NSF-MRI 프로그램 (CHE : 1229103)는 새로운 전자 제어 장치, 소프트웨어, 액체 세포 및 이중 AFM / STM을 조립하는 데 필요한 다른 장비의 구입 자금을 인정한다. 우리는 AFM 계측, 교육 및 영상에 대한 지원은 시카고 NSF-MRSEC 프로그램의 대학 (DMR-0820054)의 공용 시설을 인정하고 악기 시간 동안 재료 연구 시설 네트워크 (DMR은-0820054)에 의해 제공. 우리는 특히 우리의 캠퍼스에 필요한 장비를 가져 NSF-MRI 제안의 자금 전에 학생들을 환영 박사 Qiti 구오 박사 저스틴 Jureller, 교수 카 유 리 감사합니다. 소모품 공급을위한 여름 연구 학생 및 교직원에 대한 생활비 지원뿐만 아니라 제공하는 노스 이스턴 일리노이 대학에게 수여 : (P031C110157 ID) 우리는 제목 III STEM 기금에서 자금을 인정합니다. 마지막으로, 우리는 계속 악기 지원 및 R에 대한 허가를 브루 커 (Bruker) 나노, 주식을 인정PeakForce QNM의 메커니즘을 보여주는 플롯을 eproduce 및 자동 소프트웨어 업데이트를 설명하는 단어 ScanAsyst을 사용합니다.

