이 연구는 SH에 도이치 Forschungsgemeinschaft GraKo1121, Hu1011/2-1 및 SFB940의 교부금에 의해 지원되었다

참고 : 프로토콜에 표시된 버퍼에 대한 자세한 정보는 표 1에서 사용할 수 있습니다. 1. 포름 알데히드는 살아있는 세포 간 연결하여 단백질 - 단백질 상호 작용의 고정 <ol><li> 성장 미디어, 주식 솔루션 및 버퍼 P1을 준비 시작하려면 <ol><li> 500 ㎖의 배지를 준비 매체 막 미끼 단백질과 먹이 단백질 간의 상호 작용을 지원하는 조건을 제공한다. 또, 하나의 실험에서는 어떠한 상호 작용 (가교없이 예) 예상되는 조건 하에서 수행되어야한다. 참고 : 우리는 스트레스가 아닌 스트레스를 박테리아의 단백질 - 단백질 상호 작용을 비교합니다. 따라서, 우리는 우리가 2 L 삼각 플라스크에 스트레스 유도제 (예를 들어, 0.5 M의 NaCl)으로 보완 500 ㎖의 루리아 베르 타니 (LB) 배지 (표 1)를 준비하고 있습니다. 제어를 위해, 우리는 0.17 M 염화나트륨 (산도 7.0)와 일반 LB 매체를 사용합니다. </li><li> 트리스 버퍼를 준비합니다 (20 mM 트리스-HCL;의 pH 8.0) 및 0.1 M 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA), pH를 8.0 원액 (표 1). </li><li> 버퍼 P1을 준비합니다. 트리스 완충액에서 0.5 M의 최종 농도에 자당을 용해. 여과에 의해 버퍼 P1을 소독하고 4 ℃에서 저장 </li></ol></li><li> 벡터에서 C-말단 패 혈성 태그 융합으로 막 미끼 단백질을 발현하는 세포를 성장. 충분한 시간 동안 멤브레인 미끼 단백질의 발현을 유도한다. 참고 : 우리는 500 ml의 매체에 250 ㎕의 1 M 이소 프로필-β-D-티오 갈 락토 피 라노 시드 (IPTG)를 첨가하여 초기 로그 단계 (A 600 = 0.3)에서 (최종 농도 : 0.5 mm)를 세균의 막 미끼 단백질의 발현을 유도 . 충분히 식을 수 있도록하기 위해, 우리는 늦은 로그 단계 (A 600 = 1.2) 때까지 박테리아를 배양한다. </li><li> 300 ㎖의 각각의 최소 볼륨 각 문화 두 개의 원심 분리기 비커를 준비하고 얼음에 배치합니다. </li><li> 포름 알데히드 가교를 수행합니다. CAUTION : 포름 알데히드는 독성이 강한 우리가 안전 흄 후드에서 작업하는 것이 좋습니다.. <ol><li> 안전 흄 후드에서 배양 용기를 전송합니다. (- X)와 가교 포름 알데히드 (+ X)를 포함하여 한 두 개의 샘플, 가교를 생략 하나에 각각의 샘플을 분할합니다. 0.6 %의 최종 농도에 도달하기 위해 250 ㎖의 배양을 4 ml의 37 % 포름 알데히드 용액을 추가. </li></ol></li><li> 다시 문화 혈관을 전송하고 이전과 추가 20 분 동안 세포를 성장. </li><li> 안전 흄 후드 아래에 원심 분리기 튜브로 문화를 기입하십시오. 30 분 3,000 XG에서 원심 분리하여 세포를 수집합니다. </li><li> 신중하게 안전 연기 후드 아래에 그것을 피펫으로 상층 액을 버린다. 독성 포름 알데히드 함유 상층 액을 수집하고 적절하게 처리하십시오. </li><li> 막 단백질의 준비 기간 동안 최적의 수율에 도달하기 위해 먼저 spheroplasts를 준비합니다. 여기, 우리는 그람 음성 박테리아의 스페 형성을위한 프로토콜을 제공 : <ol><li> Prepar전자 버퍼 P2 (표 1) 동결 건조 분말. 부드럽게 1.5 ML 튜브에, 0.1 M EDTA, pH가 8에서 2 밀리그램의 라이소자임을 녹입니다. 항상 실험의 하루 갓 버퍼 P2를 준비합니다. </li><li> 단백질 분해 효소 억제제 (버퍼 P3)과 트리스 버퍼를 준비합니다. 트리스 완충액 10 ㎖로, 10 mM의 최종 농도로 0.1 ㎖의 1 M 페닐 메틸 (PMSF) (표 1)을 추가한다. 프로테아제 억제제 PMSF의 기능이 제대로 동작하는지 확인하기 위해 즉시 버퍼를 사용합니다. </li><li> 단백질 분해 효소 억제제와 15 ML 원뿔 튜브로 전송 솔루션 10 ㎖ 트리스 버퍼를 Resuspend 세포 펠렛. </li><li> 1 ㎖ 버퍼 P2를 추가하고 30 분 동안 얼음에 품어. </li><li> 30 분 3,000 XG에서 원심 분리하여 spheroplasts를 수집하고 조심스럽게 상층 액을 버린다. </li></ol></li><li> -20 ℃에서 하룻밤 스페 펠렛을 품어 </li></ol> 2. 패 혈성 태그의 막 단백질의 정제 (미끼) <ol><li> 얼음에 스페 펠렛을 놓습니다. &lt;/ 리&gt; <li> 스페 펠렛은 얼음에 해동 시간 동안 각 스페 준비를 위해 10 ㎖ 버퍼 P3를 준비합니다. 조심스럽게 10 ML 트리스 버퍼에 1 mg의 DNaseI을 녹입니다. 사용 직전에 0.1 ㎖의 1 M의 PMSF를 추가합니다. </li><li> 6 ㎖를 새로 제조 P3에서 펠렛을 재현 탁. spheroplasts을 방해하기 위해, 각 버스트 사이에 1 분의 일시 정지와 얼음에 지속적으로 1 분 동안 샘플 네 번 초음파 처리. </li><li> 수확 된 세포 파편을 10 분 동안 10,000 XG에서 샘플을 원심 분리기. 