We thank Hans Lassmann and Jan Bauer for their guidance and support. We also thank Katalin Benedek for excellent technical assistance and Caroline Westerlund for critical and linguistic appraisal.
This study was supported by grants from Biogen Idec, the Wenner-Gren Foundation, the Swedish Research Council, the Swedish Association of Persons with Neurological Disabilities, Swedish Brain Foundation, the EU 6TH Framework EURATools (LSHG-CT-2005-019015) and Neuropromise (LSHM-CT-2005-018637). The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.

윤리 정책 본 연구는 실험 동물에 대한 스웨덴 국립 이사회와 유럽 공동체위원회 지침의 지침에 따라 수행되는 윤리적 허가에 따라 (6백9분의 86 / EEC)는 N338 / 09, N15 / 10 N65 / 10에 의해 승인 된 북한 스톡홀름 동물 윤리위원회. 1. 조직 준비 <ol><li> 관류 및 고정 <ol><li> 좌심실을 통하여 관류 transcardial 수행 이소 플루 란 동물을 마취. 0.1 M PBS (PFA)에 4 % 파라 포름 알데히드 다음 혈액 성분을 제거하기 위해 인산 완충 식염수 (PBS)와 혈관의 헹굼을 시작합니다. </li><li> PFA에 침지하여 해부 뇌, 척수 및 말초 LN 조직을 흥분시키는. 4 ° C에서 24 시간 후, 추가 처리 할 때까지 4 ° C에서 PBS에 PFA에서 조직과 상점을 전송합니다. 또는 상업적 PBS에, 250 ml의의 S &amp;에 9g의 NaCl을 용해# 246; rensen은 버퍼 750 ml의를 탈 이온수를 추가 (DH 2 O); 2.5 L의 DH 2 O.에서 HPO 2 PO 4 X 2H 2 O를 4 × 상반기 2 O 및 71.2 g 2 나 0.2 M 소렌슨 완충액 (pH 7.4) 용해 13.8 g의 NaH를 준비합니다 </li></ol></li><li> 탈수 및 삽입 <ol><li> 면도날을 사용하여 약 5 ㎜의 두께 부분으로 조직을 잘라. </li><li> 크실렌 최종적 파라핀 (표 1) 다음에 조직 테크 VIP 진공 침투 프로세서 (에탄올의 농도 상승에 침수에 기초한 표준 절차를 사용하여 티슈 경화 처리 (탈수)을 시작합니다. </li><li> 금형에 조직을 올려 놓고 &quot;파라핀 블록&quot;을 형성하기 위해 샘플 주위 유동 파라핀에 붓는다. 장기 보관은 실온 (RT)가 필요합니다. 그러나, 절편하기 전에, 하룻밤, 예를 들어, 4 ℃에서 (O / N) 블록을 냉각하기를 권장합니다.</li></ol></li></ol> 2. 단면 <ol><li> 칼에 걸쳐 앞뒤로 이동할 수 썰매 마이크로톰의 고정 홀더로 파라핀 블록을 배치합니다. 블록 및 마이크로톰 나이프 (즉, 칼의 형상에 따라, 또한 절단 속도 및 기법) 사이에 최적의 각도를 조정한다. </li><li> 파라핀 블록에서 5 μm의 두께 단면 - 3 컷. </li><li> 물 용기에 바로 절단 부분을 전송하고 유리 슬라이드에 물에서 연속적으로 마운트. </li><li> 잔류 물과 잠재적 인 기포를 제거하기 위해 종이 타월에 대해 조심스럽게 장착 섹션을 누릅니다. 상업적으로 미리 접착 코팅 된 유리 슬라이드를 추천한다. </li><li> 60 °의 C - 드라이 (50)에 난로에서 두 시간 동안 슬라이드를 장착. </li></ol> 3. 탈 파라핀 (재수 및 차단 내생 퍼 옥시 다제) <ol><li> 슬라이드는 자일 렌으로 2 배 빠져 (또는 자일 렌 대체XEM-200), 각 시간 15-20 &#39;. </li><li> 99 % 에탄올로 씻어. </li><li> 내인성 퍼 옥시 다제 활성을 차단하기 위해, 0.25 %의 과산화수소를 함유하는 메탄올 용액 30 &#39;에 대한 섹션을 배양한다. </li><li> 수분 함량 (99 %, 70 % 증가하고, 증류수에서 끝나는 에탄올을 사용하여 재수 화를 계속한다. </li><li> 커버 장착 될 때까지이 시점에서 섹션을 촉촉하게 유지해야 할 전표. </li></ol> 4. 항원 검색 <ol><li> 작업을 준비하는 단계; 60 &#39;(이 경우에는 EDTA의 pH 8.5 완충액) 항원 검색 용액 슬라이드 비등하는 찜통을 사용 (EDTA 완충액 원액 DH 2 O 50 ㎖에 용해시킨 1.21 g 트리스 및 0.37 g의 EDTA를 포함 47.5 ml의 DH 2 O) 용액의 희석 2.5ml를의 EDTA 원액. </li><li> 약에 대한 RT에 슬라이드를 냉각. 1 시간 후, 3 린스 - 트리스와 배는 생리 식염수 (TBS, 사용 대안 PBS)를 0.05 M 트리스 0.15 M의 NaCl로 구성된 완충; pH를 7.5으로 조정 위스콘신일 염산. 또는 상업적 TBS를 사용합니다. </li></ol> 5. 비특이적 결합 부위를 차단 <ol><li> , 비특이적 백그라운드 반응을 피하기 10 % 소 태아 혈청 (FCS) 및 90 % DAKO 완충액을 함유하는 차단 용액에 &#39;30 RT에서 섹션을 배양. </li></ol> 6. 