해치, McIntire - 스테니스 (AD421 CRIS), USDA 씨 그랜트 (2011-04375), 및 ABD에 선생님 프레드릭 맥 매스터 연구 활동,이 프로젝트는 부분적으로 NSF IOS (0849230)에 의해 투자되었다.

<ol>
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Cell Fact. 4, 2859 (2005).</li><li>Gasser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+folding+and+conformational+stress+in+microbial+cells+producing+recombinant+proteins:+a+host+comparative+overview.">Protein folding and conformational stress in microbial cells producing recombinant proteins: a host comparative overview.</a> Microb. Cell Fact. 7, 11 (2008).</li><li>Daly, R., Hearn, M. T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+heterologous+proteins+in+Pichia+pastoris:+a+useful+experimental+tool+in+protein+engineering+and+production.">Expression of heterologous proteins in Pichia pastoris: a useful experimental tool in protein engineering and production.</a> J. Mol. Recognit. 18, 119-138 (1002).</li><li>Davis, T. 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저자가 공개하는 게 없다.

세 복제 웰 실험을 실행하여, 미끼에 결합하는 동일한 단백질의 독립적 취득한 파지들은 동일한 클론 획득 된 CDS 영역의 뉴클레오티드 서열 (즉, 명 차이지만 이러한되었을 경우에도 구별 될 수있다 ) 독립 우물에서 검색. 그렇지 않으면, 미끼에 결합하는 단백질을 코딩 동일한 파지를 구별하기위한 유일한 방법은 그들이 독립적 뉴클레오티드 서열의 일부가 다를 전사 영역을 반대로하는 경우. 친화력 선별 된 파지를 증폭에 사용하기 위해 박테리아를 모두 성장하는 일 FERNBACH 플라스크의 사용은 9 삼각 플라스크를 모니터링하는 것보다 궁합 선택 뒤에 감염에 이르는 세균 성장​​의 덜 바쁜 모니터링을 허용한다. 데워진 삼각 플라스크에, 직전에 감염이 세균을 이동시키고 또한 인해 알테에 서브 라이브러리 역가 불일치를 제거때문에 특정 플라스크별로 세균의 성장에 감염의 다중성에 식량. 따라서, 라운드로 라운드에서 파지 역가의 변화는 우물에 유지 파지의 수와 복제 된 우물 사이 역가의 변화는 최소화해야에 의존해야한다. 파지 디스플레이를 이용하여 하나의 특별한 장점은 기술이 특정 미끼 대한 선호도가 파지 디스플레이 단백질을 식별 가지고 큰 전력이다. 때문에 파지 BLT5403 호스트에 복제의 효율성에 첫 번째 선호도 선택 라운드에서 잘 유지되고 희귀 한 CDS를 나타내는 하나라도 파지, 코트 융합 단백질은 미끼에 대한 높은 친 화성을 가지고, 의지한다 훨씬 더 큰 숫자로 두 번째 라운드에서 표현 될 수있다. 네 번째 라운드로,이 파지는 용해 문화에 존재하는 파지의 대부분을 구성해야합니다. 높은 역가를 복제하는 파지의이 능력은 기술의 한계입니다신적인 기술. 특정 미끼가 도서관에서 높은 친화도를 갖고있는 상호 작용 단백질 파트너가있는 경우에는 이것들이 높은 친화력 결합 단백질에 의해 outcompeted되는 경향으로 합법적 미끼에 결합하지만 저급 궁합있다 단백질을 캡처하는 것은 매우 어렵다 . 희소 파지를 식별하는 차세대 시퀀싱 기술의 사용이 제한 한 우회의 하나의 가능한 방법이다. 또한, 인내, 오히려 거친 decontaminants (예 Envirocide) 및 극복하기 위해 우수한 멸균 기술을 필요로하는 실험실에 걸쳐 &quot;오염&quot;의 복싱 경기에서 T7 파지 결과 BLT5403의 감수성. 하나의 소스를 식별하고 제거하는 시도로 오염 궁합 선택의 진행 시간의 상당한 손실이 발생할 수 있습니다. 꽉 느슨한 &quot;바인더&quot;로 분할 파지의 성공을 제한 한 하나의 수단은 느슨한 바인더 먼저 B를 시도하고 복구하는 것입니다y는 우물에 덜 단단히 미끼에 바인딩 된 파지를 제거하기 위해 설계된 솔루션 (1 % SDS 또는 유사한 chaotrope)를 소개합니다. 이 용액을, 종래 이들 파지는 미끼에 결합 된 나머지에 의해 감염되는 것으로 예상된다 웰에 세균의 도입 먼저 제거 될 수있다. 이 기술은 또한 상당히 외관상 파지 결합을 백그라운드를 감소시킬 수있다. 이 기술을 추구한다면, 후속 라운드에서 선택된 sublibraries, 복제하고 중복 친화력의 개수는 시간과 비용을 상당히 추가되는 두 배가된다. 궁합 선택 몇 차례에 걸쳐 파지 역가 증가의 과정을 따르면 LB의 대용량 및 LB AMP 플레이트 (100)의 다수의 필터 배리어 팁, 에펜 도르프 튜브 등을 통해 실행할 수있다. 파지도 겸손한 번호를 검사하는 데 필요한 순서이기 때문에이 비싸다. TR 여러 복제물의 희석액 다수 Titering세중 eatments 그래서 전에 친 화성 선택에 하루 가능한 재료의 정도를 설정의 중요성이 가장 중요 상당한 시간이 필요합니다. 현재 탐구되고 하나의 흥미로운 가능성은 물리적 특성과 먹이와 상호 작용하는 단백질의 영역의 삼차원 구조를 모델링하기 위해, 미끼에 결합하는, 독립 파아지 단백질의 위치를​​ 사용하는 것이다. 예를 들어, 동종 늦은 배아의 집합에 바인딩 단백질 표적의 특성을 검사하는 애기 장대 (애기 장대)과 콩 (글리신 최대)에서 풍부한 (LEA) 단백질, 한 가지 중요한 결론은이 되었나요의 지역에 바인딩 된 LEA 단백질 결합 단백질 (11)의 대부분 (또는 가장들) 친수성 단백질되었습니다. 후 향적으로, LEA 단백질 탈수 동안 변성에서 자신의 클라이언트 분자를 보호하기 위해 가설 것을 감안할 때, 그것은의 할 수있다LEA 보호없이 장애에 가장 민감한 클라이언트 분자의 영역 (친수성) 물을 바인딩의 가장 유능한 사람이 될 수 있음을 urmised. 그것은 역가 팽창되지 않도록 웰에 세균의 도입과 그 사이의 검색 시간을 최소화하는 것이 바람직하다. 희석은 세균의 재고가 오염되지 않았 음을 확인하고 가장 큰 희석이 합류 용해를 방지시키기에 충분 함을 위해 바이러스 감염없이 일부 BLT5403 도금으로 충분한 지 확인합니다.

