We thank Ms. Deborah Postiff and Ms. Jackline Barikdar in the Tissue Procurement Core and Dr. Cindy DeLong in the Pluripotent Stem Cell Core Laboratory at the University of Michigan for her technical assistance. This study was supported by University of Michigan startup funding and grants from the Central Surgical Association, American College of Surgeons, Melanoma Research Alliance, and NIH/NCI (1K08CA197966-01) to F. Ito.

참고 : 환자는 셀위원회가 연구를 승인 줄기 임상 시험 심사위원회와 인간 다 능성에 참여하는 동의를 제공해야합니다. 1. 분리 및 TILS의 문화 <ol><li> 병리 서비스 / 조직 조달 코어에서 병리 조직 학적 진단을 위해 필요하지 않습니다 종양 물질을 얻습니다. 30 ml의 종양 수집 미디어 (표 1)과 50 ml의 튜브에 종양 표본의 20-100g를 놓습니다. </li><li> 고체, 회사, 가위를 사용하여 깨지기 쉬운 및 / 또는 피 묻은 괴사 지역에서 종양 표본의 정상 조직을 해부하다. 괴사 조직을 제거한 후 가능한 한 작게 시편을 말하다하기 위해 가위를 사용합니다. </li><li> 제조자의 지시에 따라 dissociator 종양 분리 키트 (인간)를 사용하여 단일 세포 현탁액 내로 해리 다진 표본. 50 ML 튜브에 설정되어있는 70 μm의 셀 스트레이너와 서스펜션 필터와 함께 스트레이너을 2 회 반복한다RPMI 1640 2 ㎖. </li><li> 5 분 동안 실온에서 200 × g으로 원심 분리기. 상층 액을 제거하고 T 세포 배지 (표 1) 10ml에 세포를 재현 탁. </li><li> 예컨대 피콜 100 % 구배 용액 10 ㎖의 하부 단계 및 둘 베코 인산염으로 희석하고 75 % 구배 용액 30 ㎖의 중간 단계로 50 ㎖의 튜브 (구배 용액)으로 두 단계 구배 용액을 준비 완충 식염수, 아니 칼슘, 아니 마그네슘 (D-PBS (-)). </li><li> (단계 1.5) 구배 용액에 (단계 140에서) 세포 현탁액 층을 포함한다. 45 분 동안 20 ° C에서 400 XG에 원심 분리기. </li><li> 100 % 구배 용액 및 50 ㎖ 튜브에서 75 % 구배 용액의 계면에서 농축 TILS을 함유하는 층을 수집한다. D-PBS 중 20 ~ 30 ml를 첨가하여 농축 TILS와 용액의 희석 층 (-). </li><li> 5 분 동안 실온에서 200 × g으로 원심 분리기. 뜨는을 취소하고 10 ml의에 TIL 풍부한 부분을 재현 탁T 세포 매체. </li><li> 배양 37 ° C에서 6 웰 플레이트에 2 T 세포 배지 ㎖의 6000 IU / ml의 재조합 인간 (RH) IL-2로한다 (단계 1.8)에서 분획, 5 % CO 2. </li><li> 배양 개시 후 5 일에 절반 미디어를 변경 한 후 2-3 일마다. </li><li> 1의 비율로 세포 분열 2 : 트립신없이 부드럽게 80~90%에 포화 상태에 도달 할 때 우물의 수를 두배로 현탁 한 후. 6000 IU / ml의 신선한 T 세포 매체와 rhIL-2의 절반 량 (1ml)에 추가한다. </li></ol> 마이 토마 이신-C-처리 SNL 피더 셀 플레이트 2. 준비 <ol><li> 80-90% 합류 (3-4 × 106 세포)까지 0.1 % 젤라틴 코팅 10cm 접시에 SNL 피더 세포 배지 (표 1) 10ml에 문화 SNL 피더 세포로 진행한다. </li><li> 직접 SNL 피더 세포 배양 접시에 0.4 ㎎ / ㎖ 마이 토마 이신 C 용액 310 μl를 추가하고 37 ° C 2 시간 15 분, 5 % CO 2 부화. 미디어 a를 대기음ND 5ml를 D-PBS로 두 번 세포를 씻어 (-). </li><li> 0.5 ml의 0.25 % 트립신 / 1mM의 EDTA를 첨가하고 세포를 해리 1 분 동안 실온에서 배양한다. 중화 SNL 피더 세포 미디어 4.5 ML을 추가하고 하나의 현탁액에 세포를 재 - 일시 중지합니다. </li><li> 5 분 동안 200 XG에 15 ML 튜브와 원심 분리기로 세포를 전송합니다. 미디어 대기음 SNL 피더 세포 배지 10ml에 다시 현탁 한 후 혈구 세포 계산. </li><li> 플레이트 1.5 × 10 6 10cm 접시에 SNL 피더 세포의 웰 당 세포와 37 ° C에서 품어, 5 % CO 2. 삼일 이내에 SNL 피더 세포를 사용합니다. </li></ol> 센다이 바이러스를 사용하여 iPSCs의 3 세대 (SEV) 벡터 <ol><li> 수확 TILS 및 플레이트 - 결합 된 마우스 항 - 인간 CD3 (1 μg의 / ㎖) TILS 5 × 105 세포를 활성화하고 수용성 마우스 항 - 인간 CD28 (/ ㎖ 5 μg의) (단계 1.11)에서, rhIL-2 세에서 6 웰 플레이트에서 T 세포 배지 2 ㎖에 (6000 IU / ㎖)7 ° C를 5 일 동안 5 % CO 2. </li><li> 피펫을 사용하여 15 ml의 튜브 (단계 3.1)을 TILS를 수확하고, 혈구와 세포 수를 계산합니다. </li><li> 500 μL의 rhIL-2 1 판 - 결합 된 마우스 항 - 인간 CD3 (1 μg의 / mL)로 TILS의 X 105 세포 및 가용성 마우스 항 - 인간 CD28 (5 μg의 / ㎖) (60 IU / ㎖) 활성화 37 ° C에서 24 웰 플레이트에 웰 당 프로그래밍 미디어 (표 1), 24 시간 동안 5 % CO 2의. SEV 감염에 대한 3 우물을 준비합니다 OCT3 / 4, SOX2, KLF4 및 c-MYC (1도) SEV 감염 (GFP : 녹색 형광 단백질) (1도) 세포 수 (1 웰). </li><li> (단계 3.3에서) 24 시간 후, 혈구와 세포 수를 계산하고 감염의 다양한 (3-20) 다중도 (MOI) 각 바이러스의 양을 결정합니다. -80 ° C 저장 영역에서 센다이 바이러스 벡터 튜브 한 세트를 제거합니다. 수조 (37 ° C)에서 신속하게 SEV 벡터를 해동하고 얼음에 배치합니다. 