1 컴퓨터 및 현미경 설정 <ol><li> N 2 실린더의 밸브를 열고 공기 테이블이 부동 레벨 확인하기 위해 노브를 조정합니다. </li><li> 이 순서에서 컴퓨터, 컨트롤러 및 파이버 광섬유 조명을 켜십시오. </li><li> AFM / LFM 모드로 스캐너를 설정하고 AFM의 머리에 카메라를 중심으로. </li><li> 오픈 소프트웨어입니다. 선택 실험 카테고리 &quot;나노 기계 속성&quot;, 실험 그룹에서 &quot;양적 나노 기계 매핑&quot;, 그리고 실험에서 &quot;유체의 PeakForce QNM&quot;. 부하 실험 한 다음 설정을 클릭합니다. </li><li> 스테이지의 표면을 볼 Z 목적을 사용 카메라 초점. / 아래로 거친을 사용 피에조 약 1mm AFM 헤드 구경의 표면 아래의 단계를 이동합니다. </li></ol> 운모 표면의 2 준비 <ol><li> 깨끗한 샘플지지 디스크 (직경 15 mm, 두께 0.8 mm)의 표면에 접착 스티커를 누른다. 운모 V-4를 밀어접착제 위에 등급 디스크 (25 X 25 X 26mm)가 단단히 연결까지. </li><li> 완전히 공기 방울이와 함께 부착 보장 운모에 명확한 테이프의 조각을 문질러. 균등을 절단 한 측에서 운모 오프 테이프를 당깁니다. 운모는 평평 보장하기 위해 필요한 경우 반복합니다. </li><li> 그립지지 디스크, 원형 핀셋 (디스크 그리퍼)의 쌍 정리 운모 측, 및 스캐너에 놓는다. 운모는 AFM 헤드 개구의 레벨 이하이어야한다. </li></ol> 3 유체 셀 조립 및 운모 표면의 영상 <ol><li> 액체 셀, O-링, 주사기 어댑터, 호스 어댑터, 및 100 % 에탄올 토출 호스 린스. DI 물 내의 유체 세포를 씻어. 모든 부분의 공기가 완전히 건조한 상태가되도록하십시오. </li><li> 깨끗한 유체 셀 포트에 호스 어댑터를 밀어 넣습니다. 부드럽게 플랫 향하고 핀셋을 사용하여 유체 셀의 중심에 압입 O-링을 누른다. </li><li> 프로브 고정 클립을 살짝 봄을 누르고 groov에서 멀리십시오팁을위한 전자. </li><li> 평면 향하고 핀셋으로 멀리 끝에서 긴 끝에 프로브를 잡고. 셀의 중심에 대향하는 선단부와 그루브로 프로브를 배치했다. 에 스프링을 밀어하고 (그림 1B)를 확보하기 위해 프로브를 통해 고정 클립을 조정합니다. </li><li> 완전히 (그림 1C) 들어 갔는지 확인하기 위해 AFM에 클램프를 확인합니다. </li><li> 유체 셀, O-링을 놓고 운모 샘플의 상단에, 아래로 향 프로브. 유체 셀이 AFM의 스터드에 휴식을 허용합니다. 무대에서 유체 셀을 안정시키기 위해 클램프를 낮 춥니 다. 육안 검사가 제대로 지원 디스크와 유체 셀 사이에 압축 된 O-링 표시 될 때까지 현미경의 아래쪽 스위치를 누르십시오. </li><li> 모니터를 보면서, 화면 유체 셀의 상단을 시각화하는 거친 조정 노브 초점. </li><li> X / Y 조절 노브와 Z를 사용하여 목적 팁의 선명한 화상이있을 때까지 이동을 현미경. 팁 앱합니다금속, 황금 삼각형과 같은 귀. 현미경 아래 피에조 레버를 이용하여 시료 표면에 가까운 선단을 이동. 팁의 반사에 초점을 맞 춥니 다. 그것의 반사의 관계에서 실제 캔틸레버를 추적. 이 단계에서, 이들은 밀접하게 정렬되지만 완전히 겹치지 않는한다. </li><li> 멸균 한 ML의 주사기에 주사기 어댑터를 연결합니다. 주사기 어댑터 토출 호스의 일단을 부착하고 완충 용액 용기에 호스의 타 단부를 배치했다. 완전히 주사기의 플런저를 확장 할 수 있습니다. </li><li> 유체 셀 호스 어댑터에 호스를 연결합니다. 유체가 완전히 중심 챔버를 채울 때까지 부드럽게 플런저를 누릅니다. 기포가없는 보장하기 위해 셀을 확인합니다. 현미경에 유체 셀에서 쏟아져에는 유체가없는 확인하십시오. 제기 고체 지지체에 주사기를 놓습니다. </li><li> 화면의 레이저 (확산 빨간 점)을 찾기 위해 카메라 공급 및 X / Y 번역 노브를 사용합니다. 레이저 movem 사용엔트 컨트롤 노브는 팁에 레이저를 이동합니다. </li><li> (- 6 값 = 4) 현미경에 표시 합 신호가 최대가 될 때까지 미세 레이저 및 미러 컨트롤을 조정합니다. </li><li> (± 0.1) 가능한 제로에 가깝도록 현미경에 표시 수직 및 수평 편향을 낮출 좌측 후방 측면에 노브와 주사 헤드의 상단 왼쪽 사분면을 사용 다이오드의 각도를 조정한다. </li><li> 소프트웨어에서 취득 옵션을 선택합니다. 최소 선택 높이 (추적 및 트레이스), 최대 힘의 오류 및 변형에서. 다른 옵션은 사용자 종속적이며 실험가가 원하는 특정 정보에 기초하여 맞추어 질 수있다. </li><li> 각 획득 창에서 RT 비행기 맞추기위한 &quot;라인&quot;을 선택합니다. 높이 창에서 OT 평면 맞추기위한 &quot;없음&quot;을 선택합니다. 아직 수행되지 않은 경우 X 및 Y는 0으로 오프셋 및 주사 각도를 설정한다. </li><li> 1 Hz에서, 256 라인 당 샘플, ScanAsyst 자동 제어에 스캔 속도를 설정개인, Off로 ScanAsyst 자동 Z 한계. 500 nm의 Z 제한을 변경합니다. 1 μm의 스캔 크기를 설정합니다. </li><li> 참여를 클릭합니다. 이 시점에서, 팁 표면에 접근한다. 선단이 접근되는 동안 화면의 좌측 하단에 Z 압전 전압 변화를 관찰한다. 팁이 범위를 벗어날 경우, 팁 재 접근을 철회. 이것이 실패 할 경우, 팁은 성공적인 접근을 위해 변경 될 필요가있다. 끝이 종사되면, 라인은 이미지를 구성 할 것이다 취득 각 창에 표시하기 시작합니다. </li><li> 1 × 1 μm의에서 운모의 이미지를 가지고 운모 표면이 깨끗하고 평평한 지 확인하기 위해 천천히 확대합니다. 그들이 나타나는 이미지를 저장하기 위해 연속 캡처를 클릭합니다. 확대하고 필요에 따라 표면을 이동. </li></ol> (4) 단백질 증착 및 이미지에 대한 샘플의 준비 <ol><li> 정제 된 단백질 샘플 (38)을 확보하고 얼음에 보관하십시오. 냉동실에 저장하는 경우에 샘플을 해동5 분 동안 얼음. </li><li> / ㎖ 냉장 사용해서 촬상 완충액 0.0010 mg의 단백질을 희석. 여기에 사용되는 촬상 버퍼는 15 mM 트리스 - 염산 (pH가 8.0), 150 mM의 염화나트륨, 15 mM의 MgCl2를이다. </li><li> 4 챔버 (100 × 15mm) 냉장 영상 완충 용액과 페트리 접시를 채 웁니다. 용액의 적어도 5 ㎖로 각 챔버를 입력합니다. 부드럽게 micropipettor 부착 팁 희석 된 단백질 용액을 혼합한다. </li><li> 이미 준비 운모의 표면에 희석 된 단백질 용액 200 μl를 적용합니다. 30 초 후, 원형 핀셋 (디스크 그리퍼)와 단백질 / 운모 표면을 픽업. 실험실 벤치에 샘플 병렬를 잡습니다. </li><li> 샘플 채 시료가 페트리 접시의 분지에 평행 한 것을 보장하면서, 즉시 페트리 접시 (단계 4.2)의 제 1 사분면에 포함 된 완충 용액에서 샘플을 담가. 1 초 후, 샘플을 제거합니다. </li><li> 분지에 샘플 평행을 유지하도록 계속페트리 접시에, 나머지 세 사분면에 대한 4.5 단계를 반복합니다. </li><li> 여분의 수분을 흡수하고, 현미경의 무대에 디스크를 전송하는 마른 먼지 천에 디스크를 넣습니다. 천으로 실제 표면을 만지지 마십시오. 샘플이 건조하지 않도록하십시오. </li><li> 3.16 - 반복 3.6 단계를 반복합니다. </li></ol> 운모에 5 이미징 단백질 <ol><li> 화면의 왼쪽에있는 체크 박스 파라미터 클릭. 스프링 크기 및 팁 반경은 팁이 사용에 기초하여 설정한다. </li><li> 참여를 클릭합니다. 마찬가지로 운모 촬상 처리 (단계 3.17)에, 선단 접근을 Z-피에조 윈도우를 관찰한다. </li><li> 적어도 두 개의 연속적인 패스에 대한 이미지 스캐너에게 동일한 영역을 허용합니다. 수집 된 각각의 이미지를 저장하기 위해 연속 캡처를 클릭합니다. </li><li> 새로운 영역에 스캐너를 이동 및 / 또는 원하는대로 이미지 크기를 변경합니다. </li><li> 자동화 된 소프트웨어는 조정 완료 후스캔 파라미터들은 특정 이미지 사이즈, 소프트웨어를 해제. </li><li> 수동으로 미세 조정하기 위해 이미지의 초점을 스캔 속도, z는 한계, 행수, 및 전압을 조절한다. 이미지가 너무 초점이 될 경우, 원래의 시작 위치를 반환 다시 소프트웨어를 켭니다. 단백질을 확대하면서 화상의 해상도를 증가시키기 위하여, 주사 속도를 감소 비례 라인의 수를 증가시킨다. </li><li> 실험 후, 100 % 에탄올로 액체 셀을 청소하고 DI H 2 O. 씻어 액체 셀에 완전히 건조 허용합니다. </li><li> 원시 이미지 데이터를 처리하는 데이터 소프트웨어를 연다. 첫째, 패턴 화 된 아이콘을 클릭하여 이미지를 평평하게. 주문 번째 제로를 선택하고 실행을 클릭합니다. 이미지에 따라, 평면 맞는 적절한 평면 화상을 얻을 필요가있다. 이 경우, 평면 맞는 아이콘을 선택하고 커서를 이용하여 화상의 평탄한 영역의 평면을 그린다. 실행을 클릭합니다. 필요한만큼 반복 </li><li> 셀프요법 단면 탭 단백질의 치수를 측정한다. 커서를 라인 분석 할 수있는 분자 또는 지역에 이동립니다. 여러 영역에 대해 반복하고 소프트웨어 오버레이를 생성합니다. 그림 또는 다른 소프트웨어 프로그램에 대한 도면과 호환 형식으로 영상을 생성하는 데 사용되는 데이터를 내보낼. </li></ol>