왜 대신에 다른 분자와 단백질의 상호 작용을 발견하고 조사에 사용할 수있는 수많은 다른 기술의 파지 디스플레이와 궁합 선택을 사용할 수 있습니까? 파지 디스플레이는 다음과 같은 단백질 - 리간드 상호 작용 1-3을 검출하는 다른 방법을 통해 몇 가지 독특한 장점을 청구 할 수 있습니다 : 미끼 분자의 매우 넓은 레퍼토리 가장 중요한 이유는 친화력 선택 4 미끼 역할을 할 수있는 분자의 다양성에있다. 파지 디스플레이는 고분자 / 분자가 복구 지원에 부착 할 수있는 경우 기본적으로, 그것은 파지 표시 단백질과 선호도에 대한 검사를 할 수있는 다른 단백질, 핵산, 탄수화물 등 5과 상호 작용하는 단백질 조각을 분리하는 매우 강력한 수단이다. 조건은 연구에 사용하는 경우 또한, 미끼 분자는 6 고정 때 생물학적 활성을 유지하는지 확인하기 위해 액세스 할 수 있습니다활동을 제거 / 끌어 내다 전에 친 화성 선택에 미끼로 번역 후 변형을 소개하고, 6 효과 또는이다. 외부 요인에 파지 저항 파지 디스플레이를 사용하는 두 번째 이유는, 그것이 어떤 미끼가 상호 작용하는 단백질을 캡처하는 환경 스트레스 (열, 높은 osmolyte 농도, 특정 보조 인자, 등.)을 요구할 수 있다는 가능하다는 것을, 또는 파지 디스플레이 단백질 든 변경해야 할 수도 친화력 선택하기 전에. 연구되고있는 요인은 먹이와 단백질 아니라 그것이 시험 유기체에 치명적인 경우 상호 작용이 발생할 수있게하거나 상태 사이의 상호 작용이다. 그것은 (T7 생존을위한 출판 열 최대 ~ 60 ° C 7입니다 예) 그대로 실행 가능한 두 가혹한 실험 조건을 견딜 수 있기 때문에 T7 파지는 이러한 연구에 특히 적합합니다. 바꾸는 파지의 예는 프로 표시로수리 효소의 단백질 기질의 애기 장대 종자 프로테옴을 검사 할 때 teins는 단백질 Isoaspartyl 메틸 Transferease (PIMT)는이 연구에 사용 된 바이러스는 도입을 장려하기 위해, 이전에 각 친화력 선택에 라운드, 일주일 동안 &quot;세&quot;있었다 isoaspartate의 (isoAsp는) 인식 및 수리 / 등의 이상을 대사 할 수 유기체에서 할 수없는 민감한 단백질 6 잔류 물. 대사 적 불활성 또한, 파지는 일반적으로 신진 대사 독과, 적어도, 대사 활성 시험 생물에다면 발현 성 효과가 발생할 것 작은 분자 간섭에 저항. 엄격 세척 후, 독은 독성이 세균 또는 후속 파아지 복제 무해한 범위로 희석되도록 박테리아의 대량 감염이 도입되기 전에 제거된다. PIMT 수리 단백질 표적을 조사하는 동안효소, S-아데노 메티오닌 (AdoMet)는 효소를 불 활성화하고 유용한 음성 대조군이있는 보안 제공하기 위해 S-아데노 호모시스테인 (AdoH​​cy)에 의존하면서 표적 단백질 캡처를 허용하도록 마이크로 타이 터 플레이트 잘 고정화 효소를 활성화하는 데 사용되었다 바이러스에 악영향 AdoMet 또는 AdoHcy 6도에 의해 영향을받을 수없는 것이 지식. 또한이 실험실에서 조사 특정 늦은 배아 풍부한 (LEA) 단백질 가족의 일원은, 시점에 콩 씨앗에서 200 밀리미터의 높은 농도를 달성 할 수 자당 8 등의 첨가제의 존재에 자신의 형상을 변경하는 것으로 알려져있다 생리적 성숙 9. 바이러스는 자율적으로 실행 가능한 시험 생물 (10)의 경우에는 해당되지 않습니다 특정 LEA-클라이언트 단백질 상호 작용에 대한 가능성에 필요한 각각의 친화력 선택 라운드, 200 MM의 자당의 첨가에 의해 영향을받을 것으로 예상되지 않습니다. 이 연구소는 discoverin에 초점을 맞추고있다G 단백질 - 단백질 탈수 (11) 또는 씨가 6 흡수 된 후에 isoAsp 형성에 취약 저장 프로테옴의 구성 요소를 복구하는 동안 저장 프로테옴 보호의 메커니즘을 기초 성숙, 탈수 또는 발아 씨앗의 상호 작용. 따라서, 생산 및 정제 활성 상태에 미끼로 필요한 재조합 단백질, 그들이 고정화 전후에 자주 어려운, 우리의 작업에 기초하지만 그들은, 그래서 남아 보장한다. 각각의 재조합 단백질 생산 시나리오가 다르기 그러나, 재조합 단백질 생산을위한 최적화 조건은 여기서 언급되지 않을 것이다. 사용자는 (이 효소 경우 마이크로 플레이트의 우물에서 효소 분석을, 예를 들면) 고정 된 단백질이 여전히 작동하는지 확인하기 위해, 가능한 한, 시도 촉구된다. 이것은 어떤 발견 상호 작용이 있는지, 미끼 따라서 생물학적 활성과 자신감을 제공합니다생물학적 관련성이 다소 가능성.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tryptone</td>
 <td>Becton Dickinson Co.</td>
 <td>211705</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Yeast Extract</td>
 <td>Becton Dickinson</td>
 <td>212750</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agar</td>
 <td>Becton Dickinson</td>
 <td>214010</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium Chloride</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>BP358-10</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agarose</td>
 <td>Research Products International</td>
 <td>A20090</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Blocking Reagent</td>
 <td>EMD Chemicals Inc.</td>
 <td>69064</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tween 20</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>BP337-100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium Hydroxide</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>BP359-212</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium Dodecyl Sulfate</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>BP166-500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris Base</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>BP152-5</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chloroform</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>BP1145-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Escherichia coli BLT5403</td>
 <td>EMD Chemicals Inc.</td>
 <td>BLT5403</td>
 <td>Genotype: F- ompT hsdSB (rB - mB -) gal dcm pAR5403 (AmpR)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ampicillin, Sodium Salt</td>
 <td>Research Products International</td>
 <td>A40040</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ethidium bromide</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>BP102-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
 <td>Sigma-Aldrich Corp.</td>
 <td>A-9647</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>penta-HIS primary antibody</td>
 <td>Qiagen Inc.</td>
 <td>34660</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Goat anti mouse alkaline phosphatise conjugate</td>
 <td>Sigma-Aldrich Corp.</td>
 <td>A-5153</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>para-nitrophenylphosphate</td>
 <td>Sigma-Aldrich Corp.</td>
 <td>N-7653</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>T7-UP primer</td>
 <td>EMD Chemicals Inc.</td>
 <td></td>
 <td>5'-GGAGCTGTCGTATTCCAGTC-3'</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>T7-DOWN primer</td>
 <td>EMD Chemicals Inc.</td>
 <td></td>
 <td>5'-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3'</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Qiaquick PCR Purification kit</td>
 <td>Qiagen Inc.</td>
 <td>28104</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Qiaquick Gel Extraction kit </td>
 <td>Qiagen Inc.</td>
 <td>28706</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit</td>
 <td>Invitrogen Life Technologies</td>
 <td>4336917</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Heating Block</td>
 <td>Pierce Chemical Co. (Thermo Fisher Scientific Co.)</td>
 <td>18780</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96 Well Cell Culture Plates</td>
 <td>Corning</td>
 <td>Costar 3590</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Isotemp Incubator Oven</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>516D</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pasteur Pipets, 5 &frac34;"</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>13-678-20A</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ChromaView Transilluminator</td>
 <td>UVP Inc.</td>
 <td>TS-15</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>UV Shield</td>
 <td>Oberon</td>
 <td>071AF</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gloves, Nitrile</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>19-170-010C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sterile 1.5 ml tubes</td>
 <td>USA Scientific Inc</td>
 <td>1615-5500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 ml borosilicate Pipets</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>13-678-25E</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Borosilicate culture tubes</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>14-961-27</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Uniskan I, ELISA plate reader</td>
 <td>Labsystem and Flow Laboratories, Helsinki, Finland</td>
 <td>Type 362</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