초원 심 분리기 튜브에 피펫을 사용하여 상층 액을 전송합니다. </li><li> 30 분 동안 100,000 XG에서 막 분획을 펠렛. 를 용해하지 않고 트리스 버퍼에 조심스럽게 펠렛을 씻으십시오. 종이 조직 (예를 들면 휴지)와 튜브를 건조. 언제든지 펠​​렛을 방해 피한다. </li><li> 1 ㎖ 트리스 버퍼에 조심스럽게 펠렛 (= 세포막을)를 Resuspend. 예 BCA 분석하여 단백질 농도를 결정하기 위해 20 μL 나누어지는을 사용합니다. 이 단계에서, 멤브레인은 충격에 리 얼 수pond 지폐 질소 -80 ° C.에 저장 </li></ol> 3. 패 혈성 태그 막 미끼 단백질 및 SDS-PAGE의 정화 <ol><li> 트리스 완충액으로 5 ㎎ / ㎖로 막 분획의 단백질 농도를 정상화. 초 원심 분리기 튜브에 2.5 ml의 막 분획 (5 ㎎ / ㎖)를 취하여 막 단백질을 가용화하기 위해, 2 %의 최종 농도에 도달하기 위해 20 % 트리톤 X-100의 0.25 mL를 넣고. 마이크로 자석 막대를 추가하고 1 시간 동안 얼음에 저어. 참고 : 일반적으로 우리는 세제로 트리톤 X-100을 사용하여 좋은 결과를 가지고 있지만, 그것은 최적화를위한 세제를 변경하는 것이 유용 할 수 있습니다. 이러한 관점에서, 우리는 각각의 멤브레인 미끼 단백질의 기능적 정제에 사용되는 세제 최상의 결과가있다. </li><li> 3.1 단계를 수행하는 동안, 50 ㎖는 (표 1)에서 W와 5 ㎖ 버퍼 E 버퍼 준비합니다. 10 ㎖ 5 배 버퍼 W 농축 ML 50을 입력하고 150 ㎕의 20 % 트리톤 (Triton) X-100을 추가합니다. <ol><li> 1 ㎖ 배 buffe를 기입R의 E의 10 ㎖로 농축하고 30 ㎕의 20 % 트리톤 (Triton) X-100을 추가합니다. 8 ㎖의 버퍼 W.와 1 ㎖ 패 혈성-Tactin superflow 중력 흐름 열 평형 주 : 정제 절차 중에 어떤 버퍼 내의 임계 미셀 농도 (CMC) 이상의 농도의 10 배에서의 가용화에 사용되는 세제를 추가하는 것이 필수적이다. </li></ol></li><li> 불용성 막 분획을 펠렛 30 분 동안 100,000 XG에서 가용화 샘플 및 초 원심 분리기에서 마이크로 자기 막대를 제거한다. 추가의 정제를위한 피펫을 사용하여 상층 액을 제거합니다. </li><li> 열을 뜨는을로드합니다. 중력의 흐름에 열을 실행합니다. 이 세척 단계 배를 반복하여 5 ㎖ 버퍼 W.에 열을 씻으십시오. </li><li> 이 용출 단계 반복 배속 1 ㎖ 버퍼 E.으로 막 미끼 단백질을 용출. </li><li> 원심 분리 필터 장치로 용출 분획 2, 3 및 4-300 μl를 집중한다. </li><li> 50 ㎕의 5 배 SDS-PAG 각 샘플의 200 μl를 혼합E 로딩 염료. 125 μL 씩 분주 각 준비를 분할합니다. 포름 알데히드 상호 링크를 반대하는, 95 ° C에서 20 분 동안 각각 준비 하나 나누어지는 끓인다. 샘플 벤치 위에 적어도 10 분 동안 실온으로 냉각 할 수 있습니다. </li><li> 면역 블롯에 적합한 폴리 아크릴 아마이드 겔의 하나의 레인에로드 각 시료 30 μl를. 가장 좋은 방향으로의 prestained 분자량 마커를 사용하여 SDS-PAGE (10)을 실행합니다. </li></ol> 4. 면역 블롯 분석 상호 작용 파트너를 확인하려면 <ol><li> 일단 7.6이 예 반 건조하여 니트로 셀룰로오스 막에 전사 단백질을 완료 단계. </li><li> 비특이적 라벨링을 방지하는 멤브레인을 차단. 0.05 % 트윈 -20 (TBS-T)의 최종 농도로 보충 트리스 - 완충 식염수 부피 당 3 중량 %를 달성하기 위해 소 혈청 알부민 (BSA)을 계량하여 차단 완충액 준비한다. 멤브레인을 포함하는 버퍼를 차단하는 충분한 양을 사용합니다. 실온에서 1 시간 동안 멤브레인을 차단합니다. </li><li> 희석ND 평소와 같이 먹이 단백질 특정 첫 번째 항체를 배양한다. 두 번째 항체로 HRP 결합 된 항체를 사용합니다. </li><li> 고감도 화학 발광 검출 키트를 사용하여 면역 블롯을 개발한다. 고전 막 처리 절차 또는 디지털 촬영 장비를 사용하여 신호를 모니터한다. </li></ol> 5. 상호 작용 파트너를 식별하는 NanoLC-ESI-MS/MS 높은 해상도 실험 <ol><li> 확인되어야한다 특정 항체가 먹이 단백질 또는 알 수없는 상호 작용 파트너를 사용할 수없는 경우, 식별을위한 질량 분석 (MS)를 사용합니다. 각질 오염을 방지하기 위해서, 단백질 분리를위한 precasted 겔을 사용한다. </li><li> 실버는 제조자의 프로토콜에 따라 MS 호환 염색 키트를 사용하여 SDS-PAGE 얼룩. 유리 탱크에있는 염색 및 세척 단계를 수행합니다. </li><li> 소비세 각 밴드와는 고해상도 LC / MS (9)에 의해 이들을 분석한다. </li></ol>

