The authors would like to thank Dr. George Gittes for advice and expertise throughout this study. SSL was supported by an American Heart Association fellowship (11POST7330002). Further to this SSL and this study was supported by an NIDDK Mentored Research Scientist Development Award (DK096996) and by the Children&#8217;s Hospital of Pittsburgh.

הערה: אוניברסיטת פיטסבורג מוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש הוועדה אישרה את כל הניסויים. 1. הכנת מכשירי אולטרסאונד-microinjection ועוברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הבמה, הר, ובדיקה (איור 1), כמו גם מכשירי ניתוח (איור 2). פתרון פוספט המקום שנאגרו מלוח (PBS) (pH7.4) באמבט התחממות 37 ° C. מלא מחט microinjection לחלוטין עם שמן מינרלים, באמצעות מיליליטר המזרק 1 מצורף ל-25 גמישים מחט G שנייה, דרך הבסיס שלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את המחט על סיבוב הר זרוע, ומחט ריקה של פתרון שמן מינרלים. למלא מחדש עם 2.5 μl של פתרון TL. ודא שאין בועות אוויר נמצאות בתוך מחט הזריקה. סובב את זרוע מחט לכיוון קיר, הרחק מהבמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את האמא בהריון בתא הרדמה באמצעות עירוי מתמשך של isoflurane. כשאמא שלו אבדה את ההכרה, להעביר את ההרדמה לצינור האף ממוקם בגצד audal של השלב, ואמא של מקום במצב שכיבה עם חוטם בצינור האף כדי לאפשר המשך מצב בהרדמה מלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גפיים קלטת ב -45 מעלות זוויות, או עם ידיים ורגליים נחו ואת מיקומו כרטיסיות / צג טמפרטורת overtop ECG. חשוב שהסכר בהריון מנוטר כל הזמן כדי להבטיח הרדמה שמספיק והמשחה שביישומים לעיניים להפחתת ייבוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מוצר להסרת שיער על פני בטן תחתונה של האמא, לנגב בעדינות את עם צמר גפן יבש, ולאחר מכן שוב עם צמר גפן רווי אתנול 70% כדי להסיר כל מוצר ושיער עודפים. ודא לנקות את עור בטן של כל השיער באתר של חתך (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע laparotomy על האמא בהריון באמצעות מלקחיים כירורגיים קנס ומספריים. תשמור על עצמך כדי להימנע מחיתוך כל כלי גדולים או איברים פנימיים. הפוך ראשון, חתך ישר של האפידרמיס 1.5-2 סנטימטר מעל הנרתיק וממשיך לחתוך לכיוון צלעות לapproximatסנטימטר Ely 2-3. לחשוף את הקרום תת-עורי, לאתר את alba linea (&quot;הקו לבן&quot;) (איור 3), ולחתוך במקביל לחתך ראשוני, יחד באותו האורך, לחשוף פנימי איברים פנימיים וsaccules רחם. </li></ol> 2. הפקה של עוברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בהחלה מכותנת שקצה 6 אינץ &#39;לתמרן אמא ועוברים. דחפו בעדינות (לא מכריח) על עור עם המוליך לתמרן עובר ראשון מתוך פתיחת חתך. לאחר החילוץ של שקיק העובר הראשון, בעדינות ולאט לאט למשוך את יתרת קרן הרחם דרך ועל חיצוני של האם. הימנע ממשייכת מעי או לאיברים אחרים דרך חתך בשלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת עוברים ומניחים בעדינות קרן רחם עזב בחזרה לאמא. לאחר מכן להתחיל בהצטרפות לקרן רחם הזכות חזרה אל אמא מתחילה עם מרוחק שקיק עובר מהנרתיק על הצופר ולנוע כלפי מטה. תמשיך את זה עד שרק שני עוברים יישארו חשופים (Fiתרשים 4). לבסוף, עוברי עמדה בטור לעיל ומקביל לחתך קו, להיות מודע לא לנתק את זרימת דם ברחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים בלוקים חימר ועמדה בין זרועות וגוף, כמו גם את הרגליים וזנב. ודא שמשטחי החימר כ רמה עם חתך laparotomy. להרטיב את צלחת פטרי fenestrated עם 37 ° C PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתפוס מלקחיים הארכה עם יד ימין וצלחת פטרי עם fenestrated יד שמאל (במקביל אשנוב לעוברים) ולהביא מלקחיים ~ 5 סנטימטר סגור דרך אשנוב, מהחלק העליון של צלחת פטרי. מלקחיים פתוחים לחלוטין מבלי לקרוע רשת אשנוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתמרן את הידיים מעל עוברים ולהתמקד מראה על שני saccules העובר. ללא (או קל) נוגע saccules עם התמזגות אשנוב או מלקחיים, להחליק אותם דרך חריץ ולהגדיר צלחת פטרי על הבטן של אמא. עם מלקחיים עדיין מורחבים, לתפעל רשת fenestrated להושיב אותו על שני צדדים ובבסיסו של כל עובר (איור 5 </stרונג&gt;) ולמשוך מלקחיים מפתיחת חריץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלב הבא, במקום גומי כחול המכיל קיר בצלחת פטרי, בלי לצבוט או פצעו עוברים (איור 6). הפוך לוקי חימר בטוחים בתקיפות מאזנים צלחת פטרי, עובר, וקיר המכיל גומי. לבסוף, למלא צלחת פטרי עם 37 מעלות צלזיוס PBS עד עובר הם שקועים לחלוטין (איור 6), תוך פיקוח על דליפות בהתמזגות fenestrated. </li></ol> נוהל 3. הזרקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב תחתון הזרקה עם אמו ועוברים למטה באמצעות כפתור כוונון הרמה-Z (איור 1) ולאחר מכן לסובב מחט זריקה ולעלות זרוע והשורה ישירות עם הבדיקה אולטרסאונד, עם סנטימטר ½ מחט משמאל ומתחת לקצה הבדיקה (איור 7) . לדחוף מחט-זרוע (לא מחט) 45 ° מהבדיקה. היזהר שלא פגע בקצה המחט עם חללית הצלחת או אולטרסאונד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעלות שלב הזרקה חזרה לגובה מקורי, עם p אולטרסאונדגלימה ישירות מעל Probe עוברים חייבת להיות שקועה מעט ובתוך 3-4 מ&quot;מ של הרקמה העוברית. כפתורי התאמת שלב השימוש X &amp; Y (איור 8) לתיקון מצב עובר / אמא / במה כדי לאתר את הלב העוברי להכות באופן שיטתי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ישירות מרכז של מסך אולטרסאונד להתבונן טוש שחור יעד המרכז נמשך (*). אתר חדר השמאלי (עדיף) או אטריום באמצעות כפתורי התאמת שלב X &amp; Y (איור 8) ולאחר מכן להגדיל או להקטין את השלב באמצעות ידית מסתובבת על הבמה למצב את יעד הזרקה בדיוק מעל הסמן המרכזי בצבע השחור על מסך אולטרסאונד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בכפתור כוונון שלב X לעבור עובר בצד הימין, מעל מסך אולטרסאונד. מיקום מחדש מחט microinjection וזרוע אחורית למקום, סנטימטר וחצי מו -90 מעלות לבדיקת אולטרסאונד (איור 7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות microinjection הר כפתורי התאמה (איור 9 ג-G), מחט עמדה עם הקצה בבירור אלigned עם הסמן המרכזי. להתאים את זווית הזרקה (תוך שימוש בידיות באיור 9 ג וEG), ו- X, Y, Z ווקטורים של מיקרו-מחט על מנת להבטיח במטוס הנכון קצה מחט מתמקד. לחזור בו מחט microinjection באמצעות אך ורק את הכפתור &quot;זריקה&quot; (איור 9F), נזהר שלא להתאים ממדים אחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוב, באמצעות רק את עובר X ​​עדין התאמת מהלך ידית שלב בחזרה מתחת לבדיקה, עם היעד בדיוק על סימן המרכז על מסך אולטרסאונד. ודא שהחדר השמאלי הוא עכשיו בדיוק באותו X, Y, Z ומטוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, רק עם הידית &quot;ההזרקה&quot; על microinjection הר, לנקב לאט עובר עם מחט microinjection ולהביא בהדרגה קצה לתוך החדר השמאלי. הזרק 2.5 μl המלא של פתרון TL לתוך חדר השמאלי או עד שצלילי צפצוף אזהרה הריקים, על ידי החזקה &quot;ריק&quot; וקשה &quot;למלא&quot; פעם אחת (איורים 2 א &amp; B). בשלב זההזרקה להתבונן צל שייוצר מקצה המחט שהוא TL נכנסים לתוך תא הלב (איור 10). בכיוון הפוך, לחזור בו במהירות מחט microinjection סיבוב ידית &quot;הזריקה&quot; (איור 9F) על microinjection הר כאשר ההזרקה היא מלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמשיך לעובר הבא ולחזור על הליך זה עבור עוברים שנותרו לאחר סדרה זו של צעדים ולבסוף מניחים את העוברים הסופיים חזרה לבטן של הסכר. לעבור הרדמה לחדר תיבה ועדינות להעביר אמא כאן במשך 15 דקות מהזמן של הזריקה האחרונה. </li></ol> 4. קציר עוברים וניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב את הסכר באמצעות נקע בצוואר הרחם. להרחיב את חתך laparotomy להסיר בקלות קרנות רחם מהאם. שמור את העוברים בתוך שק רחם. הנח עוברים בPBS המקורר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח עובר מן שק רחם (אם רקמת גוביינא הכרחית לגנוטיפ) ולמקם את כל העובר iParaformaldehyde n 4% (PFA) לילה, ואז לתוך 30% סוכרוז לילה, להקפיא בcryostat חתך בינוני. ואז לחתוך את cryosection ולמקם אותו על גבי שקופיות לניתוח immunohistochemical. לחלופין, להשתמש ברקמות לכל הר על ידי ההתייבשות במתנול 100%, לאחר הקיבוע בPFA 4%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח immunohistochemical למקם את cryosections לPBS להסיר אוקטובר אז לחסום את החלקים עם 10% חמורים בדם נורמלי למשך 30 דקות. לאחר מכן להוסיף נוגדן ראשוני PECAM ב 1: 100 דילול הלילה ב 4 מעלות צלזיוס. למחרת, לשטוף את השקופיות בPBT 3 פעמים במשך 10 דקות כל אחד ולהוסיף עכברוש אנטי חמור 594 משניים ודגירה עבור שעה 1 ב RT. הערה: זוהי טכניקה מאוד תובענית הדורשת אופטימיזציה ותיאום של אולטרסאונד וmicroinjection. יש עקומה למידה תלולה מאוד הקשורים לטכניקה זו ודורשת ארבעה עד שישה שבועות של זריקות מורה רוחניות לפני אחד הופך מיומן. </li></ol>

