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The authors have nothing to disclose.

신생아 쥐에서 분리 된 주요 심근 긴 체외에서 심근의 기능을 연구하는 데 사용되었습니다. 이 프로토콜은 처음 4 ° C에서 트립신 O / N로 소화 한 후 정제 된 콜라게나, 두 단계의 효소 소화 방법을 사용하여 쥐의 새끼에서 신생아 심근의 분리하는 방법을 설명합니다. 정제 된 콜라겐 분해 공정을 이용하는 하나의 장점은 효소의 동일 등급 모두 아이솔레이션을 위해 사용된다는 점이다. 따라서, 고립 셀의 품질과 양을 실험하는 실험에서 일치한다. 세포 배양의 형질 도입의 효율이 높은 관련 실험에 필요한 경우, 아데노 바이러스와 연관된 높은 형질 도입 효율을 고려할 때, 아데노 바이러스를 사용하는 것이 더 낫다. 높은 수준의 형질 도입이 필요하지 않은 경우, 렌티 바이러스 벡터가 사용될 수있다. 아데노 바이러스 또는 렌티 바이러스 벡터를 사용하여 어느 하나의 옵션을 갖는 것은 쉽게 적절한 transd를 실현할 수있다유전자의 다른 유형에 대한 uction과 표현 수준. 형광 강도가 공 촛점 회전 디스크 현미경 또는 ICC를 사용하여 라이브 셀 이미징에 의해 검출 된 경우는이 문제를 해결할 수 있습니다 관심의 유전자를 표현하는 다른 프로모터를 사용하는 다른 렌티 바이러스 전이 벡터를 사용하여, 렌티 바이러스 전달 후 매우 낮습니다. WB에 의해 검출 된 밴드가 아데노 바이러스 전달 후 약한 경우 아데노 바이러스 벡터로, 이것은 낮은 역가의 바이러스 주식을 나타낼 수 있습니다. 그 경우, 진행하기 전에 세포의 증식에 의해 높은 역가 아데노 바이러스 용액을 제조하는 것이 좋다. 이 기술의 한 가지 제한은 정제 된 콜라게나 제를 사용하는 경우에도 격리 된 실행 가능한 심근의 수율은 실험 실험에서 매우 일관성이 없다는 것입니다. 재현성 이미징 실험을 수행하기 위하여, 단계 1.2.13의 상등액에서 격리 심장 근세포의 선택 후 생존 세포를 세는 것이 최상이다. 프로토콜 섹션. 그런 다음, 그 자체다양한 희석에 유리 바닥 요리에 심근 에드. 세포가 부착 한 후, 실험에 대한 적절한 세포 농도와 선택 요리는 계획을 세웠다. 신생아 심근를 사용하는 많은 장점이 있지만, 몇 가지 단점도 있습니다. 가장 큰 단점은 성인 심근에서 자신의 명확한 차이입니다. 완전 차별화 된 성인 심근는 막대 모양이며, 고립 된 신생아 기본 심근 모든 방향 36으로 확대하는 반면 고립 된 성인 차 심근는, 자신의 막대 모양의 형태를 유지한다. 고립 된 성인과 신생아 심근 사이의 표현형 차이는 유전자 발현 (37)의 자신의 패턴에 반영됩니다. 따라서 차별화 된 심근이 요구되는 실험을 위해, 성인 심근의 분리를위한 프로토콜 4 필요합니다. 재조합 아데노 바이러스 및 렌티 바이러스 전달을 사용공 촛점 회전 디스크 현미경과 함께 차 쥐 신생아 심근 세포에 단백질은 우리가 배양 라이브 기본 세포에서 단백질의 기능을 분석 할 수 있습니다. 세포로 관심의 유전자를 도입하는 형질을 활용 기존의 방법을 기준으로,이 프로토콜의 중요한 장점은 아데노 바이러스와 lentiviruses는 매우 효율적으로 거의 모든 세포에 대한 관심의 유전자의 발현의 결과로 세포에 의해 촬영되는 것입니다 문화. 또한, 유전자 발현을위한 바이러스의 2 종류의 사용은 쉽게 여러 유전자 적합한 형질 체크 및 발현 수준을 달성 할 수있다. siRNA를 화학 작용제 및 길항제는 또한 더 교란 및 유전자의 기능 및 그들 인코딩 단백질을 분석하기 위해 시스템에서 사용될 수있다. 마음의 준비는 프로토콜에 매우 중요한 단계입니다. 가능한 한 빨리 몸에서 마음을 제거합니다. 해야합니다세포 생존 능력을 높게 유지하기 위해 즉시 얼음에 넣어. 또 다른 중요한 단계는 높은 품질, 역가, 아데노 바이러스 / 렌티 바이러스 주식의 준비입니다. 열등 보유 바이러스가 사용되는 경우, 관심의 유전자의 형질 도입 및 발현 수준은 낮을 것이다. 따라서, 그들은 이미징 연구에 적합하지 않을 수 있습니다. 이 기술의 중요한 미래의 응용 프로그램은 마우스의 심근에서의 &#39;사용됩니다. 이 방법은 마우스 신생아 심근의 분리에 사용할 수 있는지 여부를 시험 연구 시험은 유망한 결과를 낳았다. 때문에 쥐에 비해 마우스 마음의 상대적으로 작은 크기로, 작은 조직은 초기에 얻을 수있다. 따라서, 더 적은 세포가 동일 동물의 개수 단순히 분리를 위해 더 생쥐를 사용하는 것은이 장애물을 제거해야를 사용하여 단일 과정에서 격리된다. 쥐 심근 세포를 분리 할 수​​있는 능력은 연구자들이 유전자 변형 m으로부터 격리 세포의 기능을 조사 할 수얼음 (형질 전환, 녹아웃, 노크에있는) 그 유전자의 특정 양식을 연구하기 위해 제작되었다고. 심혈관 연구에서 주요 장애물 중 하나는 실시간으로 생체 내 심장 조직에서 발현 관련 유전자의 발현 및 기능을 연구와 관련된 어려움이다. 그러나 기능적인 박동 심근를 분리 바이러스 전달을 사용하여 세포의 기능을 조절하고 공 촛점 회전 디스크 현미경을 사용하여 실시간으로 공부를 할 수있는 능력은 생체 내에서 심근의 역할을 밝혀이 격차를 해소하는 데 도움이됩니다. 이 방법은 세포 수준에서 심근 기능을 이해하기위한 단순화 된 시스템을 제공한다. 이는 유전자 발현의 섭동은 심근 기능을 변경하는 방법의 실시간 분석을 허용한다. 심근의 라이브 세포 이미징은 심근 기능에 추가 통찰력을 제공 할 것입니다. 이러한 통찰력은 기본 cardiovascula의 발전으로 이어질 것입니다심혈관 질환의 치료를위한 새로운 치료법의 결과 R 연구.