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우리는 공개 아무것도 없어.

막 척추 분석을 확인하고 막 단백질의이 시점 알 수없는 상호 작용 파트너 식별을 가능하게하는 생화학 적 방법입니다. 막 척추 연쇄상 구균 태그가 막 미끼 단백질의 정제와 포름 알데히드에 의해 생체 내 가교에 결합한다. 면역 블로와의 조합은 예상 상호 작용 파트너의 확인 (그림 2)을 용이하게한다. 또한, MS의 분석과 함께 알 수없는 상호 작용 파트너의 식별 (그림 3)을 허용합니다. 두 애플리케이션은 해당 단백질의 먹이를 수정하기위한 요구 사항이 없다. 또한, 막 척추 내생 먹이 단백질 (6)의 검출을 허용 할 수있을만큼 충분히 민감하다. 여기, 우리는 그람 음성 세균의 막 단백질에 최적화 된 프로토콜을 제시한다. 그람 음성 박테리아의 봉투 외에도 환경이나 민병대으로부터 세포질을 분리세포질 막, 외막과 murein의 sacculus. 따라서, 우리의 프로토콜은 소위 spheroplasts의 결과로, 외막의 제거 및 murein의 sacculus이 포함되어 있습니다. 이러한 프로토콜은 대부분의 세포 유형에 사용할 수 있기 때문에, 우리의 프로토콜은 대부분의 막 단백질에 대한 적응해야한다. 또한, 다음과 같은 사항이 고려되어야한다. 먼저, 벡터의 카피 수는 막 미끼 단백질 충분한 막 단백질의 정제와 비특이적 상호 작용을 방지하기 위해 낮은 수준을 허용하는 하이 레벨 사이에서 균형을 이루어야하는 과잉 생산하는 데 사용 둘째, 일부 막 단백질 N-말단 융합은 C-말단 융합보다 최적의 수 있습니다. 두 경우 모두, 융해의 기능은 트랜스 상보성에 의해 확인되어야한다. 셋째, 다른 친화력 정화 프로토콜은 FLAG 정화로, 이후의 MS 분석과 호환이 가능하며탠덤 선호도 정화 (TAP). 때문에 우리는 8 개의 아미노산 (WSHPQFEK)와 작은 크기의 패 혈성 태그 II를 선호합니다. 네 번째, 사용되는 포름 알데히드와 가교시의 농도는 비특이적 가교 결합을 방지하도록 최적화되어야한다. 포름 알데히드의 과도한 충분하지만 사용은 가교 및 nonlinked 막 미끼 단백질 (도 2) 사이의 비로서 unboiled 샘플의 면역 블 롯팅에 의해 모니터링 될 수있다. 가교 된 단백질은 면역 블롯의 상부에 도말로 이동한다. 유엔 연결된 단백질은 치료 단백질로 마이그레이션 할 수 있습니다. 가교와 연결되지 않은 단백질의 비율은 3:1이어야한다. 다섯째, 가용화에 대한 모든 막 단백질에 대한 &quot;일반 세제는&quot;이 없습니다. 따라서, 일부 경우에 막 미끼 단백질의 가용화를위한 적절한 세제가 결정되어야한다. 이것에 의해, 선택 세제는 패 혈성 태그의 칼럼과 호환 가능해야합니다N. 마지막으로, 실버 염색 절차는 후속 MS 분석과 호환되어야한다. MS 호환은 염색 키트는 다른 공급 업체에서 사용할 수 있습니다. 우리는 비교 좋은 결과와 다른 사람을 사용했다.