두 번 Immunolabeling : 기본 애비와 동시 배양 <ol><li> 차단 솔루션 차 항체의 필요한 양을 희석 및 O / n를 4 ° C에서 품어. (1 ED1 : 1000) α-Cd68 또는 α-Iba1 (Aif1, 1 : 1000) 또는 α-Cd8α (황소 8; 1 : 200); 이중 면역 염색에 대한 α-에오 탁신 (300 일 Ccl11)를 ​​결합 . </li><li> 슬라이드는 TBS 완충액으로 3 ~ 5 배 린스 (또는 10 배 희석 DAKO 버퍼를 사용한다). </li><li> 차단 솔루션과 RT에 1 시간을 품어 : 이차 항체의 필요량 (200 바이오틴 안티 염소와 AP-복합 항 - 마우스, 모두 1) 희석. </li><li> (우리를 TBS 버퍼와 5 배 - 슬라이드 3을 씻어대안 예 10 배) DAKO 버퍼를 희석시켰다. </li><li> RT에서 1 시간 동안 블로킹 용액으로 희석하고 아비딘 - 고추 냉이 퍼 옥시 다제 착체 (HRP)와 함께 인큐베이션 슬라이드. </li><li> 슬라이드 3 린스 - TBS 버퍼 (또는 10 배 희석 DAKO 버퍼를 사용)으로 5 배. </li></ol> 7. 시각화 <ol><li> 바운드 AP 표지 이차 항체의 시각화 <ol><li> 1 L의 DH 2 O 12.1 g의 트리스 용해시켜 0.1 M 트리스 HCl 완충액을 준비하고 염산을 이용하여 pH를 조절한다. 레바 미솔 1 M 용액을 제조하기 위해 동일한 트리스 -HCl 버퍼를 사용한다. DH 2 O.에서 갓 4 %에 NaNO 2 용액을 제조 </li><li> (37 (하나의 표준 유리 큐벳에 필요한 볼륨) 빠른 블루 (FB) 기판 유리 튜브 312.5 μL의 DMF에 6.25 mg의 나프톨-AS-MX-인산을 용해 및 사전 예열 50 ㎖로 저어 50 ㎖를 얻으려면 ° C) 트리스 - 염산 완충액. 312.5 ㎕의 2 N 염산 12.5 mg의 FB RR 소금을 용해하는 것은 처리장 이전의 312.5 μl를 추가4 %에 NaNO 2 용액은 적색 및 예열 트리스 - 염산 완충액 동일한 50 ㎖로 혼합 교반한다. 노란 액체가 분명해질 때까지 가볍게 흔들어 마지막으로 이전에 제조 된 1 M의 levamisole 용액 77 μl를 추가합니다. 여액의 혼합물을 수득하고, 유리 큐벳에 넣고 슬라이드 위에 붓는다. </li><li> 37 ° C에서 배양을 시작하고 약 광학 현미경 하에서 공정을 개발하고 제어 할 수 있습니다. 매 15-30 분. 퍼지 온 경우, 새로운 혼합물로 FB 솔루션을 교체합니다. </li><li> PBS 버퍼에이어서 TBS 버퍼 및 전송에 5 배 - 슬라이드 3을 씻어. </li></ol></li><li> 결합 된 바이오틴 이차 항체의 시각화 <ol><li> DAB는 / H 2 O 2 49 ml의 PBS 1 ml의 DAB 원액 (1 ml의 PBS 당 25 mg을 DAB)을 희석하여 솔루션을 개발 준비합니다. 쏟아져 이전 섹션에 16.5 μL의 H 2 O 2 및 여과 액을 추가합니다. </li><li> 침전 이마에 발색의 DAB의 전환n 개의 안료는 즉시 할 수 있습니다. (높은 배경을 높이고 특정 신호를 마스크 수 초 이상 배양에도 몇) 광 현미경 개발 프로세스를 제어 할 수 있습니다. </li><li> 갈색 안료 석출물의 강도는 대안 적으로 &#39;5 2 % 황산구리 및 0.9 % 염화나트륨 용액으로 이루어진 배양을 향상시킬 수있다. </li><li> 슬라이드 3 린스 - PBS로 5 배 그리고 마지막으로 DH 2 O와 함께, 또는 수돗물을 사용합니다. </li><li> 커버 수성 GelTol 설치 매체를 사용하여 물에서 직접 전표와 슬라이드를 탑재합니다. 공기 방울을 생성하지 마십시오. </li><li> 설치 매체의 완전한 건조, 예를 들어, O / N에서 4 ℃로 할 수 있습니다. 스토어 RT에 슬라이드를 건조. </li></ol></li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 1. </td><td> % 에탄올 </td><td> 20 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 2. </td><td> % 에탄올 </td><td> 60# 39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 삼. </td><td> % 에탄올 </td><td> 90 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 4. </td><td> % 에탄올 </td><td> 60 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 5. </td><td> % 에탄올 </td><td> 90 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 6. </td><td> % 에탄올 </td><td> 60 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 7. </td><td> % 에탄올 </td><td> 90 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 8. </td><td> % 에탄올 </td><td> 120 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 9. </td><td> 크 실롤 </td><td> 30 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 10. </td><td> 크 실롤 </td><td> 60 &#39; </td><td> 40 ° C </td></tr><tr><td> 11. </td><td> 파라핀 </td><td> 60 &#39; </td><td> 60 ° C </td></tr><tr><td> 12. </td><td> 파라핀 </td><td> 60 &#39; </td><td> 60 ° C </td></tr><tr><td> 1삼. </td><td> 파라핀 </td><td> 60 &#39; </td><td> 60 ° C </td></tr><tr><td> 14. </td><td> 파라핀 </td><td> 120 &#39; </td><td> 60 ° C </td></tr></tbody></table> 조직 테크 VIP 진공 침투 프로세서에 의해 표 1. 조직 처리.