<ol>
	<li>Abrahamson, D. R., Robert, B., Hyink, D. P., St John, P. L., Daniel, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+and+formation+of+microvasculature+in+the+developing+kidney.">Origins and formation of microvasculature in the developing kidney.</a> Kidney international. Supplement. 67, S7-S11 (1998).</li><li>Sims-Lucas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Progenitors+Exist+within+the+Kidney+and+Lung+Mesenchyme.">Endothelial Progenitors Exist within the Kidney and Lung Mesenchyme.</a> PloS one. 8 (6), e65993 (2013).</li><li>Dressler, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+early+kidney+specification,+development+and+patterning.">Advances in early kidney specification, development and patterning.</a> Development. 136 (23), 3863-3874 (2009).</li><li>Costantini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+controls+and+cellular+behaviors+in+branching+morphogenesis+of+the+renal+collecting+system.">Genetic controls and cellular behaviors in branching morphogenesis of the renal collecting system.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1 (5), 693-713 (2012).</li><li>Costantini, F., Kopan , R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+a+complex+organ:+branching+morphogenesis+and+nephron+segmentation+in+kidney+development.">Patterning a complex organ: branching morphogenesis and nephron segmentation in kidney development.</a> Dev Cell. 18 (5), 698-712 (2010).</li><li>Das, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal-epithelial+crosstalk+regulates+kidney+progenitor+cell+differentiation.">Stromal-epithelial crosstalk regulates kidney progenitor cell differentiation.</a> Nat Cell Biol. 15 (9), 1035-1044 (2013).</li><li>Rymer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Renal+blood+flow+and+oxygenation+drive+nephron+progenitor+differentiation.">Renal blood flow and oxygenation drive nephron progenitor differentiation.</a> Am J Physiol Renal Physiol. , (2014).</li><li>Shah, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+mouse+blood+flow+and+oxygen+correlate+with+early+pancreatic+differentiation.">Embryonic mouse blood flow and oxygen correlate with early pancreatic differentiation.</a> Developmental biology. 349 (2), 342-349 (2011).</li><li>Andres, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphB4+receptor+tyrosine+kinase+transgenic+mice+develop+glomerulopathies+reminiscent+of+aglomerular+vascular+shunts.">EphB4 receptor tyrosine kinase transgenic mice develop glomerulopathies reminiscent of aglomerular vascular shunts.</a> Mech Dev. 120 (4), 511-516 (2003).</li><li>Wagner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+imaging+of+kidney+vascular+corrosion+casts+with+Nano-CT.">High-resolution imaging of kidney vascular corrosion casts with Nano-CT.</a> Microsc Microanal. 17 (2), 215-219 (2011).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