단백질의 기능을 이해하기 위해 그것의 파트너 상호 작용을 아​​는 것이 필수적이다. 여러 고전적인 기술은 수용성 단백질의 상호 작용 파트너의 ID를 사용할 수 있습니다. 그러나, 이러한 기술은 소수성 4에 의한 막 단백질을 쉽게 양도 할 수 없습니다. 이 한계를 극복하기 위해, 우리는 막 연쇄상 구균 단백질 상호 작용 실험 (막 척추) 6을 개발했습니다. 그것은 수용성 단백질 7 만 적합한 척추 방법을 기반으로합니다. 가교제의 포름 알데히드의 두 가지 장점에서 막 척추의 장점은 첫째, 포름 알데히드는 쉽게 세포막을 통과하기 때문에 살아있는 세포 8 interactome의 정확한 스냅 샷을 생성 할 수 있습니다. 둘째, 포름 알데히드 상호 링크는 9 끓는으로 되돌릴 수 있습니다. 여기서, 이러한 두 가지 이점은 멤브레인 PROTE 영구 아니라 과도 프로톤 펌프 억제제뿐만를 식별하는 데 사용기능 6. 요컨데, 패 혈성-태그가 일체형 멤브레인 미끼 단백질의 C-말단에 융합된다. 막 미끼 단백질을 발현하는 세포는 간 링크가 막 미끼 단백질로 단백질을 먹이로 포름 알데히드 (그림 1)와 함께 배양된다. 먹이 단백질의 수정은 필요하지 않습니다. 다음에, 막 분획을 제조하다. 따라서, 막 단백질은 단백질이 친화력 정화를 먹이 단백질과 공동으로 정제되어 세제 처리 및 미끼에 의해 용해된다. 이어서, 가교가 비등하여 반전되고, 미끼 및 그 공동 용출 먹이 단백질은 SDS-PAGE에 의해 분리된다. 마지막으로, 먹이 단백질은 면역 블롯 분석 또는 질량 분석법에 의해 확인 될 수있다.

<table><tbody><tr><td>37% Formaldehyde</td><td>Roth</td><td>4979.1</td><td>Should not be older than one year</td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Sigma</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>BCA protein assay kit</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Micromagnetic rod</td><td>Roth</td><td>0955.2</td><td>5 mm in length, 2 mm in diameter</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Roth</td><td>6683.1</td><td>standard detergent for solubilization</td></tr><tr><td>n-Dodecyl-&amp;beta;-maltoside</td><td>Glycon</td><td>D97002-C</td><td>the best detergent to solubilze CpxA</td></tr><tr><td>1 ml Strep-Tactin superflow gravity flow column</td><td>IBA</td><td>2-1207-050</td><td></td></tr><tr><td>Strep-tag protein purification buffer set</td><td>IBA</td><td>2-1002-001</td><td>Contains buffer W and buffer E</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4 centrifugal filter</td><td>Millipore</td><td>UFC803024</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico Chemiluminescent substrate</td><td>Pierce</td><td>34080</td><td></td></tr><tr><td>SilverQuest Silverstaining kit</td><td>Invitrogen</td><td>LC6070</td><td></td></tr><tr><td>FireSilver Staining Kit</td><td>Proteome Factory</td><td>P-S-2001</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

membrane-spine: a biochemical tool to identify protein-protein interactions of membrane proteins in vivo

막 단백질은 세포 생존에 필수적이며, 따라서 중요한 치료 표적 1-3이다. 그들은 단지 4에서 작동하기 때문에, 상호 작용을 파악하고 특징 짓는 방법은 5 필요합니다. 이를 위해, 우리는 막 척추 6라고 불리는 막 연쇄상 구균 단백질 상호 작용의 실험을 개발했다. 이 기술은 연쇄상 태깅 막 미끼 단백질의 친화도 정제하여 리버시블 가교제 포름 알데히드를 사용하여 가교 생체 내에서 결합한다. 절차 중에 가교 먹이 단백질은 막 단백질을 미끼로 공동 정제이어서 비등에 의해 분리된다. 막 등뼈를 사용하여 막 단백질의 단백질 - 단백질 상호 작용 (프로톤 펌프 억제제)를 분석 할 때 따라서, 두 가지 주요 작업을 실행할 수 있습니다 : 첫 번째, 면역 블, 그리고에 의해 제안 된 상호 작용 파트너의 확인 번째, 질량 분석 분석에 의해 새로운 상호 작용 파트너의 식별 . 또한,도 L친화력 아야, 과도 프로톤 펌프 억제제는이 기술에 의해 감지됩니다. 마지막으로, 막 척추는 막 단백질의 프로톤 펌프 억제제를 식별 할 수있는 강력한 검사 도구로 적용하고, 거의 모든 세포 유형에 적응할 수있다.