차 쥐 신생아 심근 긴 시험관 1에 심근 기능을 조사하는 데 사용되었다. 그들은 몇 가지 잘 설립 방법 2-4으로 쥐 새끼에서 분리하기 쉽다. 가장 일반적인 방법은 콜라게나 또는 이전의 세포 격리에 심장의 결합 조직을 소화 트립신을 사용합니다. 연구원은 또한 성인 설치류 5-8뿐만 아니라 신생아 마우스 9,10에서 심근 세포를 분리하는 방법을 개발했습니다. 이 프로토콜은 두 단계의 효소 분해 절차를 이용하는, 신생아 래트 새끼로부터 심근 세포를 분리하는 방법을 설명한다. 트립신은 처음 4 ° C에서 O / N을 사용하고, 37 ℃에서 다음 정제 된 콜라게나된다 4 ° C에서 트립신 O / N과 심장 조직의 배양은 따뜻한 효소 용액 2 연속 배양을 사용하는 방법에 비해 수확 세포에 필요한 단계를 줄일 수 있습니다. 또, 정제 된 CO를 이용하여llagenase 오히려 조 효소보다는, 로트 간 변동 따라서 향상된 재현성을 제공하고, 제거 할 수있다. 특정 단백질의 기능 연구는 종종 아데노 11-13 및 / 또는 14-16 렌티 바이러스를 이용하여 단백질 발현 시스템을 사용한다. [주의 메시지] 바이러스 생산 및 조작은 NIH의 지침에 따라 수행되어야한다. 아데노 바이러스는 숙주의 게놈에 통합되지 않습니다. 이는 분할 셀과 비 분할 세포를 포함하여 대부분의 세포 유형뿐만 아니라 일차 전지 및 확립 세포주에서의 형질 도입 매우 높은 효율을 갖는다. 이 아데노 바이러스 유전자 발현에 대한 신뢰할 수있는 벡터합니다. 아데노 바이러스 벡터에 의해 부호화 된 단백질의 높은 수준의 전달 다음 48 시간 내에 개발하고, 그들은 몇 주 동안 17 일을 지속 할 수있다. 그러나, 단백질 발현 아데노 바이러스를 사용하는 하나의 단점은 재조합 ADE의 개발novirus은 복잡하고 시간 소모적이다. 많은 연구자들은 재조합 유전자 발현에 lentiviruses에 의존 한 이유 단점은 부분적으로 설명합니다. 아데노 바이러스 구조와는 달리, 렌티 바이러스의 구조를 생성하는 것은 빠르고 쉽습니다. lentiviruses 전체적으로 모두 분할 및 비 - 분할 세포에서 아데노 바이러스 형질 도입의보다 낮은 효율을 가지고 있지만, 그들은 숙주 게놈에 통합 않는다. 결과적으로, 형질 도입 유전자의 발현은 아데노 바이러스에 비해 lentiviruses에 안정됩니다. 때문에, 현미경의 분야에서의 기술 진보로, 그것은 재조합 단백질을 발현하는 세포의 생균 이미지를 캡처하는 것이 훨씬 쉽다. 이도 취득 비디오 레이트 속도로 진정한 보유하고 있습니다. 이 조사는 관심의 단백질의 특정 변경이 기능적으로 실시간으로 세포에 영향을 미칠 방법을 결정 할 수 있습니다. 공 촛점 회전 디스크 현미경은 리브을위한 최적의 기술을 만드는 몇 가지 주요 기능을 가지고 있습니다전자 이미징 셀 (18, 19). 동시에 점 스캔 공 초점 현미경보다 훨씬 적은 레이저 파워를 이용하면서 요꼬 회전 디스크는, 훨씬 더 빠른 이미지 수집을 허용한다. 이러한 특징 모두는 레이저가 시료에 동시에 통과하는 다수의 구멍을 포함 촛점 스피닝 디스크에 기인한다. 획득 동안, 디스크 자체가 신속하고 지속적으로 18-20을 회전시킨다. 현미경의 자동 초점 시스템을 사용함으로써, 안정된 포커스는 장기간에 걸쳐 유지된다. 이 연구원은 잘 초점을 맞춘 라이브 셀 이미지를 촬영할 수 있습니다. 획득 된 영상을 동영상 파일로 재생됩니다. 이미지는 그러한 ImageJ에 21,22 피지 23, 또는 다른 상업적으로 이용 가능한 소프트웨어로 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 분석된다.