<ol>
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The authors declare no conflict of interest.

표준 IHC 절차는 종종 일반적으로 폭 넓은 경험뿐만 아니라 &quot;시행 착오&quot;접근 방식을 의미 최적의 결과를 얻기 위해 특정 조정을 필요로한다. 티슈 제조에서 대상 가시화 될 때까지 상기 프로토콜 거의 각 단계는 개별적으로 최종 결과를 개선하기 위해 수정 설계를 실시 할 수있다. 여기에 제시된 이중 염색 프로토콜은 특히 신경 염증에 영향을 포르말린 고정 파라핀 포매 쥐 CNS 및 LN 조직 섹션에서 우리 관심 대상 단백질 사이의 상호 관계를 평가하기위한 조정 대상 IHC 계 단백질을 예시한다. 이와 같이,이뿐만 아니라 고급 시험 영감의 근원으로, IHC의 방법을 배우기위한 가이드로서 사용될 수있다. 그러나, 유념해야 / 또는 여기에서 최적의 결과를 생성 할 수있다 표시 이외의 조직 및 다른 단백질을 대상으로 본 프로토콜의 단순한 재생. Ccl11이 congenic 쥐 스트레인 (10)의 CNS에서 각각의 mRNA 수준의 상향 조절을 나타냈다에 대하여&gt; 현장 하이브리드에 잠겨 핵산 (LNA) 리보 프로브 (riboprobe)를 사용. qPCR에 의해 확인 하였다이 결과 분석. 또한, qPCR에 야생 유형 (중량) 균주에 비해 congenic 주변 LN에도 Ccl11의 상향 조절 한 것으로 밝혀졌습니다. 최종적으로, 웨스턴 블랏 (WB)는 질병 보호 congenic 쥐 계통 (10)의 양쪽 표적 조직에 Ccl11 단백질의 유의 한 상향 조절을 보였다. 따라서, 대상 조직에 직접 케모카인의 출처를 조사 할 목적으로, 그 목적을 위해, 우리는 여기에 설명 된 이중 염색 프로토콜을 개발했다. 사후 해부 및 사후 고정 탈회시 조직의 기계적 손상을 방지 외에도, 조직 절편은 매우 도전 나타날 수 있습니다. 절편은 일반적으로 기술과 연습이 필요합니다. 슬라이스의 품질은 여러 측면의의에 따라 달라집니다UCH 절단 동안 샘플에 가해지는 압력을 감소시키기 위해 조직 블록과 칼과 직각을 조정하는 등, 슬레지 마이크로톰에 의해 생성 된 파라핀 포매 조직 조각 절단 속도 등의 두께는 2 내지 50 ㎛, 변할 수있다. 파라핀 조직 조각이 요구 염색 과정 동안 더 유지를 위해 바람직하게는 상업적으로 폴리 -L- 리신 또는 아미노 프로필 트리에 톡시 실란 (APTS) 등의 접착제로 코팅 된 유리 슬라이드 상에 온수욕에서 장착 잘라. 앞서 염색 cryomicrotome를 사용하여 -20 ℃에서 약 잘라 RT에서 건조 조직 절편을 냉동하는 반면, 파라핀 블록을 실온에서 분리하고,이어서 탈 파라핀 전에 50 ~ 60 ° C에서 건조 냉각시켰다. 고도로 보존 된 조직 구조, 세포 형태와 표적 에피토프는 표적 단백질의 위치 파악과 연계 평가를 위해 필수적이다. 최적의 조직 preser을 달성하기 위해서vation는 샘플 적절히 부응 또는 가교 고정 제를 사용하여 고정 될 수있다. 에탄올과 같은 응고 고정 제는 더 자주 냉동 보존에 사용된다. 에탄올을 사용하여 단백질 변성 조직의 탈수 (9)을 통해 달성된다 불충분 한 세포 보존 (16)이 발생할 수있다. 응고 고정 제와 달리 포름 알데히드 자주 루틴 조직학 IHC 9에서 사용되는 가교 성 정착액은 모두 cryo- 파라핀 조직 보존을위한. 우리는 이전에 탈회 이후 파라핀 삽입 4 ° C에서 24 시간 동안 포름 알데히드 용액에 침지하여 쥐 CNS와 LN위한 최적의 고정을 달성했다. 거대 분자의 형태에 큰 변화를 일으키는에도 불구하고,이 반 가역, 공유 시약 QUAL 높은 제공 (포름 알데히드, 즉 단백질을 가교하여 항체의 특이 적 결합을 방지 할 수있다 항원을, 마스크 메틸렌 다리를 형성한다)성만 조직 보존. 특히, 가교 시약과 온도 및 고정 기간은, 절편 항원 검출과도 교차 반응으로 IHC의 여러 측면에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 모두 각각 주로 인해자가 분해 또는 과도한 크로스 링크 (17)에있는 유물이 발생할 수 있습니다 포름 알데히드와 같은 알데히드 기반의 시약을 사용하여 고정 언더와 오버 고정. 그럼에도 불구하고, 소수성 단백질 overfixation 관찰 바인딩 의한 비특이적 백그라운드 염색 또는 클론 애비 (18)를 사용할 때의 희석 완충액의 pH를 상승시켜 비이 온성 계면 활성제를 함유하는 저 소금 버퍼를 사용하여 감소 될 수있다. 그러나, 이온 성 및 정전 단백질 상호 작용에 의해 발생하는 비특이적 백그라운드 염색 (노이즈)가 동시에 소수성 단백질 (18) 결합에 의해 야기되는 소음을 악화시킬 수있다 고 이온 강도로 희석 완충액을 이용하여 감소 될 수있다. 이 타겟 항원의 검출에 관해서, 알데히드 I완전히, 항원 검색 (19)에 의해 반전되지는 않았지만 단백질의 삼차 구조의 nduced 변경이 될 수 있습니다 : 다양한 pH 값 (열 유발 에피토프 검색 (HIER)와 버퍼에서 가열하여 ⅰ), ⅱ) 효소 분해에 의해 (단백질 분해 효소가 유도 에피토프 검색 (PIER 20)), ⅲ) 강 알칼리성 또는 산성 용액 또는 자당 (21)의 배양, (22) 또는 IIII) 농축 포름산 (23)으로 처리하여. 대상의 대부분이 19 에피토프 HIER 편리 나타납니다. 