이 연구는 박사 이안 Goodfellow에게 수여 Wellcome 트러스트 수석의 원정대에 의해 후원되었다.

1. 세포 라인의 생성 : pMEP4 transfection / 표현 <ol><li> pMEP4 발현 벡터와 세포를 Transfect 모든 모의 transfected 세포를 죽였으니 때까지 hygromycin B / ML (로슈)의 100 μg으로 선택합니다. pMEP4 플라스미드는 특정 클론을 격리시킬 필요가 없습니다 episomally 때문에 유지됩니다. </li><li> pMEP4 벡터를 포함하는 세포는 16 시간 동안 10 μm의 CdCl 2 치료에 의해 ​​유도된 수 있습니다. 표현과 inducibility은 세포 라인 증폭 전에 작은 규모로 확정해야한다. 단백질 G 도메인은 거의 모든 종류의 항체에 바인딩으로 TAP으로 태그가 추가된 단백질은 쉽게 감지가 가능하다. 대규모 purifications 들면 세포의 일반적으로 10 합류 175cm 2 flasks이 필요합니다. 이것은 약 2 X10 8 표현 세포로 equates. </li></ol> 2. 세포 lysate 준비 <ol><li> PBS로 세포를 데리고 한 50 ML 튜브로 결합되어 있습니다. 1200X GF 던가5 분 (이것은 세척 후 1.5 ML로 감소하는으로 시작하는 포장 세포로부터 2-3 ML 초래한다). </li><li> 얼음처럼 차가운 PBS (50 MLS 때마다)에 세포를 세 번 씻는다. </li><li> 5 ML의 용해 완충액 (에서 세포를 Lyse 50 MM 트리스-HCL (산도 7.5) 125 MM NaCl, 5 % 글리세롤, 0.2 % NP-40, 1.5 밀리미터 MgCl 2, 25 MM NaF, 1 ㎜ 나 3 조종 4 테아제 억제제 ). 참고 : NaF, 나 세 조종 4 테아제 억제제는 신선한 추가됩니다. 얼음에서 5 분 출발 전에 10 배 아래로 피펫합니다. 얼음에 5 분간 얼음에 다시 나가기 전에 무딘 바늘을 이용하여 주사기 위아래로 5-10 시간. syringing를 반복하고 얼음에 추가로 5 분 둡니다. </li><li> (액체 N 2 / 또는 드라이 아이스와 에탄올) 두 번 lysate를 냉동 해동. 예제는 4보다 큰 ° C.에 도달하도록 허용하지 마십시오 참고 : 처리 시간 ° C 때까지 -80에서이 샘플을 저장할 수 있습니다. </li><li> 1.5 ML 튜브로 나누어지는 샘플을하고 제거 unlysed 세포와 D원심 분리 (4 10 분 ° C, 16,000 X G)에 의해 ebris. </li><li> 뜨는 복구, 15 ML 팔콘 튜브에 결합하고 (옵션) 단백질 항복 부량 위해 20 μl 채취하기 전에 필터 0.45 μm의 통과. 이후의 분석 (예제 1)에 추가로 50 μl 나누어지는를 제거합니다. </li></ol> 3. 토끼 IgG-아가로 오스에 바인딩할 (참고 : 모든 핑핑이 별도로 명시되지 않는 한, 1 분 4 ° C에서 냉장 원심 분리기에 1200X g에서 실시되어야 함) <ol><li> 부드럽게 병을 소용돌이에 의해 토끼 IgG-아가로 오스 솔루션 (시그마 - 올드 리치)를 resuspend. IgG 아가로 오스 (커팅 1ml 피펫 팁 사용) 380 μl를 타고 1 분 원심 분리에 의해 운송 / 방부제 솔루션을 제거합니다. 차가운 용해 완충액 (4 ℃) 명확히하기 위해 원심 분리를 사용하여.