<table><tbody><tr><td>1 Scissors for decapitation</td><td>WPI</td><td>501749</td><td>Autoclave before use</td></tr><tr><td>1 Fine scissors for heart isolation and chopping</td><td>WPI</td><td>14393</td><td>Autoclave before use</td></tr><tr><td>2 Fine forceps (Dumont No. 5)</td><td>Sigma</td><td>F6521</td><td>Autoclave before use</td></tr><tr><td>3 Sterilized 10 cm plastic dishes</td><td>Sigma</td><td>CLS430165</td><td>For heart isolation</td></tr><tr><td>3.5 cm Glass bottom culture dishes</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td>For final plating of cardiomyocytes for future live cell imaging. Micro-Dishes from ibidi are an acceptable alternative.</td></tr><tr><td>3.5 cm Glass bottom culture dishes</td><td>MatTek</td><td>P35G-0.17-14-C</td><td>For TIRF or high resolution image</td></tr><tr><td>Ethanol solution, 70% (v/v) in water</td><td>Sigma</td><td>E7148</td><td></td></tr><tr><td>2% Gelatin</td><td>Sigma</td><td>G1393</td><td></td></tr><tr><td>1 Sterilized 10 cm plastic dish</td><td>Sigma</td><td>CLS430165</td><td>For trypsinization</td></tr><tr><td>Aluminium foil</td><td>Any brand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma</td><td>P7543</td><td></td></tr><tr><td>Two 10 cm plastic cell culture dish</td><td>Sigma</td><td>CLS430165</td><td>For selection</td></tr><tr><td>Autopipette</td><td>Drummond Scientific</td><td>4-000-300</td><td>For trituration</td></tr><tr><td>Cell counter</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cellometer, automated cell counter</td><td>nexcelom</td><td></td><td>To check and count cells</td></tr><tr><td>Microscope and hematocytometer</td><td>Any brand</td><td></td><td>To check and count cells</td></tr><tr><td>Trypan blue solution, 0.4%</td><td>invitrogen</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator</td><td>Sanyo</td><td>MCO-19AIC</td><td></td></tr><tr><td>Incubating orbital shaker</td><td>Sigma</td><td>Z673129</td><td>To shake heart tissue with collagenase at 37 &amp;deg;C at 170-200 rpm</td></tr><tr><td>10 mg/ml BrdU solution</td><td>BD Pharmingen</td><td>550891</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, high glucose</td><td>invitrogen</td><td>41965039</td><td>Mix medium as indicated in the protocol and warm before use</td></tr><tr><td>MEM</td><td>invitrogen</td><td>31095029</td><td>Mix medium as indicated in the protocol and warm before use</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>invitrogen</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin (10,000 U/ml)&amp;nbsp;</td><td>invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Section 2 Lentiviral transduction</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3 Packaging plasmids</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMDLg/pRRE</td><td>Addgene</td><td>12251</td><td></td></tr><tr><td>pRSV-Rev</td><td>Addgene</td><td>12253</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>The lentiviral transfer vector, pLVX-IRES-Puro</td><td>Clontech</td><td>632183</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM (serum-free medium)</td><td>invitrogen</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Transfection reagent</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>polyethyleneimine&amp;ldquo;Max&amp;rdquo;, (MW 40,000) - High Potency Linear PEI (Equivalent to Mw 25,000 in Free Base Form)&amp;nbsp;</td><td>Polysciences</td><td>24765-2</td><td>It can be substituted with X-tremeGENE 9 from Roche</td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9</td><td>Roche</td><td>6365779001</td><td>substitute for PEI as transfection reagent</td></tr><tr><td>Chloroquine</td><td>Sigma</td><td>C6628</td><td>Dissolve in water and make 100 mM stock solution. Inhibition of endosomal acidification can be achieved with 10-100 &amp;mu;M Chloroquine.</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Luer-Lok syringe, sterilized</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &amp;mu;m filters</td><td>Sigma</td><td>F8677</td><td>Use only cellulose acetate or polyethersulfone (PES) (low protein binding) filters. Do not use nitrocellulose filters. Nitrocellulose binds surface proteins on the lentiviral envelope and destroys the virus.</td></tr><tr><td>Hexadimethrine bromide</td><td>Sigma</td><td>H9268</td><td>Dissolve in water and make 8 mg/ml stock solution, then filter it to sterilize.</td></tr><tr><td>Polyethylene glycol 6,000</td><td>Sigma</td><td>81260</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Sigma</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Section 3 Adenoviral transduction</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK 293T cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>Some 10 cm cell culture dishes</td><td>Sigma</td><td>CLS430165</td><td></td></tr><tr><td>96-Well microplate with lid, flat-bottom, tissue culture, sterile</td><td>BD Falcon</td><td>353072</td><td>For titration</td></tr><tr><td>Multichannel pipette, 10-100 &amp;mu;l, 8-channel</td><td>eppendorf</td><td>3122 000.035</td><td></td></tr><tr><td>Section 4 Live cell imaging</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spinning disk confocal microspopy</td><td>PerkinElmer</td><td>L7267000</td><td></td></tr><tr><td>A temperature-controlled chamber</td><td>Any brand</td><td></td><td>To keep temperature at 37 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>A CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; environmental system</td><td>Any brand</td><td></td><td>Optional to maintain CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; concentration optimal</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Independent medium, no glutamine</td><td>invitrogen</td><td>18045-054&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>For long time time-lapse imaging</td></tr><tr><td>DMEM, high glucose, HEPES, no phenol red</td><td>invitrogen</td><td>21063-029</td><td>For long time time-lapse imaging</td></tr></tbody></table>

