NSF-MRIプログラム（CHE：1229103）新しい制御電子機器、ソフトウェア、液体セル、およびデュアルAFM / STMを組み立てるために必要な他の機器の購入資金を提供するために認められている。私たちは、AFM計測機器、トレーニング、およびイメージングの支援のためにシカゴ大学のNSF-MRSECプログラム（DMR-0820054）で共用設備を認識し、機器の時間のための材料研究施設ネットワーク（DMR-0820054）によって使用可能になった。私たちは、特に私たちのキャンパスに必要な器具類をもたらしたNSF-MRI提案の資金調達の前に生徒たちを歓迎するために博士Qiti郭博士ジャスティンJureller、教授のKa·イー·リーに感謝します。学生や教職員だけでなく、消耗品のためのサポートのための夏の研究奨学金を提供したノースイースタンイリノイ大学に授与：私たちは、タイトルIII STEM補助金（P031C110157 ID）から資金提供を認める。最後に、継続的なインストゥルメンタルサポートのためにとrに許可をブルカー·ナノ·インクを認めるPeakForce QNMのメカニズムを示すプロットをeproduceと自動化されたソフトウェアを記述するために単語ScanAsystを使用する。

1コンピュータおよび顕微鏡のセットアップ<ol><li> N 2気筒のバルブを開き、エアテーブルはフローティングとレベルされていることを確認するためにノブを調整します。 </li><li>このために、コンピュータ、コントローラ、および光ファイバーライトをオンにします。 </li><li> AFM / LFMモードにスキャナを設定し、AFMの頭の上にカメラを中心に。 </li><li>オープンソフトウェア。実験の下で、実験グループの下に実験カテゴリ「ナノメカニカルプロパティ」、「定量的ナノメカニカルマッピング」を選択し、「流体中PeakForce QNM」。負荷実験と[設定]をクリックします。 </li><li>ステージの表面を見るために、Z対物レンズを用いて、カメラをフォーカスします。ピエゾを粗いアップ/ダウン使用すると、約1mmのAFMヘッド開口部の表面の下にステージを移動します。 </li></ol>雲母表面の調製<ol><li>きれいなサンプル支持ディスク（直径15mm、厚さ0.8mm）の表面上に接着剤のステッカーを押します。マイカV-4を押してください接着剤へのグレードのディスク（25×25×26ミリメートル）がしっかりと取り付けまで。 </li><li>それは完全に無に気泡が付着しているの確保マイカ上に透明なテープ片をこする。均等に切断するように一方の側からマイカオフテープを引き出します。雲母が平らであることを保証するために、必要に応じて繰り返します。 </li><li>グリップ支持ディスク、円形ピンセット（ディスクグリッパー）一対のクリーンアップマイカ側、およびスキャナの上に置きます。マイカは、AFMヘッド開口のレベル以下である必要があります。 </li></ol>雲母表面の3流体セル組立·イメージング<ol><li>流体セル、O-リング、シリンジアダプタ、ホースアダプター、および100％エタノールにおける吐出ホースをすすぐ。 DI水中で流体セルをすすぐ。すべての部分が空気を完全に乾燥させます。 </li><li>きれいな流体セルのポートにホースアダプターを押し込みます。静かに平らな頭ピンセットを用いて流体セルの中心くぼみにOリングを押してください。 </li><li>プローブ保持クリップを軽く春を押して、GROOVから離れてそれを回す先端の電子。 </li><li>フラット頭ピンセットでアウェイチップからの長い先端に探針をつかみ。セルの中心に面した先端の溝にプローブを配置します。春を押して（ 図1B）、それを確保するために、プローブを介して保持クリップを調整します。 </li><li>それは完全に（ 図1C）に後退されていることを確認するために、AFMのクランプを確認してください。 </li><li>流体セル、Oリングを置き、マイカサンプルの上に、下に向けてプローブ。流体セルは、AFMのスタッド上に休息できるようにします。ステージ上で流体セルを安定させるためにクランプを下げます。目視検査がしっかりと支持円板と流体セルとの間で圧縮Oリングを示すまで、顕微鏡でのダウンスイッチを押します。 </li><li>モニターを見ながら、画面上の流体セルの上部を可視化するための粗調整ノブを当てる。 </li><li> X / Y調整ノブとZ対物レンズを用いて先端の鮮明な画像があるまで顕微鏡を移動します。先端はAPPますメタリック、黄金の三角形のような耳。顕微鏡でのダウンピエゾレバーを使用して試料表面に近い先端を移動します。先端の反射に焦点を当てています。その反射の関係で実際のカンチレバーのないことを確認してください。この段階では、それらが密接に合致するが、完全にオーバーラップしないべきである。 </li><li>無菌1mlシリンジにシリンジアダプタを取り付けます。シリンジアダプタに噴射ホースの一端を取り付け、緩衝液容器内のホースのもう一方の端を置きます。完全にシリンジのプランジャーを拡張します。 </li><li>流体セル上のホースアダプターにホースを取り付けます。流体が完全に中央チャンバーを満たすまで、慎重プランジャーを押してください。気泡が存在しない保証するためにセルをチェックします。顕微鏡上に流体セルからこぼれる流体が存在しないか確認してください。隆起した固体支持体上に注射器を置きます。 </li><li>画面上のレーザー（拡散赤い点）を見つけるために、カメラフィード、X / Yは、翻訳のノブを使用してください。レーザーMOVEMの使い方ENTコントロールノブは、先端にレーザーを移動します。 </li><li>顕微鏡上に表示される和信号が最大になるまで細かく（ - 6値= 4）、レーザーとミラーを調整します。 </li><li> （±0.1）を限りなくゼロに近づけて顕微鏡に表示されて垂直方向と水平方向の偏向を低下させるために左後方側のノブやスキャンヘッドの左上側を使用して象限ダイオードの角度を調整します。 </li><li>ソフトウェアでは、取得のオプションを選択します。最低でも、選択の高さ（トレースとリトレース）、ピーク力誤差、および変形。他のオプションはユーザ依存し、実験者が所望する特定の情報に基づいて調整することができる。 </li><li>各取得ウィンドウにおけるRT飛行機フィットのための「行」を選択します。高さの窓でのOT飛行機フィットのための &quot;none&quot;を選択します。まだ行っていない場合は、ゼロにXとYオフセットと走査角度を設定します。 </li><li> 1ヘルツ、256行あたりのサンプル、ScanAsyst自動制御にスキャンレートを設定してください個人、そしてオフにScanAsystオートZ限界に。 500nmのZ制限を変更します。 1μmのスキャンサイズを設定します。 </li><li>従事クリックしてください。この時点で、先端が表面に近づく。先端が近づいている間に、画面の左下隅にZピエゾ電圧変化を観察する。先端が範囲外になった場合、チップと再アプローチを撤回。これが失敗した場合、先端が成功したアプローチを有するために変更する必要があります。先端が係合されると、ラインがイメージを構成します取得の各ウィンドウに表示されるように開始します。 </li><li> 1×1μmとマイカの画像を取り、雲母表面がきれいで平らであることを保証するために、ゆっくりと拡大表示します。が表示されたら、画像を保存するための連続キャプチャをクリックします。ズームインし、必要に応じて表面を動き回る。 </li></ol> 4。タンパク質の沈着とイメージングのための試料の調製<ol><li>精製されたタンパク質試料38を入手し、氷上に保つ。冷凍庫で保存する場合は、上のサンプルを解凍する5分間氷。 </li><li>冷蔵イメージング緩衝液を用いて溶解0.0010ミリグラム/にタンパク質を希釈する。ここで使用される画像バッファは15 mMトリス塩酸（pH = 8.0）、150mMのNaCl、および15mMのMgCl 2である。 </li><li>冷蔵イメージング緩衝液で4室（100×15 mm）のペトリ皿を埋める。溶液の少なくとも5mlで各チャンバーを埋める。静かにピペットに取り付けられた先端を希釈したタンパク質溶液を混合する。 </li><li>すでに準備雲母の表面に希釈したタンパク質溶液200μlを適用します。 30秒後に、円形ピンセット（ディスクグリッパー）を有するタンパク質/雲母表面を拾う。実験台にサンプルを平行に保持します。 </li><li>試料を保持しながら、直ちに試料をペトリ皿の流域に平行であることを保証しながらペトリ皿（ ステップ4.2）の第一象限に含まれる緩衝液中に試料を浸す。 1秒後、サンプルを削除します。 </li><li>流域にサンプルと平行に保持するために継続ペトリ皿の、残りの3つの象限のためのステップ4.5を繰り返します。 </li><li>余分な水分を吸収し、顕微鏡のステージ上にディスクを転送するために乾いたほこりのない布でディスクを置きます。布で実際の表面に触れないでください。サンプルを乾燥させないようにしてください。 </li><li> 3.16 -を繰り返して、3.6を繰り返します 。 </li></ol>マイカ上の5。イメージングタンパク質<ol><li>画面の左側にあるチェック·パラメータ·ボックスをクリックしてください。ばねの大きさと先端半径は、使用されているチップに基づいて設定されるべきである。 </li><li>従事クリックしてください。同様にマイカ撮像処理（ ステップ3.17）に、先端的なアプローチとしてのzピエゾウィンドウを観察します。 </li><li>イメージスキャナの少なくとも2つの連続パスのための同じ領域を許可します。収集された各画像を保存するための連続キャプチャをクリックします。 </li><li>新しい領域にスキャナを移動、および/または必要に応じて画像サイズを変更します。 </li><li>自動化されたソフトウェアは、調整が終了した後特定の画像サイズのスキャンパラメータは、ソフトウェアをオフにします。 </li><li>手動で微調整するために画像の焦点を走査速度、zは限界、行数、および電圧を調整する。画像の焦点が合って遠くなった場合は、元の開始位置を返すように背面のソフトウェアをオンにします。タンパク質上で拡大しながら画像の解像度を高めるために、走査速度を減少させ、比例ラインの数を増やす。 </li><li>実験後、100％エタノールによる液細胞をきれいにし、DI H 2 Oですすぎ液体セルが完全に乾燥することができます。 </li><li>生データ画像を処理するためのデータ·ソフトウェアを開きます。まず、平坦化アイコンをクリックして画像を平坦。ゼロ番目の順序を選択して実行]をクリックします。画像によっては、平面適合は適切に平坦な画像を得ることが必要であり得る。この場合、平面フィットアイコンを選択し、カーソルを使用して、画像の平坦な領域の平面を描く。実行]をクリックします。必要に応じて繰り返し</li><li> SELタンパク質の寸法を測定するための電気ショック療法の断面]タブをクリックします。カーソルで線を引く、分析する分子または領域の上に移動します。複数のエリアについて、この手順を繰り返し、ソフトウェアがオーバーレイを生成します。画像やその他のソフトウェアおよび描画プログラムに互換性のある形式で画像を生成するために使用されるデータをエクスポートします。 </li></ol>