에 아가로 오스 세 번 씻으십시오 아가로 오스의 최종 수율은 포장 구슬 약 250 μl 있어야합니다. </li><li> 2.6 (15 ML 매 욕조에에서 지워 세포 lysate 추가E) 4에서 3 시간 동안 빨아서 토끼 IgG 아가로 오스와 부화 (또는 야간)에 ° C 회전 믹서를 사용합니다. </li><li> 4 ° C에서 5 분 아가로 오스 비즈를 돌려서 후속 분석 (예제 2) 뜨는을 제거합니다. 참고 : 단백질 태그를 TAP 이제 비즈와 관련된되어야한다. </li></ol> 4. TEV 프로 테아제 절단 (참고 : 모든 핑핑이 별도로 명시되지 않는 한, 1 분 4oC에서 냉장 원심 분리기에 1200X g에서 실시되어야 함) <ol><li> 차가운 용해 완충액에 토끼 IgG 아가로 오스 비즈 세 번 씻는다 (4 ° C) (참고 : 용해 버퍼 테아제 억제제가 없어야합니다) 명확히하기 위해 원심 분리를 사용하여. 케어는 세정 단계 동안 구슬을 제거하거나 잃지 않도록 촬영해야합니다. </li><li> 명확히하기 위해 원심 분리를 사용하여 TEV-단백 분해 효소 절단 버퍼 (10 MM 트리스-HCL (산도 7.5), 100 MM NaCl 및 0.2 % NP-40)와 함께 비즈에게 추가로 두 번 씻는다. 마지막 세척 후 신중하게 모든 리를 제거구슬에서 파운드. </li><li> TEV 단백 분해 효소 절단 믹스를 준비해, 각 샘플은 467.5 μl H 2 O 25 μl 20x TEV 버퍼 (Invitrogen), 5 μl 0.1M DTT와 2.5 μl (25 U) TEV 프로 테아제 (Invitrogen)를 포함합니다. 포장 구슬의 각 샘플이 TEV 절단 믹스 500 μl을 넣고 1.7 ML 미리 윤활 튜브 (Costar)로 전체 믹스를 전송합니다. 사전 배양은 이후 분석 (예제 3) 30 μl 나누어지는를 제거합니다. </li><li> 4에서 하룻밤 TEV 단백 분해 효소 반응을 품어 ° C에서 회전 믹서를 사용합니다. 짧은 incubations 시간은 경험적으로 결정되어야 미끼 단백질과 TEV 단백 분해 효소 절단 사이트지만 최소 배양 시간의 접근의 성격에 따라 사용할 수 있습니다. </li></ol> 5. 고정화 Streptavidin 플러스 구슬을 Ultralink에 바인딩할 (참고 : 모든 핑핑이 별도로 명시되지 않는 한, 1 분 4 ° C에서 냉장 원심 분리기에 1200X g에서 실시되어야 함) </P&gt; <ol><li> 1200X g (4 ℃)에서 5 분 동안 토끼 IgG 아가로 오스 비즈를 포함 TEV 절단 반응을 원심 분리기. 분석을 위해 명확히 뜨는의 20 μl 나누어지는 (예제 4) 삭제 </li><li> 신선 1.5 ML 사전 윤활 튜브 (Costar)에 남은 뜨는 (약 480 μl)를 전송하고 얼음에서이 작업을 둡니다. 이 뜨는 버리 지마 - 이것이 바로 너의 TEV 죽습 미끼 단백질과 연관된 바인딩 단백질이 포함되어 있습니다. </li><li> 나머지 토끼 IgG 아가로 오스 비즈와 resuspend에 차가운 용해 완충액 500 μl (제 2.3) 추가합니다. 뜨는을 제거하고 단계 5.2에서 그걸로 결합하기 전에 구슬을 명확히하기 위해이 혼합물을 원심 분리기. (지금 샘플 ~ 980 μl를 포함한다) 얼음에이 튜브를 남겨주세요. </li><li> 이후 분석을 위해 토끼 IgG 아가로 오스 비즈 (예제 5) 유지. 참고 : SDS-PAGE 젤 (또는 서쪽 얼룩)에서이 샘플을 실행하면 그것으로 인해 IgG 무거운 가벼운 존재로 배경을 많이 줄 것이다체인. </li><li> 한편 부드럽게 Ultralink이 병을 소용돌이하여 Streptavidin 플러스 아가로 오스 비즈 (피어스)를 고정화 resuspend. 