a protocol for phage display and affinity selection using recombinant protein baits

고정 미끼 분자 방향성 복제 cDNA 라이브러리로 인코딩 된 다양한 단백질 부분을 제시 할 수있는 발판 재조합 파지를 사용하여 상호 작용을 발견 할 수있는 효율적인 수단입니다. 기술은 주로 단백질 - 단백질 상호 작용을 발견하기 위해 사용되었지만 도전을 미끼 분자는 단백질에 한정 될 필요는 없다. 여기에 제시된 프로토콜은 미끼의 소극적인 수가 동일한 단백질을 제시하는 독립 클론의 식별을 최대화하기 위해 반복 실험으로 스크리닝 할 수 있도록 최적화되었다. 이 확인 된 상호 작용하는 단백질이 미끼 분자의 합법적 인 인터랙 것을 더 큰 자신감을 허용합니다. 각각의 선호도 선택 후 파지 역가를 모니터링 라운드 선호도 선택이 음성 대조군의 효과뿐 아니라 어떻게 진행되고 있는지에 대한 정보를 제공합니다. 하나는 파지를 titering, 방법을 통해 어떤이 과정이 효율적으로 진행 할 수 있도록 사전에 준비수는 표시됩니다. 독립적 인 플라크의 격리 다음 검색 증폭 산물의 특성이 선호도 선택은 진행 상황을 잘 확인하는 데 사용할 수있는 강조 표시됩니다. 문제가 잘못된 반응을 최소화하기 위해 또는 지속적으로 파지를 복구 우회하는 기술 촬영이 설명되어 있습니다. 바이러스 오염 플레어 업을 줄이는 수단이 논의된다.