live cell imaging of primary rat neonatal cardiomyocytes following adenoviral and lentiviral transduction using confocal spinning disk microscopy

그들은 쉽게 하나의 절차에 많은 수에서 고립 될 수 있기 때문에 기본 쥐 신생아 심근 세포는 체외 심장 혈관 연구의 기본에 유용합니다. 인해 현미경 기술의 발전으로는 세포에 대하여 최소한의 광독성 우려 실시간으로 세포 사건을 조사하는 목적으로 생균 이미지를 캡처하는 비교적 용이하다. 이 프로토콜은 세포의 특성을 조절하는 렌티 바이러스 및 아데노 바이러스 전달 다음 공 촛점 회전 디스크 현미경을 사용하여 기본 쥐 신생아 심근 세포 라이브 인터벌 영상을 촬영하는 방법에 대해 설명합니다. 바이러스의 2 종류의 애플리케이션이 쉽게 두 개의 다른 유전자에 대한 적절한 전달 속도 및 발현 수준을 달성 할 수있다. 잘 집중 생균 이미지는 오랜 기간 동안 안정을 유지 초점 현미경의 자동 초점 시스템을 사용하여 얻을 수있다. 이 방법을 적용, 외생 적 엔지니어의 기능일차 배양 된 세포에서 발현 에드 단백질은 분석 될 수있다. 또한,이 시스템은 siRNA를 사용을 통해뿐만 아니라 화학 조절제의 유전자의 기능을 검사하는 데 사용될 수있다.