가열 기간 외에, 예컨대 EDTA (pH를 5.5, 8.5 또는 9.0) 또는 구연산 나트륨 완충액 (pH 6.0- 6.2)로 용액의 pH 값은 HIER의 결과에 필수적 일 수있다. 특히, 본 연구에서 가장 만족스러운 결과는 pH 값을 8.5로 EDTA 용액에 1 시간에 대한 샘플을 스팀에 의해 달성 하였다. 항체가 우선적으로 특정 항원 결정기, 비특이적에 매력에 결합하지만, 동족의 Ag 유사한 바인딩사이트가 완전히 배제 할 수 없다. 특히, 백그라운드 염색을 감소 아마도 가장 효율적인 방법은 종래 기본 애비 (9)의 응용 프로그램 (본 연구에 사용 된 예로서 FCS) 단백질을 차단 인큐베이션한다. 단일 클론 차 애비는 어쨌든 인해 높은 특이성하여 감소 불특정 배경 신호에 폴리 클로 날 애비보다 선호된다. 모노클 복근 흔히 다른 (비특이적) 단백질 (24)의 일부일 수있다 아미노산의 소수로 이루어진 에피토프에 대해 지시 된 바와 그럼에도 불구하고, 교차 - 반응성은 여전히 나타날 수있다. 모노클 달리 클론 복근 표적 단백질의 여러 이성체 인식 높은 기회가있다. ⅰ) 폴리 클로 날은 염소에서 제기 및 ⅱ) 단일 클론 마우스에서 제기 : 우리는 처음에 Ccl11를 감지하는 두 가지 주요 복근을 사용했다. 우리 손에 두 제품 대상 케모카인에 동일한 염색 패턴을 나타내었다. 동시 공동 염색을 수행하기 위해, 우리는 염소 안티 쥐는 Ccl1를 사용모든 마우스에서 생성 된 각각 년 Iba-1 ED1 및 CD8,에 대한 항체와 조합 한 순이. 동일한 종에서 생성 된 기본 복근 공동 라벨에 필요한 그러나 또한 동시에 이중 면역 염색도 25에 순차적 수행 될 수있다. 본 연구에 사용 된 복근의 최적 작동 농도는 특정 신호의 강도와 배경 잡음 사이의 최적 비율로 시험 희석 시리즈를 통해 평가 하였다. 그러나,이 같은 항체의 최적의 작업 농도가 때때로 기관, 종, 배경 병리 등 특히, permeabilization가 포함 된 파라핀 수행 우리의 염색 과정에서 필요하지 않은 사이에 다를 수 있다는 것을 명심해야한다, 3-5 μm의 두께의 조직 절편 그러나, 트리톤 X-100과 같은 세제는 아직 표면 장력을 감소시키기 위해 사용되었을 수 있으므로, 항원과 항체 간의 바인딩을 촉진하는. 에Ab의 침투의 반대로, 매개 permeabilization- 개선은 일반적으로 (면역 세포 (ICC)) 세포 또는 세포 현탁액 배양에서 단백질 검출을 위해 필요, 면역의 냉동 섹션과의 (IF) IHC / IF 신선한 (두께, vibratome 컷)에서 자유 조직 조각을 떠. 여러 컨트롤은 특정 / 신뢰할 수있는 면역 표적을 생성하는 본질적으로 중요하다. 양성 대조군으로, 우리는 우리가 Ccl11 + 호산구를 감지 할 수 천식의 쥐 모델에서 폐을 사용했다. 부정적인 컨트롤은 기본 애비의 부재 만 차단 솔루션 O를 배양 / n를 4 ° C에서 있었다. 우리는 이미 배경 신호의 감소에 대한 몇 가지 원인과 잠재적 치료를 언급했다. 비특이적 면역 제품은 또한 골수 세포 (26)의 사이 DAB 반응 pseudoperoxidase 적혈구 및 퍼 옥시다아제로 발생할 수있다. 이 효소의 활동, 단지 소음 CAUS로내생 비오틴에 의해 에드 또는 AP는 이미 포르말린 고정 동안 감소되었습니다. 그러나, 메탄올 / H 2 O 2 전처리는 추가 또는 완전 불 활성화 27, 28. 포유 동물 조직에서 AP 활동에 의해 발생 배경 염색 더의 levamisole (29)에 의해 억제, 또는 아세트산 (29)에 의해 할 수있다 필요합니다. 아비딘과 반대로 대전 셀룰러 분자 (30) 사이에 이온 성 인력의 결과는 비특이적 결합 스트렙토 31 avidinii에서 스트렙 타비 딘과 난백으로부터 아비딘 치환함으로써 회피 할 수있다. DAB 아마도 IHC에서 가장 자주 사용 원체이다. DAB (갈색 반응 생성물) 외에 사용중인 다른 퍼 옥시다아제 원체 3- 아미노 -9- 에틸 카바 졸 (AEC; 적색)이고, 4 클로르 -1- 나프톨 (CN, 블루) 및 테트라 메틸 벤지딘 (TMB, 청색). 흔히 선택된 AP의 발색제가 FB, 패스트 레드 (FR), 및 새로운 푹신이다 5- 브로 모 -4- 클로로 -3- indolylphosphate / 니트로 BL단말 테트라 졸륨 클로라이드 (BCIP / NBT). 효소와 발색제의 선택은 그러한 지역화 발현 패턴 목표 기능에 의해 조향뿐만 아니라 내인성 안료 (멜라닌 헤 모시 데린) (32)의 존재에 의해 할 수 있지만, 기본적으로 개인의 선호 문제이다. Counterstain과는 IHC 절차의 마지막, 통성 단계는 일반적으로 헤 마톡 실린, 핵 고속 적색 또는 메틸 (18) 녹색을 사용하여 수행됩니다. 일반적으로 더 적합한 단일 라벨링, Counterstain과 조직 형태의 해석을 용이하게하고이 미묘 원체 석출물과 간섭을 방지하기 위해 개발되어야한다. 염색 과정의 조직 절편의 완료시 신중 장착 매체를 이용하여 커버 슬립으로 장착되어야한다. 기포의 형성을 피해야한다. 물리적 보호 옆에, 매체를 장착하면 시각화 및 이미지 품질을 향상시킵니다. 어느 / 유기 소수성 또는 수성 / 친수성의 채널장착 매체 OICE 유기 용매 중에서, 최종 생성물의 용해도에 의존한다. 톨루엔 - 기반 장착 매체 DAB를 들면, 예를 들면 적합한 것 있지만, 수성 매체 장착 형광 표지를 비롯한 모든 효소 원체에 적용될 수있다.