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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-guided+engineering+enhances+a+phytochrome-based+infrared+fluorescent+protein.">Structure-guided engineering enhances a phytochrome-based infrared fluorescent protein.</a> J. Biol. Chem. 287, 7000-7009 (2012).</li><li>Toh, K. C., Stojkovic, E. A., van Stokkum, I. H., Moffat, K., Kennis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proton-transfer+and+hydrogen-bond+interactions+determine+fluorescence+quantum+yield+and+photochemical+efficiency+of+bacteriophytochrome.">Proton-transfer and hydrogen-bond interactions determine fluorescence quantum yield and photochemical efficiency of bacteriophytochrome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 107, 9170-9175 (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Pymol+Molecular+Graphic+System+v.1.5.0.1.">The Pymol Molecular Graphic System v.1.5.0.1.</a> , .</li><li>Yang, X., Stojkovic, E. A., Kuk, J., Crystal Moffat, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=structure+of+the+chromophore+binding+domain+of+an+unusual+bacteriophytochrome,+RpBphP3,+reveals+residues+that+modulate+photoconversion.">structure of the chromophore binding domain of an unusual bacteriophytochrome, RpBphP3, reveals residues that modulate photoconversion.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 12571-12576 (2007).</li><li>Yang, X., Kuk, J., Moffat, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+Pseudomonas+aeruginosa+bacteriophytochrome:+photoconversion+and+signal+transduction.">Crystal structure of Pseudomonas aeruginosa bacteriophytochrome: photoconversion and signal transduction.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 14715-14720 (2008).</li><li>Woitowich, N. K., Garrido, C., Ozarowski, W., Stojkovic, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preliminary+X-ray+Crystallographic+and+Structural+Analyses+of+a+Bacteriophytochrome+from+Stigmatella+aurantiaca.">Preliminary X-ray Crystallographic and Structural Analyses of a Bacteriophytochrome from Stigmatella aurantiaca.</a> The FASEB Journal. 25, 928 (2011).</li><li>Wagner, J. R., Zhang, J., Brunzelle, J. S., Vierstra, R. D., Forest, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+structure+of+Deinococcus+bacteriophytochrome+yields+new+insights+into+phytochrome+architecture+and+evolution.">High resolution structure of Deinococcus bacteriophytochrome yields new insights into phytochrome architecture and evolution.</a> J. Biol. Chem. 282, 12298-12309 (2007).</li><li>Wagner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutational+analysis+of+Deinococcus+radiodurans+bacteriophytochrome+reveals+key+amino+acids+necessary+for+the+photochromicity+and+proton+exchange+cycle+of+phytochromes.">Mutational analysis of Deinococcus radiodurans bacteriophytochrome reveals key amino acids necessary for the photochromicity and proton exchange cycle of phytochromes.</a> J. Biol. Chem. 283, 12212-12226 (2008).</li></ol>

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AFM은 생리 학적 조건에서 중요한 단백질 및 다른 생체 고분자를 충분히 촬상 할 수있는 주사 탐침 현미경 방법이다. X-선 결정학 및 NMR 비교하여, AFM의 한 가지 제한은 동일한 해상도, 특히 측 방향 해상도를 달성 할 수 없다는 점이다. 모든 표면에 분자를 분석하는 AFM을 이용하면 데이터를 분석 할 때, 분자의 이미지 표면의 영향과 프로브도 고려되어야한다. 획득 된 이미지 프로브의 영향 Deconvoluting 적절한 소프트웨어를 완료 할 수있다. 실험 결과를 비교하는 이론적 모델을 개발하는 것은 또한 매우 유용하다는 것을 증명할 수 있습니다. 본 논문에서는 세균 붉은 빛이 광 수용체, RpBphP3 (P3)의 AFM 이미지 (그림 3)되게됩니다. 현미경 조립체 및 소프트웨어 동작의 설명에 채용 된 특정 악기 모델에 고유하지만, 운모단백질 샘플 준비 절차는 일반적이며 어떠한 AFM 실험에 적용될 수있다. 이 프로토콜의 몇 가지 중요한 단계는 운모 표면에 원하는 단백질 커버리지를 획득하기 위해 따라야한다. 이 운모 표면 (단계 4.3)에 적용되기 전에 먼저, 희석 된 단백질 용액을 부드럽게 혼합해야한다. 때문에 P3의 고 분자량으로, 증착은 매우 콜로이드 용액이고; 따라서, P3는 용액이 불균일하게 시간에 따른 튜브의 바닥에 침전한다. 부드러운 볶음 요법이 문제를 해결합니다. 단백질이 적용되면 둘째, 표면은 느슨하게 결합 된 분자 (- 4.6 단계 4.5)를 제거하기 위해 세척해야합니다. 느슨하게 구속 P3가 표면 상에 남아 있으면 액체 셀 완충액 충전 및 / 또는 실험 과정 AFM 프로브에 의해 촬상 될 때, 분자 중 용액으로 방출된다. 이들 이벤트 모두 성공적인 촬상 실험을 방해. 만약액체 셀 P3로 오염되고, 그 분해되어야하고 철저히 세척. AFM 프로브 분자를 픽업하면, 일반적으로 교체해야하거나 화질이 희생된다. 마지막으로, 단백질 시료를 세척하는 방법은 우수한 화상을 얻는데 중요하다. 운모는 P3에 비 선택 표면이고; 따라서, 임의로 분자 배향하는 것으로한다. 프로토콜에서 설명 헹굼 방법은 하나의 방향으로 표면에 분자를 재배 열하 피하는 하나의 방법이다. 키는 항상 젖은 샘플을 유지하고 각도로 표면을 잡고 그대로 버퍼 표면을 분사하지 않도록하는 것이다. 시료가 페트리 접시의 분지 평행 채 침지하여 세정하는 경우, 완충액의 강제 전류에 의해 표면에 P3의 왜곡이 최소화된다. 액상 세포 검사, 스캐너, 광학 헤드 부분 모두 매우 섬세하고주의하여 취급해야합니다. sprin스캐너와 광학 머리를 잡아 GS 함께 매우 강하다. 그것은 조립 또는 조각 중 하나를 분해는 스캐너에 손을 유지하기 위해 필수적입니다. 프로토콜에 설명 된대로 원래 스캔 크기가 1 μm의 (단계 3.16) 인 경우 ScanAsyst 소프트웨어 PF-QNM 들어, 이는 Z-제한 자동화 소프트웨어 제어를 해제하고, 적어도 500 nm의이 값을 설정하는 것이 필수적이다 . 이것은 표면이 예기치 않게 거친되었다 또는 오염 될 경우 스캐너를 보호합니다. 하나의 이미지가 수집되었고이를 영상화 영역이 평활 확인되면, Z-한계는 더 높은 해상도의 이미지를 달성하기 위해 하방으로 수동으로 조정될 수있다. 이 스캐너가면의 새로운 영역으로 이동할 때 또는 끝이 어떤 이유로 후퇴하면, 적어도 500 nm의 Z-다시 제한 재조정하는 것이 중요하다. 이 논문은 고품질 지형 이미지를 얻기 위해 PF-QNM 사용에 집중 하였지만,이 방법은 그 자체를 제공 할 수있다기계적 강도와 표면 구조의 유연성에 대한 추가 정보 도서관. 이 기능은 단순히 실험 기간 동안 해당 채널을 선택하여 기능에 대한 자세한 통찰력으로 이어질 수 있습니다. (16, 18)을 증착 솔루션 및 / 또는 표면의 농도를 적절하게 변경으로,이 방법은 조사 PF-QNM을 사용하는 일반적인 될 수 있습니다 액체 셀 AFM에 의해 생체 고분자. 소프트웨어의 자동화 도움으로, AFM 아니 이전에 경험이있는 상위 수준의 과학 수업에서 학생들은 기존의 태핑 모드 AFM보다 훨씬 빠르게 액체 셀 AFM 실험을 완료 할 수 있습니다. 학생들은 AFM의 기초를 경험하고 일반적인 3에서이 강력한 기술에 의해 가능하게 학제 간 연구의 맛을 얻을 수 있습니다 - 4 시간 실험실 섹션 시간 제약.

