우리는 원고에 대한 가치있는 토론을위한 이명박 실험실의 구성원을 감사드립니다. 이명박 실험실에서 작업 세포 연구 기금 (TEDCO를) 줄기 뉴욕 줄기 세포 재단의 로버트슨 조사자 포상에서 메릴랜드에서 교부금에 의해 지원되었다.

1. 셀의 제조 및 미디어 (주 1) <ol><li> 문화 DMEM 매체는 10 % FBS가 포함 된 인간의 섬유 아세포를 확장합니다. </li><li> 플레이트 인간의 섬유 아 세포 전달 전날에 잘 당 적절한 밀도로 24 웰 플레이트 상에 (그림 1). 참고 : 다른 종류의 세포가 다른 첨부 파일 기능을 가지고 있기 때문에 다음과 같은 일련의 희석액 (200K, 100K, 50K, 25K, 12.5K 및 6.25K)을 권장합니다. </li><li> 세포가 완전히 준수 및 확장이 보장, 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에서 하루 더의 세포를 품어. </li></ol> 2. 형질을 수행합니다 (2 일) <ol><li> 형질 도입의 날에, 세포 밀도를 확인하고 가장 효율적인 밀도 웰 (도 2)을 선택했다. 높은 (80 ~ 90 %), 중 (50 ~ 70 %)과 낮은 (20 ~ 40 %)의 세 가지 다른 밀도를 선택하는 것이 좋습니다. </li><li> 1 시간 이상 전달하기 전에, fibrobl를 대기음AST의 세포에서 미디어와 섬유 아세포 매체의 새로운 300 μl를 변경합니다. </li><li> -80 ° C 저장에서 4 개의 다른 센다이 바이러스 튜브의 한 세트를 제거합니다. 몇 초 동안 37 ° C의 물 배스 동시에 각 튜브를 해동하고 수욕으로부터 튜브를 가지고. 그 후, 실온까지 이들을 해동; 원심 분리기 10 초 동안 6,000 XG에 튜브 및 사용까지 얼음에 배치합니다. 동결을 다시 및 역가가 유지되지 않으므로 바이러스를 해동하지 마십시오. </li><li> 마이크로 원심 분리기 튜브에 네 센다이 바이러스 튜브 (10 월 - 4, KLF-4, C-Myc와와 삭스-2)의 각각의 지정된 볼륨을 추가합니다. 용액을 부드럽게 피펫 팅하여 잘 혼합되어 있는지 확인합니다. 예를 들어, 전달 24 - 웰 플레이트 lookwell의 50K 세포 / 잘 하나 : (생활 기술에서 분석의 인증서를 기반으로 역가가 배치에서 배치에 차이가있을 수 있습니다) 튜브 hOct-4 = 6.0 × 10 7 CIU, 3 MOI 5 μl를 = 튜브 hSox-2 = 6.5 × 10 7 CIU, 3 MOI는 = 4.6 μ; L 튜브 hKlf-4 = 6.3 × 10 7 CIU, 3 MOI = 4.8 μL 튜브 HC-Myc와 = 7.8 × 10 7 CIU, 3 MOI = 3.8 μL 총 = 24 - 웰 플레이트의 네 가지 바이러스 요인 혼합물 / 잘 하나 (50K 세포)의 18.2 μL </li><li> 세포 밀도에 따라; 2X, 1X, 그리고 잘에 바이러스 혼합물의 0.5X 볼륨을 추가합니다. 부드럽게, 플레이트 앞뒤 흔들어 좌우 (2X : 바이러스 혼합물, 1X의 36.4 μL : 18.2 μL와 0.5X : 9.1 μL). </li><li> 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에서 세포를 놓고 밤새 품어. </li></ol> 3. 문화 매체의 교체 (3 일 · 5 일) <ol><li> 24 시간 전달 후, 500 ㎕의 신선한 섬유 아세포 매체와 매체를 교체하십시오. </li><li> 5 일에, 신선한 섬유 아세포 미디어와 중간 변경합니다. </li></ol> 4. 공동 문화 MEF 요리를 준비 (8 일) <ol><li> 10 % 60mm 배양 접시에 MEF 세포를 준비 FBS는 DMEM 매체 하나 다 포함MEF 피더 세포에 형질 도입 된 섬유 아 세포를 계대 전에 Y. 참고 : 우리는 각 60mm 접시에 MEF의 5 × 5를 사용하고 있습니다. </li></ol> 5. 시작 공동 문화 MEF 피더 세포 (9 일)으로 세포를 형질 도입 <ol><li> 형질 세포를 도금하기 전에 대기음 10 % FBS는 MEF 피더 요리에서 DMEM 매체를 포함하고 FBS는 DMEM 매체를 포함 신선한 10 %를 추가합니다. </li><li> 24 - 웰 플레이트에 있고 D-PBS로 한 번 세포를 씻어 형질 섬유 아 세포에서 매체를 제거합니다. 24 - 웰 플레이트 기계가 섬유 아세포의 세포에 0.25 % 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 200 μl를 추가합니다. 세포가 플레이트에서 분리하기 시작할 때 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 미만 5 분 배양 후, 15 ML 원뿔 튜브에 성장 매체와 세포를 수집합니다. 그런 다음 4 분 6,000 XG에서 그들을 원심 분리기. 참고 : 2X, 1X, 0.5X 및 바이러스를 풀링은 형질 섬유 아세포를 권장합니다. </li><li> 뜨는 매체를 제거하고 다시 중단에 씻어트립신의 중화를위한 신선한 섬유 아세포 배지 중에서 4-5 ㎖를 가진 세포 펠렛. 그런 다음 4 분 동안 135 XG에이를 원심 분리. </li><li> 예 : 1 / 2, 1 / 4, 1 / 8, 1 / 16, 1 / 32, 1 / 64, 및 백이십팔분의 일 60 당 : 시리얼 희석 밀도 및 MEF 상에 섬유 아세포 미디어와 공동 문화에 시작 플레이트 세포 mm 접시. 전달의 첫 주 동안 세포 사멸 속도에 따라, 하나는 1 / 2 또는 128분의 1 밀도에 희석 할 필요가 있습니다. 형질 전환 유전자 RT-PCR에 대한 긍정적 인 제어로 총 RNA를 추출하기 위해 옆에 남아있는 세포를 넣어. </li><li> 5 % CO 2 배양기 하룻밤, 37 ° C에서 60mm 요리를 놓습니다. </li></ol> 6. 인간 배아 줄기 세포의 중간 피드와 셀 (주 10) 모니터 <ol><li> 다음 날, 10 μM Y-27632 인간의 ES 미디어에 섬유 아세포 미디어를 변경합니다. 그 후, 인간 ES 매체 매일 매체 변경 : 800 ml의 DMEM/F12 + 200 ㎖의 녹아웃 혈청 교체 + 10 ml의 L-글루타민 + 10 10 mM의 MEM 최소 비 필수 아미노산의 ML기본적인 섬유 아세포 성장 인자의 2 - 머 캅토 에탄올 + 10 겨 / ㎖의 + 1 ㎖. </li><li> 신선한 인간의 ES의 미디어와 매일 미디어 변경 작업을 수행합니다. 일주일 후, ES 식민지와 같은 세포 덩어리의 형성을 현미경으로 한 번에 2 ~ 3 일이다 요리를 확인합니다. 콜로니가 발견되기 전에 세포의 종류에 따라, 배양은 더 많거나 적은 시간이 걸릴 것이다. </li></ol> 7. 유도 다 능성이 세포 식민지 줄기 및 셀 확장 따기 (일 20 ~) <ol><li> 3 주 전달 후, 식민지 따기 제대로 성장 나타납니다. </li><li> 식민지를 따기 전날 24 - 웰 플레이트에 MEF 공급 장치를 준비합니다. 참고 : 우리는 하나 24 - 웰 플레이트에 MEF 12.5 × 10 5를 사용하고 있습니다. </li><li> 다음 날, 10 μM Y-27632 인간의 ES의 미디어에 섬유 아세포 미디어에서 MEF 요리의 매체를 변경합니다. 수동 따기 후드에서 현미경으로 각각 한 번에 하나의 식민지를 선택하고 피펫으로 작은 덩어​​리를 만들어 전송할새로 개의 클론을 선택하는 MEF dishes.Try 준비에. </li><li> 통로 처음 6 웰 플레이트에 24 웰 플레이트에서 각 웰 확장합니다. 그런 다음 6 잘 플레이트에서 더 전파하기 전에 60mm 요리에. </li></ol> (10 구절 후) 인간 유도 만능의 8. 특성 <ol><li> 면역 형광 <ol><li> 매일 미디어 변화 4-5 일 도중 24 웰 플레이트와 문화 플레이트 인간 유도 만능. </li><li> 면역 형광 분석을 시작, 한 번 D-PBS로 접시를 씻으십시오. 그런 다음 30 분 동안 0.4 % 파라 포름 알데히드 즉시 세포를 고정합니다. 그 후 5 분 동안 D-PBS로 세 번 씻어. </li><li> 실온에서 15 분 동안 PBS에서 0.1 % 트리톤 X-100 용액으로 고정 된 세포를 치료. </li><li> permeablization 용액 (0.1 % 트리톤 X-100 용액) 대기음 다음, 상온에서 1 시간 동안 0.5 % BSA 블로킹 용액을 추가한다. </li><li> Nanog를, 10 월 - 4, SSEA (무대 특정 배아 antig의 검출을 수행EN) 및 TRA-1-81 0.5 % BSA 용액에 항 인간 항체를 사용하여 (종양 제거 항원) (항체의 희석 비율에 대한 자료 표를 확인하시기 바랍니다.) 실온에서 2 시간 동안 차 항체를 품어. 