미리 윤활 1.5 ML 튜브로 끝 잘라내기, 나누어지는 샘플 당 streptavidin 구슬의 70 μl로 200 μl 피펫 팁을 사용하고 원심 분리하여 운송 / 방부제 솔루션을 제거합니다. 참고 :이 구슬은 매우 작고 그래서 &quot;오리 청구&quot;또는 평평 / 좁은 엔드 팁이 씻는 동안 비드 손실을 최소화하는 데 사용할 수 있습니다. </li><li> streptavidin 구슬에게 차가운 용해 완충액에 세 번 씻는다 (4 ° C)에 명확히하기 위해 원심 분리를 사용하여. 이것은 튜브 당 포장 구슬의 약 45-50 μl를 떠나해야합니다. </li><li> 전송 사에서 3 시간 (또는 특급)에 대한 형편없는 streptavidin 비즈와 부화를 포함한 튜브에 TEV-단백 분해 효소 절단에 뜨는 (즉 5.3 단계에서 시료의 980의 μl) ° C 회전 믹서를 사용합니다. </li><li> 4 ° C에서 5 분간 streptavidin 구슬을 아래로 돌리고 (후속 분석을 위해 뜨는을 제거 샘ple 6). streptavidin 구슬에게 차가운 용해 완충액에 세 번 씻는다 (4 ° C)에 명확히하기 위해 원심 분리를 사용하여. 최종 세척 후 신중하게 남아있는 모든 세차 버퍼를 제거합니다. </li></ol> 6. streptavidin 바인딩 펩타이드와 미끼 단백질의 비오틴의 용출 (참고 : 모든 핑핑이 별도로 명시되지 않는 한, 1 분 4 ° C에서 냉장 원심 분리기에 1200X g에서 실시되어야 함) <ol><li> 비오틴 (1 MM D-비오틴)과 회전 믹서를 사용 3시간 (또는 야간)에 대해 4 ° C에서 잠복기 : PBS 500 μl를 추가하여 streptavidin 비즈에서 태그가 지정된 단백질 Elute. </li><li> 4 ° C에서 5 분간 streptavidin 구슬을 아래로 돌리고 1.5 ML 미리 윤활 튜브 (참고로 뜨는을 제거 :이 최종 샘플 / 용리 (예제 7)입니다. </li><li> 나머지 streptavidin 비즈로 PBS와 회전 믹서를 사용 2-3시간 (또는 야간)에 대해 4 ° C에서 품어 : 또 다른 500 μl 비오틴을 추가합니다. </li><li> 다시이탄은 6.2 단계로 두 elutions (예제 7) 결합. 이것은 최종 용리는 -80 ° C.에 저장될 수 </li><li> 비오틴의 용출의 효율성을 평가하기 위해 나중에 SDS 샘플 버퍼 (예제 8) (피셔에서 LaneMarker 5 배 감소 샘플 버퍼 권장)에 남아있는 streptavidin 비즈를 동결하고 끓여야. </li></ol> 7. 단백질 농도 <ol><li> 최종 eluate (예제 7) 때문에 낮은 단백질 농도와 상대적으로 높은 볼륨의 사전 분석에 집중해야합니다. 이것은 낮은 분자량 (&lt;5 KDa) Vivaspin의 스핀 컬럼 (Vivascience)를 사용하여 얻을 수 있습니다. 미만 100 μl로 볼륨을 집중하고자합니다. 이 최종 샘플 (피셔에서 LaneMarker 5 배 감소 샘플 버퍼 권장) 삶은과 단백질 샘플 버퍼에 저장할 수 있습니다. </li></ol> 8. 분석 <ol><li> 샘플은 1-8 풀다운의 효율성을 결정하기 위해 서양의 얼룩으로 분석할 수 있습니다. 참고 : 대부분의 이차 항체됩니다융합 단백질의 단백질 G 도메인과 교차 반응을하지만, 이것은 TEV 단백 분해 효소 절단 후 제거됩니다. </li><li> 샘플 7 1D 또는 2D SDS-PAGE에 의해 분석할 수 있습니다. 