멤브레인 척추 분석은 막 단백질의 공동 정화 및 일시적으로 상호 작용 단백질 파트너를 허용한다. 공동 정제는 가교제 포름 알데히드를 사용함으로써 달성된다. 포름 알데히드 농도 및 가교 시간 : 두 매개 변수는 비특이적 교차 결합을 방지하기 위해 중요하다. 포름 알데히드의 과도한 충분하지만, 사용하지 않는 간단 면역 블 롯팅에 의해 제어 될 수있다. 포름 알데히드 가교 결합 된 단백질 복합체는 SDS 처리에 의해 보일 수 있지만 의해 분리 될 수있다. 따라서, 그들은 unboiled 샘플의 면역 블롯의 상단에있는 얼룩과 패 혈성 - 태그 막 미끼 단백질의 블로 팅 후 시각화 할 수 있습니다. 필요한 모든 컨트롤을 포함 멤브레인 척추 분석의 대표적인 결과는 그림 2에 표시됩니다. 미끼 단백질로서 대장균의 적분 막 단백질 CpxA는 6,11를 사용 하였다. CpxA는 센서 키나아제이며 이루어져큰 extracytoplasmic 센서 도메인과 C-말단 고도 보존 세포질 촉매 도메인 (12)를 통합하는 두 개의 횡단 도메인 (TMD)와 N-말단 센서 도메인. 자극 후, CpxA는 동족 응답 레귤레이터 CpxR을 활성화합니다. 활성화 CpxR는 응답을 중재하는 오프 확산. 멤브레인 척추, 패 혈성-태그 CpxA (CpxA-패 혈성)의 C-말단에 융합시켰다. CpxA - 패 혈성 다른 단백질이나 단백질 복합체 충분한 가교를 나타내는 unboiled 포름 알데히드 처리 한 샘플의 얼룩 (그림 2, 3 호선 대 1 호선)로 감지되는 가교. 또한, 먹이 단백질로서 동족 반응 조정제 단백질 CpxR 함께 CpxA-Strep의 직접적인 단백질 - 단백질 상호 작용은 포름 알데히드 가교 결합 특이성을지지하는 (도 2, 4 행 대 행 2) 포름 알데히드의 존재만을 검출이다. 막 척추 분석의 대표적인 결과가 제시 나N 그림 3. 그림 2에 대응하는 샘플은 스테인드했다. 화살표는 삶은 샘플에 대한 특정 밴드를 표시합니다. 때문에 배경에, MS의 분석은 또한 CpxR 6 이외의 다른 단백질을 확인했다. 따라서, 비 - 포름 알데히드 처리 한 샘플은 항상 배경 잡음과 특이 적 상호 작용 파트너를 할당하는, 분석해야한다. 표 1 : 막 척추에 필요한 버퍼 및 시약. <table border="1"><tbody><tr><th> 버퍼 / 시약 / 중 </th><th> 사용 농도 </th><th> 논평 </th></tr><tr><td> LB </td><td> 10g 트립 톤 5g 효모 추출물 10g의 NaCl L 1, 7.0으로 산도를 조정 </td><td></td><td> 루리아 국물 매체 </td></tr><tr><td> IPTG </td><td> 1 M 이소 프로필-β-D-티오 갈 락토 피 라노 시드 </td><td> 0.5 ㎜ </td><td></td></tr><tr><td> 트리스 버퍼</td><td> 20 mM 트리스 - 염산, pH가 8 </td><td></td><td> 수산화 나트륨을 사용하여 8.0으로 산도를 조정 </td></tr><tr><td> 0.1 M EDTA, pH가 8 </td><td> 0.1 M EDTA </td><td></td><td> 수산화 나트륨을 사용하여 8.0으로 산도를 조정 </td></tr><tr><td> PMSF </td><td> 100 % 이소프로판올 1 M 페닐 메틸 </td><td> 10 mM의 </td><td> PMSF는 물에 100 % 이소프로판올로 안정되어 있지만! 스톡 용액을 -20 ° C에서 저장 될 수있다; PMSF는 버퍼에 희석 전에 실온에 적응되어야한다; 버퍼 PMSF를 함유하는 제제는 10 분 이내에 사용되어야한다. </td></tr><tr><td> P1 </td><td> 20 mM 트리스 - 염산, pH를 8.0 0.5 M 자당 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> P2 </td><td> 2 ㎎ / ㎖ 리소자임 0.1 M EDTA, pH를 7.5 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> P3 </td><td> 20 mM 트리스 - 염산, pH를 8.0 10 mM의 PMSF </td><td></td><td> 즉시 주를 사용ately 후 준비 </td></tr><tr><td> 세제 </td><td> 20 % 트리톤 X-100 </td><td> 가용화 2 % </td><td></td></tr><tr><td> 버퍼 W </td><td> 10 ㎖ 5 배 50 ㎖에 집중 채워 추가 150 ㎕의 20 % 트리톤 X-100 </td><td> 100 MM 트리스 - 염산, pH를 8.0 150 mM의 NaCl을 1 ㎜ EDTA 0.06 % 트리톤 X-100 </td><td> 5 배 농축 연쇄상 태그 단백질 정제 버퍼 세트 (IBA)의 일부입니다 </td></tr><tr><td> 버퍼 E </td><td> 1 ㎖ 배 10 ㎖에 집중 채워 추가 30 μL 20 % 트리톤 X-100 </td><td> 100 MM 트리스 - 염산, pH를 8.0 150 mM의 NaCl을 1 ㎜ EDTA 2.5 mM의 Dethiobiotin 0.06 % 트리톤 X-100 </td><td> 5 배 농축 연쇄상 태그 단백질 정제 버퍼 세트 (IBA)의 일부입니다 </td></tr><tr><td> 배 SDS-PAGE 로딩 염료 </td><td> 0.3125 M 트리스 - 염산, pH를 6.8 10 % SDS 0.5 M DTT 50 % 글리세롤 <br/&gt; 0.05 % 브로 모 페놀 블루 </td><td></td><td></td></tr></tbody></table><img alt="그림 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50810/50810fig1.jpg" width="500px" /> 그림 1. Strep의 태그가 막 미끼 단백질을 발현. A) 박테리아는 포름 알데히드로 처리하여 단백질을 미끼로 대장균 세포막 단백질을 사용하여 막 - 척추 절차의 흐름도. 포름 알데히드는 세포막을 관통하여 교차 결합은 막 분획을 제조하고 막 단백질이 세정제 처리에 의해 가용화된다) 막 단백질을 미끼. B로 단백질을 먹이. 그 후, 먹이 단백질은 미끼 단백질과 공동 정제입니다. C) 포름 알데히드 상호 링크 끓여 반전하고 단백질이 SDS-PAGE에 의해 분리된다. 마지막으로, 먹이 단백질은 하나 면역 블롯 (D)에 의해 감시 또는 MS-아날로그로 식별됩니다용해 (E)는. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50810/50810fig1highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50810/50810fig2.jpg" width="500px" /> 그림 2. 세포막 단백질의 PPI를 모니터링하는 데 사용되는 대표적인 면역 블롯은. 막 미끼 단백질로서 플라스미드로부터 CpxA-Strep의 생산 박테리아, OD 1의 600에 LB 배지에서 성장 및 20 분 동안 포름 알데히드 (CH 2 O)에 노출되었다. 이너 막 분획은 막 단백질은 세제 처리에 의해 용해하고, 제조하고 CpxA-Strep의은 정제 하였다 (레인 1 및 2). 박테리아는 포름 알데히드 처리 (레인 3, 4)없이 CpxA-연쇄상 구균 중 하나를 생산 또는 포름 알데히드 처리로 빈 벡터를 들고 (레인 5, 5) 컨트롤을 역임했습니다. 각 샘플의 분취 량은 20 분 동안 95 ° C에서 삶은했다(레인 2, 4, 6) CpxA - 패 혈성에서 가교 단백질을 분리. 단백질은 12.5 % SDS-PAGE에서 분리 하였다. CpxA-Strep의 (51 kDa의)의 크기 및 각각의 먹이 CpxR 단백질 (26 kDa의)에 의한 면역 블 롯팅을 수행하고, 블롯을 분리 하였다. 면역 블롯의 두 부분은 각각 CpxA 및 CpxR에 대해 발생하는 폴리 클로 날 항체와 함께 배양 하였다. 이어서, 말 더욱 안티 - 토끼, 말 (HRP) 항체로 처리하고 SuperSignal 웨스트 피코 화학 발광 기질을 사용하여 개발 하였다. 화살촉 CpxA의 분해 산물을 표시합니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50810/50810fig2highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50810/50810fig3.jpg" width="500px" /> 그림 3. I의 식별을 위해 사용되는 주제 실버 염색 SDS-PAGEMS 분석에 의한 막 단백질의 nteraction 파트너. 그림 2에 대응하는 샘플은 스테인드했다. 화살표는 MS 분석에 의해 분석 및 CpxA 5의 상호 작용 파트너로 CpxR을 확인하는 밴드를 표시합니다. 레인 7 쇼 CpxR - 그의 6 정제 레인도 8은 정제 CpxA - 그의 6 단백질. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50810/50810fig3highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> .