그런 다음 5 분마다 D-PBS로 세 번 씻어. </li><li> 실온에서 0.5 % BSA 용액에 1:2,000 희석하는 2 차 항체와 같은 알렉사 플 루어 488 염소 항 - 마우스 IgG 항체와 배양 1 시간 후 형광 현미경을 사용하여 확인합니다. DAPI 각 MEF 피더 세포와 hiPSCs의 모든 핵을 얼룩. </li></ol></li><li> 형질 전환 유전자 확인의 RT-PCR <ol><li> RNA 추출 시약을 사용하여 세포 펠렛에서 총 mRNA의 압축을 풉니 다. </li><li> 역전사하여 PCR 증폭을위한 총 RNA와 그 결과의 cDNA의 분취에 역전사 (1 μg)을 수행합니다. </li><li> cDNA를 템플릿의 2 μL, 2X PCR 마스터 믹스 10 μL, 프라이머 2 pmol의 2 μl를 포함하는 PCR 혼합물을 준비합니다(앞으로 1 μL 및 역방향 : 1 μl를) 및 DW 6 μL. 표 1에 기재된 프라이머로 RT-PCR을 수행하여 유전자 발현을 검출한다. </li><li> 증폭 반응의 효율을위한 제어로 GAPDH 유전자와 RT-PCR을 수행합니다. 시각화하고 1 % 아가로 오스 겔 전기 영동에 의해 PCR 생성물을 분석한다. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells.">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li><li>Okita, K., Nakagawa, M., Hyenjong, H., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+mouse+induced+pluripotent+stem+cells+without+viral+vectors.">Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors.</a> Science. 322, 949-953 (2008).</li><li>Zhou, W., Freed, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenoviral+gene+delivery+can+reprogram+human+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells.">Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells. 27, 2667-2674 (2009).</li><li>Woltjen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=piggyBac+transposition+reprograms+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells.">piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 458, 766-770 (2009).</li><li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells.">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nature Methods. 8, 409-412 (2011).</li><li>Yusa, K., Rad, R., Takeda, J., Bradley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+transgene-free+induced+pluripotent+mouse+stem+cells+by+the+piggyBac+transposon.">Generation of transgene-free induced pluripotent mouse stem cells by the piggyBac transposon.</a> Nature Methods. 6, 363-369 (2009).</li><li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+direct+delivery+of+reprogramming+proteins.">Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins.</a> Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cells+free+of+vector+and+transgene+sequences.">Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences.</a> Science. 324, 797-801 (2009).</li><li>Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+germline-competent+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 448, 313-317 (2007).</li><li>Yoshioka, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Generation+of+Human+iPSCs+by+a+Synthetic+Self-Replicative+RNA.">Efficient Generation of Human iPSCs by a Synthetic Self-Replicative RNA.</a> Cell Stem Cell. 13, 246-254 (2013).</li><li>Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+integration-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+postnatal+blood+mononuclear+cells+by+plasmid+vector+expression.">Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression.</a> Nature Protocols. 7, 2013-2021 (2012).</li><li>Fluri, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation,+expansion+and+differentiation+of+induced+pluripotent+stem+cells+in+continuous+suspension+cultures.">Derivation, expansion and differentiation of induced pluripotent stem cells in continuous suspension cultures.</a> Nature Methods. 9, 509-516 (2012).</li><li>Nakagawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+without+Myc+from+mouse+and+human+fibroblasts.">Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts.</a> Nature Biotechnology. 26, 101-106 (2008).</li><li>Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+induction+of+transgene-free+human+pluripotent+stem+cells+using+a+vector+based+on+Sendai+virus,+an+RNA+virus+that+does+not+integrate+into+the+host+genome.">Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome.</a> P Jpn Acad B-Phys. 85, 348-362 .</li><li>Silva, S. S., Rowntree, R. K., Mekhoubad, S., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-chromosome+inactivation+and+epigenetic+fluidity+in+human+embryonic+stem+cells.">X-chromosome inactivation and epigenetic fluidity in human embryonic stem cells.</a> P Natl Acad Sci USA. 105, 4820-4825 (2008).</li><li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-371-3+expression+predicts+neural+differentiation+propensity+in+human+pluripotent+stem+cells.">miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8, 695-706 (2011).</li></ol>