염색법은 은색 또는 Coomassie을 (SilverQuest 실버 염색법과 Invitrogen에서 콜로이드 블루 Coomassie 염색법의 키트 권장)를 사용하여 수행할 수 있습니다. 단백질 식별은 질량 분광법을 사용하여 수행할 수 있습니다. </li></ol> 9. 대표 결과 TAP 태그가 eIF4E의 바인딩 파트너를 식별하려면이 프로토콜에서 최종 용리 (예제 7) 1D SDS-PAGE 분석의 예제는 그림 2에 제공됩니다. 이 대표 겔은 세포의 다른 단백질과 상호 작용 eIF4E의 복잡하고 풍부한 자연을 반영합니다. 전용 TAP 태그를 표현 세포주에서 생성된 또한 그림 2에 표시된 부정적인 통제와 비교​​, 풀다운 baited이 eIF4E의 특이성을 보여줍니다. 농축 최종 용리 인스턴스 15%에서 (샘플7) Invitrogen에서 Silverquest 실버 염색법 키트를 사용 물들일되기 전에 시판 프리 캐스트 기울기 젤을 사용하여 1D SDS-PAGE에 의해 분석되었다. 일반적으로 남아있는 농축 최종 용리 (예제 7) 50-85%은 콜로이드 Coomassie은 (Invitrogen) 얼룩으로 분석됩니다. 전체 차선의 표본 (겔 조각 / 밴드)가 대량 분석법에 의해 추출하여 분석되었다. 풀다운 eIF4E에서 확인된 단백질이 아닌 특정 바인딩 파트너를 식별하기 위해 부정적인 컨트롤의 바인딩 파트너에 대해 필터링되었습니다. TAP 태그 eIF4E의이 프로세스를 통해 확인된 최종 단백질은이 기술을 사용하여 식별 정상적인 단백질의 대표 그림 2에서 볼 수 있습니다. 또한, eIF3 subunits의 숫자도 (데이터가 표시되지 않음)가 발견되었다. <img src="/files/ftp_upload/3643/3643fig1.jpg" alt="그림 1" /> 1 그림. 의 개략도탠덤 친화 정화 절차는. 여섯 단계 탠덤 선호도 정화 (TAP) 프로토콜은 세포주 생성, 세포 용해, 토끼 IgG 아가로 오스 immuno-강수량, TEV 프로 테아제 절단, streptavidin 비드 친화 정화하고 마지막 비오틴 용출을 포함한다. <img src="/files/ftp_upload/3643/3643fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. murine eIF4E의 단백질 탠덤 친화 정화가. 말기 태그를 누르 N의 파트너를 나누기 eIF4E가 첨부된 프로토콜을 사용하여 진핵 HEK293 세포에서 정화되었다. 최종 용리 (예제 7)의 20 % 분율은 미리 캐스트 4-12%의 기울기 겔 (TAP-eIF4E 차선)에서 SDS-PAGE에 의해 분석되었다. 상응 분석은 혼자 태그 (TAP의 차선)에 대해 수행되었다. 단백질은 실버 염색법을 사용하여 확인되었다. 이후 동일한 샘플의 질량 분광법에 의해 확인된 단백질이 젤에 강조 표시됩니다. 약어 : eIF4G; 진핵세포 번역 개시 F배우 4 감마, PABP; polyA 바인딩 단백질, eIF4A : 진핵세포의 번역 개시 인자 4 알파, SBP-eIF4e, 진핵세포의 번역 개시 인자의 4E 바인딩, 진핵세포 번역 개시 인자의 4E로 융합, 4EBPs streptavidin 바인딩 펩타이드를 포함하는 나머지 트는 미끼 단백질 단백질, eIF4eNiF1l 진핵세포 번역 개시 인자의 4E 핵 수입 팩터 1, SBP, TEV unfused 트는 펩타이드의 남은 streptavidin 바인딩 펩타이드.