원자력 현미경 (AFM)은 1986 년 발명 (도 1) 이후 표면 박막 및 단일 분자의 구조 및 기계적 특성을 조사하기위한 매우 중요한 도구가되고있다. 1-3 액정 셀을 사용하여, 상기 방법은 보유 생리 학적으로 관련 환경에서 생체 고분자의 연구에도 살아있는 세포에 특히 유용해진다. AFM 전통적 접촉 모드 AFM 때문에, 부드러운 물질 또는 표면에 느슨하게 구속 분자 이미징에 사용되어 4-10 탭핑 모드 인해 일반적 부적합 횡력에 의한 피해에 캔틸레버하여 샘플에 가해진. 11 태핑 모드 AFM은 실질적으로 끝이 간헐적으로 표면을 만지지 가진보다는 일정한 접촉하는 이러한 힘을 감소시킨다. 이 모드에서는, 캔틸레버 또는 표면에 수직의 공진 주파수 근처에서 발진된다. 마찬가지로 AFM 모드를 연락하는 지형 항문이다XY (거리)의 함수로서 Z-피에조의 이동을 플롯하여 yzed. 캔틸레버 역학 또는 공진 근처에 매우 불안정 할 수 있습니다; 따라서, 그들은 &quot;정상 상태&quot;상황 밖에서 자동화 매우 도전적이다. 특히 이러한 역학 샘플 특성과 스캔 환경 모두에 따라 달라집니다. 하드 (어) 표면에 흡착 부드러운 분자를 들어, 분자 잘 조정 피드백 루프는 표면에 대한 피드백 진동의 원인이됩니다. 상기 작동 유체는 캔틸레버의 튜닝을 복잡. 온도 나 유체 수준의 변화는 세트 포인트, 이익, 및 기타 영상 매개 변수의 일정 재조정이 필요합니다. 이러한 조정은 매우 시간 소모적이고 누구나 도전을 경향이있다. 피크 포스 양적 나노 기계 속성 매핑 (PF-QNM)는, 모드 AFM을 눌러처럼 간헐적으로 샘플 (그림 2)에 연락하여 측면의 상호 작용을 방지 할 수 있습니다. 12-15 &lt;/ SUP&gt; 그러나, PF-QNM 비 공진 모드 및 태핑 모드 AFM보다 훨씬 낮은 주파수에서 작동합니다. 이것은 탭핑 모드 AFM, 유체의 존재에 의해 악화 특히 튜닝의 과제를 제거한다. PF-QNM을 선택하면 이미지가 접촉의 모든 지점에서 힘 응답 곡선을 복용에 의해 수집됩니다. ScanAsyst 소프트웨어의 추가로, 주사 파라미터 조정 (15)는 자동화 될 수 있고, 높은 해상도 이미지에도 경험이없는 사용자에 의해 분내에 수득. 사용자는 AFM에 익숙하게되면 자동화 된 파라미터의 일부 또는 전부는 수동으로 화질 미세 조정을 허용 실험가 언제든지 비활성화 될 수있다. 그 이래, PF-QNM이. submolecular 레벨 박테리오로돕신, 세포막 단백질 및 다른 천연 단백질을 매핑 적용된 박테리오로돕신 들어 16-18, 단백질 유연성 및 X-선 결정 학적 구조 사이에 직접적인 상관 관계가있다. 12 PF -qnM은 높은 해상도로 살아있는 세포 조사하기 위해 사용되었다. 세포의 무결성과 기능에 대 한 중요 한 적혈구 막 내 구조와 역학 사이 19, 20 또한, PF-QNM 데이터를 밝혀왔다 중요한 연결합니다. (21) 우리는 22 bacteriophytochromes (BphPs)라고 붉은 빛 감광체의 구조를 연구하기 위해 AFM (23)를 포함하여, 주 사형 프로브 현미경 (SPM)의 방법을 채용했다. 24,25 그들은 공유 시그널링 이펙터 모듈 등의보기에 연결된 광 검출 모듈로 구성 히스티딘 키나아제 (HK)로서. 26 광 감지 모듈은 일반적으로 구조 변화 시그널링 이펙터 모듈에 도달하고, 전체 단백질의 전체에 변형 선도의 시리즈, 광자의 흡수에 구조적 변형을 겪는다 bilin 발색단을 포함 . 이러한 변화를 바탕으로 24,27-29, 두 가지 광 흡수의가BphPs, 빨간색과 원적외선 광 흡수 상태 tates은 홍보 및 PFR로 표시. 홍보는 대부분의 BphPs에 대한 열 안정성, 어두운 적응 상태입니다. PR / PFR의 광 변환의 분자 기초가 완전히 때문에이 단백질의 제한 구조 지식을 이해하지 않습니다 28. D. 하나의 구조를 제외 radiodurans는, 이들 단백질의 번역 30 모두 X-선 결정 학적 구조가 어두운 상태에 적응하고 이펙터 도메인이 부족하다. 그대로 BphPs 효과적으로 핵 자기 공명 (NMR)에 의해 연구하기에는 너무 크고 X-선 결정학을위한 (특히 광 적응 상태에서) 그들의 본래 형태로 결정화 악명 어렵다. BphPs은 최근 적외선 형광 단백질 마커로 설계되었다 (IFP의).이 단백질의 31 구조 특성이 적용 IFP 디자인 지원을 촉진 할 수 있습니다. 32-36 이 기사의 초점은하는 절차를 제시하는 것PF-QNM 통해 액체 셀 AFM을 이용 BphPs의 촬상. 방법은 광합성 세균에서 R. bacteriophytochrome의 RpBphP3 (P3)의 광 적응 상태의 연구에 의해 증명된다 palustris. 여기에 제시된 AFM 절차는 단백질의 이미징을위한 편리하고 간단한 방법뿐만 아니라 다른 생물학적 거대 분자이다. 이 방법으로, 개별 분자의 구조적인 세부 사항은 상위 과학 과정 실험실 세션 유사한 시간의 단기간에 수집 할 수있다. 단면을 측정하고 상기 차원 분석을 통해 완료, 실험 데이터는 유용한 계산 모델을 비교할 수있다. 37-42

