우리는 칼슘 이미징 프로토콜에 기여 박사 S. 스텔라와 헬렌 브엉 감사합니다. 우리는 인터뷰 장면을 촬영 박사 K. 시트 감사합니다. 우리는 원고에 그녀의 의견을 박사 아린 히라노 감사합니다. 이 연구 개발 프로젝트는 원격 진료 및 고급 기술 UCLA에서 의학의 데이비드 게펜 학교에서 저자에 의해 실시 된 미국 육군 의학 연구 및 물자 명령 (USAMRMC)에 의해 수여 및 투여 한 계약의 계약에 의해 가능하게되고, 계약 번호에서 MD 요새 Detrick에서 연구 센터 (TATRC) : W81XWH-10-2-0077. 이러한 연구에 대한 지원은 NIH의 EY04067 및 VA 훈장 검토 (NB)에서왔다. NCB는 VA 경력 연구원이다.

모든 실험은 인간의 실험실 동물의 관리 및 사용 및 캘리포니아 로스 앤젤레스 대학 (UCLA) 동물 연구위원회에 미국 공중 보건 서비스 정책에 의해 발행 된 실험 동물의 복지에 대한 지침에 따라 수행 하였다. 남성과 여성 성인 흰쥐 3-5주 세 사이 (찰스 리버 연구소, 윌 밍턴, MA)를 사용 하였다. Wholemount 망막 및 면역 프로토콜에 대한 1 동물 및 조직 준비 <ol><li> 해부 현미경, 아주 좋은 팁, ​​가위, 셀룰로오스 필터 종이, 플라스틱 피펫과 현미경 슬라이드와 두 집게 다음 재료 및 도구를 준비합니다. </li><li> 깊이 단두대로 잘린 다음 1-3% 이소 플루 란 (isoflurane)와 동물을 마취에 의해 밀폐 된 챔버에 쥐를 안락사. 세포 외 용액을 포함하는 페트리 접시에 홍채 가위와 장소 한 쌍의 눈을 제거합니다. A, 에임스 나 최대 절전 모드dium 또는 생리 학적 솔루션을 권장합니다. </li><li> [선택 단계 FLUO-4와 망막 신경절 세포의 채움이 필요한 경우]. 단계 2.3-2.4에 설명 된대로 FLUO-4 라벨을 수행합니다. </li><li> 해부 현미경 (광량 : 1.6 x 10 8 포톤 / mm 2 ⋅sec)를 사용하여, 안구의 전면을 차단하여 각막을 제거한다. 집게 안쪽 망막 표면에서 렌즈와 유리체를 제거합니다. 유리체를 제거하려면 한 forcep으로 꽉 공막을 잡고 안구를 안정. 조심스럽게 다른 forcep와 망막의 중앙으로 유리체 기반을 벗겨. 이 단계에서 준비 저온부에 사용되는 아이 컵, 불린다. 저온부에 대한 자세한 내용은 참고 문헌 (14, 15)에서 찾을 수 있습니다. </li><li> 아이 컵에서 망막을 제거합니다. 그런 다음, 네 상처는 망막 눕혀 할 수 있도록 할 수 있습니다. 조심스럽게 광 수용체 층 위로 현미경 슬라이드에 망막을 탑재합니다. 망막에 용액을 한 방울을 추가하고 CE 마크를 넣어망막에 llulose 필터 종이. 망막 여과지에 부착되면, 다시 용액 망막 배치. 필요한 경우, 브러시 또는 집게로 망막을 평평. </li><li> 고정 10 ~ 15 분 동안 4 % PFA에 wholemounted 망막을 놓습니다. </li><li> 0.1 M 인산염 완충액 (PB), pH가 7.4에서 30 분 동안 wholemounted 망막을 세 번 씻으십시오. 밤새 4 ° C에서 0.3 % 트리톤 X-100, 0.1 % NaN의 3을 포함하는 0.1 PB 5 % 정상 염소 혈청 또는 당나귀 혈청 망막을 차단합니다. 우리는 차단 솔루션과 항체를 저장하기위한 모든 단계 500 μL의 최종 볼륨을 권장합니다. </li><li> 다음 날, 4 ° C에서 차 항체 5-7일와 망막의 wholemounts을 배양한다. 최적의 희석은 사용자에 의해 결정되어야한다. </li><li> PB 0.1 M에서 망막 3 × 30 분 씻고 차 항체 (농도 1 : 1000)의 종류에 대하여 지시 된 해당 형광 접합 된 이차 항체에 4 ° C에서 하룻밤 배양한다. </li><li> PB 30 분 각각의 세 최종 세척 후, 중간 장착의 망막을 탑재합니다. 장기간 보관을위한 매니큐어와 커버 슬립을 봉쇄. 저장 샘플 4 ° C에서와 빛으로부터 보호합니다. </li></ol> 칼슘 표시기 염료와 쥐 Wholemount 망막의 신경절 세포와 축삭의 2 라벨링 <ol><li> 95 %, O2 / 5 % CO 버블 포유 동물 링거 포함 125 염화나트륨, 3의 KCl, 2 염화칼슘, 1.25의 NaH 2 PO 4, 1 MgCl2를, 25 탄산 수소 나트륨 (mm 단위)의 1,000 ml의 10 포도당을 준비 &#173; 2. </li><li> 단계 1.2-1.4에 설명 된대로 절개를 수행합니다. </li><li> 주사기를 사용하여 안구에 약 1mm 후방 시신경 그루터기에 FLUO-4 pentapotassium 염 (H 2 O에서 40 밀리미터 주)의 0.5 μl를, 칼슘 지시 염료와 망막 신경절 세포 (망막 신경절 세포)와 축색 돌기를로드 삽입하려면 . [CA에 신경절 세포의 동적 인 상승을 측정하기 2+ </SUP&gt;] 나는 그런 FLUO-4 345 nm의의의 K의 D와 높은 친 화성을 ​​가진 지표는 최적입니다. FLUO-4에 결합 할 때 칼슘&gt; 100 배의 방출 증가의 결과로 매우 높은 양자 효율을 갖는 추가적인 이점을 제공한다. </li><li> 포유 동물 링어의 95 % O 버블 2 / 5 % CO에 아이 컵을 놓고 &#173; 이 어둠 속에서 실온에서 1 시간 동안. </li></ol> 망막 신경절 세포와 축삭을위한 3 칼슘 이미징 프로토콜. <ol><li> 단계 1.1 ~ 1.4에 설명 된대로 눈, 렌즈와 유리체를 제거합니다. 아이 컵에서 망막을 분리하고 사분면으로 나눕니다. 마운트 사분면의 신경절 세포의 유리 슬라이드에면을 위로하고 안정 하프 슬라이스 그리드를 사용합니다. 어두운 적응 다른 조각을 유지 포유 동물 링어의 95 % O 버블 2 / 5 % CO에 &#173; 나중에 사용하기 위해 얼음에 2. </li><li> 포유류 링거액으로 기록 챔버와 Superfuse95 %, O2 / 5 % CO 2와 함께 지속적으로 버블 링 솔루션을 유지한다. </li><li> 이미지 현미경 조직. 실온 (~ 23 ° C에서) 또는 행동 실험, 무대를 따뜻하게 시편에서 물 목욕을 가열 또는 시료의 표면에 따뜻한 공기를 적용하여 생리 온도를 얻을 수 있습니다. 주 : 많은 세포 기능은 세포 내 항상성 (16)를 유지에 중요한 역할을 온도에 의해 조절된다는 점에 유의하는 것이 중요하다. 그러나 온난화 대책의 도입은, 열팽창 17 의한 중간 포커스 드리프트의 증발을 photobleaching에의 속도를 증가시킬 수있다. 실내 온도의 사용은 FLUO-4 (18)의 세포 내 구획화을 감소시킨다. </li><li> 약물의 부재에 두 쌍의 높은 K + 펄스들의 제어를 수행한다. 활성화하기 위해 각 펄스 동안 33 초 60는 3mm O를 [K +]를 높여 망막 신경절 세포와 축삭 RGC을 탈분극여덟 채널 중력 구동 superfusion 시스템 VGCCs. 높은 K + 용액 isosmolarity을 유지하기 위해 57 mm 정도 나 +를 줄입니다. </li><li> 일반 또는 특정 칼슘 채널 차단제의 사용과 칼슘 신호에 다른 VGCCs의 기여를 평가한다. 예를 들어, 비 특정 칼슘 채널 차단제, 코발트 투여 칼슘 신호의 감소는, 높은 K + -evoked 칼슘 신호 VGCCs의 기여의 반 정량적 측정 값을 제공 하였다. </li><li> (도 2) 관심 망막 신경절 세포 주변의 관심 (ROI)의 영역을 배치하여 형광 강도 값을 획득. </li><li> 제 높은 K + 피크에 의해 생성 된 변화에 제 높은 K + 피크에 의해 생성 된 형광 강도의 변화를 정규화한다. 이어서, 특정 칼슘 채널 차단제의 테스트를 위해, 단지 한 쌍의 제 높은 K + 펄스 동안 약물을 적용하고이 피크에 대해 정상화제 1 피크 값. 이 높은 K + 피크에 약물의 영향을 측정하기 위해 제의 의하여 제 K + 피크의 진폭을 나눈다. 분석은 약물의 부재하에 측정 한 쌍의 높은 K + 피크로부터 유도 그들의 정합 제어에 대하여 이러한 값을 수행하여야한다. </li><li> 5 초 간격으로 이미지를 획득. 광 탈색을 방지하기 위해 가능한 한 낮은 레이저 구동을 유지한다. 광전자 증 배관은 505 나노 LP 필터로 형광 방출을 수집하면서, 아르곤 레이저의 488 nm의 라인으로 음원을 제공한다. </li></ol>