הרדמה Microinjection ומסגרת זמן בכל הקשור להרדמה של האמא, זה חיוני כדי לשמור על זרימת אוויר קבוע (2-3 L / min) ובPSI הנמוך. הזרימה של ההרגעה חייבת להיות מוחזקת בכ 1.75-2 L / min. במקביל, לוחות זמנים שבי הזריקות יתקיימו חייבים להיות תחת פיקוח הדוק ומבוקר לעם כל המלטה. לכל המלטה הליך ההזרקה צריך להיות כל הזמן תחת 45 דקות. חשיבותה של מגבלת זמן זה היא בעל חשיבות עליונה לניסוי, כפי שכל עובר חייב להישמר בטווח קבוע, קצב לב נורמלי על מנת להקל זלוף מבוקר ובלתי משתנה בכל הגוף והאיבר של עניין. מצאנו כי הארכת תוצאות זריקות בתוצאות מפוקפקות ותנודות בדפוסי זלוף בין עוברים ומורידה את שיעורי זריקות מוצלחות (כלומר, קצב לב איטי, מוות לבבי). לבסוף, לאחר ההזרקה הסופית בתוך החול, זה חיוניכדי לאפשר כ -15 דקות לפני עוברים נקצרים כדי להקל זלוף הנכון, מלא בכל עובר. טיפול וטיפוח של עוברים פרוצדורלי במהלך החילוץ של העוברים, שמצאנו שיעורים גבוהים יותר להצלחה עם זריקות שנעשו על ידי כל הזמן דאגה לבריאות ולשלמותה של רירית הרחם, ועוברים הכלליים במהלך חילוץ העובר של. באמצעות החלת העדינה כותנה שקצה (רוויה PBS) כדי לתפעל ולתמרן את שק הרחם וsaccules הם הכרחיים כדי להבטיח את הישרדותם של האם ועוברים לאורך כל ההליך. ראשית, חשוב לוודא כי השלמות הפיסית של הרחם ושלית מתוחזק כראוי. הימנע contorting saccules באופן שיקשה את זרימת דם לעוברים או לגרום שבר משמעותי בכלי דם המספקים את זרימת דם לשליה. זה יכול להיות מושלם על ידי חילוץ maximuמ &#39;של 1-2 עובר בכל פעם (אלא אם כן לחילוץ כל שק הרחם לספירה ראשונית) ועל ידי מיקום applicators מכלי דם גדולים בבסיס השליה. מיקומו של אתר ההזרקה העוברית המנחה את מחט microinjection במיקום הנכון עם המכונה אולטרסאונד הוא גם קריטי עבור כל ניסיון זריקה. תשומת לב קפדנית צריכה להינתן לאיתור והמרכוז של החדר השמאלי על סמן המרכז. בעקבות זאת, המחט צריכה להיות ממוקמת ומרוכזת בדיוק על סמן המרכז, כמו גם כדי ליישר את המחט ואתר הזרקה באותו X ו- Y תכנית. ברגע זה הוא מוחלט, לצייר לאט את קצה המחט קרוב יותר לאזור ההזרקה והימנע מהפעלת לחץ מופרז לצק ולב קרום הלב. הדבר נעשה על ידי מתן אפשרות למחט לעבור בהדרגה דרך שכבות רקמה, ולא לכפות את המעבר של המחט דרכם. במהלך ההזרקה, זה גם חשוב לlook החוצה לצל שחור שיוצא מקצה המחט (איור 10). זה מעיד על פתרון TL מילוי החדר. אם קצה המחט הוא במיקום הנכון, הצל צריך ברציפות מופיע ונעלמים כTL ייפלט לתוך אב העורקים. עם זאת, אם נראה חלל קרום הלב להצטבר, זה מעיד שהמחט היא לא לכיוון של החדר השמאלי ופתרון TL ממלא את חלל קרום הלב המקיף את הלב. זוהי טעות נפוצה שאפשר לפתור בקלות על ידי למקם מחדש את מחט הזריקה על X ו- Y מטוס, עם כל התאמות קלות המתרחשות עם המחט עדיין בתוך העובר. הימנע חילוץ המחט מן העובר בשלב זה. אולטראסאונד מודרך במגבלות microinjection vivo מטבע, microinjection אולטרסאונד בעל מספר המגבלות טכניות בסיסיות. בראש ובראשונה, microinjection מחט הנפחקיבולת מגבילה את טווח הגילים של זריקות לE17.5 בעכבר. 2.5 μl של פתרון TL הוכח במחקרים שלנו לינקב עוברים לחלוטין עד E15.5. עם זאת, רק לאחר נקודה זו בזמן, TL יחס נפח דם הופך לזעיר ומדולל לתייג ביעילות קרומי אנדותל כליות היקפיים. לפיכך, תמונה פחתה של זרימת דם היא הווה בזריקות נקודת זמן מאוחר יותר. בנוסף, היווצרות העצם והסחוס בעובר יוצרת מחסום טבעי לקצה המחט, וכך מובילה לזמני הזרקה התארכו וסדקים תכופים בראש המחט. מגבלות אלה ניתן להתגבר על ידי ניצול מערכת זריקות רומן עם יכולות כוח המחט ונפח גדולות יותר. טכניקות מיפוי אלטרנטיביות עוברי זרימת דם נכון להיום, שיטות חלופיות של זרימת דם עוברית עכבר מיפוי כוללות את היישום של יציקות שרף, מכתים אימונוהיסטוכימיה, וגבוה resolut<html> ההדמיה אולטרסאונד יון. כיציקות שרף (עם השילוב של טכניקות הדמיה מתקדמות) הן כיום האלטרנטיבה הפופולרית ביותר, זה יידון בפירוט בהמשך. יציקות שרף לאפשר את הקמתה של שלושה ייצוגים ממדיים מדויקים של זרימה בתוך איברים לאחר לידה. עם זאת, הצלחה קטנה כבר הייתה עם רקמת כליה לפני לידה הדמיה בשל כלי דם נקבוביים דם ומגבלות ברזולוציה. לשם השוואה, כתמי TL מצומדות לאפשר מליטה לאנדותל אנטיגנים קרום מוביל לדרגה גבוהה יותר של דיוק. במקרים אחרים, צמיגות יצוקה שרף בטרם עת חותכת לזרום לתוך כלי glomeruli ומיטות נימים זעירות, יצירת הגבלה מחקרית בהגדלות גדולות יותר. בהגדלה נמוכה, טכניקה זו היא בר-קיימא בהקמת תבניות זרימה ביחס לאזורי פיתוח באופן ברור. לעומת זאת, TL מאפשר ניתוח ברזולוציה גבוהה של זרימת דם ביחס למבנים התפתחותיים ברמה התאית. אף אוזן גרון &quot;&gt; יישום וכיוונים עתידיים הנתונים שלנו מצביעים על כך שזרימת דם וחמצון הם גורמים קריטיים בכל הקשור לנפרון בידול אב. כדי להבהיר עוד יותר את תפקידם בהתפתחות כליות, חקירות עתיד חייבים להתוות מנגנונים אנטומיים בסיסי מזרז תהליך פיסיולוגי זה, כמו גם לבחון מסלולי איתות תעתיק שמתווכים את התופעה הזאת גם כן. השערה אחת, בכל הקשור לגישור על הפער בין התופעה ומנגנון, היא שאגרגטים תא השריר וpericyte חלקים לשחק תפקידים תורמים במנצחים עיצור החולף של זרימת דם לאזורים בתאי גזע של איברים מתפתחים. כדי לבדוק זאת, מכתים immunofluorescent נוסף וניתוח חייבים להתנהל תוך התמקדות בסוגי התאים בגבול האזור nephrogenic. במונחים של חקירות עתידיות של בסיס מסלולי איתות, ברצוננו לחקור את התפקידים של גורמים ועין מתנהלת היפוקסיהפון Hippen Lindau מסלולי איתות. שני אלה במידה רבה היו מעורבים בכל ספרות כמשחק תפקידים אינדוקטיביים חשובים בשמירה על חוסר חמצן וסביבות מחומצן באזורים של תאי גזע (ראו במידה רבה להיות חוסר חמצן) ובאזורים של בידול (אזורים בצורך הגדול ביותר של חמצון), בהתאמה. יתר על כן, ברצוננו לחקור את תפקידו של אריתרופויאטין (EPO) בתיווך התהליכים של אנגיוגנזה וvasculogenesis לאורך התפתחות כלי דם בכליות. EPO הוא גליקופרוטאין כליות שמשחק תפקידים קריטיים בבידול אנדותל ותחזוקה. תפקידה בבידול האנדותל דם בתיווך הוא במידה רבה לא ידוע. לבסוף, ברצוננו לערוך ניסויים בmicroinjection vivo עם תרכובות התרחבות לחזק את תוקפו של חקירות אלה נוספים.