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USA. 104, 12571-12576 (2007).</li><li>Yang, X., Kuk, J., Moffat, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+Pseudomonas+aeruginosa+bacteriophytochrome:+photoconversion+and+signal+transduction.">Crystal structure of Pseudomonas aeruginosa bacteriophytochrome: photoconversion and signal transduction.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 14715-14720 (2008).</li><li>Woitowich, N. K., Garrido, C., Ozarowski, W., Stojkovic, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preliminary+X-ray+Crystallographic+and+Structural+Analyses+of+a+Bacteriophytochrome+from+Stigmatella+aurantiaca.">Preliminary X-ray Crystallographic and Structural Analyses of a Bacteriophytochrome from Stigmatella aurantiaca.</a> The FASEB Journal. 25, 928 (2011).</li><li>Wagner, J. R., Zhang, J., Brunzelle, J. S., Vierstra, R. D., Forest, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+structure+of+Deinococcus+bacteriophytochrome+yields+new+insights+into+phytochrome+architecture+and+evolution.">High resolution structure of Deinococcus bacteriophytochrome yields new insights into phytochrome architecture and evolution.</a> J. Biol. Chem. 282, 12298-12309 (2007).</li><li>Wagner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutational+analysis+of+Deinococcus+radiodurans+bacteriophytochrome+reveals+key+amino+acids+necessary+for+the+photochromicity+and+proton+exchange+cycle+of+phytochromes.">Mutational analysis of Deinococcus radiodurans bacteriophytochrome reveals key amino acids necessary for the photochromicity and proton exchange cycle of phytochromes.</a> J. Biol. Chem. 283, 12212-12226 (2008).</li></ol>

There are no competing financial interests or conflicts of interest.

AFMは、生理学的に関連する条件下でタンパク質および他の生物学的巨大分子を画像化する十分な能力、走査型プローブ顕微鏡法である。 X線結晶学およびNMRと比較して、AFMの一つの制限は、同じ解像度、特に横方向の解像度を達成することができないことである。任意の表面上の分子を分析するためにAFMを使用する場合、データが分析されるとき、分子の画像上表面とプローブの影響も考慮しなければならない。取得した画像上のプローブの影響のデコンボリューションは、適切なソフトウェアに完了することができる。実験的な結果と比較する理論モデルを開発することも非常に有用であることを証明することができます。 本論文では、細菌の赤色光感光体のAFM像は、RpBphP3（P3）は、（ 図3）提示されている。顕微鏡アセンブリおよびソフトウェアの動作の説明は、使用される特定の楽器のモデルに固有のものですが、マイカタンパク質試料調製手順は、一般的であり、任意のAFM実験に適用することができる。 このプロトコルのいくつかの重要なステップは、雲母表面上の所望のタンパク質カバレッジを得るためには従わなければならない。それは雲母表面（ ステップ4.3）に適用される前に、まず、希釈したタンパク質溶液を穏やかに混合でなければなりません。によるP3の高分子量のために、堆積用溶液は非常にコロイド状である。したがって、P3は解決不均質を作る時間をかけてチューブの底に落ち着く。穏やかな攪拌救済この問題。タンパク質が適用されると第二に、表面がどんな緩く結合した分子（ - 4.6ステップ4.5）を除去するためにリンスしておく必要があります。緩く結合されたP3が表面上に残っている場合、液体セルは、緩衝溶液で満たされた、および/または実験中AFMプローブによって撮像されたときに、分子が溶液中に放出されるいずれか。これらのイベントの両方が成功したイメージング実験を妨げる。場合液体セルは、P3で汚染された、それを分解し、徹底的に洗浄しなければならないとなります。 AFMプローブ分子を拾った場合、それは典型的に交換する必要があり、画像品質が犠牲にされる。最後に、タンパク質試料を洗浄する方法は、良好な画像を得るために重要である。マイカは、P3に非選択的表面である。したがって、分子がランダムに配向することが見出されなければならない。プロトコルに記載リンスの方法は、1つの配向に表面上の分子を再配列回避する1つの方法である。キーは常に湿潤試料を維持し、角度で表面を保持し、文字通りバッファーで表面を噴霧しないようにすることです。サンプルは、それがペトリ皿の流域に平行に保持しながら、浸漬することによってリンスされる場合、緩衝液の力電流による表面上のP3の歪みが最小化される。 液体セル、プローブ、スキャナ、および光学ヘッド部のすべては非常にデリケートなため、注意して取り扱わなければならない。 sprinスキャナと光学ヘッドを保持gsが一緒に非常に強いです。それは作品のいずれかを組み立てるか、装う、スキャナに手を維持することが不可欠です。プロトコールに記載されているようにScanAsystソフトウェアとPF-QNMの場合、それは、Zリミットの自動化ソフトウェア制御をオフにして、元のスキャンサイズを1μm（ ステップ3.16）であれば、少なくとも500 nmまでこの値を設定することが不可欠である。これは、表面が突然荒れとなっているか、汚染されている場合、スキャナを保護します。単一の画像が収集され、それが画像形成された領域が平滑であることが確認されると、Z-限度は、より高い解像度の画像を達成するために手動で下方に調整することができる。これは、スキャナが、表面の新たな領域に移動されたときや、先端が何らかの理由で後退させた場合、少なくとも500 nmまで戻って、Zリミットを再調整することが重要である。 本論文では、高品質の地形の画像を取得するためにPF-QNMを使用して焦点を当ててきたが、この方法自体は提供することができます表面構造の機械的強度と柔軟性に関する追加情報のライブラリー。この機能は、単純に実験中に適切なチャネルを選択することにより、機能性についての洞察につながる可能性がある。16,18堆積用溶液および/ ​​または表面の濃度を適切に変更すると、この方法では、調査するためにPF-QNMを使用するための一般的なものでよい液体セルAFMによる生体高分子。ソフトウェアの自動化された助けを借りて、AFMによる無経験を持つ上位科学コースの学生は、従来のタッピング·モードAFMよりもはるかに迅速に液体セルのAFM実験を完了することができます。学生は、AFMの基本を体験し、典型的な3以内に、この強力な技術によって可能になった学際的な研究の味を得ることができます - 4時間の実験室区間時間制約。