<ol>
	<li>Guenther, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+calcium+currents+in+retinal+ganglion+cells+from+postnatal+rat.">Separation of calcium currents in retinal ganglion cells from postnatal rat.</a> Brain Res. 633, 223-235 (1994).</li><li>Farrell, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+voltage-gated+ion+channels+in+rat+retinal+ganglion+cells+mediated+by+somatostatin+receptor+subtype+4.">Modulation of voltage-gated ion channels in rat retinal ganglion cells mediated by somatostatin receptor subtype 4.</a> J Neurophysiol. 104, 1347-1354 (2010).</li><li>Caterall, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+regulation+of+voltage-gated+Ca2++channels.">Structure and regulation of voltage-gated Ca2+ channels.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 16, 521-555 (2000).</li><li>Berridge, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium--a+life+and+death+signal.">Calcium--a life and death signal.</a> Nature. 395, 645-648 (1998).</li><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+microdomains+Organization+and+function.">Calcium microdomains Organization and function.</a> Cell Calcium. 40, 405-412 (2006).</li><li>Dolphin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+channel+diversity+multiple+roles+of+calcium+channel+subunits.">Calcium channel diversity multiple roles of calcium channel subunits.</a> Curr Opin Neurobiol. 19, 237-244 (2009).</li><li>Rottman, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribonuclease+protection+assay+a+powerful+tool+for+the+veterinary+pathologist.">The ribonuclease protection assay a powerful tool for the veterinary pathologist.</a> Vet Pathol. 39, 2-9 (2002).</li><li>Briggman, K. L., Euler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bulk+electroporation+and+population+calcium+imaging+in+the+adult+mammalian+retina.">Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina.</a> J Neurophysiol. 105, 2601-2609 (2011).</li><li>Segev, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recording+spikes+from+a+large+fraction+of+the+ganglion+cells+in+a+retinal+patch.">Recording spikes from a large fraction of the ganglion cells in a retinal patch.</a> Nat Neurosci. 7, 1154-1161 (2004).</li><li>Jeon, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+major+cell+populations+of+the+mouse+retina.">The major cell populations of the mouse retina.</a> J Neurosci. 18, 8936-8946 (1998).</li><li>Blankenship, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+and+extrasynaptic+factors+governing+glutamatergic+retinal+waves.">Synaptic and extrasynaptic factors governing glutamatergic retinal waves.</a> Neuron. 62, 230-241 (2009).</li><li>Daniels, B. A., Baldridge, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=d-Serine+enhancement+of+NMDA+receptor-mediated+calcium+increases+in+rat+retinal+ganglion+cells.">d-Serine enhancement of NMDA receptor-mediated calcium increases in rat retinal ganglion cells.</a> J Neurochem. 112, 1180-1189 (2010).</li><li>Weitz, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+response+of+the+retina+to+electrical+stimulation+with+genetically+encoded+calcium+indicators.">Imaging the response of the retina to electrical stimulation with genetically encoded calcium indicators.</a> J Neurophysiol. 109, 1979-1988 (2013).</li><li>P&#233;rez de Sevilla M&#252;ller, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+voltage-gated+calcium+channel+&#945;(2)&#948;(4)+subunits+in+the+mouse+and+rat+retina.">Expression of voltage-gated calcium channel &#945;(2)&#948;(4) subunits in the mouse and rat retina.</a> J Comp Neurol. 521 (2), 2486-2501 (2013).</li><li>Hirano, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNAP25+expression+in+mammalian+retinal+horizontal+cells.">SNAP25 expression in mammalian retinal horizontal cells.</a> J Comp Neurol. 519, 972-988 (2011).</li><li>Berridge, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signalling+dynamics,+homeostasis+and+remodeling.">Calcium signalling dynamics, homeostasis and remodeling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 4, 517-529 (2003).</li><li>Dailey, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintaining+live+cells+and+tissue+slices+in+the+imaging+setup.">Maintaining live cells and tissue slices in the imaging setup.</a> Cold Spring Harb ProtocI. , 373-379 (2011).</li><li>Spinelli, K. J., Gillespie, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+intracellular+calcium+ion+dynamics+in+hair+cell+populations+with+Fluo-4.">Monitoring intracellular calcium ion dynamics in hair cell populations with Fluo-4.</a> AM. PLoS One. 7, e51874 (2012).</li><li>Kwong, J. M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+binding+protein+with+multiple+splicing+A+new+marker+for+retinal+ganglion+cells.">RNA binding protein with multiple splicing A new marker for retinal ganglion cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 1052-1058 (2010).</li><li>P&#233;rez deSevilla M&#252;ller, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Displaced+amacrine+cells+of+the+mouse+retina.">Displaced amacrine cells of the mouse retina.</a> J Comp Neurol. 505, 177-189 (2007).</li><li>P&#233;rez de Sevilla M&#252;ller, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracer+coupling+of+intrinsically+photosensitive+retinal+ganglion+cells+to+amacrine+cells+in+the+mouse+retina.">Tracer coupling of intrinsically photosensitive retinal ganglion cells to amacrine cells in the mouse retina.