במהלך התפתחות עוברית שני תהליכים נפרדים, עדיין בו-זמנית, כלי דם יתקיימו: אנגיוגנזה, התהליך שבו גדל כלי מכלי שיט, וvasculogenesis גדולים קיימים מראש, שהוא במערך דה נובו של כלי מאבות אנדותל מגורים 1,2. בהתאמה, לשעבר הוא שם נרדף לזרימת דם, ואילו הוא חשב שהאחרון לקחת במידה רבה את המקום בהעדרו. במקביל להיווצרות כלי דם, תהליך מחזורי ודינמי של סינתזת אב כליות תא, התפשטות, ובידול מתחיל להתפתח ביום עוברי 9.5 (E9.5). בשלב זה ניצן ureteric (UB) פולש dorsally למקיף mesenchyme metanephric (MM), וממשיך עד לידת 3. חזר הסתעפות של UB למהירות עיבוי mesenchyme כובע metanephric מתחילה ההיווצרות של היחידות פונקציונליות של הכליות, נפרון. עם כל דור חדש של UB וnephרון, דורות מבוגרים הם עקורים לאזורים בקליפת המוח והלשדיים פנימיים, שבו הם לאחר מכן לעבור הבשלה והתמיינות נוספות בתוך סביבות בעיקר כלי דם צפופים. כפי שמעיד דרסלר et al. 3, תהליך עוברי זה, מוגבר על ידי איתות אינדוקטיביים, כגון crosstalk בין UB וMM, ומספר עצום של גורמים תאיים 3-6. שני גורמים שנחקרו לאחרונה תאיים בתוך לבלב הפיתוח וכליות כוללים מתח חמצן וזרימת דם 7,8. האחרון יידון בפירוט בהמשך ביחס לפיתוח כליות. על מנת לחשוף את התפקיד אינדוקטיביים שזרימת דם שעלול להיות משחקת בבידול אב נפרון תא, כמו גם בתהליכי organogenesis אחרים, שיטות מדויקות ומדויקות של זרימת דם מיפוי העוברי הוא הכרחי. שיטות חלופיות של מדידת זרימת דם כוללות את המרשם של ulההדמיה trasound ושרף מטילים 9,10. באופן חד משמעי, מצבים אלה הוכחו להיות מטבע חסר יכולתם לחשוף זמנית צירופים של זמן ומרחב בין זרימת דם וגזע התמיינות תאים. יציקות שרף, למשל, לספק מודל תקף של דפוסי כלי בתוך רקמות בוגרות, אולם בכלי בשלה, כמו עם נקודות זמן עובריים, כלים הם גס מפותחים ודולפים. לכן, שרף מטיל מצליח להחזיק בתוך כלי הזעירים, לעתים קרובות נקבוביים,. למכשולים נראות לעין אלה, בין יתר, בחרנו לשלב בmicroinjections vivo תוך-לב לקטינים עגבניות עובריים (TL) לחקירות של פיתוח כליות שלנו מונחה אולטרסאונד. בהליך זה אנו מנצלים בדיקה אולטרסאונד כדי להנחות את מחט micropipette רכובה מלאה 2.5 μl של פתרון TL לתוך החדר השמאלי של עכבר עובר בנקודות E11.5, E13.5, E15.5, וזמן E17.5 סינכרוני. E17.5 הוא הגיל ההתפתחותי האחרון כמחטים הן לא חזקות מספיק כדי לחדור את העובר מפותח יותר. היתרונות של שיטה זו הם בשפע microinjection. microinjection מודרך אולטראסאונד מאפשר מיקום מדויק של מחט זריקה בתוך החדר השמאלי העוברי, גירוש פסיבי ושליטה מלאה של פתרון ללב הפועם של בעלי החיים, נזק מינימאלי ללב ורקמות הסובבות, והימנעות מכישלון לב הפתאומי ומותו של עובר לפני זלוף גוף מלא. עם השימוש בTL FITC שכותרתו, כל כלי דם perfused ישמור את הסמן לאורך קרום פסגת אנדותל. בשילוב עם אימונוהיסטוכימיה, ניצול PECAM (CD31, מולקולת הידבקות תא אנדותל טסיות דם) וסמנים אחרים של כלי דם שונים, אנו יכולים להבחין בבירור בין כלי perfused ו- perfused un, כמו גם לאפיין כל כתמים חריגים של רקמות הסובבות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="981">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:300px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:292px;">Company</td>
			<td style="width:164px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:225px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DAPI</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>022M4004V</td>
			<td>concentration 1:5000</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pecam</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553370</td>
			<td>concentration 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FITC-Tomato Lectin</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>FL-1321</td>
			<td>concentration 2.5&#181;L / embryo</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alexa Fluor-594 (Donkey Anti-Rat )</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>712-585-150</td>
			<td>concentration 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microinjection Needle</td>
			<td>Origio Mid Atlantic Devices</td>
			<td>C060609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mineral Oil</td>
			<td style="width:292px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:164px;">BP26291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mL syringe</td>
			<td style="width:292px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:164px;">03-377-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;Clay Blocks</td>
			<td style="width:292px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:164px;">HR4-326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Surgical Tape</td>
			<td style="width:292px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:164px;">18-999-380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS</td>
			<td style="width:292px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:164px;">NC9763655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hair Removal Product</td>
			<td style="width:292px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:164px;">NC0132811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Surgical Scissors</td>
			<td style="width:292px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:164px;">14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fine Forceps</td>
			<td style="width:292px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:164px;">11064-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;Surgical Marking Pen</td>
			<td style="width:292px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:164px;">18000-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;Right angle forceps (for hysterectomy)</td>
			<td style="width:292px;">Fine Science tools</td>
			<td style="width:164px;">11151-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in utero intra-cardiac tomato-lectin injections on mouse embryos to gauge renal blood flow