기술, 렌티 바이러스 부호화 EGFP (강화 된 녹색 형광 단백질) 태그 Cx43 (connexin43에) 또는 세포에서 EGFP-태그 된 단백질을 표현하는 데 사용 된 돌연변이 Cx43 (32), 및 아데노 인코딩 FGFR1DN (섬유 아세포 성장 인자 수용체 1 우성 네거티브를 설명하기 위해 ) 세포 33-35에서 FGF 신호를 종료하는 데 사용되었다. 심근 세포의 분리는 다음과 같은 세 가지 일, 절연은 심근 세포에서 EGFP-태그 된 단백질을 표현하기 위해 렌티 바이러스로 형질 도입 하였다. 그런 렌티 바이러스 형질 도입 3 일 후에, 절연 심근 더욱 세포에서 FGF 신호를 제거하기 위해 아데노 인코딩 FGFR1DN 형질 도입 하였다. 형질 도입 된 외래 유전자를 표현하는 세포에 대한 충분한 시간을 허용 한 후, 회전 디스크 공 초점 현미경은 생균 이미지를 캡처하는 데 사용되었다. 획득 된 영상을 동영상 파일로 재생 및 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 분석된다. 자세한 표상에 대한TIVE 결과 사쿠라이 등 32를 참조하십시오. EGFP의 발현 렌티 바이러스 전달이 렌티 바이러스 전달도 1A-B 다음 공 촛점 회전 디스크 현미경 72 시간에 의해 확인 된 다음 단백질을 태그. 아데노 바이러스 전달하여 FGFR1DN의 발현 아데노 바이러스 전달도 1C-D의 24 시간 후 WB와 ICC에 의해 확인되었다. 3.5 cm의 요리에 아데노 바이러스뿐만 아니라의 시간은 이미지를 37 ˚ C에서 온도를 유지하기 위해 실 히터를 사용하여 40 배 공기 NA 0.9 대물 렌즈와 6 시간마다 5 분을 취득한 시간 0 시간 경과로 정의 하였다 공 촛점 회전 디스크 현미경으로 촬영 차 심근에서 EGFP - 태그 단백질의 시간 경과 이미지는 보충 영화 1-2에 나와 있습니다. 의 경우, 온도 평형이 충분하지 않았거나 여러 획득 모드가 제대로 작동하지 않은 곳적절하게 자동 초점 시스템을 안정적으로 유지 초점을 작업 할 때 촬영 한 이미지는 그러나. xy 평면 보충 영화 1 이동할 수 있으며이 발생하지 않았다. 온도 평형 충분한이고 또한 하나의 영역이 취득한 기업 영화 2에 나타낸 바와 같이, 캡쳐 된 이미지는 매우 고품질이다. 심근의 고동은 세포 생존 능력을 확인하기 위해 장기간의 시간 경과 라이브 세포 이미징 후 평가되었다. 시간 경과 영상 EGFP 표현 심근의 16 시간은 기능적 특성을 유지하고 리드미컬 보충 영화 3를 이길 후에도. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51666/51666fig1highres.jpg" width="500" /> 렌티 바이러스 또는 아데노 바이러스 전달 다음 단백질 발현의 그림 1. 확인. </stronG&gt; (A) Cx43-WT-EGFP을 표현 고립 된 쥐 신생아 심근는 3 일 전달 후 광고 FGFR1DN 형질 도입. 또한 보충 영화 1을 참조하십시오. (B) 삼일 전달 후 광고 FGFR1DN 형질 도입 Cx43-S325/328/330E (3SE)-EGFP을 표현 고립 된 쥐 신생아 심근. 전달 후 ICC 24 시간에 의해 검출 된 아데노 바이러스 전달 다음 보충 영화 2를 참조하십시오. (C) 단백질의 발현. 전달 후 WB 24 시간에 의해 검출 된 아데노 바이러스 전달 다음 FGFR1DN 단백질 헤 마글 루티 닌 (HA) 단백질 태그 FGFR1DN는 기존의 ICC 방법을 사용하여 항-HA 항체가 검출 된 알파 - 티닌이 심근 마커로 사용되었다. (D) 식입니다. HA-태그 FGFR1DN는 WB에 의해 항-HA 항체에 의해 검출 된, β-튜 불린은 로딩 대조군으로 사용 하였다. 고립 된 쥐 신생아 차의 보충 영화 1. 시간 경과 영상<html> 광고 FGFR1DN 형질 도입 Cx43-WT-EGFP을 표현 diomyocytes은. 시간 경과 이미지는 40 배 대물 렌즈 촛점 회전 디스크의 현미경으로 6 시간 동안 5 분 간격으로 획득했다. 획득 된 영상은 초당 10 프레임의 동영상으로 재생되었다. 이 영화는 사쿠라이 등 32에서 수정되었습니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51666/s_movie1_2.mov" target="_blank">이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 보충 영화 2. 광고 FGFR1DN 형질 도입 Cx43-S325/328/330E-EGFP을 표현 고립 된 쥐 신생아 심근의 시간 경과 영상. 시간 경과 이미지는 공 촛점 6 시간마다 5 분은 40 배 대물 렌즈로 취득한 디스크 현미경을 회전합니다. 획득 된 영상은 초당 10 프레임의 동영상으로 재생되었다. 이 영화는 사쿠라이 등 32에서 수정되었습니다.&quot;대상 =&quot;_blank &quot;는&gt;이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오. 고립 된 쥐 신생아 심근의 보충 영화 3. 시간 경과 영상은 다시 실제 속도로 연주했다. 광고 FGFR1DN가 10의 40 배 대물 렌즈로 모든 200 밀리 초를 취득한 형질 도입 Cx43-EGFP을 표현 고립 된 쥐 신생아 심근의 시간 경과 이미지 시간 경과 취득의 16 시간을 다음 공 촛점 회전 디스크 현미경 초. 획득 이미지가 실제 속도에서 초당 5 프레임의 동영상으로 재생되었다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51666/s_movie3.MOV" target="_blank">이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Live Cell Imaging of Primary Rat Neonatal Cardiomyocytes Following Adenoviral and Lentiviral Transduction Using Confocal Spinning Disk Microscopy