바이러스의 양 (μL)= MOI (CIU / 셀) 바이러스 / 역가 세포의 X 번호 (CIU / ㎖) × 10-3 (μL / ㎖) </li><li> 활성화 TILS 포함 매체로 10-20 MOI에서 SEV 벡터의 혼합물을 첨가하여 개별적 OCT3 / 4, SOX2, KLF4 및 c-MYC을 수행 네 센다이 바이러스 벡터 튜브의 각각의 계산 된 양을 추가한다. </li><li> 형질 도입 효율을 확인하려면 활성화 TILS의 우물에 SEV-GFP의 계산 된 볼륨을 추가합니다. </li><li> (단계 3.5에서 3.6 단계) 접시를 놓고 24 시간 동안 37 ° C, 5 % CO 2의 인큐베이터에서. 24 시간 후, 형광 현미경 하에서 SEV-GFP 감염 TILS를 사용하여 감염 효율을 추정한다. </li><li> 15 ML 튜브에 (단계 3.5에서) 세포를 수집합니다. 5 분 동안 실온에서 200 × g으로 원심 분리기. </li><li> 상층 액을 제거하고 영장류 ES 세포 매체와 염기성 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF 4 NG / mL)로 hESC의 미디어 0.5 ㎖에 펠렛을 재현 탁. </li><li> 접점 10cm의 접시에 현탁액을 전송인 hESC의 배지 10ml에 SNL 피더 세포 미토 마이신 C는 처리. 식민지가 성장 될 때까지 다른 모든 날 hESC의 미디어를 변경합니다. </li><li> 21 일 (18)의 주위에, 클린 벤치에서 10 μl의 팁을 사용하여 현미경으로 식민지 주위 SNL 피더 세포를 제거합니다. </li><li> 10 μl의 팁을 사용하여 콜로니를 긁어 96 웰 조직 배양 플레이트의 웰 당 iPSCs 배지 100 ㎕에 200 ㎕의 팁을 사용하여 전송. 피펫 최대 2-3 시간에 아래로 50 ~ 100 μm의 평균 크기가 작은 덩어리로 식민지를 중단합니다. </li><li> 염기성 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF 4 NG / mL)로 iPSCs 매체의 웰 당 2 ㎖ 중의 (단계 2)에서 미토 마이신 C 처리 SNL 피더 세포를 6 웰 조직 배양 플레이트에 작은 덩어리로 이동. 매일 iPSCs 미디어를 변경합니다. </li><li> 모든 5~6일 1 ㎎ / ㎖ 콜라게나 제 IV 신선한 마이 토마 이신-C-처리 SNL 피더 세포와 6 잘 조직 배양 플레이트에 iPSCs를 전송합니다. immun 각 클론의 접시 당 2 우물을 준비ostaining. </li><li> 만능 마커 (SSEA3, SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81, 및 OCT3 / 4) (1) 면역 조직 화학 염색을하여 각 클론의 전체 재 프로그래밍을 결정합니다. 참고 : 만능 잠재력의 추가 평가를 위해 완전히 재 프로그래밍 IPSC 라인이 배아 체 형성과 분화 분석 또는 기형 종 형성 분석 (16)에 의해 삼 배엽으로 분화 할 수 있는지 확인합니다. </li><li> 완전히 재 프로그래밍 IPSC 라인은 세포 유전 학적 분석에 의해 정상 핵형을 보여 있는지 확인합니다. </li><li> 기형 종 형성, 미분화 TIL 유래 IPSC DMEM 6-8 주령 암컷 NOD / SCID 마우스의 피하 조직에 10 % FCS를 함유하는 100 ㎕ (1 × 106) 현탁액을 주입. 헤 마톡 실린 및 에오신으로 얼룩 기형 종 섹션. </li></ol> SSEA3, SSEA4, TRA1-60 및 TRA1-81에 대한 iPSCs 4. 면역 형광 염색법 <ol><li> 워시 PBS 1 ㎖와 iPSCs 및 4 % PA 1 mL로 iPSCs 해결10 분 동안 raformaldehyde 솔루션입니다. 4 %의 파라 포름 알데히드 용액을 제거하고 PBS 3 회 1 mL로 iPSCs 씻는다. 참고 :이 독성이 있기 때문에 파라 포름 알데히드를 사용하는 경우주의해야합니다. </li><li> 30 분 동안 버퍼 (표 1)과 차단 iPSCs를 전처리. 한편, PBS 및 트리톤 희석 차 항체 (래트 항 - 인간 SSEA3 마우스 항 - 인간 SSEA4 마우스 항 - 인간 TRA1-60, 마우스 항 인간 TRA1-81) 1시 50분 1.5 % 염소 혈청을 희석 용액 -100 (총 용적 1 ㎖). </li><li> 차단 버퍼 (표 1)를 제거합니다. 희석 차 항체 용액을 첨가하고, 실온에서 1 시간 동안 배양한다. 한편, 이차 항체 (항 - 마우스 IgG를 및 IgM의 또는 항 래트 IgM의) 1시 50분 1.5 % 염소 혈청을 희석 용액. </li><li> 희석 차 항체 용액을 제거하고 5 분 동안 1 ml의 PBS 3 회, 각과 iPSCs를 씻는다. 희석 차 항체 용액을 첨가하고 암실에서 실온에서 45 분 동안 배양한다. </l난&gt; <li> 희석 차 항체 용액을 제거하고 5 분 동안 PBS 3 회 1 ml의 각으로 iPSCs를 씻는다. 면역 형광 현미경으로 iPSCs을 준수하십시오. </li></ol> Oct3에 대한 iPSCs 5. 면역 형광 염색 / 4 <ol><li> 워시 PBS 1 ㎖와 iPSCs 10 분간 4 % 파라 포름 알데히드 용액을 1 mL로 iPSCs 해결. 4 %의 파라 포름 알데히드 용액을 제거하고 PBS 3 회와 iPSCs를 씻는다. </li><li> permeabilization 완충액 (표 1)를 첨가하고, 10 분 동안 실온에서 배양한다. permeabilization 버퍼를 제거하고 버퍼 (표 1) 차단 추가합니다. </li><li> 실온에서 30 분 동안 인큐베이션. 한편, 버퍼를 차단의 기본 항체 (마우스 항 - 인간 Oct3 / 4) 1:50 희석. </li><li> 희석 차 항체 솔루션을 추가하고 밤새 4 ° C에서 품어. </li><li> 희석 차 항체 용액을 제거하고 5 분 동안 PBS 1ml를 3 회 각을 iPSCs를 씻는다. 한편, 디(항 - 마우스 IgG / IgM의 염소) 류트 이차 항체 1 : 100 버퍼를 차단한다. </li><li> 희석 차 항체 용액을 첨가하고 45 분 동안 암실에서 실온에서 배양한다. </li><li> 희석 보조 용액을 제거하고 5 분 동안 PBS 3 회 1 ml의 각으로 iPSCs를 씻는다. 면역 형광 현미경에서 iPSCs을 준수하십시오. </li></ol>