저자가 공개하는 게 없다.

hiPSCs에 인간의 체세포를 재 프로그램하는 것은 기본 생물학, 개인 의학 및 이식 12 전례없는 약속을 보유하고 있습니다. 이전에, 인간의 IPSC 세대는 의약품 개발과 이식 치료 13으로 추가 임상 응용 프로그램을 제한하는 바람직하지 않은 유전자 변이를 만들 수 있습니다 호스트 게놈으로 통합 위험이 DNA 바이러스를 요구했다. 이러한 이유로, 많은 연구는 여러 다른 방법으로 벡터 및 유전자없는 시스템 인간 유도 만능를 생성하는 것으로보고되었지만, 동시에, &#39;무료 풋 프린트&#39;분리의 효율은 인간 유도 만능은 고려되어야한다. 아직 센다이 바이러스 매개 IPSC 세대의 &#39;게놈 안전&#39;을 보여주기 위해 전체 게놈 시퀀싱에 대한 게시는 없지만 예를 들어, RNA 바이러스는 다른 방법 (14)에 비교 유전자 수차의 최소 수준이 있어야합니다. 여기서, 우리는와 hiPSCs를 생성하기위한 방법을 제시비용 효율적인 방식으로 높은 프로그래밍 효율이 센다이 바이러스. 그 결과 인간 유도 만능 증식 및 개발 가능성이있는 인간 배아 줄기 세포에 대한 세포 및 분자 유사성의 유지와 유전자의 무료입니다. 우리는 센다이 바이러스의 하나의 세트로 동시에 섬유 아세포의 상이한 기원 (&gt; 4)를 재 프로그램 할 수있다. 그리고 우리의 방법에서 우리는 다양한 세포 합류점 및 바이러스 투여 량의 차이를 적용합니다. 이 &#39;믹스 앤 매치&#39;조합 기술은 프로그래밍의 효과를 극대화 할 수 있습니다. 각 우물에서 (하나의 환자에서) 섬유 아 세포가 다른 바이러스 감염 수준을 가지고 있지만 함께 풀링하여 hiPSCs 식민지를 만들기의 가능성은 우리의 경험을 바탕으로 증가시킬 수있다. hiPSC 라인 사이 클론 변화의 다른 문제는 확산 속도, 세포 부착 / 생존, X 염색체의 불 활성화 (15)의 상태이고, 분화 등, 16 잠재력 사실, 우리는 각각의 클론 차이가 있는지 관찰미르 - 371 클러스터의 발현 정도를 측정하여 예측 될 수있는 신경 성향, 이비인후과. 더하여 우리는 센다이 바이러스가 재 프로그래밍 과정에서 많은 다른 세포 유형에 사용될 수 있다고 제안이 방법으로 인간 근육 아세포에서 인간 유도 만능 생성에 성공 하였다. 또한, 우리의 방법을 사용하여, 우리는 10 개 이상의 서로 다른 질병 관련 섬유 아 세포에 hiPSCs를 생성 한. 평균적으로 5-10 hiPSC 클론 한 섬유 아세포에서 얻을 수있다. 센다이 바이러스 유전자가없는 사람의 iPS 세포의 유도가 가장 실용적인 경로가 될 수있는 가장 효율적인 프로그래밍 방법이지만,이 프로토콜에 고려해야 할 몇 가지 제한 사항이 있습니다; - (2.4에서 설명) 각각 센다이 바이러스 배치에 따라, 바이러스 역가 일관된 MOI에 대해 계산 될 필요가있다. - 우리는 또한 robu에 대한 추가 적정을 필요로 다른 체세포들 사이 감염의 변화를 관찰성 바이러스 감염. - 센다이 바이러스 매개 된 리 프로그래밍은 연구 목적을위한 최선의 선택 중 하나로서 간주 할 수있다. 원래 센다이 바이러스 시스템을 개발 한 회사와 라이선스 문제가 있기 때문에 그러나 임상 시험을 위해, 그것은 첫 번째 선택이되지 않을 수 있습니다. - 다시 프로그램 체세포가 형질 전환 유전자에서 분리 될 때까지 우리가 적어도 10 구절 후 유전자 발현을 확인해야 할 이유입니다, 2 개월 정도 소요됩니다. - 우리가 직접 비교가되​​지 않지만 그것은 차 배양 섬유 아세포의 통과 번호가 센다이 바이러스와 프로그래밍의 효율성에 영향을 미칠 수 있음을 보인다. 확산 속도도 결정해야합니다. 추가 연구는 섬유 아세포 통로 번호 및 프로그래밍 효율성에 증식의 효과를 결정하기 위하여 필요하다. - 본 연구에서는, 우리는 hiPSC 생성 및 유지 관리를 위해 마우스 피더 레이어를 사용하지만, 피더 무료 시스템은 alternativ 수 있습니다향후 연구에서 전자의 방법입니다. 우리의 현재 프로토콜은 질병 모델링, 재생 의학 및 기타 응용 프로그램에 대한 환자 별 hiPSCs을 공부하기위한 중요한 단계이다.

