomously developmental processes like progenitor cell proliferation or neuronal differentiation. Furthermore it facilitates the rescue of phenotypes by re-introducing the deleted gene or its target genes. In contrast to in utero electroporation the ex utero approach improves the rate of successfully targeting deeper layers of the brain like the dentate gyrus. Overall ex utero electroporation and organotypic slice culture provide a potent tool to study regulatory mechanisms in a semi-native environment mirroring endogenous conditions.

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Here we present a protocol providing a tool to examine regulatory mechanisms of specific genes during hippocampal development. Employing ex utero electroporation and organotypic slice culture allows the up- and down-regulation of the expression of genes of interest in single cells and follow their fate during development.

마우스 해마 조직의 예 자궁 Electroporation에와 Organotypic 슬라이스 문화

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for embryo collection, immunofluorescence, imaging on a confocal microscope, and image segmentation and analysis are described. This method allows quantitation of the expression of multiple nuclear markers and the spatial (XYZ) coordinates of all cells in the embryo. It takes advantage of MINS, an image segmentation software tool specifically developed for the analysis of confocal images of preimplantation embryos and embryonic stem cell (ESC) colonies. MINS carries out unsupervised nuclear segmentation across the X, Y and Z dimensions, and produces information on cell position in three-dimensional space, as well as nuclear fluorescence levels for all channels with minimal user input. While this protocol has been optimized for the analysis of images of preimplantation stage mouse embryos, it can easily be adapted to the analysis of any other samples exhibiting a good signal-to-noise ratio and where high nuclear density poses a hurdle to image segmentation (e.g., expression analysis of embryonic stem cell (ESC) colonies, differentiating cells in culture, embryos of other species or stages, etc.).

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analysis of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for collection of blastocysts, whole-mount immunofluorescent detection of proteins, imaging of samples on a confocal microscope, and nuclear segmentation and image analysis are described.

단백질 발현의 정량 분석​​은 마우스 착상 전의 배아에서 리니지 사양을 공부하기

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene modification in preimplantation embryos provides a means to study the underlying mechanisms of genes implicated in, for instance, cellular differentiation into the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM). Here, we describe a protocol that examines the role of neogenin as an authentic receptor for initial cell fate determination in preimplantation mouse embryos. First, we discuss the experimental manipulations that were used to produce gain and loss of neogenin function by microinjecting neogenin cDNA and shRNA; the effectiveness of this approach was confirmed by a strong correlation between the pair-wise expression levels of either red fluorescent protein (RFP) or green fluorescent protein (GFP) and the immunocytochemical quantification of neogenin expression. Secondly, overexpression of neogenin in preimplantation mouse embryos leads to normal ICM development while neogenin knockdown causes the ICM to develop abnormally, implying that neogenin could be a receptor that relays extracellular cues to drive blastomeres to early cell fates. Given the success of this detailed protocol in investigating the function of a novel embryonic developmental stage-specific receptor, we propose that it has the potential to aid in exploration and identification of other stage-specific genes during embryogenesis.

The goal of this protocol is to describe a loss- and gain-of function method that is applicable to identify neogenin as a stage-specific receptor that leads to trophectoderm and inner cell mass differentiation in preimplantation mouse embryos.

착상 전의 마우스 배아의 초기 세포 운명 결정 요인을 조사 할 Loss- 및 이득 -의 - 기능 접근

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

Structure-function Studies in Mouse Embryonic Stem Cells Using Recombinase-mediated Cassette Exchange

Gene engineering in mouse embryos or embryonic stem cells (mESCs) allows for the study of the function of a given protein. Proteins are the workhorses of the cell and often consist of multiple functional domains, which can be influenced by posttranslational modifications. The depletion of the entire protein in conditional or constitutive knock-out (KO) mice does not take into account this functional diversity and regulation. An mESC line and a derived mouse model, in which a docking site for FLPe recombination-mediated cassette exchange (RMCE) was inserted within the ROSA26 (R26) locus, was previously reported. Here, we report on a structure-function approach that allows for molecular dissection of the different functionalities of a multidomain protein. To this end, RMCE-compatible mice must be crossed with KO mice and then RMCE-compatible KO mESCs must be isolated. Next, a panel of putative rescue constructs can be introduced into the R26 locus via RMCE targeting. The candidate rescue cDNAs can be easily inserted between RMCE sites of the targeting vector using recombination cloning. Next, KO mESCs are transfected with the targeting vector in combination with an FLPe recombinase expression plasmid. RMCE reactivates the promoter-less neomycin-resistance gene in the ROSA26 docking sites and allows for the selection of the correct targeting event. In this way, high targeting efficiencies close to 100% are obtained, allowing for insertion of multiple putative rescue constructs in a semi-high throughput manner. Finally, a multitude of R26-driven rescue constructs can be tested for their ability to rescue the phenotype that was observed in parental KO mESCs. We present a proof-of-principle structure-function study in p120 catenin (p120ctn) KO mESCs using endoderm differentiation in embryoid bodies (EBs) as the phenotypic readout. This approach enables the identification of important domains, putative downstream pathways, and disease-relevant point mutations that underlie KO phenotypes for a given protein.