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	<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li><li>Wernig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+reprogramming+of+fibroblasts+into+a+pluripotent+ES-cell-like+state.">In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state.</a> Nature. 448, 318-324 (2007).</li><li>Maherali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directly+reprogrammed+fibroblasts+show+global+epigenetic+remodeling+and+widespread+tissue+contribution.">Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution.</a> Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).</li><li>Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+germline-competent+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 448, 313-317 (2007).</li><li>Loh, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+T+cells+from+human+peripheral+blood.">Reprogramming of T cells from human peripheral blood.</a> Cell Stem Cell. 7, 15-19 (2010).</li><li>Seki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+terminally+differentiated+circulating+T+cells.">Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells.</a> Cell Stem Cell. 7, 11-14 (2010).</li><li>Staerk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+human+peripheral+blood+cells+to+induced+pluripotent+stem+cells.">Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 7, 20-24 (2010).</li><li>Nishimura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+rejuvenated+antigen-specific+T+cells+by+reprogramming+to+pluripotency+and+redifferentiation.">Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation.</a> Cell Stem Cell. 12, 114-126 (2013).</li><li>Vizcardo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+Human+Tumor+Antigen-Specific+T+Cells+from+iPSCs+Derived+from+Mature+CD8(+)+T+Cells.">Regeneration of Human Tumor Antigen-Specific T Cells from iPSCs Derived from Mature CD8(+) T Cells.</a> Cell Stem Cell. 12, 31-36 (2013).</li><li>Wakao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+functional+human+mucosal-associated+invariant+T+cells+via+reprogramming+to+pluripotency+and+redifferentiation.">Expansion of functional human mucosal-associated invariant T cells via reprogramming to pluripotency and redifferentiation.</a> Cell Stem Cell. 12, 546-558 (2013).</li><li>Dudley, M. E., Wunderlich, J. R., Shelton, T. E., Even, J., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+tumor-infiltrating+lymphocyte+cultures+for+use+in+adoptive+transfer+therapy+for+melanoma+patients.">Generation of tumor-infiltrating lymphocyte cultures for use in adoptive transfer therapy for melanoma patients.</a> J Immunother. 26, 332-342 (2003).</li><li>Gros, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+identifies+the+patient-specific+CD8(+)+tumor-reactive+repertoire+infiltrating+human+tumors.">PD-1 identifies the patient-specific CD8(+) tumor-reactive repertoire infiltrating human tumors.</a> J Clin Invest. 124, 2246-2259 (2014).</li><li>Rosenberg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Durable+Complete+Responses+in+Heavily+Pretreated+Patients+with+Metastatic+Melanoma+Using+T-Cell+Transfer+Immunotherapy.">Durable Complete Responses in Heavily Pretreated Patients with Metastatic Melanoma Using T-Cell Transfer Immunotherapy.</a> Clinical Cancer Research. 17, 4550-4557 (2011).</li><li>Restifo, N. P., Dudley, M. E., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+immunotherapy+for+cancer:+harnessing+the+T+cell+response.">Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response.</a> Nat Rev Immunol. 12, 269-281 (2012).</li><li>Saito, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+Melanoma+Tumor-Infiltrating+Lymphocytes+to+Induced+Pluripotent+Stem+Cells.">Reprogramming of Melanoma Tumor-Infiltrating Lymphocytes to Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cells International. 2016, 11 (2016).</li><li>Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+induction+of+transgene-free+human+pluripotent+stem+cells+using+a+vector+based+on+Sendai+virus,+an+RNA+virus+that+does+not+integrate+into+the+host+genome.">Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome.</a> Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85, 348-362 (2009).</li><li>Ban, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+transgene-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+(iPSCs)+by+temperature-sensitive+Sendai+virus+vectors.">Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 14234-14239 (2011).</li><li>Fujie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Type+of+Sendai+Virus+Vector+Provides+Transgene-Free+iPS+Cells+Derived+from+Chimpanzee+Blood.">New Type of Sendai Virus Vector Provides Transgene-Free iPS Cells Derived from Chimpanzee Blood.</a> PLoS One. 9, e113052 (2014).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