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Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

생화학 적 방법은 막 단백질의 생체 내 단백질 - 단백질 상호 작용 (PPI)를 식별하기 위해 설명된다. 이 방법은 단백질 교차 결합, 친화력 정화 및 질량 분석을 결합하여 거의 모든 세포 유형이나 유기체에 적응할 수있다. 이 방법을 과도 프로톤 펌프 억제제의도 식별이 가능하게된다.

막 척추 : 막 단백질의 단백질 - 단백질 상호 작용을 식별 할 수있는 생화학 적 도구<em&gt; 생체</em

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to ...

membrane-spine-biochemical-tool-to-identify-protein-protein

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

13.7K 조회수.  Universität Osnabrück.  생화학 적 방법은 막 단백질의 생체 내 단백질 - 단백질 상호 작용 (PPI)를 식별하기 위해 설명된다. 이 방법은 단백질 교차 결합, 친화력 정화 및 질량 분석을 결합하여 거의 모든 세포 유형이나 유기체에 적응할 수있다. 이 방법을 과도 프로톤 펌프 억제제의도 식별이 가능하게된다. 

비디오: Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The modification presented includes the combination of this technique with cell-penetrating sequences. We propose to design cell-penetrating baits that can be incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions found will reflect those that occur within the intracellular context. Connexin43 (Cx43), a protein that forms gap junction channels and hemichannels is down-regulated in high-grade gliomas. The Cx43 region comprising amino acids 266-283 is responsible for the inhibition of the oncogenic activity of c-Src in glioma cells. Here we use TAT as the cell-penetrating sequence, biotin as the pull-down tag and the region of Cx43 comprised between amino acids 266-283 as the target to find intracellular interactions in the hard-to-transfect human glioma stem cells. One of the limitations of the proposed method is that the molecule used as bait could fail to fold properly and, consequently, the interactions found could not be associated with the effect. However, this method can be especially interesting for the interactions involved in signal transduction pathways because they are usually carried out by intrinsically disordered regions and, therefore, they do not require an ordered folding. In addition, one of the advantages of the proposed method is that the relevance of each residue on the interaction can be easily studied. This is a modular system; therefore, other cell-penetrating sequences, other tags, and other intracellular targets can be employed. Finally, the scope of this protocol is far beyond protein-protein interaction because this system can be applied to other bioactive cargoes such as RNA sequences, nanoparticles, viruses or any molecule that can be transduced with cell-penetrating sequences and fused to pull-down tags to study their intracellular mechanism of action.

This is a protocol to study intracellular protein-protein interactions based on the biotin-avidin pull-down system with the novelty of combining cell-penetrating sequences. The main advantage is that the target sequence is incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions will occur within the cellular context.