<table><tbody><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>O4997-100</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Acros Organics</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Acros Organics</td><td>7791-18-6</td><td></td></tr><tr><td>Multimode 8 AFM</td><td>Bruker-Nano</td><td>492-008-011</td><td>equipped with Nanoscope V controller and J scanner</td></tr><tr><td>Probe</td><td>Bruker-Nano</td><td>SNL-10, ScanAsyst-Fluid+</td><td></td></tr><tr><td>Tapping Mode Fluid Cell</td><td>Bruker-Nano</td><td>MTFML</td><td></td></tr><tr><td>Mica V-4 Grade</td><td>SPI supplies</td><td>1150503</td><td>25 x 25 x .26 mm</td></tr><tr><td>Sample support disk</td><td>nanoSurf</td><td>BT02236</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish</td><td>Plasta-Medic, Inc.</td><td></td><td>100 mm x 15 mm&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>micropipettors</td><td>Denville Scientific</td><td>XL 3000i</td><td></td></tr><tr><td>RpBphP3</td><td></td><td></td><td>Prepared according to cited references</td></tr><tr><td>Nanoscope software</td><td>Bruker-Nano</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiber Optic Light</td><td>Digital Instruments Inc.</td><td>F0-50</td><td></td></tr><tr><td>Pelco AFM Disc Gripper</td><td>Ted Pella Inc</td><td>1668</td><td>12 mm</td></tr><tr><td>1 ml syringe</td><td>McKesson</td><td>102-ST1C</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf tubes</td><td>Denville Scientific</td><td>C2171</td><td></td></tr><tr><td>The Pymol Molecular Graphic System v.1.5.0.1</td><td>Schrodinger, LLC</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

atomic force microscopy of red-light photoreceptors using peakforce quantitative nanomechanical property mapping

원자 힘 현미경 (AFM)의 표면의 힘에 응답을 프로빙 캔틸레버에 부착 피라미드 팁을 이용한다. 팁의 편향은 지형 화상으로 변환 될 수 레이저 및 섹터 탐지기에 의해 10 ~ PN 측정 할 수있다. 진폭 변조 또는 &quot;탭핑 모드&quot;는 AFM 이미지를 생성하기 위하여 그것의 공진 주파수로 진동하면서 표면 간헐적 접촉하는 프로브를 포함한다. 유체 세포와 함께 사용, 태핑 모드 AFM은 생리 학적으로 관련 조건에서 단백질과 같은 생물학적 거대 분자의 이미징을 할 수 있습니다. 태핑 모드 AFM 프로브와 경험이없는 사용자를 위해 도전 할 수있는 스캔 매개 변수의 다수의 빈번한 조정의 수동 튜닝이 필요합니다. 고품질 화상을 얻기 위해서는, 이러한 조정은 대부분의 시간을 소비한다. PeakForce 정량적 나노 기계 공간 매핑 (PF-QNM)가 힘을 측정함으로써 respon 이미지를 만들어샘플과 접촉의 모든 지점에 대한 자체 곡선. ScanAsyst 소프트웨어로, PF-QNM은 자동화 할 수 있습니다. 이 소프트웨어는 자동으로 주어진 샘플에 대한 설정 점, 구동 주파수, 스캔 속도, 이익, 및 기타 중요한 검색 매개 변수를 조정합니다. 뿐만 아니라이 프로세스가 깨지기 탐침과 시료를 보호 않으며, 그것은 훨씬 높은 해상도의 이미지를 얻기 위해 필요한 시간을 감소시킨다. PF-QNM 유체의 AFM 이미징 호환; 따라서, 생물학적으로 중요한 물질을 이미징하는 광범위한 애플리케이션을 갖는다. 본 논문에서 제시하는 방법은 광합성 R.에서 세균 붉은 빛이 광 수용체, RpBphP3 (P3)의 이미지를 얻기 위해 PF-QNM의 응용 프로그램을 설명합니다 그 빛 적응 상태에서 palustris. 이 방법을 사용하여, 각각의 단백질의 이량 P3와 다이머의 응집체는 촬상 버퍼의 존재 운모 표면에 관찰되었다. 적절한 표면을 조정 및 / 또는 용액 농도,이 방법일반적으로 생물학적 관련 거대 분자와 부드러운 소재에 적용될 수있다.