This protocol describes a method of live cell imaging using primary rat neonatal cardiomyocytes following lentiviral and adenoviral transduction using confocal spinning disk microscopy. This enables detailed observations of cellular processes in living cardiomyocytes.

차 쥐 신생아 심근 라이브 셀 이미징은 아데노 바이러스 다음과 렌티 바이러스 형질 도입은 공 초점 현미경 디스크를 회전시키는 사용

Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

13.5K 조회수.  Max-Planck-Institute for Molecular Biomedicine and Institute of Cell Biology. This protocol describes a method of live cell imaging using primary rat neonatal cardiomyocytes following lentiviral and adenoviral transduction using confocal spinning disk microscopy. This enables detailed observations of cellular processes in living cardiomyocytes.

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Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated discs, and costameres requires the coordinated assembly of multiple components in time and space. Disruption in assembly of these components leads to developmental heart defects. Immunofluorescent staining techniques are used commonly in cultured cardiomyocytes to probe myofibril maturation, but this ex vivo approach is limited by the extent to which myocytes will fully differentiate in culture, lack of normal in vivo mechanical inputs, and absence of endocardial cues. Application of immunofluorescence techniques to the study of developing mouse heart is desirable but more technically challenging, and methods often lack sufficient sensitivity and resolution to visualize sarcomeres in the early stages of heart development. Here, we describe a robust and reproducible method to co-immunostain multiple proteins or to co-visualize a fluorescent protein with immunofluorescent staining in the embryonic mouse heart and use this method to analyze developing myofibrils, intercalated discs, and costameres. This method can be further applied to assess cardiomyocyte structural changes caused by mutations that lead to developmental heart defects.

Mutations that lead to congenital heart defects benefit from in vivo investigation of cardiac structure during development, but high-resolution structural studies in the mouse embryonic heart are technically challenging. Here we present a robust immunofluorescence and image analysis method to assess cardiomyocyte-specific structures in the developing mouse heart.

배아 마우스 마음에 면역 형광을 이용하여 심근 개발 분석

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

연구

발생학

Isolation and Cryopreservation of Neonatal Rat Cardiomyocytes

Cell culture has become increasingly important in cardiac research, but due to the limited proliferation of cardiomyocytes, culturing cardiomyocytes is difficult and time consuming. The most commonly used cells are neonatal rat cardiomyocytes (NRCMs), which require isolation every time cells are needed. The birth of the rats can be unpredictable. Cryopreservation is proposed to allow for cells to be stored until needed, yet freezing/thawing methods for primary cardiomyocytes are challenging due to the sensitivity of the cells. Using the proper cryoprotectant, dimethyl sulfoxide (DMSO), cryopreservation was achieved. By slowly extracting the DMSO while thawing the cells, cultures were obtained with viable NRCMs. NRCM phenotype was verified using immunocytochemistry staining for &#945;-sarcomeric actinin. In addition, cells also showed spontaneous contraction after several days in culture. Cell viability after thawing was acceptable at 40-60%. In spite of this, the methods outlined allow one to easily cryopreserve and thaw NRCMs. This gives researchers a greater amount of flexibility in planning experiments as well as reducing the use of animals.

The isolation of neonatal rat cardiomyocytes is a time consuming and unpredictable procedure. This study describes methods for cryopreservation and thawing of neonatal rat cardiomyocytes that allows for more efficient use of cells. The thawed NRCMs can be used for various experiments without the need for performing isolations each time.

분리 및 신생아 쥐 심근 세포의 냉동 보존

Cell culture has become increasingly important in cardiac research, but due to the limited proliferation of cardiomyocytes, culturing cardiomyocytes is ...