methylome, 사체 또는 프로테옴 수준에서 수행 분석 고급 높은 처리량의 사용에도 불구하고, 면역 염색은 조직 샘플, 세포 배양에 직접 단백질 검출 또는 세포 도말 검사의 황금 표준 남아있다. 지역화 / 배광 패턴을 계시하여 면역 조직 화학 (IHC)의 상대적인 비율과 목표 단백질의 지형적 상호 관계를 평가하고, 그들의 생물학적 활성을 나타낼 수있다. 따라서, IHC 널리 임상 연구 및 진단 목적, 예를 들면, 치료 평가 질병 메커니즘 동물 모델에서 기능적 표현형 변화 등의 연구에 활용 본질적 조직학, 병리학, 생화학 및 면역학을 포함 IHC 크게 형광 표지 된 항체는 감염된 조직 1 폐렴 구균 항원을 식별하기 위해 처음에 사용 된 1941 년 이후로 진행되었다. V휴대 제품과 IHC에 의해 구성 요소의 isualization은 특정 항원은 (Ag)에 대한 항체 (ABS)의 결합을 기반으로합니다. 형광 태그 된 항체를 사용하는 외에, 면역 반응은 2,3- 옥시다아제 또는 알칼리 포스 파타 아제와 같은 효소 (4)을 이용하여 가시화 될 수있다. 방사능 라벨자가 방사선 시각화하는 동안 또한, 콜로이드 금 항체 태그 (5)는 광학 및 전자 현미경 모두에 의해 특정 항원 항체 반응을 검출하기 위해 사용된다. 용 Ag-Ab의의 면역 직접 및 간접적 인 방법을 통해 검출 할 수있다. 직접적인 방법은 직접 차 애비 6 레이블 사용하기 때문에, 본질적으로 빠르고 간단합니다. 그러나, 감도 부족으로 심각한 간접 방법이 직접 사람에게 바람직하다. 두 단계 간접 검출 방법은 상기 제 7 층과 같은 기본 복근 향한 이차 복근 첫번째로, 표지되지 않은 기본 복근 및 표지 필요로한다.신호 증폭을 더 포함함으로써 달성 될 수 있으며, 효소 - 결합 급 순이 (세 단계 간접법) 보조 AB와 결합하는 것이다. 일반적으로 사용되는 간접 검출 방법은 아비딘 - 비오틴과 퍼 옥시 다제 - antiperoxidase (PAP)입니다. 대안 적으로, 알칼리성 포스파타제 antialkaline 포스파타제 (APAAP) 복합체 대신 PAP 방법을 사용할 수있다. 특히, 알칼리성 포스파타제 (AP) 방법은 immunoperoxidase 방법 4보다 더 민감한 것으로 나타납니다. 아비딘 - 비오틴 복합체 (ABC) 방법은 표지 아비딘 - 비오틴 복합체 (LAB) 중 하나와 함께 바이오틴 차 순이를 사용, 또는 스트렙 타비 딘 - 비오틴 복합체 (SLAB) 표지. 검출 감도는 상기 퍼 옥시다아제 또는 알칼리 포스 파타 아제 표지 아비딘 (8)를 포함함으로써 증가 될 수있다. 사용의 다른 검출 방법은 고분자 라벨, 타이 라민 증폭 및 면역 구름 원 9입니다. 특히, 다른 검출 방법은 동일한 조직에 다수의 Ag 검출을 위해 결합 될 수있다여기에 제시된 1978 4. 동시 이중 면역 염색에 처음보고 된 샘플은 각각, 퍼 옥시 다제 - 결합 및 AP 접합 이차 항체를 이용하여 포르말린 고정 된 파라핀 포매 쥐 CNS 및 LN 조직 절편에서 수행 하였다. 신호는 각각 (FB) APAAP 복잡한 3,3&#39;- diaminobencidine (DAB) 색 원체 및 패스트 블루를 사용하여 시각화 하였다.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Isoflurane 			(Isofluran): 1-Chlor-2,2,2-trifluorethyl (difluormethyl 			ether) 
 2-Chlor-2-(difluormethoxy)-1,1,1-trifluorethan 			(C3H2ClF5O)</td>
 <td>Baxter</td>
 <td>1001936060</td>
 <td>Eye 			irradiation. Probably influences fertility and damages baby in 			uterus. Administer only in adequately equipped anesthetizing 			environment.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodiumchloride 			(NaCl)</td>
 <td>Merck</td>
 <td>1.0604</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phosphate 			Buffer Saline (PBS), tablet</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P4417</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Paraformaldehyde 			(OH(CH2O)nH (n = 8 - 100), 4% in 1x PBS </td>
 <td>Apl pharma</td>
 <td>34 24 28</td>
 <td>Health 			hazard. Corrosive. Flamable. Acute toxicity.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethanol 			&ge;99.5%, absolute (CH3CH2OH)</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>459844-1L</td>
 <td>Flamable.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Xylene 			(Xylenes, histological grade; C6H4(CH3)2 </td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>534056</td>
 <td>Flamable. 			Acute toxicity.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Histo-Comp 			Paraffin 			Wax</td>
 <td>Tissue-Tek</td>
 <td>V0-5-1001 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Adhesive 			Microscope Slides</td>
 <td>Starfrost </td>
 <td>MIC-1040-W</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Xylol 			substitute XEM-200 </td>
 <td>Vogel GmbH</td>
 <td>ND-HS-200</td>
 <td>Respiratory 			sensitization. Carcinogenicity.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&alpha;- CD8 			(Ox-8) mouse anti-rat, primary antibody</td>
 <td>AbD 			Serotec</td>
 <td>MCA48G</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&alpha;- Iba1 			(AIF1) mouse anti-rat, primary antibody</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>MABN92</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&alpha;- CD68 			(ED1) mouse anti-rat, primary antibody</td>
 <td>AbD 			Serotec </td>
 <td>MCA341R</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>&alpha;- 			eotaxin C-19 (CCL11) goat anti-rat, primary antibody</td>
 <td>Santa Cruz 			BT</td>
 <td>SC-6181</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Alkaline 			phosphatase (AP)-conjugated secondary antibody</td>
 <td>Dakopatts, 			Denmark</td>
 <td>D0314</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Biotinylated 			secondary antibody</td>
 <td>Amersham 			Biotech</td>