Biotinylated 세포 관통 펩 티 드 세포내 단백질-단백질 상호 작용을 공부 하

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

연구

생화학

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein interactions in many cases is associated with significant experimental challenges. In particular, sorting receptors interact with their protein cargo in the lumen of the membrane compartments often in a detergent-sensitive fashion, making co-immunoprecipitation of these proteins unusable. Binding of the sorting receptor sortilin to glucose transporter GLUT4 may serve as an example of weak luminal interactions between membrane proteins. Here, we describe a fast, simple, and inexpensive assay to validate the interaction between sortilin and GLUT4. For that, we have designed and chemically synthesized the myc-tagged peptide corresponding to the potential sortilin-binding epitope in the luminal part of GLUT4. Sortilin tagged with six histidines was expressed in mammalian cells, and isolated from cell lysates using Cobalt beads. Sortilin immobilized on the beads was incubated with the peptide solution at different pH values, and the eluted material was analyzed by Western blotting. This assay can be easily adapted to study other detergent-sensitive protein-protein interactions.

We describe a protocol for detection of detergent-sensitive interactions between membrane proteins using binding of the sorting receptor, sortilin, to the first luminal loop of the glucose transporter protein, GLUT4, as an example.

세제에 민감한 막 단백질 사이 상호 작용의 탐지

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced that allow the proximity-dependent labeling of proteins in living cells. One such enzyme, BirA* (used in the BioID approach), mediates the biotinylation of proteins within a range of approximately 10 nm. Hence, when fused to a protein of interest and expressed in cells, it allows the labeling of proximal proteins in their native environment. As opposed to AP that relies on the purification of assembled protein complexes, BioID detects proteins that have been marked within cells no matter whether they are still interacting with the protein of interest when they are isolated. Since it biotinylates proximal proteins, one can moreover capitalize on the exceptional affinity of streptavidin for biotin to very efficiently isolate them. While BioID performs better than AP for identifying transient or weak interactions, both AP- and BioID-mass spectrometry approaches provide an overview of all possible interactions a given protein may have. However, they do not provide information on the context of each identified PPI. Indeed, most proteins are typically part of several complexes, corresponding to distinct maturation steps or different functional units. To address this common limitation of both methods, we have engineered a protein-fragments complementation assay based on the BirA* enzyme. In this assay, two inactive fragments of BirA* can reassemble into an active enzyme when brought in close proximity by two interacting proteins to which they are fused. The resulting split-BioID assay thus allows the labeling of proteins that assemble around a pair of interacting proteins. Provided these two only interact in a given context, split-BioID then allows the analysis of specific context-dependent functional units in their native cellular environment. Here, we provide a step-by-step protocol to test and apply split-BioID to a pair of interacting proteins.

We provide a step-by-step protocol for split-BioID, a protein fragments-complementation assay based on the proximity-labeling technique BioID. Activated on the interaction of two given proteins, it allows the proteomics analysis of context-dependent protein complexes in their native cellular environment. The method is simple, cost-effective and only requires standard laboratory equipment.

그들의 네이티브 셀룰러 환경에서 상황에 맞는 단백질 복합물의 분할-BioID-Proteomic 분석

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions largely depend on intracellular protein&#8211;protein interactions. Therefore, research regarding these interactions is indispensable to facilitating the understanding of physiologic processes. Co-precipitation of associated proteins, followed by mass spectrometry (MS) analysis, enables the identification of novel protein interactions. In this study, we have provided details of the novel technique of immunoprecipitation-liquid chromatography (LC)-MS/MS analysis combined with on-membrane digestion for the analysis of protein&#8211;protein interactions. This technique is suitable for crude immunoprecipitants and can improve the throughput of proteomic analyses. Tagged recombinant proteins were precipitated using specific antibodies; next, immunoprecipitants blotted onto polyvinylidene difluoride membrane pieces were subjected to reductive alkylation. Following trypsinization, the digested protein residues were analyzed using LC-MS/MS. Using this technique, we were able to identify several candidate associated proteins. Thus, this method is convenient and useful for the characterization of novel protein&#8211;protein interactions.

Here, we present a protocol for an on-membrane digestion technique for the preparation of samples for mass spectrometry. This technique facilitates the convenient analysis of protein&#8211;protein interactions.

온-막 소화 기술을 사용한 단백질-단백질 상호 작용의 평가

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal transduction; from sensing environmental signals to biological response; from metabolic regulation to developmental control. Accurate structural information of protein-protein interactions is crucial for understanding the molecular mechanisms of membrane protein complexes and for the design of highly specific molecules to modulate these proteins. Many in vivo and in vitro approaches have been developed for the detection and analysis of protein-protein interactions. Among them the structural biology approach is unique in that it can provide direct structural information of protein-protein interactions at the atomic level. However, current membrane protein structural biology is still largely limited to detergent-based methods. The major drawback of detergent-based methods is that they often dissociate or denature membrane protein complexes once their native lipid bilayer environment is removed by detergent molecules. We have been developing a&#160;native cell membrane nanoparticle system for membrane protein structural biology. Here, we demonstrate the use of this system in the analysis of protein-protein interactions on the cell membrane with a case study of the oligomeric state of AcrB.

Presented here is a protocol for the determination of oligomeric state of membrane proteins that utilizes a native cell membrane nanoparticle system in conjunction with electron microscopy.