Proteins often contain multiple domains that can exert different cellular functions. Gene knock-outs (KO) do not consider this functional diversity. Here, we report a recombination-mediated cassette exchange (RMCE)-based structure-function approach in KO embryonic stem cells that allows for the molecular dissection of various functional domains or variants of a protein.

재조합 효소 매개 카세트 교환을 사용하여 마우스 배아 줄기 세포의 구조 - 기능 연구

Gene engineering in mouse embryos or embryonic stem cells (mESCs) allows for the study of the function of a given protein. Proteins are the workhorses of ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is the formation of the transient organizers, the node and notochordal plate, from cells that have passed through the primitive streak. The proper formation of these signaling centers is essential for the development of the body plan and techniques to visualize them are of high interest to mouse developmental biologists. The node and notochordal plate lie on the ventral surface of gastrulating mouse embryos around embryonic day (E) 7.5 of development. The node is a cup-shaped structure whose cells possess a single slender cilium each. The proper subcellular localization and rotation of the cilia in the node pit determines left-right asymmetry. The notochordal plate cells also possess single cilia albeit shorter than those of the node cells. The notochordal plate forms the notochord which acts as an important signaling organizer for somitogenesis and neural patterning. Because the cells of the node and notochordal plate are transiently present on the surface and possess cilia, they can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Among other techniques used to visualize these structures at the cellular level is whole mount immunofluorescence (WMIF) using the antibodies against the proteins that are highly expressed in the node and notochordal plate. In this report, we describe our optimized protocols to perform SEM and WMIF of the node and notochordal plate in developing mouse embryos to help in the assessment of tissue shape and cellular organization in wild-type and gastrulation mutant embryos.

The node and notochordal plate are transient signaling organizers in developing mouse embryos that can be visualized using several techniques. Here, we describe in detail how to perform two of the techniques to study their structure and morphogenesis: 1) scanning electron microscopy (SEM); and 2) whole mount immunofluorescence (WMIF).

노드 및 스캐닝 전자 현미경 검사 법, 면역 형광 산 전체를 사용 하 여 Gastrulating 마우스 배아에서 Notochordal 접시를 시각화

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by Sertoli cell junctions at the blood-testis barrier (BTB), which is the tightest tissue barrier in the mammalian body and segregates the seminiferous epithelium into two compartments, a basal and an adluminal. The BTB creates a unique microenvironment for germ cells in meiosis I/II and for the development of postmeiotic spermatids into spermatozoa via spermiogenesis. Here, we describe a reliable assay to monitor BTB integrity of mouse testis in vivo. An intact BTB blocks the diffusion of FITC-conjugated inulin from the basal to the apical compartment of the seminiferous tubules. This technique is suitable for studying gene candidates, viruses, or environmental toxicants that may affect BTB function or integrity, with an easy procedure and a minimal requirement of surgical skills compared to alternative methods.

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Here, we present a protocol to assess the blood-testis barrier integrity by injecting inulin-FITC into testes. This is an efficient in vivo method to study blood-testis barrier integrity that can be compromised by genetic and environmental elements.

Vivo에서 하는 방법 마우스 혈액 고환 방 벽 완전성을 공부

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational health hazard. Here, we demonstrate the exposure of primary stem cells from the mouse ocular surface to UV-C radiation. Reactive oxygen species (ROS) formation is the readout of the extent of oxidative stress/damage. In an experimental in vitro setting, it is also essential to assess the percentage of dead cells generated due to oxidative stress. In this article, we will demonstrate the 2&#39;,7&#39;-Dichlorofluoresceindiacetate (DCFDA) staining of UV-C exposed mouse primary ocular surface stem cells and their quantification based on the fluorescent images of DCFDA staining. DCFDA staining directly corresponds to ROS generation. We also demonstrate the quantification of dead and live cells by simultaneous staining with propidium iodide (PI) and Hoechst 3332 respectively and the percentage of DCFDA (ROS positive) and PI positive cells.