ההיווצרות וזלוף, יצירת כלי דם כליות (מלבד glomeruli) הם understudied מאוד. ככלי דם מתפתח באמצעות אנגיוגנזה (שהוא מתפצלים כלי גדולים) וvasculogenesis (היווצרות כלי דה נובו), טכניקות מיפוי זלוף כגון יציקות שרף, in vivo הדמיה אולטרסאונד, ומיקרו לנתיחה היו מוגבלות במפגינות יחסים האינטימיים בין שני תהליכים אלו ומבני כליות מתפתחים בתוך העובר. כאן, אנו מתארים את ההליך של בmicroinjections הרחם תוך-לב מודרך-אולטרסאונד FITC שכותרתו עגבניות לקטינים בעוברי עכבר כדי לאמוד את ontogeny של פרפוזיה. קטיני עגבניות (TL) היה perfused לאורך העובר והכליות שנקטפו. רקמות שיתוף מוכתמות עבור מבנים שונים בכליות כוללים: אבות נפרון, מבני נפרון, האפיתל ureteric, וכלי דם. החל מ E13.5 כלי קליבר גדולים היו perfused, ציוד היקפי ואולםכלי נשארו unperfused. על ידי E15.5 וE17.5, כלי היקפיים קטנים, כמו גם glomeruli התחילו להיות perfused. טכניקה ניסויית זה היא קריטי ללימוד התפקיד של כלי דם וזרימת דם במהלך התפתחות עוברית.

היווצרות כלי דם מקדימה זרימה בפיתוח בכליות רוב הרקמות עובריים (כולל הכליות) מכיל כלי דם צפופים (שני unperfused וperfused), אפילו בנקודות זמן עובריים מוקדמות. כדי לאמוד ולנתח טובים יותר את זרימת דם בתוך הכליה הפיתוח אנו מנוצלים שיטה בmicroinjections intracardiac העוברי ברחם. עם השימוש באולטרסאונד ברזולוציה גבוהה כדי לזהות את הלב העוברי בE11.5 באמצעות E17.5, ולאחר המיצוי והחשיפה של שקיק רחם יחיד באמצעות laparotomy, שהיינו מסוגל להזריק 2.5 μl של TL (isothiocyanate והעמסת (FITC) -conjugated). מצאנו E13.5 הגדול ביותר להצלחת הזרקה וE15.5 נקודות זמן עוברית, עם שיעור הצלחה של כ ~ 80% עד 90%, בהתאמה. בגלל הנוכחות של לב יחסית בשלה בE11.5 והקיום של סחוס ועצם היווצרות צפוף בE17.5, ti הפריפריהשלי נקודות קשות יחסית להזריק, בהסתברות נמוכה באופן משמעותי להצלחה בהשוואה לנקודות זמן העוברית אמצע. ניתן לצפות לפחות ~ 50% ו~ שיעורי הצלחה של 30% עם נקודות E11.5 וזמן E17.5, בהתאמה. על ידי רקמת שיתוף עם תיוג PECAM (CD31), סמן אנדותל אוניברסלי, אנו יכולים לסווג איכותיים כלים ורקמות פלורסנט לשלוש קבוצות: כלי דם perfused (PECAM חיובי וTL חיובי), כלי דם unperfused (PECAM חיובי), וaberrantly perfused מבנים (TL חיובי). דפוס צביעה מיוחד זה מאפשר לנו להבחין במרחב שבין תחומי זלוף ובלתי-זלוף (איור 11). בE11.5, גילו שכלי perfused לתמצת את הכליות מתפתחות בדפוס-כמו אינטרנט מבלי לחדור לאיבר (איור 12 ב). על ידי E13.5, כלי גדולים היו perfused עם כמה קטן יותרכלי אבזר צביעה עם TL (12C איור). מכתים גם נצפו בחלק מאפיתל ureteric, זה יכול להיות גם מglomeruli שכבר perfused או עקב הדליפות הטבועות של כלי עובריים המוקדמים. על ידי E15.5 כלי גדולים היו perfused, אך מספר גדול של glomeruli יכול להיות גם ציין מחזיק את כתם TL, המצביע על כך סינון משמעותי מתרחש (איור 12D). גם בשלב זה להצביע על מספר כלי שיט בקוטר קטן יותר מופיעים perfused, למרות שחלק משמעותי מאזור nephrogenic החיצוני נראה נטול זרימת דם. לבסוף, לעומת זאת, על ידי E17.5 רוב הכליות היה perfused למעט כלי דם של אזור nephrogenic, שהוא ברובה נטול זלוף (אולם הצפוף בכלי חיוביים PECAM) ובכך מצביע על היעדר אנגיוגנזה באזורי פריפריה. כלי קליבר קטנים יותר להכיל TL והמספר הממוצע של glomeruli perfused יש באופן דרמטי במקומט בהשוואה לנקודות מוקדם יותר זמן (איור 12E). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52398/52398fig1.jpg" /> בדיקה איור 1. אולטראסאונד, שלב כירורגית, מערכת microinjection, מערכת רכבות, וערכת בסיסית עד א.ק.ג. / צג טמפרטורה. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52398/52398fig2.jpg" /> איור 2. ציוד הכרחי כירורגית, פתרונות, והתקנים. Applicators כותנה שקצה (). (ב) הרחבת מלקחיים (טבעת). (C) מספריים כירורגיות. שקצהו בלאנט (D) מלקחיים. (E) Fine מלקחיים. (F) Microinjection מחט (Origio, # C060609). (H) הזרקה / מלא בקר. (I) בופר פוספט (PBS). (J) שמן מינרלים (סיגמא אולדריץ &#39;). <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52398/52398fig3.jpg" /> איור 3. Laparotomy 2 סנטימטר מבוצע על אמא בהרדמה, וחושף את השכבה התת עורית (דופן בטן) מעל הרחם. ניצול המספריים כירורגיות ומלקחיים עדינים, לחשוף את alba linea ולעשות במקביל לקיצוץ חתך אפידרמיס. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52398/52398fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן ל להציג גרסה גדולה יותר של הדמות.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52398/52398fig4.jpg" /> איור 4. 1-2 saccules רחם E15.5 שהושג באמצעות חתך laparotomy וחשוף. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52398/52398fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה גדולה יותר</a>גרסה של הדמות. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/52398/52398fig5.jpg" /> saccules רחם איור 5. חשוף מודרך דרך חריץ בצלחת פטרי באמצעות מלקחיים fenestrated הארכה. Fenestrated meshing מושבי מלבב בבסיס של saccules. <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/52398/52398fig6.jpg" /> איור 6. קיר המכיל Blue ממוקם בצד הימין של saccules רחם. צלחת פטרי מלא 37 ° C PBS עד עוברים ומכיל קיר שקוע לחלוטין. בלוקים חימר ממוקמים באופן מאובטח תחת צלחת פטרי / עובר בין זרועות וגוף ורגליים וזנב. <img alt="איור 7" src="/files/ftp_upload/52398/52398fig7.jpg" /> איור 7. Positio מערכת ההזרקה<html> נד ½ סנטימטר בצד השמאל ולמטה, ו -90 מעלות לבדיקת אולטרסאונד. <img alt="איור 8" src="/files/ftp_upload/52398/52398fig8.jpg" /> איור 8. X שלב ומנגנוני התאמת Y. <img alt="איור 9" src="/files/ftp_upload/52398/52398fig9.jpg" /> איור 9. ריק / מלא מכשיר, מערכת microinjection, ולביים הר. (א) מלא כפתור. (ב) להזריק כפתור. כפתור כוונון זווית מחט עגולה (C). כפתור כוונון (E) Fine X. ידית (F) &quot;הזרקה&quot;. כפתור כוונון (G) הקורס X. (H) שלב מסתובב ידית כוונון גובה. <html> 98fig10.jpg &quot;/&gt; איור 10. תמונת אולטראסאונד של TL microinjection. קצה מחט התוך-לב E15.5 ממוקם בתוך תא לב, פתרון TL הוא הצביע על ידי צל שחור בתוך שני חדרים. קרום הלב וחלל קרום הלב נבדלים בקלות. <img alt="איור 11" src="/files/ftp_upload/52398/52398fig11.jpg" /> איור 11. תחומי בין זלוף, unperfusion, ומכתימים חריגים להבחין. הפנל הראשון מציג את כתם PECAM. הפנל באמצע מציג את כתם TL על אותו האזור בדיוק של רקמה. ניצן Ureteric הוא aberrantly צבעוני; כלי גדולים נארזים על ידי קווים מקווקווים לבנים. הפנל האחרון הוא המיזוג. חצים לבנים מצביעים על דליפת כלי, וחיצים אפורים להפגין מגמת מעבר לכלי הופך perfused. צהובים מבנים מייצגים כלי דם perfused באופן מלא.OAD / 52,398 52398fig11large.jpg &quot;target =&quot; / _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של הדמות. <img alt="איור 12" src="/files/ftp_upload/52398/52398fig12.jpg" /> איור העובר 12. וontogeny זלוף הכליות נחקר. (א) העובר E11.5 כולו הוא perfused, עם כלי מאוד היקפיים בתוך אזורי ראש והזנב מחזיקים TL. כלי (B) perfused נראו מסביב אבל לא שולבו בכליות מתפתחות בE11.5 בדפוס-כמו אינטרנט, יש גם כמות גדולה למדי של מכתים מפוזר בשלב זה. כליות (C) E13.5 תערוכות כלי גדולים, גדולים קליבר הם perfused ברחבי כליות (חץ לבן וצהוב), עם זלוף נעדר בתוך אזור nephrogenic (קו מקווקו לבן). כליות (D) E15.5 תערוכות זלוף ברחבי קליבר קטן, כלי היקפיים (חיצים צהובים),בחלק glomeruli (חצים לבנים), ושוב העדר זלוף באח כליות היקפי. כליות (E) E17.5 תערוכות זלוף ענקי בכל רחבי glomeruli (חצים לבנים) וכלי דם קטנים בקוטר (חיצים צהובים). אזור nephrogenic הוא נבדל משאר הכליות בהגדלה זה. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52398/52398fig12large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של הדמות.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Utero Intra-cardiac Tomato-lectin Injections on Mouse Embryos to Gauge Renal Blood Flow at JoVE.com