</a> J Comp Neurol. 518, 4813-4824 (2010).</li><li>Raymond, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyan+fluorescent+protein+expression+in+ganglion+and+amacrine+cells+in+a+thy1-CFP+transgenic+mouse+retina.">Cyan fluorescent protein expression in ganglion and amacrine cells in a thy1-CFP transgenic mouse retina.</a> Mol Vis. 14, 1559-1574 (2008).</li><li>Raymond, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Thy1-CFP+DBA/2J+mouse+line+with+cyan+fluorescent+protein+expression+in+retinal+ganglion+cells.">A Thy1-CFP DBA/2J mouse line with cyan fluorescent protein expression in retinal ganglion cells.</a> Vis Neurosci. 26, 453-465 (2009).</li><li>Mayer, M. L., Westbrook, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeation+and+block+of+N-methyl-D-aspartic+acid+receptor+channels+by+divalent+cations+in+mouse+cultured+central+neurones.">Permeation and block of N-methyl-D-aspartic acid receptor channels by divalent cations in mouse cultured central neurones.</a> J Physiol. 394, 501-527 (1987).</li><li>Ascher, P., Nowak, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+divalent+cations+in+the+N-methyl-D-aspartate+responses+of+mouse+central+neurons+in+culture.">The role of divalent cations in the N-methyl-D-aspartate responses of mouse central neurons in culture.</a> J Physiol. 399, 247-266 (1988).</li><li>Aizenman, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+mediated+by+excitatory+amino+acid+receptors+in+solitary+retinal+ganglion+cells+from+rat.">Responses mediated by excitatory amino acid receptors in solitary retinal ganglion cells from rat.</a> J Physiol. 396, 75-91 (1988).</li><li>Taschenberger, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+current+kinetics+in+a+solely+AMPA-receptor-operated+glutamatergic+synapse+formed+by+rat+retinal+ganglion+neurons.">Synaptic current kinetics in a solely AMPA-receptor-operated glutamatergic synapse formed by rat retinal ganglion neurons.</a> J Neurophysiol. 74, 1123-1136 (1995).</li><li>Chen, S., Diamond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptically+released+glutamate+activates+extrasynaptic+NMDA+receptors+on+cells+in+the+ganglion+cell+layer+of+rat+retina.">Synaptically released glutamate activates extrasynaptic NMDA receptors on cells in the ganglion cell layer of rat retina.</a> J Neurosci. 22, 2165-2173 (2002).</li><li>Jakobs, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+mRNA+for+glutamate+receptor+subunits+distinguishes+the+major+classes+of+retinal+neurons,+but+is+less+specific+for+individual+cell+types.">Expression of mRNA for glutamate receptor subunits distinguishes the major classes of retinal neurons, but is less specific for individual cell types.</a> Mol Vis. 13, 933-948 (2007).</li><li>Margolis, D. J., Detwiler, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+mechanisms+generate+maintained+activity+in+ON+and+OFF+retinal+ganglion+cells.">Different mechanisms generate maintained activity in ON and OFF retinal ganglion cells.</a> J NeurosciI. 27, 5994-6005 (2007).</li><li>Margolis, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+calcium+signaling+in+ON+and+OFF+mouse+retinal+ganglion+cells.">Dendritic calcium signaling in ON and OFF mouse retinal ganglion cells.</a> J Neurosci. 30, 7127-7138 (2010).</li><li>Baldridge, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+recordings+of+the+effects+of+cholinergic+ligands+on+neurons+in+the+ganglion+cell+layer+of+mammalian+retina.">Optical recordings of the effects of cholinergic ligands on neurons in the ganglion cell layer of mammalian retina.</a> J Neurosci. 16, 5060-5072 (1996).</li><li>Hartwick, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+assessment+of+glutamate+clearance+mechanisms+in+a+chronic+rat+glaucoma+model+using+retinal+ganglion+cell+calcium+imaging.">Functional assessment of glutamate clearance mechanisms in a chronic rat glaucoma model using retinal ganglion cell calcium imaging.</a> J Neurochem. 94, 794-807 (2005).</li><li>Badea, T. C., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+neuronal+morphologies+in+the+mouse+retina+visualized+by+using+a+genetically+directed+reporter.">Quantitative analysis of neuronal morphologies in the mouse retina visualized by using a genetically directed reporter.</a> J Comp Neurol. 480, 331-351 (2004).</li><li>Huberman, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+and+activity-mediated+refinement+of+axonal+projections+from+a+mosaic+of+genetically+identified+retinal+ganglion+cells.">Architecture and activity-mediated refinement of axonal projections from a mosaic of genetically identified retinal ganglion cells.</a> Neuron. 59, 425-438 (2008).</li><li>Kim, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+identification+of+a+retinal+cell+type+that+responds+to+upward+motion.">Molecular identification of a retinal cell type that responds to upward motion.</a> Nature. 452, 478-482 (2008).</li><li>Munch, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approach+sensitivity+in+the+retina+processed+by+a+multifunctional+neural+circuit.">Approach sensitivity in the retina processed by a multifunctional neural circuit.</a> Nat Neurosci. 12, 1308-1316 (2009).</li><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li></ol>