Visualization of Cell Cycle Variations and Determination of Nucleation in Postnatal Cardiomyocytes

Cardiomyocytes are prone to variations of the cell cycle, such as endoreduplication (continuing rounds of DNA synthesis without karyokinesis and cytokinesis) and acytokinetic mitosis (karyokinesis but no cytokinesis). Such atypical cell cycle variations result in polyploid and multinucleated cells rather than in cell division. Therefore, to determine cardiac turnover and regeneration, it is of crucial importance to correctly identify cardiomyocyte nuclei, the number of nuclei per cell, and their cell cycle status. This is especially true for the use of nuclear markers for identifying cell cycle activity, such as thymidine analogues Ki-67, PCNA, or pHH3. Here, we present methods for recognizing cardiomyocytes and their nuclearity and for determining their cell cycle activity. We use two published transgenic systems: the Myh6-H2B-mCh transgenic mouse line, for the unequivocal identification of cardiomyocyte nuclei, and the CAG-eGFP-anillin mouse line, for distinguishing cell division from cell cycle variations. Combined together, these two systems ease the study of cardiac regeneration and plasticity.

To distinguish cell division from cell cycle variations in cardiomyocytes, we present protocols using two transgenic mouse lines: Myh6-H2B-mCh transgenic mice, for the unequivocal identification of cardiomyocyte nuclei, and CAG-eGFP-anillin mice, for distinguishing cell division from cell cycle variations.

출생 후 심근 세포의 세포주기 변화의 시각화 및 핵의 결정

Cardiomyocytes are prone to variations of the cell cycle, such as endoreduplication (continuing rounds of DNA synthesis without karyokinesis and ...

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and a working heart on the other. Thus, cardiomyocytes serve as good models for cardiac cellular physiology and pathophysiology, for pharmaceutical investigations as well as for the exploration of transgenic animal models. Here we describe a method of isolating the cells from the heart. Furthermore we show how a genetic manipulation on cardiac myocytes can be performed without breeding a transgenic animal: This is the combination of long term culture (1 week) and adenoviral gene transfer. The latter one is described from the construction of the virus to the transduction of the cells. It can be used for the expression of genetically encoded biosensors (GEBs), fluorescent fusion proteins, but also for protein over expression and down regulation, e.g. using RNAi. Here we provide an example for the expression of a fusion protein staining a subcellular structure (Golgi). Such protein expression can be visualized by confocal imaging of z-stacks for a 3D-reconstruction of subcellular structures. The protocol comprises state-of-the-art in cell culture, molecular biology and biophysics and thus provides an approach for exploring new horizons in cellular cardiology.

Adult cardiac myocytes are primary cells that can be isolated from animal hearts and cultured for several days. Within this culture period adenoviral gene transfer can be used to express genetically encoded biosensors (GEBs) or fluorescent fusion proteins. Both approaches allow cellular investigations by means of confocal microscopy.

공촛점 이미징에 대한 분리 및 성인 심장 Myocytes의 유전자 조작

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

생물학

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. Technological advances have identified these structures as key elements in neuron connectivity and synaptic plasticity. The quantitative analysis of spine morphology using light microscopy remains an essential problem due to technical limitations associated with light's intrinsic refraction limit. Dendritic spines can be readily identified by confocal laser-scanning fluorescence microscopy. However, measuring subtle changes in the shape and size of spines is difficult because spine dimensions other than length are usually smaller than conventional optical resolution fixed by light microscopy's theoretical resolution limit of 200 nm.
Several recently developed super resolution techniques have been used to image cellular structures smaller than the 200 nm, including dendritic spines. These techniques are based on classical far-field operations and therefore allow the use of existing sample preparation methods and to image beyond the surface of a specimen. Described here is a working protocol to apply super resolution structured illumination microscopy (SIM) to the imaging of dendritic spines in primary hippocampal neuron cultures. Possible applications of SIM overlap with those of confocal microscopy. However, the two techniques present different applicability. SIM offers higher effective lateral resolution, while confocal microscopy, due to the usage of a physical pinhole, achieves resolution improvement at the expense of removal of out of focus light. In this protocol, primary neurons are cultured on glass coverslips using a standard protocol, transfected with DNA plasmids encoding fluorescent proteins and imaged using SIM. The whole protocol described herein takes approximately 2 weeks, because dendritic spines are imaged after 16-17 days in vitro, when dendritic development is optimal. After completion of the protocol, dendritic spines can be reconstructed in 3D from series of SIM image stacks using specialized software.

This article describes a working protocol to image dendritic spines from hippocampal neurons in vitro using Structured Illumination Microscopy (SIM). Super-resolution microscopy using SIM provides image resolution significantly beyond the light diffraction limit in all three spatial dimensions, allowing the imaging of individual dendritic spines with improved detail.