<ol>
	<li>Williamson, M. P., Sutcliffe, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions.">Protein-protein interactions.</a> Biochem. Soc. Trans. 38 (4), 875-878 (2010).</li><li>Rigaut, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration.">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration.</a> Nat. Biotechnol. 17 (10), 1030-1032 (1999).</li><li>Blackwell, C., Brown, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+application+of+tandem-affinity+purification+to+Candida+albicans.">The application of tandem-affinity purification to Candida albicans.</a> Methods Mol. Biol. 499, 133-148 (2009).</li><li>Cochrane, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+complex+formation+between+HIV+Rev+and+the+nucleosome+assembly+protein,+NAP1,+affects+Rev+function.">Stable complex formation between HIV Rev and the nucleosome assembly protein, NAP1, affects Rev function.</a> Virology. 388 (1), 103-111 (2009).</li><li>Fernandez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+tandem+affinity+purification+of+PSD-95+recovers+core+postsynaptic+complexes+and+schizophrenia+susceptibility+proteins.">Targeted tandem affinity purification of PSD-95 recovers core postsynaptic complexes and schizophrenia susceptibility proteins.</a> Mol. Syst. Biol. 5, 269-269 (2009).</li><li>Gloeckner, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+affinity+purification+of+protein+complexes+from+mammalian+cells+by+the+Strep&#47;FLAG+(SF)-TAP+tag.">Tandem affinity purification of protein complexes from mammalian cells by the Strep&#47;FLAG (SF)-TAP tag.</a> Methods Mol. Biol. 564, 359-372 (2009).</li><li>Holowaty, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+profiling+with+Epstein-Barr+nuclear+antigen-1+reveals+an+interaction+with+the+herpesvirus-associated+ubiquitin-specific+protease+HAUSP/USP7.">Protein profiling with Epstein-Barr nuclear antigen-1 reveals an interaction with the herpesvirus-associated ubiquitin-specific protease HAUSP/USP7.</a> J. Biol. Chem. 278 (32), 29987-29994 (2003).</li><li>Burckstummer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+tandem+affinity+purification+procedure+for+interaction+proteomics+in+mammalian+cells.">An efficient tandem affinity purification procedure for interaction proteomics in mammalian cells.</a> Nat. Methods. 3 (12), 1013-1019 (2006).