그 빛 적응 상태에서 광 수용체 단백질, P3, 대표 AFM 이미지는 그림 3과 그림 4에 제시되어있다. 갓 죽습 운모 기판 (그림 3a는) 단백질 흡착에 적합한 평평한 표면입니다. 음성 대조군으로서 깨끗한 운모의 화상을 수집하는 것은 여러 가지 이유로 중요하다. 첫째, 액체 세포가 깨끗 보장 이전 실험에서 잔류 물질은 표면을 오염하지 않습니다. 둘째, 프로브의 품질을 테스트한다. 프로브가 더럽거나 변형 된 경우,이 줄무늬로 이미지에 표시 또는 노이즈로 자신을 선물 할 것이다. 마지막으로, 운모 깨끗한​​ 화상을 프로브 적절 미래 실험 조정될 수 확인한다. 단일 감광체 단백질 이량 체는 표면 커버리지 (도 3B, C) ​​적절한 경우 PeakForce QNM를 사용하여 관찰 될 수있다. 화살표는 개별적인 신호 다이머; 별표는 단백질 집합체를 의미한다.단백질 샘플, 증착 시간 및 영상 버퍼의 이온 강도의 농도는 표면 커버리지에 영향. 23을 단일 분자의 높은 분포를 들어, 매우 짧은 침착 시간이 요구되는 솔루션을 희석한다. 예를 들어, 증착 시간을 두 배로하는 것은 더 큰 응집체의 높은 분포를 산출한다. 단백질 농도는 0.100 mg의 증가 시키면 / ㎖, 감광체의 박막 증착 시간을 수정 또는 이온 강도를 버퍼링없이 관찰된다. 화상 (도 4)을 평평하게 한 후 화상 해석 소프트웨어를 사용하여 단백질의 단면이 측정 될 수있다. 횡단면은 대응하는 높이와 XY 측정 데이터를 제공한다. 이러한 측정 등 세부 구조, 단백질 / 표면 상호 작용, 기계적 강도, XY-데이터 AFM 탐침으로 뒤얽힌 수를 제공하기 위해 사용될 수있다; 그러나,이 효과는 더욱 선명한 프로브를 사용함으로써 최소화 될 수있다. 사실, CHO프로브의 얼음은 컨볼 루션의 허용 가능한 양 날카로운 탐침에 의한 손상에 이미지화 물질의 저항 사이의 정교한 균형이다. 필요하다면 팁 컨벌루션 또한 적절한 소프트웨어를 사용하여, 화상으로부터 감산 될 수있다. 선택된 사진은 직접 탭핑 모드 AFM을 사용하여 수집 이전에 발행 된 이미지와 비교 될 수있다. PeakForce QNM에 운모를 사용 P3 20 측정 사이즈 탭핑 모드 AFM으로 얻어진 값의 5 % 이내이다. <img alt="그림 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52164/52164fig1highres.jpg" width="600" /> 1 액체 셀 원자 힘 현미경을줍니다. (A) 레이저, 캔틸레버, 탐침과 표면 배향. 프로브와 캔틸레버는 액체 셀 안쪽에 부착되어 있습니다. (B) 액체 셀. 프로브, 캔틸레버 및 샘플 완전히 유체에 몰입. (C) Compl죽어 야지 어셈블리. 액체 셀은 마이크로 미터에 부착된다. 사진은 액체 셀에 관계 광학 헤드와 스캐너를 보여줍니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52164/52164fig1highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림이" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/52164/52164fig2highres.jpg" width="300" /> 그림 2 :. PeakForce 양적 나노 기계 속성 매핑이 작은 피크 힘에 대 한 그림입니다 (A) 접근 (B) 점프 (C) 최대 힘 (D) 접착 (E)가 후퇴에 문의 할 수 있습니다.. 그림은 재현의 허가를 맞게되었다. (15) <img alt="그림 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52164/52164fig3highres.jpg" width= &quot;600&quot;/&gt; 운모에 P3의 그림 3과 원자 힘 현미경. 깨끗한 운모 (1 × 1 μm의)의 (A) 이미지. (B) 이미지 (1 μm의 × 1 μm의)는 P3의 운모에 적용. 화살표는 하나의 단백질 이량 체의 예를 나타냅니다. 별표는 단백질 이량 체의 집합체를 나타낸다.이 단백질의 이량 체 (C) 이미지 (170 X 170 nm의) 단일 이량 체의 3 차원 인세. 캐럿은 삽입에 존재하는 단백질 이합체 지정합니다. 모든 이미지는 이미지 버퍼의 존재 (증착을위한 단백질 농도 = 0.0010 ㎎ / ㎖)에서 촬영되었다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52164/52164fig3highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/52164/52164fig4highres.jpg" width="300" /> 운모에 P3의 그림 4 횡단면 분석. </stron단면 높이 / 거리 측정과 운모 (170 X 170 nm의)에 P3의 g&gt; AFM 이미지는이 이량 체에 대해 언급했다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52164/52164fig4highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Atomic Force Microscopy of Red-Light Photoreceptors Using PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping

A method for investigating the structure of a protein photoreceptor using atomic force microscopy (AFM) is described in this paper. PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) reveals intact protein dimers on a mica surface.

PeakForce 양적 나노 기계 대지 매핑을 사용하여 붉은 빛이 광수의 원자 힘 현미경

Atomic force microscopy (AFM) uses a pyramidal tip attached to a cantilever to probe the force response of a surface. The deflections of the tip can be ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Engineering

11.7K 조회수.  Northeastern Illinois University. A method for investigating the structure of a protein photoreceptor using atomic force microscopy (AFM) is described in this paper. PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) reveals intact protein dimers on a mica surface. 

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Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. Atomic force microscopy (AFM) can address this problem by enabling stretching and relaxation of single protein molecules, which gives direct evidence of specific unfolding and refolding characteristics. AFM-based single-molecule force-spectroscopy (AFM-SMFS) provides a means to consistently measure high-energy conformations in proteins that are not possible in traditional bulk (biochemical) measurements. Although numerous papers were published to show principles of AFM-SMFS, it is not easy to conduct SMFS experiments due to a lack of an exhaustively complete protocol. In this study, we briefly illustrate the principles of AFM and extensively detail the protocols, procedures, and data analysis as a guideline to achieve good results from SMFS experiments. We demonstrate representative SMFS results of single protein mechanical unfolding measurements and we provide troubleshooting strategies for some commonly encountered problems.