In Utero Intra-cardiac Tomato-lectin Injections on Mouse Embryos to Gauge Renal Blood Flow

This manuscript describes a technique for visualization of the developing vasculature. Here we utilized in utero intra-cardiac FITC-labeled tomato lectin microinjections on mouse embryos. Using this technique, we delineate the perfused and unperfused vessels throughout the embryonic kidney.

בזריקות עגבניות-לקטינים הרחם Intra-לב בעוברי עכבר כדי לאמוד את זרימת דם בכליות

The formation and perfusion of developing renal blood vessels (apart from glomeruli) are greatly understudied. As vasculature develops via angiogenesis ...

in-utero-intra-cardiac-tomato-lectin-injections-on-mouse-embryos-to

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Utero Intra-cardiac Tomato-lectin Injections on Mouse Embryos to Gauge Renal Blood Flow

9.6K Views.  Children's Hospital of Pittsburgh of UPMC. This manuscript describes a technique for visualization of the developing vasculature. Here we utilized in utero intra-cardiac FITC-labeled tomato lectin microinjections on mouse embryos. Using this technique, we delineate the perfused and unperfused vessels throughout the embryonic kidney.

Video: In Utero Intra-cardiac Tomato-lectin Injections on Mouse Embryos to Gauge Renal Blood Flow

Contrast Imaging in Mouse Embryos Using High-frequency Ultrasound

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted applications, facilitate the detection and measure of vascular biomarkers at the molecular level. Within the mouse embryo, this noninvasive technique may be used to uncover basic mechanisms underlying vascular development in the early mouse circulatory system and in genetic models of cardiovascular disease. The mouse embryo also presents as an excellent model for studying the adhesion of microbubbles to angiogenic targets (including vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR2) or &#945;v&#946;3) and for assessing the quantitative nature of molecular ultrasound. We therefore developed a method to introduce ultrasound contrast agents into the vasculature of living, isolated embryos. This allows freedom in terms of injection control and positioning, reproducibility of the imaging plane without obstruction and motion, and simplified image analysis and quantification. Late gestational stage (embryonic day (E)16.6 and E17.5) murine embryos were isolated from the uterus, gently exteriorized from the yolk sac and microbubble contrast agents were injected into veins accessible on the chorionic surface of the placental disc. Nonlinear contrast ultrasound imaging was then employed to collect a number of basic perfusion parameters (peak enhancement, wash-in rate and time to peak) and quantify targeted microbubble binding in an endoglin mouse model. We show the successful circulation of microbubbles within living embryos and the utility of this approach in characterizing embryonic vasculature and microbubble behavior.

Here, we present a protocol to inject ultrasound microbubble contrast agents into living, isolated late-gestation stage murine embryos. This method enables the study of perfusion parameters and of vascular molecular markers within the embryo using contrast-enhanced high-frequency ultrasound imaging.

הדמיה ניגודיות בעכבר עוברים באמצעות תדר גבוהים אולטראסאונד

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted ...