여기, 우리는 OCT3 / 4, SOX2, KLF4 및 c-MYC는 네 개의 전사의 SEV 매개 형질 도입에 의해 iPSCs에 흑색 종 TILS를 재 프로그래밍하기위한 프로토콜 요인 보여 주었다. 이 방법은 T 세포를 재 프로그램하는 SEV 시스템을 사용하여, 비 - 통합 방식 (7)의 이점을 제공한다. 이전의 연구는 SEV 리 프로그래밍 시스템은 섬유 모세포뿐만 아니라 말초 혈액 T 세포 7,17뿐만 아니라 재 프로그래밍 고효율 및 신뢰성있는 것으로 나타났다. 또, 최근에는 더 분화되고 그러한 PD-1과 같은 SEV 16 벡터하여 재 프로그램 할 수있는 말초 혈액 T 세포보다 같은 억제 수용체의 높은 수준의 발현이 흑색 TILS을 보여 주었다. SEV 벡터와 항 CD3 / CD28 자극과 감염의 타이밍은 재 프로그래밍 TILS 중요했다. 말초 혈액 T 세포를 대상 7 whil으로부터 수확 후 즉시 재 프로그래밍 항 CD3 및 IL-2로 자극 될 수있다전자 TILS 자극하기 전에 IL-2 3-4 주 동안 배양 할 필요가있다. TILS의 99 % 이상이 CD8 T 세포가 IL-2 및 항 CD3와 활성화와 문화 3-4 주 후에했지만 / CD28 (16), 우리는 iPSCs에서 TCR 재 배열의 분석 iPSCs가 TILS 출신 생성 된 것을 확인하는 것이 좋습니다 (그림 5). 참고로, 우리의 이전 연구를 비롯한 모든 iPSCs는 말초 혈 단핵 세포에서 SEV를 사용하여 생성 된 것을 나타내거나 TILS는 TCR 재 배열 7,16 있었다. 흑색 종 TILS에서 iPSCs의 생성이 가능했지만, 우리는 말초 혈액 T 세포 (0.1 %) 7보다 16 흑색 종 TILS의 재 프로그래밍 효율이 낮은 (0.01-0.05 %)는 것을 발견했다. 이것에 대한 이유는 불분명하지만, 그것은 억제 수용체의 발현 또는 높은 TILS 13,16 분화 T 세포 서브 세트의 큰 번호와 관련 될 수있다. 최근 상당한 진전리 프로그래밍 기술 TIL-iPSCs을 생성하는 리 프로그래밍 효율을 향상시킬 수있다. 2 세대 SEV 벡터 TS12KOS는 이전 연구에서 사용 18,19 종래 SEV 벡터보다 IPSC 발생의 높은 효율을 갖는 것으로 밝혀졌다. SEV의 재 프로그래밍 시스템과 인간 iPSCs의 유도가 가능하지만,이 프로토콜에 고려해야 할 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 우리는이 프로토콜에 SEV 감염시 태아 소 혈청을 사용합니다. 우리는 TILS 유사한 확산에도 불구하고, 소 태아 혈청 하나에 비해 SEV 감염시 인간 혈청와 미디어를 사용하는 경우 흑색 종 TILS의 재 프로그래밍 효율이 상당히 낮은 것으로 나타났습니다. 우리는 또한 IPSC 생성 및 유지 관리를 위해 마우스 피더 레이어를 사용하지만, 정의 피더 - 무료 및 이종없는 시스템은 향후 연구에서 다른 방법 일 수있다. 그것은 iPSCs를 생성하는 종양 수확의 시간에서 이개월를 해결한다흑색 종 TILS에서. 또한, 트랜스 프리 iPSCs를 얻기 위해 추가 1-2개월 걸릴 것이다. 이는 더 효율적인 바이러스 제거율 19 보였다 SEV 벡터 TS12KOS의 새로운 타입의 사용에 의해 단축 될 수있다. 결론적으로 흑색 TILS에서 인간 iPSCs의 발생이 가능하다. 현재의 프로토콜 T 세포 대체 요법에 대한 종양 특이 적 T 세포의 무한한 수를 생성하기위한 중요한 단계 일 수있다.