 <td>RPN1025</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Avidin- 			horseradish peroxidase complex (HRP) </td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A3151</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Naphthol 			AS-MX phosphate (C19H18NO5P)</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>N4875-1G</td>
 <td>Acute 			toxicity.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fast Blue 			RR Salt, Azoic Diazo No. 24 (C15H14ClN3O3 			x 			1/2 ZnCl2)</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>FBS25</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Levamisol 			hydrochloride (C11H13ClN2S)</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>31742</td>
 <td>Acute 			toxicity.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>3,3'-Diaminobenzidine 			tetrahydrochloride (DAB Chromogen)</td>
 <td>DAKO</td>
 <td>S3000 </td>
 <td>Highly 			flammable. Toxic.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Copper 			sulphate (CuSO4)</td>
 <td>Merck</td>
 <td>1.02791</td>
 <td>Acute 			toxicity. Environmental hazzard.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GelTol 			Aqueous Mounting Medium</td>
 <td>Thermo 			Electron Corporation</td>
 <td>230100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hydrogen 			peroxide, 30% (H2O2)</td>
 <td>Merck</td>
 <td>107210</td>
 <td>Acute 			toxicity.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Methanol 			(CH3OH)</td>
 <td>Fluka</td>
 <td>65543</td>
 <td>Acute 			toxicity. Respiratory sensitization. Carcinogenicity. Flammable.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris 			(hydroxymethyl) aminomethane, TRIS base (C4H11NO3 			)</td>
 <td>AppliChem </td>
 <td>A1379</td>
 <td>Skin and 			eye irritation.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris 			Buffered Saline (TBS), tablet</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>T5030</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Di- Sodium 			hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4 			x 			2H2O)</td>
 <td>Merck</td>
 <td>1.0658</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium 			dihydrogen phosphate monohydrate (NaH2PO4 			x 			1H2O) </td>
 <td>Merck</td>
 <td>1.06346</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fetal calf 			serum (FCS) </td>
 <td>Cambrex 			BioScience</td>
 <td>DE-14-802F</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DAKO 			cytomation wash buffer 10x </td>
 <td>DAKO </td>
 <td>S3006</td>
 <td>Should be 			stored at 2-8 &deg;C to inhibit bacterial growth. Avoid foaming.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>N,N- 			Dimethylformamide; DMF (C3H7NO)</td>
 <td>Fluka</td>
 <td>40250</td>
 <td>Flammable. 			Acute toxicity.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glas 			coverslips 24 x 36 mm </td>
 <td>Menzel-Gl&auml;ser</td>
 <td>BB024036A1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hydrochloric acid, conc. (HCl)</td>
 <td>Sigma-Aldrich </td>
 <td>30721</td>
 <td>Corrosive, 			irritant, permeator. Lung sensitizer (as acid mist). Toxic.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hydrochloric acid solution 			volumetric, 2M HCl (2N) </td>
 <td>Fluka </td>
 <td>71826</td>
 <td>Corrosive, 			irritant, permeator. Lung sensitizer (as acid mist). Toxic.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium 			nitrite, ReagentPlus, &ge;99.0% (NaNO2)</td>
 <td>Sigma-Aldrich </td>
 <td>S2252 </td>
 <td>Oxidant. 			Toxic. Dangerous for the environment.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethylenedinitrilotetraacetic 			acid disodium salt dihydrate (EDTA; C10H14N2Na2O8 			x 2H2O)</td>
 <td>Merck</td>
 <td>1.08454</td>
 <td>Oral 			exposures may cause reproductive and developmental effects.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td> Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tissue-Tek 			V.I.P 			Vacuum Infiltration Processor </td>
 <td>Sakura</td>
 <td>5902 VIP 			Jr. 115 V, 60 Hz</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hacker-Bright 			8000 Series Base Sledge Microtome </td>
 <td>Hacker 			instruments</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Household 			food steamer </td>
 <td>Braun</td>
 <td>MultiGourmet 			FS 20</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Light 			microscope </td>
 <td>Leica 			Polyvar 2</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>