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical and molecular methods provides information of potential target genes and signaling pathways. To further elucidate specific regulatory mechanisms requires a system allowing the manipulation of only a small number of cells of a specific tissue by either overexpression, ablation or re-introduction of specific genes and follow their fate during development. To achieve this ex utero electroporation of hippocampal structures, especially the dentate gyrus, followed by organotypic slice culture provides such a tool. Using this system to generate mosaic deletions allows determining whether the gene of interest regulates cell-autonomously developmental processes like progenitor cell proliferation or neuronal differentiation. Furthermore it facilitates the rescue of phenotypes by re-introducing the deleted gene or its target genes. In contrast to in utero electroporation the ex utero approach improves the rate of successfully targeting deeper layers of the brain like the dentate gyrus. Overall ex utero electroporation and organotypic slice culture provide a potent tool to study regulatory mechanisms in a semi-native environment mirroring endogenous conditions.

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Here we present a protocol providing a tool to examine regulatory mechanisms of specific genes during hippocampal development. Employing ex utero electroporation and organotypic slice culture allows the up- and down-regulation of the expression of genes of interest in single cells and follow their fate during development.

Ex הרחם Electroporation וOrganotypic Slice תרבות של רקמות העכבר בהיפוקמפוס

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for embryo collection, immunofluorescence, imaging on a confocal microscope, and image segmentation and analysis are described. This method allows quantitation of the expression of multiple nuclear markers and the spatial (XYZ) coordinates of all cells in the embryo. It takes advantage of MINS, an image segmentation software tool specifically developed for the analysis of confocal images of preimplantation embryos and embryonic stem cell (ESC) colonies. MINS carries out unsupervised nuclear segmentation across the X, Y and Z dimensions, and produces information on cell position in three-dimensional space, as well as nuclear fluorescence levels for all channels with minimal user input. While this protocol has been optimized for the analysis of images of preimplantation stage mouse embryos, it can easily be adapted to the analysis of any other samples exhibiting a good signal-to-noise ratio and where high nuclear density poses a hurdle to image segmentation (e.g., expression analysis of embryonic stem cell (ESC) colonies, differentiating cells in culture, embryos of other species or stages, etc.).

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analysis of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for collection of blastocysts, whole-mount immunofluorescent detection of proteins, imaging of samples on a confocal microscope, and nuclear segmentation and image analysis are described.

ניתוח כמותי של ביטוי חלבון לחקר מפרט Lineage עכבר preimplantation עוברים

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene modification in preimplantation embryos provides a means to study the underlying mechanisms of genes implicated in, for instance, cellular differentiation into the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM). Here, we describe a protocol that examines the role of neogenin as an authentic receptor for initial cell fate determination in preimplantation mouse embryos. First, we discuss the experimental manipulations that were used to produce gain and loss of neogenin function by microinjecting neogenin cDNA and shRNA; the effectiveness of this approach was confirmed by a strong correlation between the pair-wise expression levels of either red fluorescent protein (RFP) or green fluorescent protein (GFP) and the immunocytochemical quantification of neogenin expression. Secondly, overexpression of neogenin in preimplantation mouse embryos leads to normal ICM development while neogenin knockdown causes the ICM to develop abnormally, implying that neogenin could be a receptor that relays extracellular cues to drive blastomeres to early cell fates. Given the success of this detailed protocol in investigating the function of a novel embryonic developmental stage-specific receptor, we propose that it has the potential to aid in exploration and identification of other stage-specific genes during embryogenesis.

The goal of this protocol is to describe a loss- and gain-of function method that is applicable to identify neogenin as a stage-specific receptor that leads to trophectoderm and inner cell mass differentiation in preimplantation mouse embryos.

Loss- ו-של-פונקצית רווח גישה לחקר תא מוקדם קובעי גורל preimplantation עכבר עובר

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

Structure-function Studies in Mouse Embryonic Stem Cells Using Recombinase-mediated Cassette Exchange

Gene engineering in mouse embryos or embryonic stem cells (mESCs) allows for the study of the function of a given protein. Proteins are the workhorses of the cell and often consist of multiple functional domains, which can be influenced by posttranslational modifications. The depletion of the entire protein in conditional or constitutive knock-out (KO) mice does not take into account this functional diversity and regulation. An mESC line and a derived mouse model, in which a docking site for FLPe recombination-mediated cassette exchange (RMCE) was inserted within the ROSA26 (R26) locus, was previously reported. Here, we report on a structure-function approach that allows for molecular dissection of the different functionalities of a multidomain protein. To this end, RMCE-compatible mice must be crossed with KO mice and then RMCE-compatible KO mESCs must be isolated. Next, a panel of putative rescue constructs can be introduced into the R26 locus via RMCE targeting. The candidate rescue cDNAs can be easily inserted between RMCE sites of the targeting vector using recombination cloning. Next, KO mESCs are transfected with the targeting vector in combination with an FLPe recombinase expression plasmid. RMCE reactivates the promoter-less neomycin-resistance gene in the ROSA26 docking sites and allows for the selection of the correct targeting event. In this way, high targeting efficiencies close to 100% are obtained, allowing for insertion of multiple putative rescue constructs in a semi-high throughput manner. Finally, a multitude of R26-driven rescue constructs can be tested for their ability to rescue the phenotype that was observed in parental KO mESCs. We present a proof-of-principle structure-function study in p120 catenin (p120ctn) KO mESCs using endoderm differentiation in embryoid bodies (EBs) as the phenotypic readout. This approach enables the identification of important domains, putative downstream pathways, and disease-relevant point mutations that underlie KO phenotypes for a given protein.

Proteins often contain multiple domains that can exert different cellular functions. Gene knock-outs (KO) do not consider this functional diversity. Here, we report a recombination-mediated cassette exchange (RMCE)-based structure-function approach in KO embryonic stem cells that allows for the molecular dissection of various functional domains or variants of a protein.

מחקרי מבנה-תפקוד תאי גזע עוברי עכבר שימוש recombinase בתיווך Exchange קסטה

Gene engineering in mouse embryos or embryonic stem cells (mESCs) allows for the study of the function of a given protein. Proteins are the workhorses of ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is the formation of the transient organizers, the node and notochordal plate, from cells that have passed through the primitive streak. The proper formation of these signaling centers is essential for the development of the body plan and techniques to visualize them are of high interest to mouse developmental biologists. The node and notochordal plate lie on the ventral surface of gastrulating mouse embryos around embryonic day (E) 7.5 of development. The node is a cup-shaped structure whose cells possess a single slender cilium each. The proper subcellular localization and rotation of the cilia in the node pit determines left-right asymmetry. The notochordal plate cells also possess single cilia albeit shorter than those of the node cells. The notochordal plate forms the notochord which acts as an important signaling organizer for somitogenesis and neural patterning. Because the cells of the node and notochordal plate are transiently present on the surface and possess cilia, they can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Among other techniques used to visualize these structures at the cellular level is whole mount immunofluorescence (WMIF) using the antibodies against the proteins that are highly expressed in the node and notochordal plate. In this report, we describe our optimized protocols to perform SEM and WMIF of the node and notochordal plate in developing mouse embryos to help in the assessment of tissue shape and cellular organization in wild-type and gastrulation mutant embryos.