전사 인자의 정의 된 설정의 과발현을 통해 유도 된 다 능성 줄기 세포 (iPSCs)의 생성을 허용 세포 리 프로그래밍 기술은 세포 기반 치료 1,2- 분야에서 큰 가능성을 보유하고있다. 이러한 iPSCs는 전사와 후생 유전 학적 특징을 나타내는 유사 배아 줄기 세포 (는 ESC) 3-5 자기 갱신과 다 능성에 대한 용량을 가지고있다. 지난 10 년 동안 프로그래밍 기술로 만든 놀라운 진보는 우리가 심지어 T 세포 6-8으로 말기 분화 세포에서 인간 iPSCs를 생성 할 수있다. T 세포 유래 iPSCs는 (TiPSCs)는 TiPSCs 9-11에서 항원 특이 적 T 세포의 재생을 허용하는 원 T 세포와 같은 T 세포 수용체 (TCR) 쇄 유전자의 동일한 재 배열 된 구성을 유지한다. 흑색 침윤 림프구의 약 80 % (TILS)이 환자의 종양 특이 적 종양 관련 항원 A를 인식 얻은차 원래 암세포 (12)에 대한 세포 독성을 유지한다. 특히 TILS에 프로그램 된 세포 사멸 단백질 -1 (PD-1)의 발현은 돌연변이 neoantigen 특정 CD8 + 림프구 (13)을 포함한자가 종양 반응성 레퍼토리를 식별하는 것으로 밝혀졌다. 예비 lymphodepleting 요법 및 인터루킨 -2 (IL-2)의 전신 투여와 함께 전 생체 확장자가 TILS의 입양 전송 환자 (14)의 하위 집합에서 전이성 흑색 종의 실질적인 회귀가 발생할 수 있습니다. 전임상 모델에서 환자의 결과를 유도에도 불구하고, 불량한 주입 된 T 세포의 생존과 면역 억제 경로의 존재는 T 세포 대체 치료 잠재력을 손상시킬 것으로 보인다. 현재 임상 프로토콜은 다수 얻기 위해자가 T 세포의 광범위한 생체 조작을 필요로한다. 이것은 생존율이 불량한 말단 분화 된 T 세포를 감소 prol의 발생을 초래iferative 용량, PD-1 (15)의 높은 수준. 대체 T 세포 요법이 이론적 한계에 대한자가 면역 T 세포의 무제한 소스를 제공 할 수 iPSCs를 사용함으로써 극복 될 수있다. 최근 센다이 바이러스 (SEV) 네 개의 전사 인자 - 매개 전달, OCT3 / 4, SOX2, KLF4 및 c-MYC × 16 PD-1의 높은 발현 수준을 흑색 TILS의 프로그래밍을보고 하였다. 레트로 바이러스 벡터가 재 프로그래밍 유전자를 표현하기 위해 호스트 염색체에 통합을 필요로하지만, SEV 벡터가 아닌 통합하고 결국 세포질에서 제거된다. 효율성을 재 프로그래밍하는 렌티 바이러스 또는 레트로 바이러스 벡터에 비해 6-8 SEV 시스템 훨씬 높다. 렌티 바이러스 또는 레트로 바이러스 벡터에 의해 생성 된 일부 IPSC 클론 nonlymphoid 계통 6-8에서 할 수 있지만 또한 SEV 특히, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에서의 T 세포를 재 프로그램 할 수있다. 여기, 우리는 세부 사항절차는 인간 흑색 종 TILS의 단리 및 활성화와 SEV 리 프로그래밍 시스템을 사용 TIL 유래 iPSCs의 발생 구현.

<table><tbody><tr><td>gentle MACS C Tubes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>gentle MACS Dissociator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>Tumor Dissociation Kit, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-929</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 70 um Cell Strainer</td><td>BD</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon 50ml Conical Cntrifuge tubes</td><td>BD</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Life technologies</td><td>12440053</td><td></td></tr><tr><td>human AB serum</td><td>Life technologies</td><td>34005100</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine (200mM)</td><td>Life technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol (1000x, 55mM)</td><td>Life technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin&amp;nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>gentamicin</td><td>Life technologies</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (-)</td><td>Life technologies</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>recombinant human (rh) IL-2</td><td>Aldesleukin, Prometheus Laboratories Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD3</td><td>BD</td><td>555329</td><td></td></tr><tr><td>Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD28</td><td>BD</td><td>555725</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15</td><td>Lonza</td><td>04-418Q</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life technologies</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>N-Acetylcysteine</td><td>Cumberland Pharmaceuticals Inc.</td><td>NDC 66220-207-30</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tissue Culture Plates (6-well)</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tissue Culture Plates (24-well)</td><td>Corning</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>Sendai virus vector</td><td>DNAVEC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SNL feeder cells</td><td>Cell Biolabs, Inc</td><td>CBA-316</td><td></td></tr><tr><td>mitomycin C</td><td>SIGMA</td><td>M4287</td><td>soluble in water (0.5 mg/ml)</td></tr><tr><td>gelatin</td><td>SIGMA</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>basic fibroblast growth factor (bFGF)</td><td>Life technologies</td><td>PHG0264</td><td></td></tr></tbody></table>

generation of induced pluripotent stem cells from human melanoma tumor-infiltrating lymphocytes

생체의 입양 전송 전이성 흑색 종 환자의 상당한 부분 집합의 내구성과 완전한 응답을 중재 할 수자가 종양 침윤 림프구 (TILS)을 확장했다. 이 접근법의 주요 장애물 텔로미어 단축에 의한 전사 T 세포의 감소 된 가능성, 그리고 TILS의 제한된 수의 환자로부터 얻은. 그러나, 이들 덜 분화 된 T 세포의 다수 발생하는 문제이다 텔로미어 길이 덜 분화 된 T 세포는 T 세포 대체 요법을위한 이상적인 T 세포의 서브 세트 일 것이다. 대체 T 세포 요법이 제한 이론적하여 유도 다 능성 줄기 세포 (iPSCs)에 의해 극복 될 수있는 자기 갱신 능성, 길쭉한 텔로미어를 유지 및 면역 요법자가 T 세포의 무제한 소스를 제공한다. 여기서는 TILS로 프로그래밍 인자의 형질 센다이 바이러스 벡터를 사용 iPSCs를 생성하는 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 생성완전히 재 프로그래밍, 벡터없는 클론이야. 이러한 TIL 유래 iPSCs는 T 세포 대체 요법에 대한 환자 - 덜 분화 된 종양 특이 적 T 세포를 생성 할 수있을 것이다.