멤브레인 단백질-단백질 상호 작용 분석을 위한 기본 세포막 나노입자 시스템

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of methodological options for addressing molecular interactions in cells have been developed, but most of these methods suffer from being rather indirect and therefore hardly quantitative. On the contrary, a few high-end quantitative approaches were introduced, which however are difficult to extend to high throughput. To combine high throughput capabilities with the possibility to extract quantitative information, we recently developed a new concept for identifying protein-protein interactions (Schwarzenbacher et al., 2008). Here, we describe a detailed protocol for the design and the construction of this system which allows for analyzing interactions between a fluorophore-labeled protein ("prey") and a membrane protein ("bait") in-vivo. Cells are plated on micropatterned surfaces functionalized with antibodies against the bait exoplasmic domain. Bait-prey interactions are assayed via the redistribution of the fluorescent prey. The method is characterized by high sensitivity down to the level of single molecules, the capability to detect weak interactions, and high throughput capability, making it applicable as screening tool.

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

This video shows experiments with subsequent analysis of protein-protein interactions by the use of micro-patterned surfaces. The approach offers the possibility to detect protein interactions in living cells and combines high throughput capabilities with the possibility to extract quantitative information.

마이크로 패턴의 표면에 단백질 - 단백질 상호 작용에 - 생체내 감지

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

생물학

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, preventing their identification and analysis through traditional biochemical methods such as co-immunoprecipitation. In this regard, the genetically encodable fluorescent proteins (GFP, RFP, etc.) and their associated overlapping fluorescence spectrum have revolutionized our ability to monitor weak interactions in vivo using F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)1-3. Here, we detail our use of a FRET-based proximity assay for monitoring receptor-receptor interactions on the endothelial cell surface.

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

This protocol describes how to image protein-protein interactions using a FRET-based proximity assay.

이미징 단백질 - 단백질 상호 작용 생체내에</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level. There are several methods, both in vitro and in vivo, to evaluate protein binding, and at least two methods that complement the shortcomings of each other should be conducted to obtain reliable insights. 
For an in vivo assay, the bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assay represents the most popular and least invasive approach that enables to detect protein-protein interaction within living cells, as well as identify the intracellular localization of the interacting proteins 1,2. In this assay, non-fluorescent N- and C-terminal halves of GFP or its variants are fused to tested proteins, and when the two fusion proteins are brought together due to the tested proteins&#x2019; interactions, the fluorescent signal is reconstituted3-6. Because its signal is readily detectable by epifluorescence or confocal microscopy, BiFC has emerged as a powerful tool of choice among cell biologists for studying about protein-protein interactions in living cells 3. This assay, however, can sometimes produce false positive results. For example, the fluorescent signal can be reconstituted by two GFP fragments arranged as far as 7 nm from each other due to close packing in a small subcellular compartment, rather that due to specific interactions7.
Due to these limitations, the results obtained from live cell imaging technologies should be confirmed by an independent approach based on a different principle for detecting protein interactions. Co-immunoprecipitation (Co-IP) or glutathione transferase (GST) pull-down assays represent such alternative methods that are commonly used to analyze protein-protein interactions in vitro. However, iIn these assays, however, the tested proteins must be readily soluble in the buffer that supportsused for the binding reaction. Therefore, specific interactions involving an insoluble protein cannot be assessed by these techniques.
 Here, we illustrate the protocol for the protein membrane overlay binding assay, which circumvents this difficulty. In this technique, interaction between soluble and insoluble proteins can be reliably tested because one of the proteins is immobilized on a membrane matrix. This method, in combination with in vivo experiments, such as BiFC, provides a reliable approach to investigate and characterize interactions faithfully between soluble and insoluble proteins. In this article, binding between Tobacco mosaic virus (TMV) movement protein (MP), which exerts multiple functions during viral cell-to-cell transport8-14, and a recently identified plant cellular interactor, tobacco ankyrin repeat-containing protein (ANK) 15, is demonstrated using this technique.

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Testing protein-protein interaction is indispensable for dissection of protein functionality. Here, we introduce an in vitro protein-protein binding assay to probe a membrane-immobilized protein with a soluble protein. This assay provides a reliable method to test interaction between an insoluble protein and a protein in solution.

단백질 막 중첩 분석 : 가용성식이 및 불용성 단백질 간의 상호 작용을 테스트하는 프로토콜 체외에서</em

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level.  There are several ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.

Using protein microarrays containing nearly the entire S. cerevisiae proteome is probed for rapid unbiased interrogation of thousands of protein-protein interactions in parallel. This method can be utilized for protein-small molecule, posttranslational modification, and other assays in high-throughput.

고밀도 기능성 단백질 마이크로 어레이를 프로빙하는 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출하기

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Biotinylated Cell-Penetrating Peptide Probe to Detect Protein-Protein Interactions

Source: Jara&#237;z-Rodr&#237;guez, M. et al., <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/56457">Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates a technique that uses biotinylated cell-penetrating peptides to detect intracellular protein-protein interactions. The cell-penetrating peptides facilitate the conjugated peptide to enter a cell and specifically bind to its interacting proteins. The biotin, after binding to avidin, allows purification of the interacting proteins&#8217; complex from a cell lysate.

단백질과 단백질의 상호작용을 검출하기 위한 Biotinylated Cell-Penetrating Peptide 프로브

Source: Jara&#237;z-Rodr&#237;guez, M. et al., Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions. J. Vis. Exp. ...

막 척추 : 막 단백질의 단백질 - 단백질 상호 작용을 식별 할 수있는 생화학 적 도구

요약

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