(대사 미끼 중독) 파지 표시 단백질과 상호 작용하는 미끼의 능력을 손상 할 수 있다는 것은이 기술에 대한 강력한 음의 컨트롤을 제공합니다. 그것은 미끼가 잘 마이크로 플레이트에 결합 할 때, 그 기능을 유지하고 있는지 확인하는 것이 좋습니다. 이러한 검사는 모두 nonpoisoned 미끼로 회수 상호 작용, 파지 표시 단백질은 안전한 것으로 신뢰를 증가 할 것이다. 각 우물에서 세 삼중를 샘플링 선호도 선택에 필요한 시간과 작업에 상당히 추가 한 번만 샘플링보다 각 웰 내 역가의보다 정확한 견적을 제공합니다. 삼중의 역가의 대부분이 잘 일치하지만, 라운드 네에서 BSA의 복제 2의 삼중는 (표 1) 다양 있습니다. 여러 번 샘플링하여, 최종 잡은 탈리는 피펫 팅의 오차 및 t의 더 정확한 추정치뿐만 취약하지그는 실제 역가이 예상 주위의 변화는 잘 - 투 - 글쎄, (표 1, 그림 5C)를 얻을 수있다. 친화력 선택의 수가 증가 라운드로, 우선적으로 nonpoisoned 미끼, 파지 역가의 증가는 또한 기술은 (그림 5C) 작동하고 있다는 확신을 제공합니다. 선호도 선택 조건의 수가 증가함에 nonpoisoned 베이트 웰 인서트를 함유 파지의 증가 비율의 보존도 정사각형 (도 6a 및도 6b)이다. (;도 6b PCR은 ~ 100 bp의 크기보다 더 큰 증폭 산물로서 식별)를, 첫 번째 라운드 (도 6A)에 대하여, 그리고 침전 궁합 선택 고급 라운드의 수의 증가는 독립적으로 삽입 한 파지를 회수 후에 그림 (b) &lt;에 몇 가지 동일한 크기의 밴드 (주 차선 5-9, 11-18에서 이러한 증폭 산물)&gt; / 강한, 특히 클론 선호도 선택에서 (그림 6A 및 6B)를 선택되고 있다는 좋은 지표입니다. 라운드 최종 선호도 선택에서 얻어진 플라크의 수를 시퀀싱 한 후, 같은 단백질의 유사한 지역 (다른 클론)의 검색이 표시되는 단백질의 일부가 미끼를위한 선의의 친 화성을 ​​가지고 독립적 인 검증이다. 이러한 독립적 복구 파지는 미끼와 상호 작용 할 수있는 전체 단백질의 어떤 부분에 대한 정보를 제공합니다. 파지 cDNA 라이브러리 랜덤 프라이밍을 사용하여 생성 된 표시하는 경우, 부분과 전체 길이의 단백질 범위의 다양성은 여러 개의 독립적 인 복제로 이어지는, (cDNA를 삽입 크기를 허용하는 파지의 범위 내에서) 예상 할 수있다 단백질의 동일한 부분을 덮는. 심지어 연속 아웃의 프레임 히트가 된 바 비슷한 모티브를 인코딩 여부를 확인하기 위해 자세히 조사해야한다그것은 바인딩합니다. (이 라이브러리는 ORF 기술 3을 사용하여 구성되지 않은 것으로 가정). <img alt="표 1" src="/files/ftp_upload/50685/50685table1.jpg" /> 표 1. 세 가지 치료에 대한 선호도 선택의 네 번째 라운드의 우물의 평균 역가 / ㎖ 감염된 박테리아 계산. 잘 미끼의 첫 번째 복제에서 촬영 플라크의 10 -3 희석 각 세중의 숫자 그림 (b)에서 가져온 것입니다 것은. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50685/50685table1highres.jpg" target="_blank">큰 테이블을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50685/50685fig1.jpg" fo:src="/files/ftp_upload/50685/50685fig1highres.jpg" /> 파지 디스플레이 프로세스의 그림 1. 전체를 그래픽으로 보여줍니다 </strong&gt;. 두 가지 주요 요구 사항은 다음과 같습니다; A) 바람직 cDNA를 생성을위한 랜덤 프라이머, 폴리-A 선택 RNA를 사용하여 구성 파지 디스플레이 라이브러리에 대한 액세스, 그리고 B) 지금까지 가능한 한에서, 미끼, 생물학적으로 활성 상태로 검증을 고체 지지체에 고정화하고, 가능하다면, 억제제의 첨가에 의해 비활성 렌더링하는 경우에도 (예를 들어 경쟁적 미끼 결합 단백질을 억제). RT : 역전사. <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50685/50685fig2.jpg" fo:src="/files/ftp_upload/50685/50685fig2highres.jpg" /> .. 그림 2 장비와 파지 디스플레이를 수행에 필요한 자료의 일부 살균 기술은 모두에 액세스 할 수 있어야합니다 : A) 오토 클레이브와, B) 층류 후드. 파지 라이브러리와 BLT5403 세균성 주식은 필요 -80 &amp; #<html> 176, 장기 보관의 C에 대한 C의 온도) 성장 파지와 세균), EF는)) (궤도 액체 문화를 성장시킬 수 중 하나는 37 ° C의 보육을, DF가 필요합니다. 컬러 코딩, F)를 통해 실험을 최적화하는 것은 실수를 최소화 할 수 있습니다. titering에 대한 BLT5403 세포를 4 ℃에서 최대 1 주일, G)에 저장 될 수있다 다음 궤도 셰이커에 세포 밀도를 다음과 같은 사항에 대해, H) 분광 광도계의 배치를 최적화하는 것은 시간을 절약 할 수 있습니다. 자주와 표면과 피펫을 치료, I) 강력한 세제 J) Envirocide는, 바이러스 오염의 위험을 최소화하는 데 도움이 될 수 있습니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50685/50685fig2highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 85fig3.jpg &quot;FO : SRC =&quot;/ files/ftp_upload/50685/50685fig3highres.jpg &quot;/&gt; 그림 3. 