</li><li>Goodfellow, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calicivirus+translation+initiation+requires+an+interaction+between+VPg+and+eIF+4+E.">Calicivirus translation initiation requires an interaction between VPg and eIF 4 E.</a> EMBO Rep. 6 (10), 968-972 (2005).</li><li>Goodfellow, I. G., Roberts, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+initiation+factor+4E.">Eukaryotic initiation factor 4E.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 40 (12), 2675-2680 (2008).</li></ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

여기에 그림과 TAP 태그 기술은 진핵 세포의 미끼 단백질의 바인딩 파트너를 격리를위한 매우 구체적이고 엄격한 방법을 보여줍니다. 이 접근법은 세포와 바이러스 모두 단백질에 적용할 수 있습니다. 우리가 알기로,이 같은 기술이 번역 개시 인자의 eIF4E에 적용되었습니다 처음이다. 이 기법을 사용하여 알려진 eIF4E 바인딩 단백질의 eIF4G 및 4EBPs의 확인은 이러한 접근 방식의 유효성을 확인. 또한, eIF4F 복합 나머지 구성 요소의 식별은, 즉 eIF4A 및 PABP는 간접 상호 작용과 차 단지는 정화 과정에서 그대로 유지 인증해줍니다. 정식 eIF4e 바인딩 단백질의 여러 isoforms의 신분도 분명했습니다. 이들은 그림 2에 자세히 설명되어 있습니다. 접근 방식의 한계로 돌아가서 특정주의 선택에 관련하여 복용해야미끼 단백질과 N-또는 C-말단에 태그 태그를 추가할지 여부. 그것은 기능적 분석을 수행하거나 태그를 유도체가 작동하기 위해 사전에 전격적인 정화에 현미경으로 융합 단백질의 지방화를 검토 권할 수도 있습니다. 적분 막이나 핵 단백질은 반드시 용해 단계에서 설명한 비교적 순한 세제를 조건으로 석방되지 않을 수 있습니다. 모든 immunoprecipitations 및 유사 풀다운 assays와 마찬가지로, 수정은 용해의 효율성을 높일 수있는 용해 완충액에서 자연과 세제의 농도로 만들 수 있습니다. 용해 및 세척 버퍼의 이온 농도는 정화의 엄중을 늘리거나 줄일 수정할 수 있습니다. 그것은 표준 온화한 조건 (위에서 설명한)에서 초기 정화를 수행하는 것도 가능하지만, 이후 연속적으로 증가하는 이온 사기꾼 아래 씻어 수 4-5 aliquots에 streptavidin 구슬 (섹션 5.8), 나누다ditions. 이것은 사용자가 아닌 특정 상호 작용하는 단백질을 제거 최적의 조건을 확인할 수 있습니다. 전체 프로세스는 또한 과도 상호 작용하는 파트너 알려져 transfection 이후 서부의 얼룩에 의해서만 결정의 존재 또는 부재를 사용하여 수행할 수 있습니다. 이 경우 우리는 각각의 플라스미드 표현 8 μg으로 transfected 세포의 두 100cm 두 요리를 제안합니다. 알려진 바인딩 파트너들과 상호 작용하기 위해 TAP-융합 단백질의 돌연변이 유도체의 능력을 조사 때 수정 절차는 쓸모없는 것입니다. 실버 스테인드 SDS-PAGE의 젤 (또는 서양 얼룩에 의한 항체를 사용할 수있는 경우) 8을 통해 샘플 1을 분석하는 것은 문제 해결의 좋은 방법이며, 기술 수​​용 결과를 생성하는 데 실패한다. 각 친화력 기반의 강수량 및 특정 용리의 효율성이 체계적인 표본 추출 방법을 사용하여 분석할 수 있습니다. 샘플 8-1는 o​​ptim 동안 복용해야각각의 새 미끼를위한 프로토콜의 ization. TAP 태그 기술은 GST와 같은 다른 접근 방식 당겨 - 다운 등 이중 친화 정화 및 특정 용출 단계 (TEV 절단과 비오틴의 용출이)로 유지되는 특이성과 엄중를 제공 효모 두 하이브리드 assays를 대한 강력하고 강력한 대안을 제공합니다 정화 절차 전반에 걸쳐 높은 수준. 비판적으로이 기법은 모든 단백질에 적용할 수 있으므로 관심있는 단백질 표적에 대한 바인딩 파트너를 식별하기위한 탁월한 방법을 나타냅니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> Hygromycin B </td><td> 로슈 </td><td> 10843555001 </td></tr><tr><td> 토끼 IgG 아가로 오스 </td><td> 시그마 </td><td> A2909 </td></tr><tr><td> AC-TEV 프로 테아제 </td><td> Invitrogen </td><td> 12575-015 </td></tr><tr><td> 테아제 억제제 칵테일 </td><td> Calbiochem </td><td> 539,134 </td></tr><tr><td> Ultralink는 Streptavidin 플러스 