原子間力顕微鏡（AFM）は、1986年の発明（ 図1）ので、表面、薄膜、単分子の構造的および機械的特性を調査するために非常に重要なツールとなっている。1-3液晶セルを使用して、方法が有している生体高分子の研究や生理学的に関連する環境下であっても、生きている細胞で特に有効になる。非接触モードAFMによる一般的に不適切であることから4-10タッピングモードAFMは、伝統的に、表面に軟質材料または緩く結合した分子を画像化するために使用されている横方向の力による被害にカンチレバーことにより、試料に加わる。11タッピング·モードAFMは、実質的に先端が断続的に表面に触れたのではなく、一定の接触することによってこれらの力を低減します。このモードでは、カンチレバーが表面に垂直なその共振周波数で又はその付近で振動される。同様に、AFMモードに連絡することを、トポグラフィーは肛門ですのxy（距離）の関数としてのzピエゾの動きをプロットすることによってyzed。 カンチレバーダイナミクスは時や共振の近くで非常に不安定になることができます。従って、それらは、「定常状態」状況の外側を自動化することは非常に挑戦的である。具体的には、これらのダイナミクスは、サンプルの特性および走査環境の両方に依存します。 （より）硬い表面に吸着柔らかい分子の場合、分子に適切にチューニングされたフィードバック·ループは、表面のための帰還発振につながる可能性があります。さらに流体中の動作は、カンチレバーのチューニングが複雑になる。温度の変化又は流体レベルが一定の設定点の再調整、ゲイン、および他の撮像パラメータを必要とする。これらの調整は非常に時間がかかり、ユーザにとって困難である傾向がある。 ピークフォース定量的ナノメカニカルプロパティのマッピング（PF-QNM）は、タッピングモードAFMのように、断続的にサンプル（ 図2）と接触させることにより横方向の相互作用を避けることができます。12-15 &lt;/ SUP&gt;しかし、PF-QNMは、非共振モードとタッピングモードAFMよりもはるかに低い周波数で動作します。これは、タッピングモードAFM、流体の存在によって悪化特にチューニングの課題を排除します。 PF-QNMで、画像は、接点の全ての点において力応答曲線を取ることによって収集される。 ScanAsystソフトウェアの追加により、スキャンパラメータの15調整が自動化することができ、高解像度の画像であっても、経験の浅いユーザーがほんの数分で得られる。ユーザはAFM​​に慣れになると、自動化されたパラメータのいずれかまたは全てが、画像品質を手動で微調整するために実験者を許可し、いつでも無効にすることができる。創業以来、PF-QNMは。分子下レベルでのバクテリオロドプシン、膜タンパク質、および他の天然タンパク質をマッピングするために適用されたバクテリオロドプシンのために16-18、タンパク質の柔軟性とX線結晶構造の間の直接的な相関関係があります。12 PF -qnMは、高解像度の生細胞を研究するために利用されている。19,20さらに、PF-QNMデータは、細胞の整合性と機能に重要である赤血球膜内の構造と力学の間の重要な接続を明らかにしています。21 私たちは、22 bacteriophytochromes（BphPs）と呼ばれる赤色光の光受容体の構造を調べるためにAFM、23を含む、走査型プローブ顕微鏡（SPM）の方法を使用している。24,25彼らが共有シグナリングエフェクターモジュールなどにに連結された光検出モジュールから構成されヒスチジンキナーゼ（HK）として。26光センシングモジュールは、一般的に構造変化のシグナル伝達エフェクターモジュールに達し、全体のタンパク質の全体的な変革につながる一連の光子を吸収すると構造変化を受け、ビリン発色団が含まれていますこの変換に基づく24,27-29、二つの異なる光吸収のあるBphPs、赤と遠赤色光吸収状態のtatesは、​​Pr及びPfrのと表記。 PrはほとんどBphPsため、熱的に安定な、暗順応状態である。のPr /のPfR光変換の分子基盤は完全に起因するこれらのタンパク質の限定された構造の知識に理解されていない28。 Dから一つの構造を除いてデュランスは 、これらのタンパク質の30すべての公開X線結晶構造は、暗順応状態にあり、エフェクタードメインを欠いている。無傷BphPs効果的核磁気共鳴（NMR）によって研究することが大きすぎると、X線結晶学のために（特に、明順応状態で）、その完全な形で結晶化することが困難なことで有名である。 BphPsは最近、赤外蛍光タンパク質マーカー（IFPの）ように操作されている。これらのタンパク質の31構造解析が有効IFP設計で支援を促進することができます。32-36 この記事の焦点は、手順を提示することであるPF-QNMを介して液体セルAFMを用いBphPsの撮影。この方法は、光合成細菌RからbacteriophytochromeのRpBphP3（P3）の明順応状態の研究によって証明されるオオウズラタケ 。ここに提示AFM手順は、タンパク質の画像化のための便利で簡単な方法、ならびに他の生物学的巨大分子である。この方法では、個別の分子の構造の詳細は、上位理系実験セッションのような短時間で収集することができる。断面積を測定し、さらに次元解析を完了を通して、実験データは、有用な計算モデルと比較することができる。37-42