저자는 공시가 없습니다.

1) 면역 조직 화학 망막 wholemounts의 신경절 세포에 FLUO-4 현지화를 보여, 2) 칼슘 이미징 망막 신경절 세포 축색 돌기 칼슘 역학을 분석하기 위해이 문서에서 우리는 두 가지 기술을 설명했다. wholemounts을 사용하여 면역 조직 화학 20-23 망막 설치류에서 단백질의 현지화를 나타 내기 위해 사용되었다. 그러나, 몇 가지 제한이있다. 염색의 품질은 그 각각의 항원과 관심 특정 층에 망막 조직에 침투하는 능력을 인식하는 항체의 능력에 크게 의존한다. 이러한 문제는 신경절 세포 층을 통해 항체의 확산을 허용하도록 여과지없이, 최대 7 일까지 차 항체의 잠복기를 증가 트리톤-X의 농도를 증가 및 / 또는 망막을 배양함으로써 개선 될 수 있고, 광 수용체. 또 다른 제한은 durati입니다에와 고정의 농도. 조직이 한 시간 동안 고정 될 때 다른 항체가 짧은 고정 기간을 필요로하지만 어떤 항체는 더 나은 작동합니다. 특정 항체가 4 % PFA 고정에 최선을 작업하는 동안 마찬가지로, 다른 사람은 감소 된 농도에서 더 잘 작동합니다. 우리는 사용자가 최적의 재생 시간과의 고정 농도, 인큐베이션 시간, 트리톤-X의 농도뿐만 아니라, 최적의 결과를위한 일차 항체의 농도를 결정하는 것을 추천한다. 칼슘 이미징은 망막 신경절 세포의 축색 돌기 칼슘 동역학을 연구하기 위해 사용되었다. VGCC 차단제의 Superfusion는 약물의 상대적 차단 효과와 다른 칼슘 채널 아형의 존재의 평가를 허용했다. 망막 신경절 세포 축삭과 높은 K +에 응답하지 않는 경우에는, 높은 농도가 포화 될 수 있고, 칼슘 지시 염료의 농도를 감소하려고. 유리체의 불완전한 제거또한 망막 신경절 세포와 축색 돌기에 도달 높은 K의 +를 방지 장벽으로 작용할 수있다. 또한, 적절하게 망막 위에 하프를 탑재 실패 형광 강도 값을 획득하지 못하는 결과를 초래할 수있는 운동. 망막이 계속 이동하면, 신중 망막 주변 영역을 건조, 하프를 제거하고 그 둘레에 그리스를 더 추가하여 하프 다시 마운트. 망막 wholemount의 유리체 최소한의 운동의 완전한 제거는 실험의 성공에 매우 중요합니다. 예컨대 N-메틸-D-아스파 테이트 (NMDA) 등 망막 신경절 세포에 의해 발현 칼슘 투과성 글루타메이트 수용체 α 24,25 - 아미노 -3 - 하이드 록시 -5 - 메틸 아이 -4 - 프로피온산 (AMPA) 수용체 및 kainate 형 작용제 이온 성 글루타메이트 수용체는 26-29, 칼슘의 직접 입력을 불러 일으킬뿐만 아니라 VGCCs를 활성화 탈분극 자극을 ​​제공하는데 사용될 수있다. 이러한 작용 물질의 이용은 비 발생할 수 있습니다망막 신경절 세포의 다른 유형에 글루타메이트 수용체 아형의 발현 차이에 기인 -uniform 응답. 이광자 현미경은 망막 신경절 세포 (30) 및 그 돌기 (31)의 광 유발 칼슘 신호들을 조사하는 데에 이용 될 수있다. 망막 신경절 세포의 선택적 표지는 FLUO-4 pentapotassium 소금 칼슘 지시 염료의 막 impermeant 특성으로 인해 달성되었다. 덱스 트란 - 복합 칼슘 지표 염료를 선택적으로 토끼 32 쥐 33에서 망막 주사를 통해 망막 신경절 세포와 축삭 자신의 레이블을 사용되어왔다. 두 연구에서 망막 신경절 세포와 축색 돌기의 선택적 표지 토끼 32에서 2 시간 배양 또는 쥐 33에서 7 시간 배양 한 다음에 덱스 트란 - 복합 칼슘 지시 염료의 망막 주사를 통해 달성되었다. 망막에서 균일 한 표시를 위해 적절한 배양 기간을 제공에도 불구하고, 이러한 방법은 망막 신경절 세포의 증가 및 라벨링 될 그들의주사 부위 가까운 축삭 주사 부위에 말단 지역에 비해 부족한 라벨. 볼드리지 (1996), 주사 부위 불균일 라벨링 한 바와 같이 선단 영역에 라벨링 가능성하다가 역행 수송, 노광 (절단) 수지상에서 염료 흡수의 결과로 소마의 diffusional 라벨링에 기인 한 노출 축삭 32에서 염료의 흡수부터. 우리의 기술은 개선 된 방법 망막 신경절 세포와 축색 돌기의 균일 한 라벨을 증가하고 필요한 잠복 기간을 최소화 할 수 있습니다. 본 염료 로딩 방법은 신경절 세포 층에서의 변위 무 축삭 세포의 비특이적 로딩 될 벌크 로딩 및 전기 천공과 같은 종래의 기술에 대한 대안의 전략을 제공한다. 특정 신경절 세포 집단 34-38, 미래 입학 원서에 프로모터의 제어하에 tdTomato 또는 EGFP를 발현하는 형질 전환 마우스 선 가용성이 기술의 기능은 특정 망막 신경절 세포 아형의 칼슘 이미징 연구를 포함 할 수있다.