인간 배아 줄기 세포 (hESCs)는 약물 검사에 대한 질병 모델링을위한 잠재적으로 유용 할 수 있고, 질병 및 조직 손상을 치료하는 세포 기반 치료법을 개발하기 위해 자기 갱신 시험 관내 및가 능성에 대한 능력을 보유하고 있습니다. 그러나 인간 배아 줄기 세포 때문에, 면역 학적 종양학과 윤리적 장벽의 세포 대체 요법에 대한 제한이 있고, 질병 관련 유전자를 연구, 질병 특정 인간 배아 줄기 세포는 착상 전 유전자 진단 (PGD) 방식을 통해 분리 할 수​​ 있지만, 여전히 기술적으로 도전 및 배아 기증은 매우 드물다. 이러한 문제는 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs)의 개발을 주도하고있다 줄기 세포 생물학의 진행과 관련이 있습니다. 인간 유도 만능은 유 전적으로 인간의 성인 체세포에서 프로그램이 다시 그들에게 예 : D 재생 의학을위한 유용한 소스를 만드는 인간 배아 줄기 세포와 유사한 만능 줄기 세포와 같은 기능을 품고있다양탄자 발견, 질병 모델링 및 환자 특정 방식으로 1,2의 세포 치료. 지금까지 바이러스 매개 (레트로 바이러스 및 아데노 바이러스)를 포함하여 인간 유도 만능를 생성하는 여러 가지 방법, 3, 비 바이러스 매개 (BAC 시스템과 벡터의 형질) 4 유전자 transductions 및 단백질 전달 시스템 5-7이 있습니다. 바이러스 매개 유전자 전달 효율의 특정 수준을 보장 할 수 있지만 그들이 통제 할 수없는 방식으로 프로그램을 다시 만들 유전자를 표현하는 호스트의 염색체에 통합하기 때문에, 바이러스 성 벡터는 유전자 발자국을 떠날 수 있습니다. 전사 인자의 바이러스 통합을 활성화하거나 호스트 8 유전자를 불 활성화 할 수 있더라도, 이는 예기치 유전 수차 및 종양의 5,9의 위험을 일으킬 수있다. 한편, 체성 세포로 단백질 또는 RNA의 직접적인 도입은보고 있지만, 이러한 노동 집약적 반복 TRANSF 등의 몇 가지 단점을 가지고 있었다ection 및 7,10 재 프로그램의 낮은 수준입니다. 심지어 에피 솜 및 비 통합 아데노 바이러스, 아데노 - 관련 바이러스, 플라스미드 벡터는 여전히 11 비교적 덜 효율적이다. 이러한 이유로, 그것은 IPSC 세대의 높은 효능과 적은 유전자 이상과 비 통합 프로그램을 다시 만들 방법을 선택하는 그럴듯​​. 이 연구에서, 우리는 센다이 바이러스 기반 프로그래밍을 사용합니다. 이 방법은 호스트 게놈에 비 통합과 지속적으로 유전자 통합하지 않고 인간 유도 만능를 생산하는 것으로 알려져있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1109">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:543px;">CytoTune-iPS Reprogramming Kit</td>
			<td style="width:195px;">invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A1378002</td>
			<td style="width:253px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">CF-6,MEFs, neomycin-resistant, mitomycin C treated&#160;</td>
			<td>Global stem</td>
			<td>GSC-6105M&#160;</td>
			<td>5X105/6cm or 12.5X105/24 well plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin EDTA 0.25% Trypsin with EDTA 4Na 1X</td>
			<td style="width:195px;">invitrogen</td>
			<td>25200114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F-12 medium</td>
			<td style="width:195px;">&#160;invitrogen</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-well Cell Culture Plate, flat-bottom with lid</td>
			<td style="width:195px;">BD</td>
			<td>353935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:543px;">Y-27632</td>
			<td style="width:195px;">TOCRIS</td>
			<td style="width:119px;">1254</td>
			<td>10 uM (Stock: 10 mM)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:543px;">basic fibroblast growth factor</td>
			<td>LIFE TECHNOLOGIES&#160;</td>
			<td>PHG0263</td>
			<td>10 ng (Stock : 100 ug)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:543px;">Knock-out serum replacement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (D-MEM, DMEM) (1X), liquid (high glucose)</td>
			<td style="width:195px;">&#160;invitrogen</td>
			<td>11965118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:543px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Scientific Fermentas</td>
			<td style="width:119px;">SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamine-200 mM (100X), liquid</td>
			<td style="width:195px;">GIBCO</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>1/100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X</td>
			<td>LIFE TECHNOLOGIES&#160;</td>
			<td>11140050</td>
			<td>1/100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-Mercaptoethanol (1,000X), liquid</td>
			<td style="width:195px;">GIBCO</td>
			<td>21985023</td>
			<td>1/1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hausser Phase Contrast Hemacytometers</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>02-671-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution</td>
			<td style="width:195px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">ES-006-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:543px;">SSEA-4</td>
			<td style="width:195px;">DSHB</td>
			<td>MC-813-70</td>
			<td>1/200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-Tra-1-81</td>
			<td style="width:195px;">cell signaling</td>
			<td>4745S</td>
			<td>1/200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mouse monoclonal Oct4 antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-5279</td>
			<td>1/1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:543px;">Nanog</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>AF1997</td>
			<td>1/1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:543px;">Alexa Flouor 488 goat anti-mouse</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>948492</td>
			<td>1/2000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DPBS (Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline), 1X without calcium &#38; magnesium</td>
			<td style="width:195px;">cellgro</td>
			<td style="width:119px;">21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:543px;">QuantiTect Reverse Transcription Kit</td>
			<td style="width:195px;">QIAGEN</td>
			<td>205313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">PCR Master Mix [2X]</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Scientific Fermentas</td>
			<td style="width:119px;">K0171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trizol</td>
			<td style="width:195px;">invitrogen</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">picking hood</td>
			<td>NuAire</td>
			<td style="width:119px;">&#160;NU-301&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:543px;">dissecting scope&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient generation human induced pluripotent stem cells from human somatic cells with sendai-virus