We describe the detailed procedures and strategies to measure the mechanical properties and mechanical unfolding pathways of single protein molecules using an atomic force microscope. We also show representative results as a reference for selection and justification of good single protein molecule recordings.

원자 힘 현미경을 사용 하 여 단일 단백질 분자 힘 분광학

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

연구

생화학

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

원자 힘 현미경을 사용하여 살아있는 세포의 기계적 특성을 측정

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

생체공학

Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions are likely affected by the mechanical environment in which binding and signaling take place. A recent study demonstrated that mechanical force can regulate antigen recognition by and triggering of the T-cell receptor (TCR). This was made possible by a new technology we developed and termed fluorescence biomembrane force probe (fBFP), which combines single-molecule force spectroscopy with fluorescence microscopy. Using an ultra-soft human red blood cell as the sensitive force sensor, a high-speed camera and real-time imaging tracking techniques, the fBFP is of ~1 pN (10-12 N), ~3 nm and ~0.5 msec in force, spatial and temporal resolution. With the fBFP, one can precisely measure single receptor-ligand binding kinetics under force regulation and simultaneously image binding-triggered intracellular calcium signaling on a single live cell. This new technology can be used to study other membrane receptor-ligand interaction and signaling in other cells under mechanical regulation.

We describe a technique for concurrently measuring force-regulated single receptor-ligand binding kinetics and real-time imaging of calcium signaling in a single T lymphocyte.

형광 생체막 포스 프로브 : 하나의 세포에서 수용체 - 리간드 속도론의 동시 정량 및 바인딩에 의한 세포 내 신호

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions ...

Easy and Accurate Mechano-profiling on Micropost Arrays

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate surroundings. Particularly, cell-substrate interactions are the main interest. Today micropost arrays are a well-characterized and established method with a broad range of applications that have been published over the last decade. However, there seems to be a reservation among biologists to adapt the technique due to the lengthy and challenging process of micropost manufacture along with the lack of easily approachable software for analyzing images of cells interacting with microposts. 
The force read-out from microposts is surprisingly easy. A micropost acts like a spring with the cell ideally attached at its tip. Depending on size a cell applies force from its cytoskeleton through one or multiple focal adhesion points to the micropost, thus deflecting the micropost. The amount of deflection correlates directly to the applied force in direction and in magnitude. The number of microposts covered by a cell and the post deflection patterns are characteristic and allow determination of values like force per post and many biologically relevant parameters that allow &#8220;mechano-profiling&#8221; of cell phenotypes.
A convenient method for mechano-profiling is described here combining the first generation of ready-to-use commercially available microposts with an in-house developed software package that is now accessible to all researchers. As a demonstration of typical application, single images of bone cancer cells were taken in bright-field microscopy for mechano-profiling of cell line models of metastasis. This combination of commercial traction force sensors and open source software for analysis allows for the first time a rapid implementation of the micropost array technique into routine lab work done by non-expert users. Furthermore, a robust and streamlined analysis process enables a user to analyze a large number of micropost images in a highly time-efficient manner.

Described are protocols for quantifying mechanical interactions between adherent cells and microstructured substrates. These interactions are closely linked to essential cell behaviors including migration, proliferation, differentiation, and apoptosis. The protocols present an open-source image analysis software called MechProfiler, which enables determination of involved forces for each micropost.

Micropost 배열에 쉽고 정확한 - 기계 프로파일

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate ...

A Protocol for Using F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. Nesprin-2G is a key component of the LINC complex that connects the actin cytoskeleton to membrane proteins (SUN domain proteins) in the perinuclear space. These membrane proteins connect to lamins inside the nucleus. Recently, a F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force probe was cloned into mini-Nesprin-2G (Nesprin-TS (tension sensor)) and used to measure tension across Nesprin-2G in live NIH3T3 fibroblasts. This paper describes the process of using Nesprin-TS to measure LINC complex forces in NIH3T3 fibroblasts. To extract FRET information from Nesprin-TS, an outline of how to spectrally unmix raw spectral images into acceptor and donor fluorescent channels is also presented. Using open-source software (ImageJ), images are pre-processed and transformed into ratiometric images. Finally, FRET data of Nesprin-TS is presented, along with strategies for how to compare data across different experimental groups.

A number of FRET-based force biosensors have recently been developed, enabling the protein-specific resolution of intracellular force. In this protocol, we demonstrate how one of these sensors, designed for the linker of the nucleoskeleton-cytoskeleton (LINC) complex protein Nesprin-2G can be used to measure actomyosin forces on the nuclear LINC complex.

포스터 공명 에너지 전달 (FRET) -force의 바이오 센서를 사용하는 프로토콜은 핵 LINC 단지에서 기계의 힘을 측정하는

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. ...

Direct Force Measurements of Subcellular Mechanics in Confinement using Optical Tweezers

During the development of a multicellular organism, a single fertilized cell divides and gives rise to multiple tissues with diverse functions. Tissue morphogenesis goes in hand with molecular and structural changes at the single cell level that result in variations of subcellular mechanical properties. As a consequence, even within the same cell, different organelles and compartments resist differently to mechanical stresses; and mechanotransduction pathways can actively regulate their mechanical properties. The ability of a cell to adapt to the microenvironment of the tissue niche thus is in part due to the ability to sense and respond to mechanical stresses. We recently proposed a new mechanosensation paradigm in which nuclear deformation and positioning enables a cell to gauge the physical 3D environment and endows the cell with a sense of proprioception to decode changes in cell shape. In this article, we describe a new method to measure the forces and material properties that shape the cell nucleus inside living cells, exemplified on adherent cells and mechanically confined cells. The measurements can be performed non-invasively with optical traps inside cells, and the forces are directly accessible through calibration-free detection of light momentum. This allows measuring the mechanics of the nucleus independently from cell surface deformations and allowing dissection of exteroceptive and interoceptive mechanotransduction pathways. Importantly, the trapping experiment can be combined with optical microscopy to investigate the cellular response and subcellular dynamics using fluorescence imaging of the cytoskeleton, calcium ions, or nuclear morphology. The presented method is straightforward to apply, compatible with commercial solutions for force measurements, and can easily be extended to investigate the mechanics of other subcellular compartments, e.g., mitochondria, stress-fibers, and endosomes.