현재 1,2 채널 Ca는 전체 셀의 이들 성분의 약리 봉쇄를 통해 결정된 바와 같이 망막 신경절 세포 (망막 신경절 세포는) L-, N-, P / Q- 및 T 형 VGCC 표현. VGCC 송신기 자료, 유전자 전사, 세포 조절과 시냅스 가소성의 3,4,5에 참여하는 횡단 다중 체 단백질이다. 한 기공 채널의 생물 물리학 적 및 약리학 적 특성, 주로 세포 외 보조 α이 δ 소단위와 세포 내 β 서브 유닛을 설정 서브 유닛을 형성 α 대형, 횡단 : 기능 VGCCs은 서브 유닛 중 적어도 세 가지 클래스로 구성되어 있습니다. 다른 한 α 소단위와 후자의 두 형태 heteromeric 복합체와 세포막 6 채널의 게이팅 동력학 및 매매를 변경. 최근 수십 년 동안 많은 기술은 단백질 expre을 연구하기 위해 사용되었다이러한 면역 조직 화학, 효소 면역 분석법, 서부 분석 및 유동 세포 계측법 등 ssion. 이러한 기술은 주어진 관심 단백질의 검출을 위해 특정 항체의 사용을 필요로하고 다른 조직에서 지역화 특정 단백질의 분포를위한 강력한 도구를 제공한다. 항체가 용이하지 않을 때 예컨대 노던 블롯 분석과 같은 특정 단백질의 mRNA 발현 수준을 검출하고 정량화하기 위해 사용되는 기술은, RT-PCR은 실시간 정량 RT-PCR은, 동일계 하이브리드 화에서의 cDNA 마이크로 어레이 및 리보 뉴 클레아 제 보호 어 세이는 대안적인 접근법을 제공한다 특정 단백질을 사용할 경우 또는 발현 수준 7 낮다. 그러나, 이러한 분자 기술의 사용에 대한 제한은 하나의 유전자 서열의 신분증이다. 망막에서 단백질을 지역화하기 위해 면역 조직 화학 염색은 wholemount 망막 수행 할 수 있습니다. 망막 신경절 세포의 접근성, wholemount 인해준비는 RGC의 세포체와 축색 돌기 특정 단백질의 현지화를 연구 할 수있는 훌륭한 플랫폼을 제공합니다. 현지화 외에도, 망막 신경절 세포에서 VGCCs 일부 기능적 특성은 칼슘 이미징 기술의 사용을 통해 입증 될 수있다. 우리는 선택적으로 세포 내 칼슘의 동력학을 측정하는 칼슘 지시 염료와 망막 신경절 세포에 레이블 칼슘 촬상 프로토콜을 설명한다. 다른 세포 구획에서 칼슘 신호에 다른 VGCCs의 기여도는 특정 서브 타입 칼슘 채널 차단제를 이용하여 분리 할 수​​있다. 아마도 여기서 설명 칼슘 이미징 기술의 가장 이로운 측면 중 하나는 독립적으로 동시에 다수의 망막 신경절 세포 및 그들의 축삭에서 기록하는 기능이다. 이러한 전체 세포 패치 클램프 녹음 등 많은 생리 학적 기술은 높은 시간 해상도 막 전류의 기록, 신체 또는 살전의 축삭 소스를 제공하지만기록 된 전자 전류는 구별 될 수없고 레코딩은 한번에 하나의 신경 세포로부터 제조 될 수있다. 다중 전극 배열 (다자간)는 동시에 여러 셀들로부터 스파이크를 기록 할 수 있지만, 검출되지도의 활성화를 구별, 칼슘 채널의 예를 들면, 상이한 서브 타입 둘 수있다. 우선적으로 대형 스파이크 구를 생성하는 세포에서 주어진 전극 (8) 기록에 가까이에있는 세포에서 기록 MEAS. 광학 이미징 방법은 단일 세포 미세 전극 및 패치 클램프 기록 MEA 기록에 의한 정보로 통합 될 수있는 세포의 전체 인구의 동시 독립적 녹화 가능하도록 대체 전략을 제공한다. 여기에 설명 된 칼슘 이미징 기술은 망막 신경절 세포의 칼슘 동역학을 연구하기 위해 사용되었지만, 패치 클램프 및 다자간 또한 상기 이온 전류 및 망막 신경절 세포의 특성을 규명 급상승 병렬로 사용될 수있다. <p클래스 = &quot;jove_content&quot;&gt; 변위 무 축삭 세포 10 망막 마우스의 신경절 세포 층에서의 신경 인구의 약 60 %를 차지하기 때문에, 우리의 목표는 선택적으로 합성 칼슘 지시 염료와 망막 신경절 세포를 라벨 로딩 기술을 사용하는 것이었다 wholemount 준비. 합성 칼슘 지표 염료는 세포 내 칼슘 역학 연구를위한 훌륭한 플랫폼을 제공하지만, 널리 사용은 효과적으로 주어진 네트워크 내에서 신경 세포의 특정 인구를로드 할 수없는 방해하고있다. 같은 대량로드 (11)와 일렉트로의 8,12와 같은 많은 기술은 세포의 전체 인구는, 그러나, 이러한 기술은 특정 세포 유형을 구별하지 않는로드하기 위해 수행되었다. 유전자 칼슘 지표 선택적으로 세포의 특정 집단 레이블을 할 수있는 능력을 제공하는 부호화 그러나 이러한 방법은 형질 전환 동물 (13)의 생성을 요구한다. 우리의 기술 방식 운전 방식을 설명d를 선택적으로 칼슘 지시 염료의 시신경 그루터기 주입을 통해 wholemount 준비 망막 신경절 세포 레이블을. 이와 함께,이 문서에 설명 된 구조와 생리 학적 기술은 망막 신경절 세포와 축색 돌기의 현지화 및 칼슘 신호에 VGCCs의 기여를 공부하는 플랫폼을 제공합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="676">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Straight scissors</td>
			<td style="width:112px;">WPI</td>
			<td style="width:119px;">14124-G</td>
			<td style="width:229px;">dissecting tools</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Straight Forceps</td>
			<td style="width:112px;">WPI</td>
			<td style="width:119px;">501985</td>
			<td>dissecting tools</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">curved iris scissors</td>
			<td style="width:112px;">WPI</td>
			<td>504487</td>
			<td>dissecting tools</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cellulose filter paper</td>
			<td style="width:112px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">HABP04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hibernate A</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td><a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catProductDetail&amp;productID=A1247501">A12475-01</a></td>
			<td>Media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vectashield</td>
			<td>Vector</td>
			<td>H-1000&#160;</td>
			<td><a href="https://www.google.com/url?sa=t&amp;rct=j&amp;q=&amp;esrc=s&amp;source=web&amp;cd=1&amp;cad=rja&amp;sqi=2&amp;ved=0CC0QFjAA&amp;url=http%3A%2F%2Fwww.vectorlabs.com%2Fcatalog.aspx%3FcatID%3D279&amp;ei=VAHbUb_fBceeiQLK2IHIDw&amp;usg=AFQjCNHijFTTB8p19FMPQ5hg_qTawXU9mA&amp;sig2=FJCfB9fzKR_TmjxoGvhLcg&amp;bvm=bv.48705608,d.cGE">Mounting Media for Fluorescence</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fluo-4 pentapotassium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F-14200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Isoflurane</td>
			<td>Abbott Laboratories</td>
			<td>05260-05</td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microscope slide</td>
			<td style="width:112px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22-178-277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Zeiss LSM 5 Pascal microscope</td>
			<td style="width:112px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Axioplan 40x (NA 0.8) objective lens</td>
			<td style="width:112px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody</td>
			<td style="width:112px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">A-11034</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RBPMS</td>
			<td style="width:112px;">ProSci, Poway, CA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>A rabbit polyclonal antibody&#160;was generated against the N-terminus of the RBPMS&#160;polypeptide (RBPMS4-24), GGKAEKENTPSEANLQEEEVR, by a commercial vendor (ProSci, Poway, CA).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunohistochemical and calcium imaging methods in wholemount rat retina