그림 1은 항 CD3 / CD28와 활성화 및 TILS에 OCT3 / 4, KLF4, SOX2 및 c-MYC의 유전자 전달 뒤에 rhIL-2 흑색 종 TILS의 초기 확장을 포함하는 절차의 개요를 보여줍니다 iPSCs의 생성. 일반적으로, rhIL-2 시작과 문화에 TILS는 구체에게 문화의 개시 후 21-28일을 형성한다. 이 시점에서, TILS는 항 CD3 활성화 될 준비가되어 / CD28가. 그림 2A 문화에 TILS은 rhIL-2 21 일에, 활성화 될 준비가 쇼 항 CD3 / CD28.도 2b는 GFP 소개를 보여줍니다 (20)에 형질 전환 된 센다이 바이러스 (SEV)에 의해 MOI. 그림 2C는 18~21일 SEV 감염 후에 나타나는 SNL 피더 세포에 대한 전형적인 만능 클론을 보여줍니다. 그림 2D가 발생 TIL 파생 된 iPSCs가 정상 핵형을 가지고 있음을 보여준다. 3은 그림 면역 염색은 쪽을 확인합니다iPSCs (SSEA3, SSEA4, TRA1-81, TRA1-60 및 OCT3 / 4)에 luripotency 마커 발현.도 4는 흑색 종 TILS로부터 유도 iPSCs 세 배엽으로부터 다양한 세포를 포함 기형 종을 형성 할 수 있음을 보여준다 (신경 조직, 호흡기 상피 세포 및 연골). TIL 유래 iPSCs는 TCR의 재 배열을 유지 생성 5는 그림. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54375/54375fig1.jpg" /> 그림 1 :. 흑색 종 TILS에서 iPSCs의 생성 도식 개요 프로토콜은 세 단계가 포함됩니다 IL-2 분리 및 TILS의 문화, 항 CD3 / CD28, 및 센다이 바이러스와 세포 재 프로그래밍과 T 세포 활성화 (SEV) 벡터 인코딩 OCT3 / 4, SOX2, KLF4 및 c-MYC. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54375/54375fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <p<html> 유지-together.within 페이지 = &quot;1&quot;&gt; : FO 클래스 = &quot;jove_content&quot; <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54375/54375fig2.jpg" /> 그림 2 :. 흑색 종에서 iPSCs의 생성은 TILS (A) rhIL-2의 TILS의 형태를 나타내는 이미지 그들은 문화의 개시 후 2-3 주 확장하기 시작했을 때. (B) SEV 감염 후 TILS 일일의 형태와 GFP 발현을 나타내는 이미지. (C) SEV 감염 후 21 일에 전형적인 ESC와 같은 IPSC 식민지. 스케일 바는 200 μm의 =. (D) TILS 흑색 종 유래의 iPSCs 중 하나 스물 G 줄무늬 중기 세포의 세포 유전학 분석. 그림 (D)는 사이토 등 (16)로부터 구성된다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54375/54375fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <html> ftp_upload / 54375 / 54375fig3.jpg &quot;/&gt; 그림 3 :. 줄기 세포의 다 능성 마커와 면역 형광 염색 면역 형광 분석은이 환자의 TIL에서 파생 된 iPSCs가 SSEA3, SSEA4, TRA-1-81, TRA-1-60, 및 OCT3 / 4 긍정적 인 것을 알 수있다. 스케일 바 = 100 μm.The 그림은 사이토 등 (16)로부터 구성된다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54375/54375fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54375/54375fig4.jpg" /> 그림 4 :. (NOD / SCID 마우스에 육주 후 분사)를 TIL 파생 된 iPSCs 클론에서 파생 된 기형 종 형성 Hematoxylin-와 iPSCs 및 에오신 염색 대표 기형 종 섹션의 다 능성의 확인이 표시됩니다. 사이토 등의 알 (16)에서 적응 그림..COM / 파일 / ftp_upload / 54375 / 54375fig4large.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/54375/54375fig5.jpg" /> 그림 5 :. TIL-iPSCs에서 TIL-iPSCs TCR-β 유전자 재 배열에서 TCR-β 유전자 배열 패턴의 다양한는 모세관 전기 영동으로 식별됩니다. 녹색 선은 Jβ1 유전자의 밴드에서 파생되고, 파란색 선은 Jβ2 유전자의 밴드에서 파생됩니다. 그림은 사이토 등 (16)로부터 구성된다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54375/54375fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="1 번 테이블" src="/files/ftp_upload/54375/54375tbl1.jpg" /> 표 1 : T 세포, 프로그래밍, t에 대한 구성umor SNL 피더 셀 및 IPSC 미디어 및 permeabilization 및 차단 버퍼 수집. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54375/54375tbl1large.jpg" target="_blank">이 테이블의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

The goal of this protocol is to show the protocol for reprogramming melanoma tumor-infiltrating lymphocytes into induced pluripotent stem cells.

인간의 흑색 종 종양 침윤 림프구에서 유도 만능 줄기 세포의 생성

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

generation-induced-pluripotent-stem-cells-from-human-melanoma-tumor

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.7K 조회수.  University of Michigan. The goal of this protocol is to show the protocol for reprogramming melanoma tumor-infiltrating lymphocytes into induced pluripotent stem cells.

비디오: Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using patient-specific hiPSCs allows the study of the underlying mechanism for pathogenesis, also providing a platform for the development of in vitro drug screening and gene therapy to improve treatment options. The promising potential of hiPSCs for regenerative medicine is also evident from the increasing number of publications (>7000) on iPSCs in recent years. Various cell types from distinct lineages have been successfully used for hiPSC generation, including skin fibroblasts, hematopoietic cells and epidermal keratinocytes. While skin biopsies and blood collection are routinely performed in many labs as a source of somatic cells for the generation of hiPSCs, the collection and subsequent derivation of hair keratinocytes are less commonly used. Hair-derived keratinocytes represent a non-invasive approach to obtain cell samples from patients. Here we outline a simple non-invasive method for the derivation of keratinocytes from plucked hair. We also provide instructions for maintenance of keratinocytes and subsequent reprogramming to generate integration-free hiPSC using episomal vectors.

This manuscript provides a step-by-step procedure for the derivation and maintenance of human keratinocytes from plucked hair and subsequent generation of integration-free human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) by episomal vectors.

헤어 유래 각질 세포를 사용하여 통합없는 인간 유도 만능 줄기 세포의 생성

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using ...