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

This protocol demonstrates the simultaneous detection of reactive oxygen species (ROS), live cells, and dead cells in live primary cultures from mouse ocular surface cells. 2&#39;,7&#39;-Dichlorofluoresceindiacetate, propidium iodide, and Hoechst staining are used to assess the ROS, dead cells, and live cells, respectively, followed by imaging and analysis.

자외선-C (UV-C) 손상에 응하여 1 차 마우스 안구 표면 세포/줄기 세포에 있는 산화 손상의 평가

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in zebrafish during different developmental stages. To investigate the role of endoglin(eng) in vessel formation during the development of hereditary hemorrhagic telangiectasia&#160;(HHT), morpholino-mediated targeted knockdown of eng in zebrafish are used to study its temporal expression and associated functions. Here, whole-mount in situ RNA hybridization (WISH) is employed for the analysis of eng and its downstream genes in zebrafish embryos. Also, tube formation assays are performed in HHT patient-derived induced pluripotent stem cell-differentiated&#160;endothelial cells (iPSC-ECs; with eng mutations). A specific signal amplifying system using the whole amount In Situ Hybridization &#8211; WISH provides higher resolution and lower background results compared to traditional methods. To obtain a better signal, the post-fixation time is adjusted to 30 min after probe hybridization. Because fluorescence staining is not sensitive in zebrafish embryos, it is replaced with diaminobezidine (DAB) staining here. In this protocol, HHT&#160;patient-derived iPSC lines containing an eng mutation are differentiated into endothelial cells. After coating a plate with basement membrane matrix for 30 min at 37 &#176;C, iPSC-ECs are seeded as a monolayer into wells and kept at 37 &#176;C for 3 h. Then, the tube length and number of branches are calculated using microscopic images. Thus, with this improved WISH protocol, it is shown that reduced eng expression affects endothelial progenitor formation in zebrafish embryos. This is further confirmed by tube formation assays using iPSC-ECs derived from a patient with HHT. These assays confirm the role for eng in early vascular development.

Presented here is a protocol for whole-mount in situ RNA hybridization analysis in zebrafish and tube formation assay in patient-derived induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells to study the role of endoglin in vascular formation.

혈관 발달에서 엔도글린의 역할을 연구하기 위해 iPSC-ECs의 제브라피시 배아 및 튜브 형성 분석에서 시투 혼성화에 대한 전체 마운트

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Using Flow Cytometry to Detect and Quantitate Altered Blood Formation in the Developing Zebrafish

The diversity of cell lineages that comprise mature blood in vertebrate animals arise from the differentiation of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs). This is a critical process that occurs throughout the lifespan of organisms, and disruption of the molecular pathways involved during embryogenesis can have catastrophic long-term consequences. For a multitude of reasons, zebrafish (Danio rerio) has become a model organism to study hematopoiesis. Zebrafish embryos develop externally, and by 7 days postfertilization (dpf) have produced most of the subtypes of definitive blood cells that will persist for their lifetime. Assays to assess the number of hematopoietic cells have been developed, mainly utilizing specific histological stains, in situ hybridization techniques, and microscopy of transgenic animals that utilize blood cell-specific promoters driving the expression of fluorescent proteins. However, most staining assays and in situ hybridization techniques do not accurately quantitate the number of blood cells present; only large differences in cell numbers are easily visualized. Utilizing transgenic animals and analyzing individuals with fluorescent or confocal microscopy can be performed, but the quantitation of these assays relies on either counting manually or utilizing expensive imaging software, both of which can make errors. Development of additional methods to assess blood cell numbers would be economical, faster, and could even be automated to quickly assess the effect of CRISPR-mediated genetic modification, morpholino-mediated transcript reduction, and the effect of drug compounds that affect hematopoiesis on a large scale. This novel assay to quantitate blood cells is performed by dissociating whole zebrafish embryos and analyzing the amount of fluorescently labelled blood cells present. These assays should allow elucidation of molecular pathways responsible for blood cell generation, expansion, and regulation during embryogenesis, which will allow researchers to further discover novel factors altered during blood diseases, as well as pathways essential during the evolution of vertebrate hematopoiesis.

This assay is a simple method to quantitate hematopoietic cells in developing embryonic zebrafish. Blood cells from dissociated zebrafish are subjected to flow cytometry analysis. This allows the detection of blood defects in mutant animals and after genetic modification.

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