한 가지 가능한 셋업 부드러운 선호도를 선택합니다.) BLT5403을 허용하는 데 유용이 하루 이틀 전에 titering로 성장하고있다들은이 바이러스에 오염되지 않음을 결정하기 위해, 바이러스 성 도입하지 않고, 도금된다. 에펜 도르프를 prelabeling) B와, C) 붕 규산염 관은 LB 100AMP의 희석 용액을 분취하고 4 ° C에서 하룻밤을 저장 B)를 사용하는 D : 선호도 선택의 날에 Titering하는 사전 준비에 의해 촉진 될 수있다.. ) 멸균 최고 아가로 오스 (캡을 느슨하게)을 용융 및 냉각 예열 50 ° C의 물을 욕조에 배치). E를 titering 전에 약 1 시간을 따뜻하게하기 위해 37 ° C에서 prenumbered, LB 100AMP의 한천, 페트리 접시를 놓고 이 온도에 titering 전에 시간이 시작됩니다. 르를 사용최고 아가로 오스를 제거로 병 전복을 피하기 위해 광고 도넛. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50685/50685fig3highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50685/50685fig4.jpg" fo:src="/files/ftp_upload/50685/50685fig4highres.jpg" /> 그림 4. 친 화성 선택의 라운드에서 회수 된 파지를 Titering. 도금 역가. A) 바이러스에 감염된 BLT5403 희석하고 랙에 조립 붕규산 튜브의 첫번째 세트의 인공 팽창을 방지하기 위해 감염 후 가능한 빨리 시작한다. 필터 장벽 팁 사용 : 250 ㎕를 4 ° C에서 재고 BLT5403 세포 BC은) 붕 규산염 튜브로 전송됩니다. 필터 장벽 팁을 사용 : 첫 번째 붕 규산염 관 DE) BLT5403는 인터넷에 감염첫 바이러스 희석. F) 붕 규산염 피펫은 막힘을 방지하고 정상 아가 따뜻하게 유지하기 위해 불에 가열된다. . 과도하게 피펫을 가열하지 마십시오 박테리아가 끓는되고 다이 G) 3 ㎖ 용융 최고 아가로 오스는 신속하게 검색하고 붕 규산염 관 H) 관은 내용을 섞어 잠시 가볍게 쳤다되고있는 박테리아에 주입됩니다. I) 내용은 플레이트의 측면에 거품을 이동하고 상위 아가로 오스는 전체 플레이트를 커버하기 위해 튜브를 사용하여 데워진 LB 100AMP 한천 플레이트에 붓고. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50685/50685fig4highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50685/50685fig5.jpg" fo:src="/files/ftp_upload/50685/50685fig5highres.jpg" /> 그림 5. 일반적인 역가 재sults.) 낮은 희석 (10-2) 거의 예외없이 첫 번째 선호도 선택 라운드에서 모든 치료 (그림에서 바이러스가 지나치게 긴 촬영을 용이하게하기 위해 과도한 플라크 크기의 결과로 증가 된)에 대한 합류 용해 초래한다. B) 플라크의 적절한 희석가 집계 플라크를 추적하는 빈틈을 사용하여 계산됩니다. C) 크게 BSA 또는 독 미끼 안정 더 또는 덜 유지하면서 미끼 우물의 역가가 증가합니다. 후반 라운드에서 미끼 우물 고원과 더 친 화성 선택에서 역가가 비생산적이다. D) 잘 격리 된 플라크를 초과하는 액체 적어도 그것을 제거해야되고, 에펜 도르프 튜브에서 솔루션 목장 피펫을 적시하여 시퀀싱을 위해 선택하고 수집 된 여러 플라크를 통해 실행 코어를 오염. E) 피펫은 이미 압축 피펫 전구와 플라크를 통해 추진 된피펫은 코어 형 플라크 적절한 에펜 도르프 튜브에 액체로 전달되기 직전까지 피펫에 플라크 (화살표). G)를 빠는 상단 아가로 오스에있는 동안. F) 전구가 출시되었습니다. 파지 희석 (LB 100AMP의 볼륨 당 감염된 박테리아의 양)은 페트리 접시 (예 : 10 -3 = 1 / 1, 000 희석)에 묘사되어있다. 복제도 1 세 세중의 샘플은 여행으로 단축된다. 1, 여행. 2, 그리고 여행. 3, 모든 복제 1 (의원 1 =도 1)를 참조하십시오. B의 접시의 바닥)의 숫자는 접시에 집계 실제 플라크 번호입니다. 이 미끼에 친화력 선택 (그림 R4)의 네 번째 라운드에서 박테리아의 10 -3 희석 있습니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50685/50685fig5highres.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page=&quot;항상&quot;&gt; <img alt="그림 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50685/50685fig6.jpg" fo:src="/files/ftp_upload/50685/50685fig6highres.jpg" /> 그림 6. 적절한 미끼에 친 화성 선택에 대한 일반적인 PCR 결과. A) 빈 벡터 플라크 (화살표)의 비율은 일반적으로 매우 높은 초기하지만, 미끼 우물에, B) 이후 라운드에서 감소한다. 플라크 포함 삽입이 나중에 선호도 선택 라운드에서 동일 크기의 삽입을 포함하는에 정착하는 경향이있다. MWM : 분자량 마커.