본 논문에서 우리는 도구, 시약 및에 필요한 실제적인 단계를 설명 : 면역 조직 화학 염색에 대한 wholemount 망막의 1) 성공적인 준비를하고, 망막에서 칼슘 신호 전달을 매개 전압 게이트 칼슘 채널 (VGCC)의 연구를위한 2) 칼슘 이미징 신경절 세포. 칼슘 촬상 방법 우리 신경절 세포 층에서의 변위 무 축삭 세포의 비특이적 로딩 우회 관한 문제를 설명한다.

특정 항체를 Immunolabeling은 망막과 칼슘 이미징 기술에 대한 관심의 특정 단백질의 현지화를 연구하는 플랫폼을 제공하는 망막 신경절 세포 축색 돌기의 칼슘 역학 VGCCs의 기여에 대한 연구를 허용합니다. 신경절 세포 단백질 RBPMS에 대해 선택적으로 망막 신경절 세포 (19) 레이블 (다중 접합와 RNA 결합 단백질)을 항체를 사용하여, 우리는 FLUO-4 라벨은 신경절 세포 (그림 1)로 제한되어 있음을 보여줄 수 있었다. 루터 주입이 기술에서 예상 할 수있는 모든 신경절 세포의 라벨로 이어질하지 않습니다. 토끼 폴리 클로 날 항체는 상업적 공급 업체 (표 1)에 의해, RBPMS 폴리펩티드 (RBPMS 4-24) GGKAEKENTPSEANLQEEEVR의 N-말단에 대해 생성 하였다. RBPMS 높은 포유 동물 중에서 보존되고 폴리펩티드 서열이 사용<html> 예방 접종에 대한 마우스, 쥐, 원숭이와 인간 (NCBI 단백질 은행, 동일하다 <a href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein">http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein</a> ). 토끼의 혈청은 RBPMS 폴리 펩타이드 친 화성 컬럼을 사용하여 정제 예방 접종과 친 화성이 다음 수집 하였다. 친 화성 정제 된 항체는 마우스와 쥐의 망막 신경절 세포를 발현 사이 나타났다. RBPMS 면역 염색의 특이성을 평가하기 위해, preabsorption 제어 토끼 항체로 실시 하였다. 간단히, RBPMS 항체 RT에서 2 시간 동안 1 μg / ML의 최종 농도에서 RBPMS 폴리펩티드와 0.5 % 트리톤 X-100을 함유하는 혼합 된 0.1 M의 PB로 희석 하였다. 아니 RBPMS 면역 염색은 RBPMS 표준 면역 조직 화학 기술에 의해 처리 할 수​​있는 미리 흡수 토끼 항체와 함께 배양 조직 섹션에 존재하지 않았다. s.jpg &quot;폭 =&quot;600 &quot;/&gt; 그림 1 : RGC 단백질 RBPMS (빨간색)에 대한 항체와 사후 면역 염색은 신경절 세포에 FLUO-4 (녹색) 지역화를 보여 알렉사 568 염소 항 - 토끼 차 항체를 사용 하였다.. 스케일 바 : 20mm. 칼슘 이미징 기술은 망막 신경절 세포의 축삭과 그들의 칼슘 VGCCs 신호의 기여도를 연구하는 데 사용된다. 형광 강도 값은 관심있는 망막 신경절 세포 (그림 2)에 ROI를 배치하여 획득 하였다. <img alt="그림이" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51396/51396fig2highres.jpg" width="400" /> 그림 2 :. 50mm : 형광 강도 값을 획득하기 위해, 로아가 신경절 세포의 세포체 및 / 또는 축삭 스케일 표시 줄에 배치했다. FLUO-4 pentapotassium 염은 망막 신경절 세포와 축색 돌기 (그림 3) 라벨을 사용 하였다. 그림 3 : 신경절 세포의 세포체와 축색 돌기에서 칼슘 신호에 기여 VGCC 아형. (A)베이스 라인 수준에서 wholemount 망막의 공 초점 이미지. 망막 신경절 세포 및 RGC 축삭은 FLUO-4로 표지 알 수있다. (B)이 높은 K의 페어링 펄스 + (60 mM)을 입욕 용액 및 후속 환원에 의해 유도 된 평균 형광 강도의 증가를 보여주는 단일 RGC의 세포체로부터 형광 신호 초 펄스 동안에 코발트의 존재 하에서 형광. 에 대한 스케일 바 : 20mm. 자이스 LM5 파스칼 시스템은 5 초의 프레임 레이트로 이미지를 포착하도록 설정하고 각 풀 프레임 주사가 사용 설정에서 1.57 초 걸렸다. 318 μm의 X 318 μm의 컬렉션 영역은 512 X 512 파이의 스캔 영역에 포함되었다픽셀 당 0.385 μM 2의 면적을주는 xels. 이러한 설정은 원하는 해상도에 따라 변화 될 수있다. 시스템은 488 nm의 여기를위한 25 mW의 아르곤 레이저를 사용한다. 우리는 3 % 전력에서이 라인을 사용했다. 채도가 제 탈분극 자극에 강력한 반응을 수득 한 다음, 출력 이득을 감소시킴으로써 칼슘 지시 염료의 최저 농도를 선택함으로써 최소화 하였다. 레이저 파워의 감소는 표백을 방지하는 데 도움이. 표시 농도는 측정되지 않았다. 비 비율 적 이미징 보정 칼슘 ionophores의 사용으로 가능하지만 백필 기법뿐만 아니라 염료 비율 적으로 작동 할 수 있습니다. 최적의 표시 농도를 결정하기 위해, 우리는 1-40 밀리미터에 이르기까지 FLUO-4의 그루터기 주입 농도와 형광의 탈분극 - 유발 변화를 비교 하​​였다. 원형 및 타원형 ROI를 안정 형광 강도를 나타내 각각 망막 신경절 세포와 축색 돌기 주위에 그려진. 망막 신경절 세포와 축삭에서 표류때문에 superfusion에 의한 움직임에 초점이 선택되지 않았습니다.