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog #</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O4997-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multimode 8 AFM</td>
			<td>Bruker-Nano</td>
			<td>492-008-011</td>
			<td>equipped with Nanoscope V controller and J scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe</td>
			<td>Bruker-Nano</td>
			<td>SNL-10, ScanAsyst-Fluid+</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tapping Mode Fluid Cell</td>
			<td>Bruker-Nano</td>
			<td>MTFML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mica V-4 Grade</td>
			<td>SPI supplies</td>
			<td>1150503</td>
			<td>25 x 25 x .26 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample support disk</td>
			<td>nanoSurf</td>
			<td>BT02236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Plasta-Medic, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>100 mm x 15 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micropipettors</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>XL 3000i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RpBphP3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepared according to cited references</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoscope software</td>
			<td>Bruker-Nano</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Optic Light</td>
			<td>Digital Instruments Inc.</td>
			<td>F0-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pelco AFM Disc Gripper</td>
			<td>Ted Pella Inc</td>
			<td>1668</td>
			<td>12 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>102-ST1C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>C2171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Pymol Molecular Graphic System v.1.5.0.1</td>
			<td>Schrodinger, LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

atomic force microscopy of red-light photoreceptors using peakforce quantitative nanomechanical property mapping

原子間力顕微鏡（AFM）は、表面の力応答を調べるために、カンチレバーに取り付けられたピラミッド型チップを使用しています。先端部の偏向は、画像地形に変換することができるレーザ及びセクタ化検出器での10〜pNで測定することができる。振幅変調または「タッピングモード」AFM画像を生成するためにその共振周波数で振動させながら表面に断続的に接触するプローブを含む。流体セルと組み合わせて使用​​し、タッピングモードAFMは、そのような生理学的に関連する条件の中のタンパク質などの生体高分子のイメージングを可能にします。タッピングモードAFMは、プローブと経験の浅いユーザーのために挑戦することができ、スキャンパラメータの多数の頻繁な調整を手動でチューニングする必要があります。高品質な画像を得るために、これらの調整は最も時間を消費である。 PeakForce定量的ナノメカニカルプロパティのマッピング（PF-QNM）は力responを測定することにより、画像を生成する試料との接触のすべてのポイントのためにそれ自体の曲線。 ScanAsystソフトウェアでは、PF-QNMを自動化することができる。このソフトウェアは、与えられたサンプルに対して自動的に設定点、駆動周波数、スキャン速度、ゲイン、およびその他の重要なスキャンパラメータを調整する。のみならず、このプロセスは壊れやすいプローブおよびサンプルの両方を保護しない、それは非常に高い解像度の画像を得るのに必要な時間を減少させる。 PF-QNMは、流体中のAFMイメージングのための互換性があります。したがって、それは生物学的に関連する材料を画像化するための広範な用途を有する。 本論文で提示した方法は、光合成Rから、細菌の赤色光感光体RpBphP3（P3）の画像を得るため、PF-QNMのアプリケーションについて説明しその明順応状態にあるオオウズラタケ 。この方法を使用して、個別のタンパク質P3の二量体および二量体の凝集体は、イメージング緩衝液の存在下で雲母表面上に観察されている。適切な表面の調整及び/又は溶液の濃度は、この方法に一般に、他の生物学的に関連する高分子および軟質材料に適用することができる。

その明順応状態で感光体タンパク質の代表的なAFM画像を、P3は、 図3及び図4に示されている。新たに切断されたマイカ基板（ 図3A）は 、タンパク質吸着に適した、平坦面である。ネガティブコントロールとして、クリーン雲母の画像を収集することは、いくつかの理由のために重要である。まず、液晶セルは、清潔さを保証し、これまでの実験からの残留物質が表面を汚染しません。第二に、プローブの品質をテストする。プローブが汚れていたり、変形している場合、これはスジなどの画像に表示されたり、ノイズとしての地位を提示します。最後に、清浄な雲母画像は、プローブが適切に将来の実験のために調整することができる確認する。 表面被覆率（ 図3B、C）適切であれば、単一の感光体タンパク質二量体はPeakForce QNMを用いて観察することができる。矢印は個別の二量体を知らせる。アスタリスクは、タンパク質凝集体を意味する。ザ·タンパク質試料、堆積時間、及び撮像緩衝液のイオン強度の濃度は、表面被覆率に影響を与える。23を単一分子の高い分布のために、非常に短い堆積時間が必要であると希釈溶液。例えば、堆積時間を倍にすると、さらに大きな凝集体の高い分布が得られます。タンパク質濃度が0.100ミリグラム/ mlに増加すると、光受容体の薄膜は、蒸着時間を変更することなく観察又はイオン強度をバッファリングされる。 画像は（ 図4）平坦化された後、画像解析ソフトを用いて、タンパク質の断面を測定することができる。断面は、対応する高さ測定値とのxyデータを提供する。これらの測定は、xyデータは、AFMプローブにより畳み込むことができる等の構造的詳細、タンパク質/表面相互作用、機械的強度を提供するために使用することができる。しかしながら、この効果はより鋭いプローブを使用することによって最小限に抑えることができる。実際には、町プローブの氷はコンボリューションの許容量と鋭いプローブによる損傷に画像化された材料の抵抗との間の微妙なバランスである。必要に応じて、先端の畳み込みは、適切なソフトウェアを使用して、画像から減算することができる。 これらの写真は、直接タッピングモードAFMを使用して収集以前に公開された画像と比較することができる。PeakForce QNMを用いて雲母上P3の20測定された寸法は、タッピングモードのAFMを用いて得られた値の5％以内である。 <img alt="図1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52164/52164fig1highres.jpg" width="600" /> 1液体セル原子間力顕微鏡図。 （A）レーザー、カンチレバー、探針、および表面アラインメント。探針とカンチレバーを液体セル内に貼付されている。（B）の液晶セル。プローブは、カンチレバー、試料を完全に液中に浸漬されている。（C）COMPLエテアセンブリ。液晶セルは、マイクロメーターに取り付けられている。写真は、液晶セルとの関係で、光ヘッドとスキャナを示している。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52164/52164fig1highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/52164/52164fig2highres.jpg" width="300" /> 図2：。PeakForce定量的ナノメカニカルプロパティのマッピングこれは、小さなピーク力するための図で、（A）アプローチ（B）は、引っ込め（C）ピーク力（D）密着性（E）を連絡するジャンプ。図は許可を得て複製し、適合させた。15 <img alt="図3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52164/52164fig3highres.jpg" width= &quot;600&quot; /&gt; マイカ上のP3の図3。原子間力顕微鏡。クリーンマイカ（1×1ミクロン）の（A）の画像。（B）画像（1ミクロン×1μm）は、P3の雲母に適用される。矢印は、単一のタンパク質二量体の例を示している。アスタリスクは、タンパク質二量体の集合体を意味する。単量体の三次元インセットと二つのタンパク質二量体（C）画像（170のx 170）である。キャレットは、二量体は挿入図中に存在するタンパク質で指定します。すべての画像は、撮像バッファー（堆積のためのタンパク質濃度= 0.0010 mg / mlで）の存在下で撮影された<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52164/52164fig3highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/52164/52164fig4highres.jpg" width="300" /> マイカ上のP3の図4。断面解析。 </stron断面高さ/距離測定とマイカ（170 X 170 nm）の上のP3のG&gt; AFM像は、2つの二量体のために注意。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52164/52164fig4highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Atomic Force Microscopy of Red-Light Photoreceptors Using PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping

A method for investigating the structure of a protein photoreceptor using atomic force microscopy (AFM) is described in this paper. PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) reveals intact protein dimers on a mica surface.

PeakForce定量的ナノメカニカルプロパティマッピングを使用した赤色光光受容体の原子間力顕微鏡

Atomic force microscopy (AFM) uses a pyramidal tip attached to a cantilever to probe the force response of a surface. The deflections of the tip can be ...

atomic-force-microscopy-red-light-photoreceptors-using-peakforce

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Engineering

11.7K ビュー.  Northeastern Illinois University. A method for investigating the structure of a protein photoreceptor using atomic force microscopy (AFM) is described in this paper. PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) reveals intact protein dimers on a mica surface. 

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Concurrent Quantitative Conductivity and Mechanical Properties Measurements of Organic Photovoltaic Materials using AFM

Organic photovoltaic (OPV) materials are inherently inhomogeneous at the nanometer scale. Nanoscale inhomogeneity of OPV materials affects performance of photovoltaic devices. Thus, understanding of spatial variations in composition as well as electrical properties of OPV materials is of paramount importance for moving PV technology forward.1,2 In this paper, we describe a protocol for quantitative measurements of electrical and mechanical properties of OPV materials with sub-100 nm resolution. Currently, materials properties measurements performed using commercially available AFM-based techniques (PeakForce, conductive AFM) generally provide only qualitative information. The values for resistance as well as Young's modulus measured using our method on the prototypical ITO/PEDOT:PSS/P3HT:PC61BM system correspond well with literature data. The P3HT:PC61BM blend separates onto PC61BM-rich and P3HT-rich domains. Mechanical properties of PC61BM-rich and P3HT-rich domains are different, which allows for domain attribution on the surface of the film. Importantly, combining mechanical and electrical data allows for correlation of the domain structure on the surface of the film with electrical properties variation measured through the thickness of the film.

Organic photovoltaic (OPV) materials are inherently inhomogeneous at the nanometer scale. Nanoscale inhomogeneity of OPV materials affects performance of photovoltaic devices. In this paper, we describe a protocol for quantitative measurements of electrical and mechanical properties of OPV materials with sub-100 nm resolution.

同時定量伝導率およびAFMを用いた有機太陽電池材料の機械的特性の測定

Organic photovoltaic  (OPV) materials are inherently inhomogeneous at the nanometer scale. Nanoscale  inhomogeneity of OPV materials affects performance ...

工学

Preparation and Friction Force Microscopy Measurements of Immiscible, Opposing Polymer Brushes

Solvated polymer brushes are well known to lubricate high-pressure contacts, because they can sustain a positive normal load while maintaining low friction at the interface. Nevertheless, these systems can be sensitive to wear due to interdigitation of the opposing brushes. In a recent publication, we have shown via molecular dynamics simulations and atomic force microscopy experiments, that using an immiscible polymer brush system terminating the substrate and the slider surfaces, respectively, can eliminate such interdigitation. As a consequence, wear in the contacts is reduced. Moreover, the friction force is two orders of magnitude lower compared to traditional miscible polymer brush systems. This newly proposed system therefore holds great potential for application in industry. Here, the methodology to construct an immiscible polymer brush system of two different brushes each solvated by their own preferred solvent is presented. The procedure how to graft poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAM) from a flat surface and poly(methyl methacrylate) (PMMA) from an atomic force microscopy (AFM) colloidal probe is described. PNIPAM is solvated in water and PMMA in acetophenone. Via friction force AFM measurements, it is shown that the friction for this system is indeed reduced by two orders of magnitude compared to the miscible system of PMMA on PMMA solvated in acetophenone.

The methodology to perform friction force microscopy experiments for contacting brushes is presented: Two polymer brushes that are grafted from (a) substrates and (b) colloidal probes are slid to show that, by using two contacting immiscible brush systems, friction in sliding contacts is reduced compared to miscible brush systems.

ポリマーブラシに反対非混和性の調製と摩擦力顕微鏡の測定、

Solvated polymer brushes are well known to lubricate high-pressure contacts, because they can sustain a positive normal load while maintaining low ...

Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy

Atomic force spectroscopy is an ideal tool to study molecules at surfaces and interfaces. An experimental protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. At the same time the AFM tip is passivated to prevent unspecific interactions between the tip and the substrate, which is a prerequisite to study single molecules attached to the AFM tip. Analyses to determine the adhesion force, the adhesion length, and the free energy of these molecules on solid surfaces and bio-interfaces are shortly presented and external references for further reading are provided. Example molecules are the poly(amino acid) polytyrosine, the graft polymer PI-g-PS and the phospholipid POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine). These molecules are desorbed from different surfaces like CH3-SAMs, hydrogen terminated diamond and supported lipid bilayers under various solvent conditions. Finally, the advantages of force spectroscopic single molecule experiments are discussed including means to decide if truly a single molecule has been studied in the experiment.

A protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. Procedures and examples to determine the adhesion force and free energy of these molecules on solid supports and bio-interfaces are provided.

原子間力分光法による単一分子の接着性を調査

Atomic force spectroscopy is an ideal tool to study molecules at surfaces and interfaces. An experimental protocol to couple a large variety of single ...

Dynamic Pore-scale Reservoir-condition Imaging of Reaction in Carbonates Using Synchrotron Fast Tomography

Underground storage permanence is a major concern for carbon capture and storage. Pumping CO2 into carbonate reservoirs has the potential to dissolve geologic seals and allow CO2 to escape. However, the dissolution processes at reservoir conditions are poorly understood. Thus, time-resolved experiments are needed to observe and predict the nature and rate of dissolution at the pore scale. Synchrotron fast tomography is a method of taking high-resolution time-resolved images of complex pore structures much more quickly than traditional &#181;-CT. The Diamond Lightsource Pink Beam was used to dynamically image dissolution of limestone in the presence of CO2-saturated brine at reservoir conditions. 100 scans were taken at a 6.1 &#181;m resolution over a period of 2 hours. The images were segmented and the porosity and permeability were measured using image analysis and network extraction. Porosity increased uniformly along the length of the sample; however, the rate of increase of both porosity and permeability slowed at later times.

Synchrotron fast tomography was used to dynamically image dissolution of limestone in the presence of CO2-saturated brine at reservoir conditions. 100 scans were taken at a 6.1 &#181;m resolution over a period of 2 h.

シンクロトロン高速断層撮影法を使用した炭酸における反応の動的細孔スケール貯水池条件イメージング

Underground storage permanence is a major concern for carbon capture and storage. Pumping CO2 into carbonate reservoirs has the potential to dissolve ...

Evanescent Field Based Photoacoustics: Optical Property Evaluation at Surfaces

Here, we present a protocol to estimate material and surface optical properties using the photoacoustic effect combined with total internal reflection. Optical property evaluation of thin films and the surfaces of bulk materials is an important step in understanding new optical material systems and their applications. The method presented can estimate thickness, refractive index, and use absorptive properties of materials for detection. This metrology system uses evanescent field-based photoacoustics (EFPA), a field of research based upon the interaction of an evanescent field with the photoacoustic effect. This interaction and its resulting family of techniques allow the technique to probe optical properties within a few hundred nanometers of the sample surface. This optical near field allows for the highly accurate estimation of material properties on the same scale as the field itself such as refractive index and film thickness. With the use of EFPA and its sub techniques such as total internal reflection photoacoustic spectroscopy (TIRPAS) and optical tunneling photoacoustic spectroscopy (OTPAS), it is possible to evaluate a material at the nanoscale in a consolidated instrument without the need for many instruments and experiments that may be cost prohibitive.

Here we present a protocol to estimate material and surface optical properties using the photoacoustic effect combined with total internal reflection. This technique evanescent field-based photoacoustics can be used to create a photoacoustic metrology system to estimate materials&#39; thicknesses, bulk and thin film refractive indices, and explore their optical properties.

エバネセント場ベースの光音響：表面での光学特性評価

Here, we present a protocol to estimate material and surface optical properties using the photoacoustic effect combined with total internal reflection. ...

Sub-nanometer Resolution Imaging with Amplitude-modulation Atomic Force Microscopy in Liquid

Atomic force microscopy (AFM) has become a well-established technique for nanoscale imaging of samples in air and in liquid. Recent studies have shown that when operated in amplitude-modulation (tapping) mode, atomic or molecular-level resolution images can be achieved over a wide range of soft and hard samples in liquid. In these situations, small oscillation amplitudes (SAM-AFM) enhance the resolution by exploiting the solvated liquid at the surface of the sample. Although the technique has been successfully applied across fields as diverse as materials science, biology and biophysics and surface chemistry, obtaining high-resolution images in liquid can still remain challenging for novice users. This is partly due to the large number of variables to control and optimize such as the choice of cantilever, the sample preparation, and the correct manipulation of the imaging parameters. Here, we present a protocol for achieving high-resolution images of hard and soft samples in fluid using SAM-AFM on a commercial instrument. Our goal is to provide a step-by-step practical guide to achieving high-resolution images, including the cleaning and preparation of the apparatus and the sample, the choice of cantilever and optimization of the imaging parameters. For each step, we explain the scientific rationale behind our choices to facilitate the adaptation of the methodology to every user's specific system.

We present a method for achieving sub-nanometer resolution images with amplitude-modulation (tapping mode) atomic force microscopy in liquid. The method is demonstrated on commercial atomic force microscopes. We explain the rationale behind our choices of parameters and suggest strategies for resolution optimization.

液体中の振幅変調原子間力顕微鏡でのサブナノメートル分解能イメージング

Atomic force microscopy (AFM) has become a well-established technique for nanoscale imaging of samples in air and in liquid. Recent studies have shown ...