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A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

파지 디스플레이는 그 고정 된 분자와 상호 작용하는 단백질이나 단백질 부분을 캡처 할 수있는 강력한 기술이다. 생성하는 파아지 cDNA 라이브러리의 형식과 스크린의 결정이 제작되면, 여기에 설명 된 프로토콜 인터랙의 식별에 이르는 효율 선호도 선택을 허용한다.

재조합 단백질의 미끼를 사용 파지 디스플레이와 궁합 선택을위한 프로토콜

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

a-protocol-for-phage-display-affinity-selection-using-recombinant

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

33.8K 조회수.  University of Kentucky.  파지 디스플레이는 그 고정 된 분자와 상호 작용하는 단백질이나 단백질 부분을 캡처 할 수있는 강력한 기술이다. 생성하는 파아지 cDNA 라이브러리의 형식과 스크린의 결정이 제작되면, 여기에 설명 된 프로토콜 인터랙의 식별에 이르는 효율 선호도 선택을 허용한다. 

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A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells.

CD1 proteins constitute a third class of antigen-presenting molecules. They are cell surface glycoproteins, expressed as approximately 50-kDa glycosylated heavy chains that are noncovalently associated with beta2-microglobulin. They bind lipids rather than peptides. Although their structure confirms the similarity of CD1 proteins to MHC class I and class II antigen presenting molecules, the mCD1d groove is relatively narrow, deep, and highly hydrophobic and it has two binding pockets instead of the several shallow pockets described for the classical MHC-encoded antigen-presenting molecules. Based upon their amino acid sequences, such a hydrobphobic groove provides an ideal environment for the binding of lipid antigens. The Natural Killer T (NKT) cells use their TCR to recognize glycolipids bound to or presented by CD1d. T cells reactive to lipids presented by CD1 have been involved in the protection against autoimmune and infectious diseases and in tumor rejection. Thus, the ability to identify, purify , and track the response of CD1-reactive NKT cell is of great importance . The generation of tetramers of alpha Galactosyl ceramide (a-Galcer) with CD1d has significant insight into the biology of NKT cells. Tetramers constructed from other CD1 molecules have also been generated and these new reagents have greatly expanded the knowledge of the functions of lipid-reactive T cells, with potential use in monitoring the response to lipid-based vaccines and in the diagnosis of autoimmune diseases and other treatments.

A Method to prepare Insect cells and infect them with baculovirus for the the purpose of production of recombinant mCD1d proteinand generating mCD1d tetramers.

곤충 세포에서 재조합 단백질의 생산 mCD1d하는 방법.

CD1 proteins constitute a third class of antigen-presenting molecules. They are cell surface glycoproteins, expressed as approximately 50-kDa glycosylated ...

연구

생물학

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

액상 복구와 분자량 기반 분류에 대한 GELFREE 8100 분획화 시스템을 사용하여

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Primer-Free Aptamer Selection Using A Random DNA Library

Aptamers are highly structured oligonucleotides (DNA or RNA) that can bind to targets with affinities comparable to antibodies 1. They are identified through an in vitro selection process called Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment (SELEX) to recognize a wide variety of targets, from small molecules to proteins and other macromolecules 2-4. Aptamers have properties that are well suited for in vivo diagnostic and/or therapeutic applications: Besides good specificity and affinity, they are easily synthesized, survive more rigorous processing conditions, they are poorly immunogenic, and their relatively small size can result in facile penetration of tissues.
Aptamers that are identified through the standard SELEX process usually comprise ~80 nucleotides (nt), since they are typically selected from nucleic acid libraries with ~40 nt long randomized regions plus fixed primer sites of ~20 nt on each side. The fixed primer sequences thus can comprise nearly ~50% of the library sequences, and therefore may positively or negatively compromise identification of aptamers in the selection process 3, although bioinformatics approaches suggest that the fixed sequences do not contribute significantly to aptamer structure after selection 5. To address these potential problems, primer sequences have been blocked by complementary oligonucleotides or switched to different sequences midway during the rounds of SELEX 6, or they have been trimmed to 6-9 nt 7, 8. Wen and Gray 9 designed a primer-free genomic SELEX method, in which the primer sequences were completely removed from the library before selection and were then regenerated to allow amplification of the selected genomic fragments. However, to employ the technique, a unique genomic library has to be constructed, which possesses limited diversity, and regeneration after rounds of selection relies on a linear reamplification step. Alternatively, efforts to circumvent problems caused by fixed primer sequences using high efficiency partitioning are met with problems regarding PCR amplification 10.
We have developed a primer-free (PF) selection method that significantly simplifies SELEX procedures and effectively eliminates primer-interference problems 11, 12. The protocols work in a straightforward manner. The central random region of the library is purified without extraneous flanking sequences and is bound to a suitable target (for example to a purified protein or complex mixtures such as cell lines). Then the bound sequences are obtained, reunited with flanking sequences, and re-amplified to generate selected sub-libraries. As an example, here we selected aptamers to S100B, a protein marker for melanoma. Binding assays showed Kd s in the 10-7 - 10-8 M range after a few rounds of selection, and we demonstrate that the aptamers function effectively in a sandwich binding format.

SELEX protocols comprise multiple rounds of selection, each of which require regeneration of bound ligands, which in turn require fixed primer sequences flanking the random library regions. These fixed primer sequences can interfere with the selection process (false positives and negatives). Here we present a primer-free protocol.

랜덤 DNA 라이브러리를 사용하여 뇌관 - 무료 Aptamer 선택

Aptamers are highly structured oligonucleotides (DNA or RNA) that can bind to targets with affinities comparable to antibodies 1. They are identified ...

Peptides from Phage Display Library Modulate Gene Expression in Mesenchymal Cells and Potentiate Osteogenesis in Unicortical Bone Defects

Two novel synthetic peptides accelerate bone formation and can be delivered using a collagen matrix. The aim of this study was to investigate the effects on bone repair in a unicortical defect model. Treatment of mesenchymal cells produced an increase in alkaline phosphatase activity, showed nodule formation by the cells, and increased the expression of genes for runx2, osterix, bone sialoprotein, and osteocalcin. A collagen sponge soaked with peptide promoted repair of bone defects, whereas the control was less effective. The results from this study demonstrated that mesenchymal cells treated with peptide in vitro differentiate towards osteogenesis, and, that peptides delivered in vivo using a collagen sponge promote the repair of unicortical defects.

A phage display library was used to identify peptide sequences that target bone. The objective was to investigate the effect of these peptides on mesenchymal cell differentiation and to determine their effect on bone regeneration.

파지 디스플레이 도서관에서 펩티드는 Mesenchymal 세포의 유전자 발현을 조절하고 Unicortical 뼈 결함에 Osteogenesis을 힘을 주다

Two novel synthetic peptides accelerate bone formation and can be delivered using a collagen matrix. The aim of this study was to investigate the effects ...