구조적 조명 현미경을 사용하여 쥐 차 해마 신경 세포의 돌기 쪽 이미징

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

신경과학

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

개발 마우스 배아의 피질 유사 분열의 라이브 영상

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포에서 단세포 광학 작용 잠재적 측정

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

생체공학

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow for easy investigation and manipulation of biochemical pathways, and their effect on the biomechanical properties of spontaneously beating cardiomyocytes.	
The following 2-day protocol describes the isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. We show how to easily dissect hearts from neonates, dissociate the cardiac tissue and enrich cardiomyocytes from the cardiac cell-population. We discuss the usage of different enzyme mixes for cell-dissociation, and their effects on cell-viability. The isolated cardiomyocytes can be subsequently used for a variety of morphological, electrophysiological, biochemical, cell-biological or biomechanical assays. We optimized the protocol for robustness and reproducibility, by using only commercially available solutions and enzyme mixes that show little lot-to-lot variability. We also address common problems associated with the isolation and culture of cardiomyocytes, and offer a variety of options for the optimization of isolation and culture conditions.

Primary mouse cardiomyocyte cultures are one of the pivotal tools for the investigation of myofibrillar organization and function. The following protocol describes the isolation and culture of primary cardiomyocytes from neonatal mouse hearts. The resulting cardiomyocyte cultures may be subsequently used for a variety of biomechanical, biochemical and cell-biological assays.

분리 및 문화 신생아 마우스 심근

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

STED 현미경을 사용한 뉴런의 미토콘드리아 초세구조 규명

Using Live Cell STED Imaging to Visualize Mitochondrial Inner Membrane Ultrastructure in Neuronal Cell Models

Mitochondria play many essential roles in the cell, including energy production, regulation of Ca2+ homeostasis, lipid biosynthesis, and production of reactive oxygen species (ROS). These mitochondria-mediated processes take on specialized roles in neurons, coordinating aerobic metabolism to meet the high energy demands of these cells, modulating Ca2+ signaling, providing lipids for axon growth and regeneration, and tuning ROS production for neuronal development and function. Mitochondrial dysfunction is therefore a central driver in neurodegenerative diseases. Mitochondrial structure and function are inextricably linked. The morphologically complex inner membrane with structural infolds called cristae harbors many molecular systems that perform the signature processes of the mitochondrion. The architectural features of the inner membrane are ultrastructural and therefore, too small to be visualized by traditional diffraction-limited resolved microscopy. Thus, most insights on mitochondrial ultrastructure have come from electron microscopy on fixed samples. However, emerging technologies in super-resolution fluorescence microscopy now provide resolution down to tens of nanometers, allowing visualization of ultrastructural features in live cells. Super-resolution imaging therefore offers an unprecedented ability to directly image fine details of mitochondrial structure, nanoscale protein distributions, and cristae dynamics, providing fundamental new insights that link mitochondria to human health and disease. This protocol presents the use of stimulated emission depletion (STED) super-resolution microscopy to visualize the mitochondrial ultrastructure of live human neuroblastoma cells and primary rat neurons. This procedure is organized into five sections: (1) growth and differentiation of the SH-SY5Y cell line, (2) isolation, plating, and growth of primary rat hippocampal neurons, (3) procedures for staining cells for live STED imaging, (4) procedures for live cell STED experiments using a STED microscope&#160;for reference, and (5) guidance for segmentation and image processing using examples to measure and quantify morphological features of the inner membrane.

저자 스포트라이트: 미토콘드리아 노화 해독 

This protocol presents a workflow for the propagation, differentiation, and staining of cultured SH-SY5Y cells and primary rat hippocampal neurons for mitochondrial ultrastructure visualization and analysis using stimulated emission depletion (STED) microscopy.

신경 세포 모델에서 미토콘드리아 내막 초세구조를 시각화하기 위한 라이브 셀 STED 이미징 사용

Mitochondria play many essential roles in the cell, including energy production, regulation of Ca2+ homeostasis, lipid biosynthesis, and production of ...

차 쥐 신생아 심근 라이브 셀 이미징은 아데노 바이러스 다음과 렌티 바이러스 형질 도입은 공 초점 현미경 디스크를 회전시키는 사용

요약

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배아 마우스 마음에 면역 형광을 이용하여 심근 개발 분석

분리 및 신생아 쥐 심근 세포의 냉동 보존

출생 후 심근 세포의 세포주기 변화의 시각화 및 핵의 결정

공촛점 이미징에 대한 분리 및 성인 심장 Myocytes의 유전자 조작

구조적 조명 현미경을 사용하여 쥐 차 해마 신경 세포의 돌기 쪽 이미징

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신경 세포 모델에서 미토콘드리아 내막 초세구조를 시각화하기 위한 라이브 셀 STED 이미징 사용

신경 세포 모델에서 미토콘드리아 내막 초세구조를 시각화하기 위한 라이브 셀 STED 이미징 사용