연구

발생학

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can direct the differentiation of hPSCs into the cell type of interest by manipulating the culture conditions to recapitulate signals seen during development. One such cell type is the melanocyte, a pigment-producing cell of neural crest (NC) origin responsible for protecting the skin against UV irradiation. This protocol presents an extension of a currently available in vitro Neural Crest differentiation protocol from hPSCs to further differentiate NC into fully pigmented melanocytes. Melanocyte precursors can be enriched from the Neural Crest protocol via a timed exposure to activators of WNT, BMP, and EDN3 signaling under dual-SMAD-inhibition conditions. The resultant melanocyte precursors are then purified and matured into fully pigmented melanocytes by culture in a selective medium. The resultant melanocytes are fully pigmented and stain appropriately for proteins characteristic of mature melanocytes.

This work describes an in vitro differentiation protocol to produce pigmented, mature melanocytes from human pluripotent stem cells via a neural crest and melanoblast intermediate stage using a feeder-free, 25 day protocol.

인간 다 능성 줄기 세포에서 멜라닌 세포의 공급이없는 유도

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a promising source for adoptive T cell therapy (ACT). However, classical in vitro methods for producing regenerated T cells from iPSC result in either innate-like or terminally differentiated T cells, which are phenotypically and functionally distinct from na&#239;ve T cells. Recently, a novel three-dimensional (3D) thymic culture system was developed to generate a homogenous subset of CD8&#945;&#946;+ antigen-specific T cells with a na&#239;ve T cell-like functional phenotype, including the capacity for proliferation, memory formation, and tumor suppression in vivo. This protocol avoids aberrant developmental fates, allowing for the generation of clinically relevant iPSC-derived T cells, designated as iPSC-derived thymic emigrants (iTE), while also providing a potent tool to elucidate the subsequent functions necessary for T cell maturation after thymic selection.

This article describes a novel method to generate tumor antigen-specific induced pluripotent stem cell-derived thymic emigrants (iTE) by a three-dimensional (3D) thymic culture system. iTE are a homogenous subset of T cells closely related to na&#239;ve T cells with the capacity for proliferation, memory formation, and tumor suppression.

뮤린 유도 만능 줄기 세포 유래 종양 항원 특이적 흉선 유이주자를 생성하는 3차원 흉선 배양 시스템

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

암 연구학

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of malignancies 1. CTLs can recognize malignant cells by interacting tumor antigens with the T cell receptors (TCR), and release cytotoxins as well as cytokines to kill malignant cells. It is known that less-differentiated and central-memory-like (termed highly reactive) CTLs are the optimal population for ACT-based immunotherapy, because these CTLs have a high proliferative potential, are less prone to apoptosis than more differentiated cells and have a higher ability to respond to homeostatic cytokines 2-7. However, due to difficulties in obtaining a high number of such CTLs from patients, there is an urgent need to find a new approach to generate highly reactive Ag-specific CTLs for successful ACT-based therapies.
TCR transduction of the self-renewable stem cells for immune reconstitution has a therapeutic potential for the treatment of diseases 8-10. However, the approach to obtain embryonic stem cells (ESCs) from patients is not feasible. Although the use of hematopoietic stem cells (HSCs) for therapeutic purposes has been widely applied in clinic 11-13, HSCs have reduced differentiation and proliferative capacities, and HSCs are difficult to expand in in vitro cell culture 14-16. Recent iPS cell technology and the development of an in vitro system for gene delivery are capable of generating iPS cells from patients without any surgical approach. In addition, like ESCs, iPS cells possess indefinite proliferative capacity in vitro, and have been shown to differentiate into hematopoietic cells. Thus, iPS cells have greater potential to be used in ACT-based immunotherapy compared to ESCs or HSCs.
Here, we present methods for the generation of T lymphocytes from iPS cells in vitro, and in vivo programming of antigen-specific CTLs from iPS cells for promoting cancer immune surveillance. Stimulation in vitro with a Notch ligand drives T cell differentiation from iPS cells, and TCR gene transduction results in iPS cells differentiating into antigen-specific T cells in vivo, which prevents tumor growth. Thus, we demonstrate antigen-specific T cell differentiation from iPS cells. Our studies provide a potentially more efficient approach for generating antigen-specific CTLs for ACT-based therapies and facilitate the development of therapeutic strategies for diseases.

Generation of T lymphocytes from induced pluripotent stem (iPS) cells gives an alternative approach of using embryonic stem cells for T cell-based immunotherapy. The method shows that by utilizing either in vitro or in vivo induction system, iPS cells are able to differentiate into both conventional and antigen-specific T lymphocytes.

T Lymphocytes쪽으로 유도 Pluripotent 줄기 세포의 분화 감독

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

면역학 및 감염병학

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of patients with advanced cancer. Adoptive T cell transfer (ACT) of highly enriched tumor antigen-specific T cells has been shown to cause durable regression of metastatic cancer in some patients. However, during expansion, these cells may become exhausted or senescent, limiting their effector function and persistence in vivo. Induced pluripotent stem cell (iPSC) technology may overcome these obstacles by leading to in vitro generation of large numbers of less differentiated tumor antigen-specific T cells. Human iPSC (hiPSC) have the capacity to differentiate into any type of somatic cell, including lymphocytes, which retain the original T cell receptor (TCR) genomic rearrangement when a T cell is used as a starting cell. Therefore, reprogramming of human tumor antigen-specific T cells to hiPSC followed by redifferentiation to T cell lineage has the potential to produce rejuvenated tumor antigen-specific T cells. Described here is a method for generating tumor antigen-specific CD8&#945;&#946;+ single positive (SP) T cells from hiPSC using OP9/DLL1 co-culture system. This method is a powerful tool for in vitro T cell lineage generation and will facilitate the development of in vitro derived T cells for use in regenerative medicine and cell-based therapies.