몇 년 전, 인간 유도 만능 줄기 세포 (유도 만능)의 설립은 생물 의학의 새로운 시대를 열었다. 인간 유도 만능의 잠재적 인 사용은 인간의 유전 질환의 모델링 발병 유전자 보정 후자가 세포 치료, 환자 별 증상과 관련된 세포의 소스를 제공함으로써 맞춤 약물 검사를 포함한다. 그러나, 이러한 인간 유도 만능 생산 후 남은 프로그래밍 인자 유전자의 발현을 제거하는 등의 극복하는 여러 장애물이있다. 더 중요한 것은, 미분화 된 인간 유도 만능 잔류 유전자 발현 적절한 분화를 방해하고 질병 관련 체외 표현형에서의 해석을 잘못지도 할 수 있습니다. 이러한 이유와 함께, 통합 - 무료 및 / 또는 유전자가없는 인간 유도 만능는 아데노 바이러스, 피기 백 (PiggyBac) 시스템, minicircle 벡터, 에피 솜 벡터, 직접 단백질 전달과 같은 몇 가지 방법을 사용하여 개발 및 mRNA의 합성되었다. 그러나 reprogra의 효율성통합없는 방법을 사용하여 mming하는 것은 대부분의 경우 매우 낮습니다. 여기서, 우리는 센다이 바이러스 (RNA 바이러스) 기반 프로그래밍 시스템을 사용하여 인간 유도 만능을 분리하는 방법을 제시한다. 이 프로그래밍 방법은 일관된 결과 및 비용 효율적인 방식으로 고성능을 나타낸다.