Watch this Scientific Journal Video about Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina at JoVE.com

Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina

면역 프로토콜은 망막에있는 특정 단백질의 현지화를 연구하는 데 사용됩니다. 칼슘 이미징 기술은 망막 신경절 세포 축색 돌기 칼슘 역학을 연구하기 위해 사용된다.

Wholemount 쥐의 망막에서 면역 조직 화학 및 칼슘 이미징 방법

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for ...

immunohistochemical-calcium-imaging-methods-wholemount-rat

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.4K 조회수.  University of California, Los Angeles.  면역 프로토콜은 망막에있는 특정 단백질의 현지화를 연구하는 데 사용됩니다. 칼슘 이미징 기술은 망막 신경절 세포 축색 돌기 칼슘 역학을 연구하기 위해 사용된다. 

비디오: Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina

Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in intact spinal cord, brainstem, retina, cortex and dissociated neuronal culture preparations. During periods of spontaneous activity, neurons depolarize to fire single or bursts of action potentials, activating many ion channels. Depolarization activates voltage-gated calcium channels on dendrites and spines that mediate calcium influx. Highly synchronized electrical activity has been measured from local neuronal networks using field electrodes. This technique enables high temporal sampling rates but lower spatial resolution due to integrated read-out of multiple neurons at one electrode. Single cell resolution of neuronal activity is possible using patch-clamp electrophysiology on single neurons to measure firing activity. However, the ability to measure from a network is limited to the number of neurons patched simultaneously, and typically is only one or two neurons. The use of calcium-dependent fluorescent indicator dyes has enabled the measurement of synchronized activity across a network of cells. This technique gives both high spatial resolution and sufficient temporal sampling to record spontaneous activity of the developing network.
A key feature of newly-forming cortical and hippocampal networks during pre- and early postnatal development is spontaneous, synchronized neuronal activity (Katz &amp; Shatz, 1996; Khaziphov &amp; Luhmann, 2006). This correlated network activity is believed to be essential for the generation of functional circuits in the developing nervous system (Spitzer, 2006). In both primate and rodent brain, early electrical and calcium network waves are observed pre- and postnatally in vivo and in vitro (Adelsberger et al., 2005; Garaschuk et al., 2000; Lamblin et al., 1999). These early activity patterns, which are known to control several developmental processes including neuronal differentiation, synaptogenesis and plasticity (Rakic &amp; Komuro, 1995; Spitzer et al., 2004) are of critical importance for the correct development and maturation of the cortical circuitry.
In this JoVE video, we demonstrate the methods used to image spontaneous activity in developing cortical networks. Calcium-sensitive indicators, such as Fura 2-AM ester diffuse across the cell membrane where intracellular esterase activity cleaves the AM esters to leave the cell-impermeant form of indicator dye. The impermeant form of indicator has carboxylic acid groups which are able to then detect and bind calcium ions intracellularly.. The fluorescence of the calcium-sensitive dye is transiently altered upon binding to calcium. Single or multi-photon imaging techniques are used to measure the change in photons being emitted from the dye, and thus indicate an alteration in intracellular calcium. Furthermore, these calcium-dependent indicators can be combined with other fluorescent markers to investigate cell types within the active network.

Spontaneous activity of developing neuronal networks can be measured using AM-ester forms of calcium-sensitive indicator dyes. Changes in intracellular calcium, indicating neuronal activation, are detected as transient changes in indicator fluorescence with one- or two-photon imaging. This protocol can be adapted for a range of developmentally-dependent neuronal networks in vitro.

두피 네트워크 개발에 기능성 칼슘 이미징

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in ...

연구

신경과학

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

C.의 생체 Neuronal 칼슘 이미징에서 elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based multicolor labeling is challenging, especially when utilized for assessing interrelations between target proteins in the tissue with a high fat content such as the central nervous system (CNS).
Our protocol represents a refinement of the standard immunolabeling technique particularly adjusted for detection of both structural and soluble proteins in the rat CNS and peripheral lymph nodes (LN) affected by neuroinflammation. Nonetheless, with or without further modifications, our protocol could likely be used for detection of other related protein targets, even in other organs and species than here presented.

We here present an optimized, detailed protocol for double immunostaining in formalin-fixed, paraffin-embedded rat central nervous system (CNS) and peripheral lymph node (LN) tissue sections.