Automated Hydrophobic Interaction Chromatography Column Selection for Use in Protein Purification

In contrast to other chromatographic methods for purifying proteins (e.g. gel filtration, affinity, and ion exchange), hydrophobic interaction chromatography (HIC) commonly requires experimental determination (referred to as screening or "scouting") in order to select the most suitable chromatographic medium for purifying a given protein 1. The method presented here describes an automated approach to scouting for an optimal HIC media to be used in protein purification.
HIC separates proteins and other biomolecules from a crude lysate based on differences in hydrophobicity. Similar to affinity chromatography (AC) and ion exchange chromatography (IEX), HIC is capable of concentrating the protein of interest as it progresses through the chromatographic process. Proteins best suited for purification by HIC include those with hydrophobic surface regions and able to withstand exposure to salt concentrations in excess of 2 M ammonium sulfate ((NH4)2SO4). HIC is often chosen as a purification method for proteins lacking an affinity tag, and thus unsuitable for AC, and when IEX fails to provide adequate purification. Hydrophobic moieties on the protein surface temporarily bind to a nonpolar ligand coupled to an inert, immobile matrix. The interaction between protein and ligand are highly dependent on the salt concentration of the buffer flowing through the chromatography column, with high ionic concentrations strengthening the protein-ligand interaction and making the protein immobile (i.e. bound inside the column) 2. As salt concentrations decrease, the protein-ligand interaction dissipates, the protein again becomes mobile and elutes from the column. Several HIC media are commercially available in pre-packed columns, each containing one of several hydrophobic ligands (e.g. S-butyl, butyl, octyl, and phenyl) cross-linked at varying densities to agarose beads of a specific diameter 3. Automated column scouting allows for an efficient approach for determining which HIC media should be employed for future, more exhaustive optimization experiments and protein purification runs 4.
The specific protein being purified here is recombinant green fluorescent protein (GFP); however, the approach may be adapted for purifying other proteins with one or more hydrophobic surface regions. GFP serves as a useful model protein, due to its stability, unique light absorbance peak at 397 nm, and fluorescence when exposed to UV light 5. Bacterial lysate containing wild type GFP was prepared in a high-salt buffer, loaded into a Bio-Rad DuoFlow medium pressure liquid chromatography system, and adsorbed to HiTrap HIC columns containing different HIC media. The protein was eluted from the columns and analyzed by in-line and post-run detection methods. Buffer blending, dynamic sample loop injection, sequential column selection, multi-wavelength analysis, and split fraction eluate collection increased the functionality of the system and reproducibility of the experimental approach.

An automated method for identifying suitable hydrophobic interaction chromatography (HIC) media to be used in the process of protein purification is presented. The method utilizes a medium-pressure liquid chromatography system including automated buffer blending, dynamic sample loop injection, sequential column selection, multi-wavelength analysis, and split fraction eluate collection.

단백질 정제에서 사용하기 위해 자동화된 소수성 상호 작용 크로마 토그래피 칼럼 선정

In contrast to other chromatographic methods for purifying proteins (e.g. gel filtration, affinity, and ion exchange), hydrophobic interaction ...

A Protocol for Computer-Based Protein Structure and Function Prediction

Genome sequencing projects have ciphered millions of protein sequence, which require knowledge of their structure and function to improve the understanding of their biological role. Although experimental methods can provide detailed information for a small fraction of these proteins, computational modeling is needed for the majority of protein molecules which are experimentally uncharacterized. The I-TASSER server is an on-line workbench for high-resolution modeling of protein structure and function. Given a protein sequence, a typical output from the I-TASSER server includes secondary structure prediction, predicted solvent accessibility of each residue, homologous template proteins detected by threading and structure alignments, up to five full-length tertiary structural models, and structure-based functional annotations for enzyme classification, Gene Ontology terms and protein-ligand binding sites. All the predictions are tagged with a confidence score which tells how accurate the predictions are without knowing the experimental data. To facilitate the special requests of end users, the server provides channels to accept user-specified inter-residue distance and contact maps to interactively change the I-TASSER modeling; it also allows users to specify any proteins as template, or to exclude any template proteins during the structure assembly simulations. The structural information could be collected by the users based on experimental evidences or biological insights with the purpose of improving the quality of I-TASSER predictions. The server was evaluated as the best programs for protein structure and function predictions in the recent community-wide CASP experiments. There are currently &gt;20,000 registered scientists from over 100 countries who are using the on-line I-TASSER server.

Guidelines for computer based structural and functional characterization of protein using the I-TASSER pipeline is described. Starting from query protein sequence, 3D models are generated using multiple threading alignments and iterative structural assembly simulations. Functional inferences are thereafter drawn based on matches to proteins with known structure and functions.

컴퓨터 기반의 단백질 구조 및 기능 예측을위한 프로토콜

Genome sequencing projects have ciphered millions of protein sequence, which require knowledge of their structure and function to improve the ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a demand for general methods that do not require target protein specific optimization1 . To achieve this, purification tags that genetically can be fused to the gene of interest are commonly used2 . The most widely used affinity handle is the hexa-histidine tag, which is suitable for purification under both native and denaturing conditions3 . The metabolic burden for producing the tag is low, but it does not provide as high specificity as competing affinity chromatography based strategies1,2.
Here, a bispecific purification tag with two different binding sites on a 46 amino acid, small protein domain has been developed. The albumin-binding domain is derived from Streptococcal protein G and has a strong inherent affinity to human serum albumin (HSA). Eleven surface-exposed amino acids, not involved in albumin-binding4 , were genetically randomized to produce a combinatorial library. The protein library with the novel randomly arranged binding surface (Figure 1) was expressed on phage particles to facilitate selection of binders by phage display technology. Through several rounds of biopanning against a dimeric Z-domain derived from Staphylococcal protein A5, a small, bispecific molecule with affinity for both HSA and the novel target was identified6 .
The novel protein domain, referred to as ABDz1, was evaluated as a purification tag for a selection of target proteins with different molecular weight, solubility and isoelectric point. Three target proteins were expressed in Escherishia coli with the novel tag fused to their N-termini and thereafter affinity purified. Initial purification on either a column with immobilized HSA or Z-domain resulted in relatively pure products. Two-step affinity purification with the bispecific tag resulted in substantial improvement of protein purity. Chromatographic media with the Z-domain immobilized, for example MabSelect SuRe, are readily available for purification of antibodies and HSA can easily be chemically coupled to media to provide the second matrix.
This method is especially advantageous when there is a high demand on purity of the recovered target protein. The bifunctionality of the tag allows two different chromatographic steps to be used while the metabolic burden on the expression host is limited due to the small size of the tag. It provides a competitive alternative to so called combinatorial tagging where multiple tags are used in combination1,7.