immunohistochemical analysis in the rat central nervous system and peripheral lymph node tissue sections

면역 조직 화학 (IHC)이 높은 특정 안정적이고 매력적인 단백질의 시각화를 제공합니다. IHC 기반의 빛깔 표지의 정확한 성능과 해석은 중추 신경계 (CNS) 등의 지방 함량이 높은 조직에서 목적 단백질 사이의 상호 관계를 평가하기 위해 사용될 때 특히 도전적이다. 우리의 프로토콜은 특히 쥐 CNS와 신경 염증에 의해 영향을받는 주변 림프절 (LN) 모두 구조 및 가용성 단백질의 검출을 위해 조정 된 표준 immunolabeling 기술의 정교화를 나타냅니다. 그럼에도 불구하고, 추가 수정하거나하지 않고, 우리의 프로토콜 가능성도 여기에 제시된 것보다 다른 기관과 종, 기타 관련 단백질 표적의 탐지를 위해 사용될 수있다.

더블 immunostainings (공동의 염색)는 포르말린 고정 파라핀 포함 된 쥐 CNS 및 LN 절에서 수행되었다. 3-5 μm의 두께 조직 슬라이스 사전 코팅 접착 유리 슬라이드에 연속적으로 설치 이전에 10,11,12 설명으로 처리, 썰매 마이크로톰을 사용하여 절단 하였다. 간단히 deparaffinizing, 조직 재수 내생 퍼 옥시 다제 불 활성화 한 후, 절편을 비특이적 결합 부위를 제거하는 단계를 차단 한 다음, 항원 검색 과정을 실시한다. 공동의 염색은 다음의 조합으로 수행되었다 : ⅰ) Ccl11 / 년 Iba-1, II) Ccl11 / ED1 및 ⅲ) Ccl11 / CD8. 각 공동 염색에 사용되는 주요 애비는 자신의 동시 배양을 사용할 수 두 개의 서로 다른 종 (각각 염소 및 마우스)에 제기되었다. 이바-1 ED1과 CD8은 청색 AP 신호 시각화 동안 Ccl11는 갈색 퍼 옥시 다제 반응 생성물에 의해 가시화 하였다. 10 -like 다발성 경화증 (MS)의 Ccl11 케모카인의 역할에 대한 우리의 최근의 연구에 큰 맥락에서 기술되었다. IHC는 쥐 CNS에서 수행 분석에 따르면, Ccl11는 pericarya, 수상 돌기 및 척수 회백질 (그림 1A 및 B)의 복부 뿔에있는 신경 세포의 축삭에 존재했다. 또한, 단일 Ccl11 + 혈장 세포는 동일한 조직 섹션 (도 1a)의 검출뿐만 아니라 있었다 단일 Ccl11 + / ED1 + 염증 부위에서 관찰 식세포 뇌 상주 미세 아교 세포는 (데이터는 도시하지 않음] ED1이 리소좀 단백질 마커 활성화 된 대 식세포와 미세 아교 세포 13)이다. 특히, Ccl11의 케모카인은 이바-1 + 대식 세포와 뇌 상주 미세 아교 세포 (1A와 공동 현지화를 찾을 수 없습니다, 이바-1 칼슘을 2 + -bindi를 이온화 검출하기위한 마커<html> NG 단백질 (14)). IHC 기반의 단백질은 ED1 (그림 2B)로 Ccl11 단백질의 공동 현지화 전시 된 주변 쥐 LN에서 수행 타겟팅. 그러나, Ccl11 분비 CD8 + T 림프구 (그림 2A, CD8 + 세포를 방지 Cd8α, MHC 클래스에 바인딩 주로 세포 독성 T 세포 마커 I 15 분자를 사용하여 검출되었다) 같은 조직 섹션에서 검출되지 않았다. 프로토콜에 기술 된 바와 같이 블로킹 용액에서 O / N 항온 처리 동안 기본 복근을 생략 제외하고, 제어부는 처리 하였다. 표적 단백질의 어떤 검출 신호 (도면의 1A, 2A 및 B에 제시된 바와 같이, B)은 CNS 및 LN 제어부 (각각도 1c 및도 2c)에서 관찰되지 않았다. S / ftp_upload / 50425 / 50425fig1.jpg &quot;/&gt; 그림 1. A, B : 더블 면역 염색 쥐 LN있다. 중 α-CD8 (A) 또는 ED1 (B)와 조합 Ccl11 케모카인 대항 일차 항체. . Ccl11 검출 신호 (브라운) 대 식세포의 리소좀 단백질 마커 (ED1, 파랑)와 공동 지역화 : 동일한 셀 내에 공동 지역화 Ccl11 + (갈색) 및 CD8 + 세포 (파란색) B에 대해 관찰되지 않았다. C : 음성 제어; 주변 LN에 레이블이없는 상주 세포를 보여주는 세부 사항. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50425/50425fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/50425/50425fig2.jpg" /> 그림 2. A, B : 더블 면역 염색 쥐 S에서PINAL 코드. 신경 pericarya, 수상 돌기 및 축삭에 Ccl11을 나타내는 회색 물질의 복부 경적 (갈색)와 공동 염색 중 이바-1 + (A, 파란색) 또는 ED1 + (B, 파랑) 대 식세포 / 미세 아교 세포 C :. 음성 대조군; 척수 회백질의 복부 혼에 레이블이없는 상주 세포를 보여주는 세부 사항. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50425/50425fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

We here present an optimized, detailed protocol for double immunostaining in formalin-fixed, paraffin-embedded rat central nervous system (CNS) and peripheral lymph node (LN) tissue sections.

쥐 중추 신경계에서 면역 조직 화학 분석 및 주변 림프절 조직 섹션

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

immunohistochemical-analysis-rat-central-nervous-system-peripheral

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.0K 조회수.  Karolinska Institutet. We here present an optimized, detailed protocol for double immunostaining in formalin-fixed, paraffin-embedded rat central nervous system (CNS) and peripheral lymph node (LN) tissue sections.

비디오: Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

Systemic and Local Drug Delivery for Treating Diseases of the Central Nervous System in Rodent Models

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution in assessing therapeutic efficacy. Between the two major classifications of administration, local vs. systemic, systemic delivery approaches are often preferred due to ease of administration. However, systemic delivery may result in suboptimal drug concentration being achieved in the CNS, and lead to erroneous conclusions regarding agent efficacy. Local drug delivery methods are more invasive, but may be necessary to achieve therapeutic CNS drug levels. Here, we demonstrate proper technique for three routes of systemic drug delivery: intravenous injection, intraperitoneal injection, and oral gavage. In addition, we show a method for local delivery to the brain: convection-enhanced delivery (CED). The use of fluorescently-labeled compounds is included for in vivo imaging and verification of proper drug administration. The methods are presented using murine models, but can easily be adapted for use in rats.

Thorough preclinical testing of drugs that act in the central nervous system often involves assessing and comparing drug biodistribution in association with specific routes of administration. Here, three commonly used methods of systemic delivery (intravenous, intraperitoneal, and oral) as well as a method for local delivery (convection-enhanced delivery) are demonstrated in mice.

쥐 모델에서 중추 신경계의 질병 치료를위한 체계와 지역 마약 배달

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution ...

연구

신경과학

Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be accessed within the orbit of the eye and completely transected (axotomized), cutting the axons of the entire RGC population. Optic nerve 
transection is a reproducible model of apoptotic neuronal cell death in the adult CNS 1-4. This model is particularly attractive because the vitreous
 chamber of the eye acts as a capsule for drug delivery to the retina, permitting experimental manipulations via intraocular injections. The diffusion of chemicals 
through the vitreous fluid ensures that they act upon the entire RGC population. Moreover, RGCs can be selectively transfected by applying short interfering RNAs 
(siRNAs), plasmids, or viral vectors to the cut end of the optic nerve 5-7 or injecting vectors into their target, the superior colliculus 8. 
This allows researchers to study apoptotic mechanisms in the desired neuronal population without confounding effects on other bystander neurons or surrounding glia. 
An additional benefit is the ease and accuracy with which cell survival can be quantified after injury. The retina is a flat, layered tissue and RGCs are localized in 
the innermost layer, the ganglion cell layer. The survival of RGCs can be tracked over time by applying a fluorescent tracer (3% Fluorogold) to the cut end of the 
optic nerve at the time of axotomy, or by injecting the tracer into the superior colliculus (RGC target) one week prior to axotomy. The tracer is retrogradely transported, labeling 
the entire RGC population. Because the ganglion cell layer is a monolayer (one cell thick), RGC densities can be quantified in flat-mounted tissue, without the need 
for stereology. Optic nerve transection leads to the apoptotic death of 90% of injured RGCs within 14 days postaxotomy 9-11. RGC apoptosis has a 
characteristic time-course whereby cell death is delayed 3-4 days postaxotomy, after which the cells rapidly degenerate. This provides a time window for 
experimental manipulations directed against pathways involved in apoptosis.