쥐 중추 신경계에서 면역 조직 화학 분석 및 주변 림프절 조직 섹션

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

Non-invasive Parenchymal, Vascular and Metabolic High-frequency Ultrasound and Photoacoustic Rat Deep Brain Imaging

Photoacoustics and high frequency ultrasound stands out as powerful tools for neurobiological applications enabling high-resolution imaging on the central nervous system of small animals. However, transdermal and transcranial neuroimaging is frequently affected by low sensitivity, image aberrations and loss of space resolution, requiring scalp or even skull removal before imaging. To overcome this challenge, a new protocol is presented to gain significant insights in brain hemodynamics by photoacoustic and high-frequency ultrasounds imaging with the animal skin and skull intact. The procedure relies on the passage of ultrasound (US) waves and laser directly through the fissures that are naturally present on the animal cranium. By juxtaposing the imaging transducer device exactly in correspondence to these selected areas where the skull has a reduced thickness or is totally absent, one can acquire high quality deep images and explore internal brain regions that are usually difficult to anatomically or functionally describe without an invasive approach. By applying this experimental procedure, significant data can be collected in both sonic and optoacoustic modalities, enabling to image the parenchymal and the vascular anatomy far below the head surface. Deep brain features such as parenchymal convolutions and fissures separating the lobes were clearly visible. Moreover, the configuration of large and small blood vessels was imaged at several millimeters of depth, and precise information were collected about blood fluxes, vascular stream velocities and the hemoglobin chemical state. This repertoire of data could be crucial in several research contests, ranging from brain vascular disease studies to experimental techniques involving the systemic administration of exogenous chemicals or other objects endowed with imaging contrast enhancement properties. In conclusion, thanks to the presented protocol, the US and PA techniques become an attractive noninvasive performance-competitive means for cortical and internal brain imaging, retaining a significant potential in many neurologic fields.

The present work describes a new protocol to perform non-invasive high-frequency ultrasound and photoacoustic based imaging on rat brain, to efficiently visualize deep subcortical regions and their vascular patterns by directing signals on skull foramina naturally present on animal cranium.

비 침습적 실질, 혈관 및 대사 고주파 초음파 및 광 음향 쥐 뇌 심부 이미징

Photoacoustics and high frequency ultrasound stands out as powerful tools for neurobiological applications enabling high-resolution imaging on the central ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new method of Ca2+-imaging using the bioluminescent reporter GFP-aequorin (GA) has been developed. This new technique relies on the fusion of the GFP and aequorin genes, producing a molecule capable of binding calcium and&#160;&#8212; with the addition of its cofactor coelenterazine &#8212; emitting bright light that can be monitored through a photon collector. Transgenic lines carrying the GFP-aequorin gene have been generated for both mice and Drosophila. In Drosophila, the GFP-aequorin gene has been placed under the control of the GAL4/UAS binary expression system allowing for targeted expression and imaging within the brain. This method has subsequently been shown to be capable of detecting both inward Ca2+-transients and Ca2+-released from inner stores. Most importantly it allows for a greater duration in continuous recording, imaging at greater depths within the brain, and recording at high temporal resolutions (up to 8.3 msec). Here we present the basic method for using bioluminescent imaging to record and analyze Ca2+-activity within the mushroom bodies, a structure central to learning and memory in the fly brain.

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Here we present a novel Ca2+-imaging approach using a bioluminescent reporter. This approach uses a fused construct GFP-aequorin which binds to Ca2+ and emits light, eliminating the need for light excitation. Significantly this method permits long continuous imaging, access to deep brain structures and high temporal resolution.

발광 생물 칼슘 표시 GFP - 쿼린을 기반으로 생체 기능성 뇌 영상의 접근 방식

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

두뇌 조각에서 신경 모 수석에서 2 광자 칼슘 이미지

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies

Pericytes are associated with endothelial cells and astrocytic endfeet in a structure known as the neurovascular unit (NVU). Brain capillary pericyte function is not fully known. Pericytes have been suggested to be involved in capillary development, regulation of endothelial barrier tightness and trancytosis activity, regulation of capillary tone and to play crucial roles in certain brain pathologies.
Pericytes are challenging to investigate in the intact brain due to the difficulties in visualizing processes in the brain parenchyma, as well as the close proximity to the other cells of the NVU. The present protocol describes a method for isolation and culture of primary bovine brain capillary pericytes and their following usage in calcium imaging studies, where effects of agonists involved in brain signaling and pathologies can be investigated. Cortical capillary fragments are allowed to attach to the bottom of culture flasks and, after 6 days, endothelial cells and pericytes have grown out from the capillary fragments. The endothelial cells are removed by gentle trypsinization and pericytes are cultured for 5 additional days before passaging.
Isolated pericytes are seeded in 96-well culture plates and loaded with the calcium indicator dye (Fura-2 acetoxymethyl (AM)) to allow for measurements of intracellular calcium levels in a plate reader setup. Alternatively, pericytes are seeded on coverslips and mounted in cell chambers. Following loading with the calcium indicator (Cal-520 AM), calcium live-imaging can be performed using confocal microscopy at an excitation wavelength of 488 nm and emission wavelength of 510-520 nm.
The method described here has been used to obtain the first intracellular calcium measurements from primary brain capillary pericytes, demonstrating that pericytes are stimulated via ATP and are able to contract in vitro.

Brain capillary pericytes are essential players in the regulation of blood-brain barrier properties and blood flow. This protocol describes how brain capillary pericytes can be isolated, cultured, characterized with respect to cell type and applied for investigations of intracellular calcium signaling with fluorescent probes.

세포칼슘 측정 및 칼슘 이미징 연구를 위한 뇌 모세관 과구 배양

Pericytes are associated with endothelial cells and astrocytic endfeet in a structure known as the neurovascular unit (NVU). Brain capillary pericyte ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

경동공 이광자 마우스 망막의 생체 내 이미징

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.

생체 내 마우스 열등올리브의 칼슘 이미징

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to correlate this with local hemodynamics. This protocol uses transgenic mice that have been prepared with a chronic cranial window and express the genetically encoded calcium indicator, RCaMP1.07, under the &#945;-smooth muscle actin promoter to specifically label mural cells, such as vascular smooth muscle cells and ensheathing pericytes. Steps are outlined on how to prepare a tail vein catheter for intravenous injection of fluorescent dyes to trace blood flow, as well as how to measure brain pericyte calcium and local blood vessel hemodynamics (diameter, red blood cell velocity, etc.) by two photon microscopy in vivo through the cranial window in ketamine/xylazine anesthetized mice. Finally, details are provided for the analysis of calcium fluctuations and blood flow movies via the image processing algorithms developed by Barrett et al. 2018, with an emphasis on how these processes can be adapted to other cellular imaging data.