보통 감염 섬유 아 세포는 센다이 바이러스 전달 후 몇 일에 한 어떤 형태의 변화를 보여주지 않지만, 5 일 후, 그들은 다른 모양 (그림 1)를 가지고 시작합니다. 도 1의 오른쪽 패널에서 설명한 바와 같이, 세포는 전형적인 섬유 아세포의 형태를 가지고 있지 않는다. 그들은 세포질보다 둥근 모양과 더 큰 핵이있다. 전달이 80 %의 세포 포화 상태에서 수행되는 경우에도 그들이 다시 프로그램 시작 후가 아니라 덜 합류처럼, 그것은 보인다. 형태 이러한 종류의 변경이 아니라 가장에서 볼 수 시작하면, 형질 섬유 아세포 MEF 피더 배양 접시에 도금 할 준비가 된 것입니다. 우리의 프로토콜에서는, 세포 배양 규모를 최소화하고 또한 hiPSCs 발전 효율을 증가 같은 다른 섬유 아세포 세포 밀도 및 바이러스 역가를 이용한 다양한 프로그래밍 가능성, 및 후속 몇개 재 도금 비율 MEF를 (준 <strong&gt; 그림 2). 전달하기 전에, 다른 컨 플루 (낮음, 중간, 높은)와 우물은 더 센다이 바이러스 전달을 위해 선택 될 수있다; 접시에 빨강, 녹색, 노란 색으로 표시. MEF 피더에 재 프로그램의 시작 부분에서, 그것은 형질 세포 유형을 구분하기 어렵지만, 공동 문화에서 하나 이상의 주 후에, 부분적으로 재 프로그래밍 섬유 아세포가 나타나고 느슨해 ES와 같은 모양 (그림 3)과 같이. 때문에 인간의 IPSC 식민지 새로운 MEF 피더 접시에 통과에 대한 준비가되어이 이유, 수동 따기는 효소 전송 대신 해리 더 효율적인 방법입니다. 그림 3과 그림 4에서 현미경으로 인간 유도 만능은 ( &#39;완전히 다시 프로그램 세포&#39;로 간주) 인간 유도 만능와 형태의 &#39;불완전 다시 프로그램 세포의 사이에 명확한 구별을 분명히 가장자리를 보유하고 있습니다. 완전히 다시 프로그램 세포 싸다확인 컴팩트하고 단단히 포장 등을들 수있다. 부분적으로 다시 프로그램 세포가 식민지를 만들기 위해 함께 수집처럼 보이지만 매우 잃고 무너 뜨리는 깨지기 쉬운 반면, 특히 식민지, 명확한 경계를해야합니다. 우리는 조심스럽게 피펫을해도 그것은 쉽게 분리됩니다. 도 (그들과 계대을 확장 중) 부분적으로 재 프로그램 인간 유도 만능의 식민지를 제외한 후, 완전히 재 프로그래밍 인간 유도 만능은 수동 따기에 의해 관리 될 필요가있다. 식민지를 따기와 몇 주 동안 hiPSC 클론을 확대 한 후, stemness 마커의 발현을 결정해야합니다. hiPSC 클론의 확장 후, 우리는 품질 관리로 (데이터가 표시되지 않음) 항체 염색 (SSEA4, 월 4, TRA-81와 Nanog를) 및 다 능성 마커의 RT-PCR 등의 다른 테스트 세트로 확인합니다. H9에 비해, 두 개의 서로 다른 hiPSCs는 SSEA4, 월 4, TRA-81, 및 Nanog를 긍정적이다. 이 결과는 고립 된 인간 유도 만능은 만능 품질 (인수 것을 보여줍니다 <stronG&gt; 그림 5). 마지막으로, 그림 6은 우리가 RT-PCR에 의해 hiPSC 클론의 모든 유전자 발현을 감지 할 수 있음을 보여줍니다. 위한 적어도 10 이상의 통로 hiPSCs, 특이 적 프라이머 (표 1) 외인성 월 04 삭스-2, KLF-4 및 C-Myc와 강한 트랜스 진 발현 수준을 갖는 양성 대조군 샘플을 사용할 수있다. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51406/51406fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51406/51406fig1.jpg" /> 그림 1. 형태 변화 센다이 바이러스 전달 후. 전달하기 전에, 섬유 아 세포는 일반적인 스핀들 형상 (왼쪽)를 보여줍니다. 약 팔일 전달 후, 훨씬 더 둥근 모양 (오른쪽)와 같은 유전자 변형 세포 변화의 형태. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51406/51406fig1highres.jpg" target="_blank">시간을 클릭 해주세요</a>이 그림의 더 큰 버전을 보려면 감수. <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51406/51406fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51406/51406fig2.jpg" /> 최대 효율을 보장하기 위해 유도 계획 2. 다이어그램을 그림. 네 개 이상의 서로 다른 세포 유형은 (1-4) 24 웰 플레이트에서 도금 될 수있다. 자신의 부착 능력과 세포의 생존은 세포 유형에 따라 다를 수 있기 때문에 (물론 당 200K 6.25K로 세포) 다른 세포 밀도를 도금하는 것이 좋습니다. 또, 바이러스 농도 (0.5X, 1X 및 2X)를 조정할 수있다. <img alt="그림 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51406/51406fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51406/51406fig3.jpg" /> 형질 F에서 인간 유도 만능 줄기 세포 식민지의 그림 3. 형성ibroblast. MEFs으로 그들을 다시 도금 후 약 2 주에서 라운드 식민지가 나타납니다 인간 배아 줄기 세포 식민지 같습니다. 일반적으로 완벽하게 재 프로그래밍 인간 IPSC 식민지 매우 분명 한계가있다. (화살표 : 완전한 인간 IPSC 식민지, 화살촉 다시 프로그램 : 부분적으로 프로그램이 다시 인간 유도 만능를). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51406/51406fig3highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51406/51406fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51406/51406fig4.jpg" /> 그림 4. 인간 유도 만능 줄기 세포 식민지를 따기. 인간의 IPSC 식민지은 종종 부분적으로 다시 프로그램 세포 (왼쪽)에 의해 둘러싸여있다. 현미경, ES와 같은 식민지를 따기 만, 작은 덩어리로 분해 한 후 전송 (오른쪽). 2 ~ 3 통로 후,<html> 미분화 hiPSC 식민지 (아래 &amp; 왼쪽)가있다. (화살표 : 완전히 재 프로그래밍 인간 IPSC 식민지, 화살촉 : 부분적으로 프로그램이 다시 인간 유도 만능이) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51406/51406fig4highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51406/51406fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51406/51406fig5.jpg" /> 줄기 세포의 다 능성 마커 그림 5. 면역 형광 염색법. 면역 형광 분석은 인간 유도 만능이 stemness가 features.SSEA-4, TRA-81, Nanog를, 10 월 - 4AS의 다 능성 마커 및 DAPI는 핵 염색을위한 컨트롤입니다이 보여줍니다. (A) H9 염색을 나타냅니다 대조 샘플. (B) 및 (C)은 인간의 IPSC 클론을 보여준다.등은 = &quot;_blank&quot;&gt; 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51406/51406fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51406/51406fig6.jpg" /> 도입 유전자 발현 수준의도 6. 확인은. 적어도 인간 유도 만능, 외인성 SOX2의 침묵, KLF-4, c-myc 그리고 Oct-4 유전자 발현 수준의 열 통로 배양 후 역전사 중합 효소 연쇄 반응에 의해 확인된다. hGAPDH 내부 컨트롤입니다. 긍정적 인 제어를 위해, RNA는 남은 형질 섬유 아세포 (센다이 바이러스 감염 후 7 일)에서 추출된다. (레인 1 : 마커, 레인 2-6 : GAPDH, KLF4, C-Myc와, 10 월 - 4 및 양성 대조군의 삭스-2, 차선 7-11 : GAPDH, KLF4, C-Myc와, 10 월 - 4 및 삭스 -2 hiPSCs에서). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="305"><colgroup><col /><col /></colgroup><tbody><tr><td> 프라이머 이름 </td> &lt;TD&gt; 시퀀스 </td></tr><tr><td> hOCT4 (F) </td><td> CCC GAA AGA GAA AGC GAA CCA G </td></tr><tr><td> hOCT4 (R) </td><td> AAT GTA TCG AAG GTG CTC AA </td></tr><tr><td> hMYC (F) </td><td> TAA CTG ACT AGC AGG CTT GTC G </td></tr><tr><td> hMYC (R) </td><td> TCC ACA TAC AGT CCT GGA TGA TGA TG </td></tr><tr><td> hSOX2 (F) </td><td> ACA AGA GAA AAA ACA TGT ATG G </td></tr><tr><td> hSOX2 (R) </td><td> ATG CGC TGG TTC ACG CCC GCG CCC AGG </td></tr><tr><td> hKLF4 (F) </td><td> ACA AGA GAA AAA ACA TGT ATG G </td></tr><tr><td> hKLF4 (R) </td><td> CGC GCT GGC AGG의 GCC의 GCT GCT CGA C </td></tr><tr><td> hGAPDH (F) </td><td> AGG TCG GAG TCA ACG GAT TTG </td></tr><tr><td> hGAPDH (R) </td><td> GTG ATG GCA TGG ACT GTG GT </td></tr></tbody></table> 형질 전환 유전자 확인을 위해 표 1. RT-PCR 프라이머. 이들은 TRA에 사용되는 프라이머 서열이다nsgene 확인. T (M)는 모든 프라이머 세트에 50.6 ° C이다.

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Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

여기, 우리는 일관된 결과 및 향상된 효율성을 보여줍니다 센다이 바이러스와 유전자가없는 인간 유도 만능에 인간의 체세포를 재 프로그램하는 우리의 설립 방법을 제시한다.

센다이 바이러스와 인간의 체세포의 효율적인 생성 인간 유도 만능 줄기 세포

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

22.3K 조회수.  Johns Hopkins University School of Medicine.  여기, 우리는 일관된 결과 및 향상된 효율성을 보여줍니다 센다이 바이러스와 유전자가없는 인간 유도 만능에 인간의 체세포를 재 프로그램하는 우리의 설립 방법을 제시한다. 