Here, we present a protocol to investigate the intracellular mechanical properties of isolated embryonic zebrafish cells in three-dimensional confinement with direct force measurement by an optical trap.

광학 핀셋을 사용하여 감금된 세포 전 역학의 직접 힘 측정

During the development of a multicellular organism, a single fertilized cell divides and gives rise to multiple tissues with diverse functions. Tissue ...

발생학

High-Speed Magnetic Tweezers for Nanomechanical Measurements on Force-Sensitive Elements

Single-molecule magnetic tweezers (MTs) have served as powerful tools to forcefully interrogate biomolecules, such as nucleic acids and proteins, and are therefore poised to be useful in the field of mechanobiology. Since the method commonly relies on image-based tracking of magnetic beads, the speed limit in recording and analyzing images, as well as the thermal fluctuations of the beads, has long hampered its application in observing small and fast structural changes in target molecules. This article describes detailed methods for the construction and operation of a high-resolution MT setup that can resolve nanoscale, millisecond dynamics of biomolecules and their complexes. As application examples, experiments with DNA hairpins and SNARE complexes (membrane-fusion machinery) are demonstrated, focusing on how their transient states and transitions can be detected in the presence of piconewton-scale forces. We expect that high-speed MTs will continue to enable high-precision nanomechanical measurements on molecules that sense, transmit, and generate forces in cells, and thereby deepen our molecular-level understanding of mechanobiology.

Here, we describe a high-speed magnetic tweezer setup that performs nanomechanical measurements on force-sensitive biomolecules at the maximum rate of 1.2 kHz. We introduce its application to DNA hairpins and SNARE complexes as model systems, but it will be also applicable to other molecules involved in mechanobiological events.

힘에 민감한 요소에 대한 나노 역학 측정을 위한 고속 자기 핀셋

Single-molecule magnetic tweezers (MTs) have served as powerful tools to forcefully interrogate biomolecules, such as nucleic acids and proteins, and are ...

Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called mechanotransduction. A crucial step in mechanotransduction is the transmission of forces between the external and internal environments. To transmit forces, there must be a sustained, unbroken physical linkage created by a series of protein-protein interactions. For a given protein-protein interaction, mechanical load can either have no effect on the interaction, lead to faster disassociation of the interaction, or even stabilize the interaction. Understanding how molecular load dictates protein turnover in living cells can provide valuable information about the mechanical state of a protein, in turn elucidating its role in mechanotransduction. Existing techniques for measuring force-sensitive protein dynamics either lack direct measurements of protein load or rely on the measurements performed outside of the cellular context. Here, we describe a protocol for the F&#246;rster resonance energy transfer-fluorescence recovery after photobleaching (FRET-FRAP) technique, which enables the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells. This technique is potentially applicable to any FRET-based tension sensor, facilitating the study of force-sensitive protein dynamics in variety of subcellular structures and in different cell types.

Here, we present a protocol for the simultaneous use of F&#246;rster resonance energy transfer-based tension sensors to measure protein load and fluorescence recovery after photobleaching to measure protein dynamics enabling the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells.

살아있는 세포 형광 기술의 조합을 사용 하 여 힘에 민감한 단백질 역학의 측정

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called ...

Functionalization of Atomic Force Microscope Cantilevers with Single-T Cells or Single-Particle for Immunological Single-Cell Force Spectroscopy

Atomic force microscopy based single cell force spectroscopy (AFM-SCFS) is a powerful tool for studying biophysical properties of living cells. This technique allows for probing interaction strengths and dynamics on a live cell membrane, including those between cells, receptor and ligands, and alongside many other variations. It also works as a mechanism to deliver a physical or biochemical stimulus on single cells in a spatiotemporally controlled manner, thus allowing specific cell activation and subsequent cellular events to be monitored in real-time when combined with live-cell fluorescence imaging. The key step in those AFM-SCFS measurements is AFM-cantilever functionalization, or in other words, attaching a subject of interest to the cantilever. Here, we present methods to modify AFM cantilevers with a single T cell and a single polystyrene bead respectively for immunological studies. The former involves a biocompatible glue that couples single T cells to the tip of a flat cantilever in a solution, while the latter relies on an epoxy glue for single bead adhesion in the air environment. Two immunological applications associated with each cantilever modification are provided as well. The methods described here can be easily adapted to different cell types and solid particles.

We present a protocol to functionalize atomic force microscope (AFM) cantilevers with a single T cell and bead particle for immunological studies. Procedures to probe single-pair T cell-dendritic cell binding by AFM and to monitor the real-time cellular response of macrophages to a single solid particle by AFM with fluorescence imaging are shown.

단일 T 세포또는 면역 학적 단세포 힘 분광학을 위한 단입자를 가진 원자력 현미경 캔틸레버의 기능화

Atomic force microscopy based single cell force spectroscopy (AFM-SCFS) is a powerful tool for studying biophysical properties of living cells. This ...

면역학 및 감염병학

Protrusion Force Microscopy: A Method to Quantify Forces Developed by Cell Protrusions

In numerous biological contexts, animal cells need to interact physically with their environment by developing mechanical forces. Among these, traction forces have been well-characterized, but there is a lack of techniques allowing the measurement of the protrusion forces exerted by cells orthogonally to their substrate. We designed an experimental setup to measure the protrusion forces exerted by adherent cells on their substrate. Cells plated on a compliant Formvar sheet deform this substrate and the resulting topography is mapped by atomic force microscopy (AFM) at the nanometer scale. Force values are then extracted from an analysis of the deformation profile based on the geometry of the protrusive cellular structures. Hence, the forces exerted by the individual protruding units of a living cell can be measured over time. This technique will enable the study of force generation and its regulation in the many cellular processes involving protrusion. Here, we describe its application to measure the protrusive forces generated by podosomes formed by human macrophages.

Here, we detail the experimental techniques used to evaluate the protrusion forces that podosomes apply on a compliant film, from the preparation of the film to the automated analysis of topographical images.

돌출 힘 현미경 검사 법: 셀 돌출에 의해 개발 된 세력을 계량 하는 방법

In numerous biological contexts, animal cells need to interact physically with their environment by developing mechanical forces. Among these, traction ...