Optic Nerve transection is a widely used model of adult CNS injury. Ninety percent of retinal ganglion cells (RGCs) whose axons are completely transected (axotomy) die within 14 days after axotomy. This model is easily amenable to experimental manipulations and highly reproducible.

시신경의 절개 : 중추 신경계에서 신경 세포의 Apoptosis 성인의 모델

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be ...

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

마우스의 중추 신경계에서 줄기 세포 주입의 Multimodal 이미징

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing therapeutic approaches. Lentiviral vectors are attractive tools in transduction of neurons and other cell types in CNS as they transduce both dividing and non-dividing cells, support sustained expression of transgenes, and have relatively large packaging capacity and low toxicity 1-3. Lentiviral vectors have been successfully used in transducing many neural cell types in vitro 4-6 and in animals 7-10.
Great efforts have been made to develop lentiviral vectors with improved biosafety and efficiency for gene delivery. The current third generation replication-defective and self-inactivating (SIN) lentiviral vectors are depicted in Figure 1. The required elements for vector packaging are split into four plasmids. In the lentiviral transfer plasmid, the U3 region in the 5' long terminal repeat (LTR) is replaced with a strong promoter from another virus. This modification allows the transcription of the vector sequence independent of HIV-1 Tat protein that is normally required for HIV gene expression 11. The packaging signal (&Psi;) is essential for encapsidation and the Rev-responsive element (RRE) is required for producing high titer vectors. The central polypurine tract (cPPT) is important for nuclear import of the vector DNA, a feature required for transducing non-dividing cells 12. In the 3' LTR, the cis-regulatory sequences are completely removed from the U3 region. This deletion is copied to 5' LTR after reverse transcription, resulting in transcriptional inactivation of both LTRs. Plasmid pMDLg/pRRE contains HIV-1 gag/pol genes, which provide structural proteins and reverse transcriptase. pRSV-Rev encodes Rev which binds to the RRE for efficient RNA export from the nucleus. pCMV-G encodes the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) that replaces HIV-1 Env. VSV-G expands the tropism of the vectors and allows concentration via ultracentrifugation 13. All the genes encoding the accessory proteins, including Vif, Vpr, Vpu, and Nef are excluded in the packaging system. The production and manipulation of lentiviral vectors should be carried out according to NIH guidelines for research involving recombinant DNA (<a href="http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf</a>). An approval from individual Institutional Biological and Chemical Safety Committee may be required before using lentiviral vectors. Lentiviral vectors are commonly produced by cotransfection of 293T cells with lentiviral transfer plasmid and the helper plasmids encoding the proteins required for vector packaging. Many lentiviral transfer plasmids and helper plasmids can be obtained from Addgene, a non-profit plasmid repository (<a href="http://www.addgene.org/" target="_blank">http://www.addgene.org/</a>). Some stable packaging cell lines have been developed, but these systems provide less flexibility and their packaging efficiency generally declines over time 14, 15. Commercially available transfection kits may support high efficiency of transfection 16, but they can be very expensive for large scale vector preparations. Calcium phosphate precipitation methods provide highly efficient transfection of 293T cells and thus provide a reliable and cost effective approach for lentiviral vector production.
In this protocol, we produce lentiviral vectors by cotransfection of 293T cells with four plasmids based on the calcium phosphate precipitation principle, followed by purification and concentration with ultracentrifugation through a 20% sucrose cushion. The vector titers are determined by fluorescence- activated cell sorting (FACS) analysis or by real time qPCR. The production and titration of lentiviral vectors in this protocol can be finished with 9 days. We provide an example of transducing these vectors into murine neocortical cultures containing both neurons and astrocytes. We demonstrate that lentiviral vectors support high efficiency of transduction and cell type-specific gene expression in primary cultured cells from CNS.

In this protocol we describe production, purification and titration of lentiviral vectors. We provide an example of lentiviral vector-mediated gene delivery in primary cultured neurons and astrocytes. Our methods may also apply to other cell types in vitro and in vivo.

중추 신경계에서 Transducing 전지 Lentiviral 벡터 제작

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

의 중추 신경계에 단일 세포의 라벨<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. Understanding repair and regeneration in animals is a key question in biology. The damaged human CNS does not regenerate, and understanding how to promote the regeneration is one of main goals of medical neuroscience. The powerful genetic toolkit of Drosophila can be used to tackle the problem of CNS regeneration.
A lesion to the CNS ventral nerve cord (VNC, equivalent to the vertebrate spinal cord) is applied manually with a tungsten needle. The VNC can subsequently be filmed in time-lapse using laser scanning confocal microscopy for up to 24 hr to follow the development of the lesion over time. Alternatively, it can be cultured, then fixed and stained using immunofluorescence to visualize neuron and glial cells with confocal microscopy. Using appropriate markers, changes in cell morphology and cell state as a result of injury can be visualized. With ImageJ and purposely developed plug-ins, quantitative and statistical analyses can be carried out to measure changes in wound size over time and the effects of injury in cell proliferation and cell death. These methods allow the analysis of large sample sizes. They can be combined with the powerful genetics of Drosophila to investigate the molecular mechanisms underlying CNS regeneration and repair.

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An injury paradigm using the Drosophila larval ventral nerve cord to investigate central nervous system regeneration and repair is described. Stabbing followed by laser scanning confocal microscopy in time-lapse and fixed specimens, combined with quantitative analysis with purposefully developed software and genetics, are used to investigate the molecular mechanisms of CNS regeneration and repair.

에 중추 신경 시스템 복구를 조사하기 위해 상해 패러다임<em&gt; Drosophila</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for immunohistochemistry and, 2) calcium imaging for the study of voltage gated calcium channel (VGCC) mediated calcium signaling in retinal ganglion cells. The calcium imaging method we describe circumvents issues concerning non-specific loading of displaced amacrine cells in the ganglion cell layer.

Immunohistochemistry protocols are used to study the localization of a specific protein in the retina. Calcium imaging techniques are employed to study calcium dynamics in retinal ganglion cells and their axons.

Wholemount 쥐의 망막에서 면역 조직 화학 및 칼슘 이미징 방법

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

설치류 중추 신경계의 생체 Optogenetic 자극

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

수동 CLARITY를 사용하여 마우스 중추 신경계의 광학 지우기

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...