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Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

인간 배아 줄기 세포에서 염색질의 Immunoprecipitation

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

연구

생물학

Generation of Human CD40-activated B cells

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer immunotherapy 1-3. Compared to Dendritic cells (DCs), the best characterized APC, CD40-B cells have several distinct biological and technical properties. Similar to DCs, B cells show an increased expression of MHC and co-stimulatory molecules (Fig.1b), exhibit a strong migratory capacity and present antigen presentation efficiently to T cells, after stimulation with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L). However, in contrast to immature or mature DCs, CD40-B cells express the full lymph node homing triad consisting of CD62L, CCR7/CXCR4, and leukocyte function antigen-1 (LFA1, CD11a/CD18), necessary for homing to secondary lymphoid organs (Fig.1a) 3. CD40-B cells can be generated without difficulties from very small amounts of peripheral blood which can be further expanded in vitro to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients (Fig.1c,d) 1,4. 
In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated CD40-B cells from human PBMC. Key molecules for the cell culture are CD40 ligand, interleukin-4 (IL-4) and cyclosporin A (CsA), which are replenished in a 3-4 day culture cycle. For laboratory purposes CD40-stimulation is provided by NIH/3T3 cells expressing recombinant human CD40 ligand (tCD40L NIH/3T3) 5. To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the human CD40 ligand on the transfectants has to be checked regularly (Fig.2). 
After 14 days CD40-B cell cultures consist of more than 95% pure B cells and an expansion of CD40-B cells over 65 days is frequently possible without any loss of function 1, 4. CD40-B cells efficiently take up, process and present antigens to T cells 6. They do not only prime na&#970;ve, but also expand memory T cells 7,8. CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation, differentiation and function. Moreover, they represent a promising tool for therapeutic or preventive vaccination against tumors 9.

In this video we present the ex vivo generation and expansion of human CD40-activated B cells (CD40-B) from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by stimulation with CD40 ligand and interleukin-4.

인간 CD40 - 활성화된 B 세포의 생성

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Human Fibroblasts with the Stemgent Human TF Lentivirus Set

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing the pluripotent state in mouse fibroblasts.1 The same group also reported the successful reprogramming of human somatic cells into induced pluripotent stem (iPS) cells using human versions of the same transcription factors delivered by retroviral vectors.2 Additionally, James Thomson et al. reported that the lentivirus-mediated co-expression of another set of factors (Oct4, Sox2, Nanog and Lin28) was capable of reprogramming human somatic cells into iPS cells.3
iPS cells are similar to ES cells in morphology, proliferation and the ability to differentiate into all tissue types of the body. Human iPS cells have a distinct advantage over ES cells as they exhibit key properties of ES cells without the ethical dilemma of embryo destruction. The generation of patient-specific iPS cells circumvents an important roadblock to personalized regenerative medicine therapies by eliminating the potential for immune rejection of non-autologous transplanted cells.
Here we demonstrate the protocol for reprogramming human fibroblast cells using the Stemgent Human TF Lentivirus Set. We also show that cells reprogrammed with this set begin to show iPS morphology four days post-transduction. Using the Stemolecule Y27632, we selected for iPS cells and observed correct morphology after three sequential rounds of colony picking and passaging. We also demonstrate that after reprogramming cells displayed the pluripotency marker AP, surface markers TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4, and SSEA-3, and nuclear markers Oct4, Sox2 and Nanog.

We demonstrate the protocol for the generation of induced pluripotent stem cells from human somatic cells using lentivirus-mediated delivery of the human factors Oct4, Sox2, Nanog, and Lin28. Pluripotency was confirmed by morphology and the presence of embryonic stem (ES) cell-specific markers.

Stemgent 인간 TF의 Lentivirus와 인간의 섬유아 세포를 프로그래밍하여 유도 Pluripotent 줄기 세포의 생성 세트

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing ...

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human embryonic stem cells (HESCs)1. While improvements in several gene delivery methods have been described2-9, transfection remains a capricious process for HESCs, and has not yet been reported in human induced pluripotent stem cells (iPSCs). In this video, we demonstrate how our lab routinely transfects and nucleofects human iPSCs using plasmid with an enhanced green fluorescence protein (eGFP) reporter. Human iPSCs are adapted and maintained as feeder-free cultures to eliminate the possibility of feeder cell transfection and to allow efficient selection of stable transgenic iPSC clones following transfection. For nucleofection, human iPSCs are pre-treated with ROCK inhibitor11, trypsinized into small clumps of cells, nucleofected and replated on feeders in feeder cell-conditioned medium to enhance cell recovery. Transgene-expressing human iPSCs can be obtained after 6 hours. Antibiotic selection is applied after 24 hours and stable transgenic lines appear within 1 week. Our protocol is robust and reproducible for human iPSC lines without altering pluripotency of these cells.

Despite recent advancements in genetic modification, transfection of human embryonic stem cells (HESCs) remains a capricious process. To our knowledge, systematic and efficient methods to transfect human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have not been reported. Here, we describe robust protocols to efficiently transfect and nucleofect human iPSCs.

인간 유도 만능의 줄기 세포를 Transfecting 및 Nucleofecting

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

작은 분자와 유도 Pluripotent 인간 배아 줄기 세포로부터 인간 심장 엽 성의 전구 물질과 Cardiomyocytes의 효율 유도

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-myc (OSKM) in the presence of sodium butyrate 1-3. We used this method to reprogram late passage (&gt;p10) human adult fibroblasts derived from Friedreich's ataxia patient (GM03665, Coriell Repository). The reprogramming approach includes highly efficient transduction protocol using repetitive centrifugation of fibroblasts in the presence of virus-containing media. The reprogrammed hiPSC colonies were identified using live immunostaining for Tra-1-81, a surface marker of pluripotent cells, separated from non-reprogrammed fibroblasts and manually passaged 4,5. These hiPSC were then transferred to Matrigel plates and grown in feeder-free conditions, directly from the reprogramming plate. Starting from the first passage, hiPSC colonies demonstrate characteristic hES-like morphology. Using this protocol more than 70% of selected colonies can be successfully expanded and established into cell lines. The established hiPSC lines displayed characteristic pluripotency markers including surface markers TRA-1-60 and SSEA-4, as well as nuclear markers Oct3/4, Sox2 and Nanog. 
The protocol presented here has been established and tested using adult fibroblasts obtained from Friedreich's ataxia patients and control individuals 6, human newborn fibroblasts, as well as human keratinocytes.

We present a protocol for efficient reprogramming of human somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-myc (OSKM) and identification of correctly reprogrammed hiPSC by live staining with Tra-1-81 antibody.