Measurement of Quantum Interference in a Silicon Ring Resonator Photon Source

Silicon photonic chips have the potential to realize complex integrated quantum information processing circuits, including photon sources, qubit manipulation, and integrated single-photon detectors. Here, we present the key aspects of preparing and testing a silicon photonic quantum chip with an integrated photon source and two-photon interferometer. The most important aspect of an integrated quantum circuit is minimizing loss so that all of the generated photons are detected with the highest possible fidelity. Here, we describe how to perform low-loss edge coupling by using an ultra-high numerical aperture fiber to closely match the mode of the silicon waveguides. By using an optimized fusion splicing recipe, the UHNA fiber is seamlessly interfaced with a standard single-mode fiber. This low-loss coupling allows the measurement of high-fidelity photon production in an integrated silicon ring resonator and the subsequent two-photon interference of the produced photons in a closely integrated Mach-Zehnder interferometer. This paper describes the essential procedures for the preparation and characterization of high-performance and scalable silicon quantum photonic circuits.

Silicon photonic chips have the potential to realize complex integrated quantum systems. Presented here is a method for preparing and testing a silicon photonic chip for quantum measurements.

シリコンリング共振器光子源における量子干渉の測定

Silicon photonic chips have the potential to realize complex integrated quantum information processing circuits, including photon sources, qubit ...

Characterization of Ultra-fine Grained and Nanocrystalline Materials Using Transmission Kikuchi Diffraction

One of the challenges in microstructure analysis nowadays resides in the reliable and accurate characterization of ultra-fine grained (UFG) and nanocrystalline materials. The traditional techniques associated with scanning electron microscopy (SEM), such as electron backscatter diffraction (EBSD), do not possess the required spatial resolution due to the large interaction volume between the electrons from the beam and the atoms of the material. Transmission electron microscopy (TEM) has the required spatial resolution. However, due to a lack of automation in the analysis system, the rate of data acquisition is slow which limits the area of the specimen that can be characterized. This paper presents a new characterization technique, Transmission Kikuchi Diffraction (TKD), which enables the analysis of the microstructure of UFG and nanocrystalline materials using an SEM equipped with a standard EBSD system. The spatial resolution of this technique can reach 2 nm. This technique can be applied to a large range of materials that would be difficult to analyze using traditional EBSD. After presenting the experimental set up and describing the different steps necessary to realize a TKD analysis, examples of its use on metal alloys and minerals are shown to illustrate the resolution of the technique and its flexibility in term of material to be characterized.

This paper provides a detailed method to characterize the microstructure of ultra-fine grained and nanocrystalline materials using a scanning electron microscope equipped with a standard electron backscatter diffraction system. Metal alloys and minerals presenting refined microstructures are analyzed using this technique, showing the diversity of its possible applications.

トランスミッション菊池回折を用いて超微細粒とナノ結晶材料のキャラクタリゼーション

One of the challenges in microstructure analysis nowadays resides in the reliable and accurate characterization of ultra-fine grained (UFG) and ...

An Efficient Method for Selective Desalination of Radioactive Iodine Anions by Using Gold Nanoparticles-Embedded Membrane Filter

Here, we demonstrate a detail protocol for the preparation of nanomaterials-embedded composite membranes and its application to the efficient and ion-selective removal of radioactive iodines. By using citrate-stabilized gold nanoparticles (mean diameter: 13 nm) and cellulose acetate membranes, gold nanoparticle-embedded cellulose acetate membranes (Au-CAM) have easily been fabricated. The nano-adsorbents on Au-CAM were highly stable in the presence of high concentration of inorganic salts and organic molecules. The iodide ions in aqueous solutions could rapidly be captured by this engineered membrane. Through a filtration process using an Au-CAM containing filter unit, excellent removal efficiency (&gt;99%) as well as ion-selective desalination result was achieved in a short time. Moreover, Au-CAM provided good reusability without significant decrease of its performances. These results suggested that the present technology using the engineered hybrid membrane will be a promising process for the large-scale decontamination of radioactive iodine from liquid wastes.

An efficient method for the rapid and ion-selective desalination of radioactive iodine in several aqueous solutions is described by using gold nanoparticles-immobilized cellulose acetate membrane filters.

金ナノ粒子に埋め込まれた膜フィルターを用いた放射性ヨウ素アニオン選択性淡水化の効率的な方法

Here, we demonstrate a detail protocol for the preparation of nanomaterials-embedded composite membranes and its application to the efficient and ...

Surface Mapping of Earth-like Exoplanets using Single Point Light Curves

Spatially resolving exoplanet features from single-point observations is essential for evaluating the potential habitability of exoplanets. The ultimate goal of this protocol is to determine whether these planetary worlds harbor geological features and/or climate systems. We present a method of extracting information from multi-wavelength single-point light curves and retrieving surface maps. It uses singular value decomposition (SVD) to separate sources that contribute to light curve variations and infer the existence of partially cloudy climate systems. Through analysis of the time series obtained from SVD, physical attributions of principal components (PCs) could be inferred without assumptions of any spectral properties. Combining with viewing geometry, it is feasible to reconstruct surface maps if one of the PCs are found to contain surface information. Degeneracy originated from convolution of the pixel geometry and spectrum information determines the quality of reconstructed surface maps, which requires the introduction of regularization. For the purpose of demonstrating the protocol, multi-wavelength light curves of Earth, which serves as a proxy exoplanet, are analyzed. Comparison between the results and the ground truth is presented to show the performance and limitation of the protocol. This work provides a benchmark for future generalization of exoplanet applications.

The protocol extracts information from light curves of exoplanets and constructs their surface maps. It uses light curves of Earth, which serves as a proxy exoplanet, to demonstrate the approach.

単一点光曲線を用いた地球系外惑星の表面マッピング

Spatially resolving exoplanet features from single-point observations is essential for evaluating the potential habitability of exoplanets. The ultimate ...