This article describes a method to generate functional tumor antigen-specific induced pluripotent stem cell-derived CD8&#945;&#946;+ single positive T cells using OP9/DLL1 co-culture system.

종양 항원 특이적 T 세포의 생성을 위한 인간 유도 만능 줄기 세포를 사용하여

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for progression-free and overall survival. Therefore, translational research needs to provide further molecular evidence to improve targeted therapies for malignant melanomas. In the past, oncogenic mechanisms related to melanoma were extensively studied in established cell lines. On the way to more personalized treatment regimens based on individual genetic profiles, we propose to use patient-derived cell lines instead of generic cell lines. Together with high quality clinical data, especially on patient follow-up, these cells will be instrumental to better understand the molecular mechanisms behind melanoma progression.
Here, we report the establishment of primary melanoma cultures from dissected fresh tumor tissue. This procedure includes mincing and dissociation of the tissue into single cells, removal of contaminations with erythrocytes and fibroblasts as well as primary culture and reliable verification of the cells' melanoma origin.
Recent reports revealed that melanomas, like the majority of tumors, harbor a small subpopulation of cancer stem cells (CSCs), which seem to exclusively fuel tumor initiation and progression towards the metastatic state. One of the key markers for CSC identification and isolation in melanoma is CD133. To isolate CD133+ CSCs from primary melanoma cultures, we have modified and optimized the Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) procedure from Miltenyi resulting in high sorting purity and viability of CD133+ CSCs and CD133- bulk, which can be cultivated and functionally analyzed thereafter.

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

This article describes the preparation of freshly obtained melanoma tissue into primary cell cultures, and how to remove contaminations of erythrocytes and fibroblasts from the tumor cells. Finally, we describe how CD133+ putative melanoma stem cells are sorted from the CD133- bulk using Magnetic Activated Cell Sorting (MACS).

환자 유래 세포 배양 및 CD133의 절연<sup&gt; +</sup흑종에서&gt; Putative 암 줄기 세포

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

의학

Direct Reprogramming of Mouse Fibroblasts into Melanocytes

The loss of function of melanocytes leads to vitiligo, which seriously affects the physical and mental health of the affected individuals. Presently, there is no effective long-term treatment for vitiligo. Therefore, it is imperative to develop a convenient and effective treatment for vitiligo. Regenerative medicine technology for direct reprogramming of skin cells into melanocytes seems to be a promising novel treatment of vitiligo. This involves the direct reprogramming of the patient's skin cells into functional melanocytes to help ameliorate the loss of melanocytes in patients with vitiligo. However, this method needs to be first tested on mice. Although direct reprogramming is widely used, there is no clear protocol for direct reprogramming into melanocytes. Moreover, the number of available transcription factors is overwhelming. 
Here, a concentrated lentivirus packaging system protocol is presented to produce transcription factors selected for reprogramming skin cells to melanocytes, including Sox10, Mitf, Pax3, Sox2, Sox9, and Snai2. Mouse embryonic fibroblasts (MEFs) were infected with the concentrated lentivirus for all these transcription factors for the direct reprogramming of the MEFs into induced melanocytes (iMels) in vitro. Furthermore, these transcription factors were screened, and the system was optimized for direct reprogramming to melanocytes. The expression of the characteristic markers of melanin in iMels at the gene or protein level was significantly increased. These results suggest that direct reprogramming of fibroblasts to melanocytes could be a successful new therapeutic strategy for vitiligo and confirm the mechanism of melanocyte development, which will provide the basis for further direct reprogramming of fibroblasts into melanocytes in vivo.

Here, we describe an optimized direct reprogramming system for melanocytes and a high-efficiency, concentrated virus packaging system that ensures smooth direct reprogramming.

The loss of function of melanocytes leads to vitiligo, which seriously affects the physical and mental health of the affected individuals. Presently, ...

<meta charset="utf8"></head><body>환자 유래 흑색종 오가노이드: 암 면역 요법의 최전선

Unveiling Therapeutic Opportunities with Melanoma Patient-derived Organoid Models

With the development of immunotherapy, there is an ongoing need to develop models that can recapitulate the tumor microenvironment of native tumors. While traditional two- and three-dimensional models can offer insights into cancer development and progression, these lack crucial aspects that hinder a faithful mimic of native tumors. An alternative model that has gained a lot of attention is the patient-derived organoid. The development of these organoids recapitulates the complex intercellular communication, tumor microenvironment, and histoarchitecture of tumors. This paper describes the protocol for establishing melanoma patient-derived organoid (MPDO) models. To validate these models, we assessed the immune cell composition, including the expression levels of T-cell activation markers, to confirm the cellular heterogeneity of the organoids. Additionally, to describe the potential utility of MPDOs in cellular therapies, we evaluated the cytotoxic capabilities of treating the organoids with &#947;&#948; T-cells. In conclusion, the MPDO models offer promising avenues for understanding tumor complexity, validating therapeutic strategies, and potentially advancing personalized treatment.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: 면역요법 평가를 위한 환자 유래 오가노이드를 사용한 흑색종 복잡성 재현

Here, we present a protocol to generate melanoma patient-derived organoids by culturing disassociated cell suspensions from fresh melanoma tissues. These organoids faithfully recapitulate patient-specific tumors in vitro, offering an innovative approach to exploring tumor immunosuppressive mechanisms, drug screening, drug resistance mechanisms, and cancer surveillance approaches.

흑색종 환자 유래 오가노이드 모델을 통한 치료 기회 발굴

With the development of immunotherapy, there is an ongoing need to develop models that can recapitulate the tumor microenvironment of native tumors. While ...

인간의 흑색 종 종양 침윤 림프구에서 유도 만능 줄기 세포의 생성

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Direct Reprogramming of Mouse Fibroblasts into Melanocytes

흑색종 환자 유래 오가노이드 모델을 통한 치료 기회 발굴

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