인간 유도 Pluripotent 줄기 세포의 선택 및 분리 식민지는 성인 섬유아 세포에서 다시 프로그램

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has been previously shown that human somatic cells can be reprogrammed to pluripotency by ectopic expression of four transcription factors (Oct4, Sox2, Klf4 and Myc) and become induced pluripotent stem cells (iPSCs)2-4 . Like hESCs, human iPSCs are pluripotent and a potential source for autologous cells. Here we describe the protocol to reprogram human fibroblast cells with the four reprogramming factors cloned into GFP-containing retroviral backbone4. Using the following protocol, we generate human iPSCs in 3-4 weeks under human ESC culture condition. Human iPSC colonies closely resemble hESCs in morphology and display the loss of GFP fluorescence as a result of retroviral transgene silencing. iPSC colonies isolated mechanically under a fluorescence microscope behave in a similar fashion as hESCs. In these cells, we detect the expression of multiple pluripotency genes and surface markers.

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

A method to generate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) via retrovirus-mediated ectopic expression of OCT4, SOX2, KLF4 and MYC is described. A practical way to identify human iPSC colonies based on GFP expression is also discussed.

GFP와 Retroviral 벡터를 사용하여 유도 Pluripotent 줄기 세포 (iPSCs)로 인간 체세포를 프로그래밍

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it is not easy to establish an effective system for culturing these cells. Since the culture conditions can influence gene expression that confers pluripotency in hESCs and hiPSCs, the optimization and standardization of the culture method is crucial.
The establishment of hESC lines was first described by using MEFs as feeder cells and fetal bovine serum (FBS)-containing culture medium2. Next, FBS was replaced with knockout serum replacement (KSR) and FGF2, which enhances proliferation of hESCs3. Finally, feeder-free culture systems enable culturing cells on Matrigel-coated plates in KSR-containing conditioned medium (medium conditioned by MEFs)4. Subsequently, hESCs culture conditions have moved towards feeder-free culture in chemically defined conditions5-7. Moreover, to avoid the potential contamination by pathogens and animal proteins culture methods using xeno-free components have been established8.
To obtain improved conditions mouse feeder cells have been replaced with human cell lines (e.g. fetal muscle and skin cells9, adult skin cells10, foreskin fibroblasts11-12, amniotic mesenchymal cells13). However, the efficiency of maintaining undifferentiated hESCs using human foreskin fibroblast-derived feeder layers is not as high as that from mouse feeder cells due to the lower level of secretion of Activin A14. Obviously, there is an evident difference in growth factor production by mouse and human feeder cells.
Analyses of the transcriptomes of mouse and human feeder cells revealed significant differences between supportive and non-supportive cells. Exogenous FGF2 is crucial for maintaining self-renewal of hESCs and hiPSCs, and has been identified as a key factor regulating the expression of Tgf&beta;1, Activin A and Gremlin (a BMP antagonist) in feeder cells. Activin A has been shown to induce the expression of OCT4, SOX2, and NANOG in hESCs15-16.
For long-term culture, hESCs and hiPSCs can be grown on mitotically inactivated MEFs or under feeder-free conditions in MEF-CM (MEF-Conditioned Medium) on Matrigel-coated plates to maintain their undifferentiated state. Success of both culture conditions fully depends on the quality of the feeder cells, since they directly affect the growth of hESCs.
Here, we present an optimized method for the isolation and culture of mouse embryonic fibroblasts (MEFs), preparation of conditioned medium (CM) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to assess the levels of Activin A within the media.

The quality of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) is dictated by the right strain of mouse such as CF-1. Pluripotency-supportive MEFs and conditioned media (CM) obtained from these should contain optimal concentrations of Activin A, Gremlin and Tgf&beta;1 needed for the Activin/Nodal and FGF pathways to co-operatively maintain self-renewal and pluripotency.

Culturing 인간의 배아와 유도 Pluripotent 줄기 세포에 적합 마우스 배아 Fibroblast 세포의 준비

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

유도 만능의 줄기 세포에서 파생 마우스의 생성

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, generating so-called induced pluripotent stem cells (iPSCs)1-4. Patient-specific iPSCs lack the ethical concerns that surround embryonic stem cells (ESCs) and would bypass possible immune rejection. Thus, iPSCs have attracted considerable attention for disease modeling studies, the screening of pharmacological compounds, and regenerative therapies5.
We have shown the generation of transgene-free human iPSCs from patients with different lung diseases using a single excisable polycistronic lentiviral Stem Cell Cassette (STEMCCA) encoding the Yamanaka factors6. These iPSC lines were generated from skin fibroblasts, the most common cell type used for reprogramming. Normally, obtaining fibroblasts requires a skin punch biopsy followed by expansion of the cells in culture for a few passages. Importantly, a number of groups have reported the reprogramming of human peripheral blood cells into iPSCs7-9. In one study, a Tet inducible version of the STEMCCA vector was employed9, which required the blood cells to be simultaneously infected with a constitutively active lentivirus encoding the reverse tetracycline transactivator. In contrast to fibroblasts, peripheral blood cells can be collected via minimally invasive procedures, greatly reducing the discomfort and distress of the patient. A simple and effective protocol for reprogramming blood cells using a constitutive single excisable vector may accelerate the application of iPSC technology by making it accessible to a broader research community. Furthermore, reprogramming of peripheral blood cells allows for the generation of iPSCs from individuals in which skin biopsies should be avoided (i.e. aberrant scarring) or due to pre-existing disease conditions preventing access to punch biopsies.
Here we demonstrate a protocol for the generation of human iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using a single floxed-excisable lentiviral vector constitutively expressing the 4 factors. Freshly collected or thawed PBMCs are expanded for 9 days as described10,11 in medium containing ascorbic acid, SCF, IGF-1, IL-3 and EPO before being transduced with the STEMCCA lentivirus. Cells are then plated onto MEFs and ESC-like colonies can be visualized two weeks after infection. Finally, selected clones are expanded and tested for the expression of the pluripotency markers SSEA-4, Tra-1-60 and Tra-1-81. This protocol is simple, robust and highly consistent, providing a reliable methodology for the generation of human iPSCs from readily accessible 4 ml of blood.

Here we show a simple and effective protocol for the generation of human iPSCs from 3-4 ml of peripheral blood using a single lentiviral reprogramming vector. Reprogramming of readily available blood cells promises to accelerate the utilization of iPSC technology by making it accessible to a broader research community.

STEMCCA Lentiviral 벡터를 사용하여 말초 혈에서 인간 유도 만능 줄기 세포의 생성

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, ...