The node and notochordal plate are transient signaling organizers in developing mouse embryos that can be visualized using several techniques. Here, we describe in detail how to perform two of the techniques to study their structure and morphogenesis: 1) scanning electron microscopy (SEM); and 2) whole mount immunofluorescence (WMIF).

להמחיש את צומת ואת צלחת Notochordal Gastrulating עוברי העכבר באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה כל הר Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by Sertoli cell junctions at the blood-testis barrier (BTB), which is the tightest tissue barrier in the mammalian body and segregates the seminiferous epithelium into two compartments, a basal and an adluminal. The BTB creates a unique microenvironment for germ cells in meiosis I/II and for the development of postmeiotic spermatids into spermatozoa via spermiogenesis. Here, we describe a reliable assay to monitor BTB integrity of mouse testis in vivo. An intact BTB blocks the diffusion of FITC-conjugated inulin from the basal to the apical compartment of the seminiferous tubules. This technique is suitable for studying gene candidates, viruses, or environmental toxicants that may affect BTB function or integrity, with an easy procedure and a minimal requirement of surgical skills compared to alternative methods.

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Here, we present a protocol to assess the blood-testis barrier integrity by injecting inulin-FITC into testes. This is an efficient in vivo method to study blood-testis barrier integrity that can be compromised by genetic and environmental elements.

שיטת In Vivo ללמוד העכבר דם Testis מכשול שלמות

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational health hazard. Here, we demonstrate the exposure of primary stem cells from the mouse ocular surface to UV-C radiation. Reactive oxygen species (ROS) formation is the readout of the extent of oxidative stress/damage. In an experimental in vitro setting, it is also essential to assess the percentage of dead cells generated due to oxidative stress. In this article, we will demonstrate the 2&#39;,7&#39;-Dichlorofluoresceindiacetate (DCFDA) staining of UV-C exposed mouse primary ocular surface stem cells and their quantification based on the fluorescent images of DCFDA staining. DCFDA staining directly corresponds to ROS generation. We also demonstrate the quantification of dead and live cells by simultaneous staining with propidium iodide (PI) and Hoechst 3332 respectively and the percentage of DCFDA (ROS positive) and PI positive cells.

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

This protocol demonstrates the simultaneous detection of reactive oxygen species (ROS), live cells, and dead cells in live primary cultures from mouse ocular surface cells. 2&#39;,7&#39;-Dichlorofluoresceindiacetate, propidium iodide, and Hoechst staining are used to assess the ROS, dead cells, and live cells, respectively, followed by imaging and analysis.

הערכה של נזק חמצוני בעכבר הראשי פני השטח העינית/תאים גזע בתגובה אולטרה סגול (UV-C) נזק

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in zebrafish during different developmental stages. To investigate the role of endoglin(eng) in vessel formation during the development of hereditary hemorrhagic telangiectasia&#160;(HHT), morpholino-mediated targeted knockdown of eng in zebrafish are used to study its temporal expression and associated functions. Here, whole-mount in situ RNA hybridization (WISH) is employed for the analysis of eng and its downstream genes in zebrafish embryos. Also, tube formation assays are performed in HHT patient-derived induced pluripotent stem cell-differentiated&#160;endothelial cells (iPSC-ECs; with eng mutations). A specific signal amplifying system using the whole amount In Situ Hybridization &#8211; WISH provides higher resolution and lower background results compared to traditional methods. To obtain a better signal, the post-fixation time is adjusted to 30 min after probe hybridization. Because fluorescence staining is not sensitive in zebrafish embryos, it is replaced with diaminobezidine (DAB) staining here. In this protocol, HHT&#160;patient-derived iPSC lines containing an eng mutation are differentiated into endothelial cells. After coating a plate with basement membrane matrix for 30 min at 37 &#176;C, iPSC-ECs are seeded as a monolayer into wells and kept at 37 &#176;C for 3 h. Then, the tube length and number of branches are calculated using microscopic images. Thus, with this improved WISH protocol, it is shown that reduced eng expression affects endothelial progenitor formation in zebrafish embryos. This is further confirmed by tube formation assays using iPSC-ECs derived from a patient with HHT. These assays confirm the role for eng in early vascular development.

Presented here is a protocol for whole-mount in situ RNA hybridization analysis in zebrafish and tube formation assay in patient-derived induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells to study the role of endoglin in vascular formation.

הר שלם בתוך היברידיזציה ב-Zebrafish עוברים ושיטת היווצרות צינור ב-iPSC-ECs ללמוד את התפקיד של אנגלין בפיתוח כלי דם

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Using Flow Cytometry to Detect and Quantitate Altered Blood Formation in the Developing Zebrafish

The diversity of cell lineages that comprise mature blood in vertebrate animals arise from the differentiation of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs). This is a critical process that occurs throughout the lifespan of organisms, and disruption of the molecular pathways involved during embryogenesis can have catastrophic long-term consequences. For a multitude of reasons, zebrafish (Danio rerio) has become a model organism to study hematopoiesis. Zebrafish embryos develop externally, and by 7 days postfertilization (dpf) have produced most of the subtypes of definitive blood cells that will persist for their lifetime. Assays to assess the number of hematopoietic cells have been developed, mainly utilizing specific histological stains, in situ hybridization techniques, and microscopy of transgenic animals that utilize blood cell-specific promoters driving the expression of fluorescent proteins. However, most staining assays and in situ hybridization techniques do not accurately quantitate the number of blood cells present; only large differences in cell numbers are easily visualized. Utilizing transgenic animals and analyzing individuals with fluorescent or confocal microscopy can be performed, but the quantitation of these assays relies on either counting manually or utilizing expensive imaging software, both of which can make errors. Development of additional methods to assess blood cell numbers would be economical, faster, and could even be automated to quickly assess the effect of CRISPR-mediated genetic modification, morpholino-mediated transcript reduction, and the effect of drug compounds that affect hematopoiesis on a large scale. This novel assay to quantitate blood cells is performed by dissociating whole zebrafish embryos and analyzing the amount of fluorescently labelled blood cells present. These assays should allow elucidation of molecular pathways responsible for blood cell generation, expansion, and regulation during embryogenesis, which will allow researchers to further discover novel factors altered during blood diseases, as well as pathways essential during the evolution of vertebrate hematopoiesis.

This assay is a simple method to quantitate hematopoietic cells in developing embryonic zebrafish. Blood cells from dissociated zebrafish are subjected to flow cytometry analysis. This allows the detection of blood defects in mutant animals and after genetic modification.

שימוש בציטומטריית זרימה כדי לזהות ולכמת היווצרות דם שהשתנתה בדגי הזברה המתפתחים

The diversity of cell lineages that comprise mature blood in vertebrate animals arise from the differentiation of hematopoietic stem and progenitor cells ...