A novel and highly efficient two-step affinity chromatography protocol has been developed and is described in detail. The method is based on a small purification tag with two inherent affinities and is applicable to a wide range of target proteins with different properties.

작은 Bispecific 선호도 태그에 의해 용이 직교 단백질 정제

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

탠덤 동질 정제를 사용하여 단백질 나누기 파트너의 식별

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein labeled, this method can be implemented for the investigation of protein-protein interactions. It is based on one hand on the recognition of the tagged protein by cobalt coated magnetic beads and on the other hand on the interaction between the tagged protein and a second specific protein that is labeled. First, the labeled and tagged proteins are mixed and incubated at room temperature. The magnetic beads, that recognize the tag, are added and the bound fraction of labeled protein is separated from the unbound fraction using magnets. The amount of labeled protein that is captured can be determined in an indirect way by measuring the signal of the labeled protein remained in the unbound fraction. The described liquid phase affinity assay is extremely useful when conformational conversion sensitive proteins are assayed. The development and application of the assay is demonstrated for the interaction between poliovirus and poliovirus recognizing nanobodies1. Since poliovirus is sensitive to conformational conversion2 when attached to a solid surface (unpublished results), the use of ELISA is limited and a liquid phase based system should therefore be preferred. An example of a liquid phase based system often used in polioresearch3,4 is the micro protein A-immunoprecipitation test5. Even though this test has proven its applicability, it requires an Fc-structure, which is absent in the nanobodies6,7. However, as another opportunity, these interesting and stable single-domain antibodies8 can be easily engineered with different tags. The widely used (His)6-tag shows affinity for bivalent ions such as nickel or cobalt, which can on their turn be easily coated on magnetic beads. We therefore developed this simple quantitative affinity capture assay based on cobalt coated magnetic beads. Poliovirus was labeled with 35S to enable unhindered interaction with the nanobodies and to make a quantitative detection feasible. The method is easy to perform and can be established with a low cost, which is further supported by the possibility of effectively regenerating the magnetic beads.

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. It is a reliable technique based on the interaction between magnetic beads and tagged proteins (e.g. nanobodies) on one hand and the affinity between the tagged protein and a second, labeled protein (e.g. poliovirus) on the other.

단백질 - 단백질 상호 작용 연구를 자성 비즈를 사용하여 액상 동질 캡처 분석 : Poliovirus-Nanobody의 예

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in current research and a plethora of methods for their investigation is available1. Protein-protein interactions often are highly dynamic and may depend on subcellular localization, post-translational modifications and the local protein environment2. Therefore, they should be investigated in their natural environment, for which co-immunoprecipitation approaches are the method of choice3. Co-precipitated interaction partners are identified either by immunoblotting in a targeted approach, or by mass spectrometry (LC-MS/MS) in an untargeted way. The latter strategy often is adversely affected by a large number of false positive discoveries, mainly derived from the high sensitivity of modern mass spectrometers that confidently detect traces of unspecifically precipitating proteins. A recent approach to overcome this problem is based on the idea that reduced amounts of specific interaction partners will co-precipitate with a given target protein whose cellular concentration is reduced by RNAi, while the amounts of unspecifically precipitating proteins should be unaffected. This approach, termed QUICK for QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown4, employs Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC)5 and MS to quantify the amounts of proteins immunoprecipitated from wild-type and knock-down strains. Proteins found in a 1:1 ratio can be considered as contaminants, those enriched in precipitates from the wild type as specific interaction partners of the target protein. Although innovative, QUICK bears some limitations: first, SILAC is cost-intensive and limited to organisms that ideally are auxotrophic for arginine and/or lysine. Moreover, when heavy arginine is fed, arginine-to-proline interconversion results in additional mass shifts for each proline in a peptide and slightly dilutes heavy with light arginine, which makes quantification more tedious and less accurate5,6. Second, QUICK requires that antibodies are titrated such that they do not become saturated with target protein in extracts from knock-down mutants.
Here we introduce a modified QUICK protocol which overcomes the abovementioned limitations of QUICK by replacing SILAC for 15N metabolic labeling and by replacing RNAi-mediated knock-down for affinity modulation of protein-protein interactions. We demonstrate the applicability of this protocol using the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii as model organism and the chloroplast HSP70B chaperone as target protein7 (Figure 1). HSP70s are known to interact with specific co-chaperones and substrates only in the ADP state8. We exploit this property as a means to verify the specific interaction of HSP70B with its nucleotide exchange factor CGE19.

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

We present a variation of the QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown) approach that was introduced previously to distinguish between true and false protein-protein interactions. Our approach is based on 15N metabolic labeling, the modulation of affinities of protein-protein interactions by the presence/absence of ATP, immunoprecipitation, and quantitative mass spectrometry.

을 바탕으로 단백질 - 단백질 상호 작용의 확인에 프로토콜<sup&gt; 15</sup&gt; N 신진 대사 라벨링, Immunoprecipitation, 수량 질량 분석법 및 선호도 변조

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...