비즈를 고정화 </td><td> 찌르다 </td><td> 53,116 </td></tr><tr><td> Vivaspin 500 원심 농축기 (5KDa) </td><td> Vivaspin </td><td> V50112 </td></tr><tr><td> SilverQuest 실버 염색법 키트 </td><td> Invitrogen </td><td> LC6070 </td></tr><tr><td> Novex 콜로이드 블루 Coomassie의 염색법 키트 </td><td> Invitrogen </td><td> LC6025 </td></tr><tr><td> 1.7ml prelubricated 튜브</td><td> Costar </td><td> 3207 </td></tr><tr><td> 피펫 팁 Microcapillary </td><td> VWR </td><td> 37001-150 </td></tr><tr><td> NuPage 4~12% 비스 - 트리스 그라디언트 젤 </td><td> Invitrogen </td><td> NP0322BOX </td></tr><tr><td> CdCl 2 </td><td> 시그마 </td><td> 202,908 </td></tr><tr><td> 5 배 SDS 샘플 버퍼 </td><td> 어부 </td><td> PN39000 </td></tr></tbody></table>

identification of protein interacting partners using tandem affinity purification

호스트 및 바이러스 단백질의 기능을 이해하는데 중요하며 종종 제한 단계는 세포 또는 바이러스성 단백질 파트너를 상호 작용의 신분증입니다. 상호 작용하는 효모 두 하이브리드 시스템을 포함한 파트너,뿐만 아니라 재조합 단백질 및 대량 분석법 식별 1 다음 내생 단백질의 immunoprecipitation을 사용하여 assays를 풀다운의 식별을 허용 여러 방법이 있습니다. 최근 연구는 상호 작용하는 단백질의 식별에 두 특정 용출 단계와 결합 이중 친화 태그 중재 정화의 유틸리티를 강조했습니다. 이러한 접근 방식은, 되나 탠덤 동질 정화 (TAP)는 처음 효모 2,3에 사용되었지만 최근에는 포유 동물 세포에서 4-8를 사용하는 적응되었습니다. Proof-Of-Concept, 개념으로서 우리는 잘 특성화 진핵세포 번역 개시 포워드 액티브를 사용하여 탠덤 선호도 정화 (TAP) 메서드를 설립토르 eIF4E 9,10 있습니다. 셀룰러 번역 팩터 eIF4E는 캡 종속 번역 개시 10에 관련된 세포 eIF4F 복합 중요한 구성 요소입니다. 현재 연구에 사용되는 TAP 태그는 두 단백질 G 단위로 구성되어와 streptavidin 바인딩 펩타이드는 담배 엣지 바이러스 (TEV) 단백 분해 효소 절단 순서로 구분됩니다. 현재 연구에 사용되는 TAP 태그는 두 단백질 G 단위로 구성되어와 streptavidin 바인딩 펩타이드는 담배 엣지 바이러스로 구분 (TEV) 단백 분해 효소 절단 순서 8이다. clonal 세포 라인의 생성에 대한 필요성을 ...없이 지내다하기 위해, 우리는 pMEP4 (Invitrogen)에 근거 episomally 유지 플라스미드의 TAP-태그를 미끼 단백질의 표현에 의존 빠른 시스템을 개발했습니다. 이 플라스미드의 태그를 murine eIF4E 표현은 카드뮴 염화물 inducible의 metallothionein 모터를 사용하여 통제되었다. R에 바인딩을 통해 표현하는 세포와 후속 친화 정화의 용해abbit IgG 아가로 오스, TEV 프로 테아제 절단은 streptavidin 연결된 아가로 오스로 묶는 방식과 (혼자 TAP 태그를 표현하는 세포 라인을 제어하는​​ 비교시) 이후 비오틴의 용출은 풀다운 eIF4E에 분명히 특정 다수의 단백질을 발견. 단백질의 정체성은 1D SDS-PAGE와 후속 탠덤 질량 분광법에서 밴드의 절단에 의해 획득되었다. 식별된 구성 요소는 알려진 eIF4E 구속력 eIF4G 단백질과 4EBP-1을 포함시켰습니다. 또한, eIF4F 복합 다른 구성 요소는 eIF4E는 구성 요소가 eIF4A 및 폴리-결합 단백질 즉, 식별되었습니다이다 중. 알려진 직접적인 구속력이 파트너뿐만 아니라, 이차 상호 작용하는 단백질뿐만 아니라, 식별하는 능력은 더욱 알 수없는 함수의 단백질의 특성이 접근 방식의 유틸리티를 강조 표시합니다.

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Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

탠덤 친화 정화 단백질 바인딩 파트너의 식별을위한 강력한 접근이다. 개념 증명으로서,이 방법론은 숙주 세포의 요인 번역 개시에 관여 공동 침전물에 잘 특성화 번역 개시 인자의 eIF4E에 적용되었다. 이 방법은 쉽게 다른 세포 또는 바이러스성 단백질에 적응하고 있습니다.

탠덤 동질 정제를 사용하여 단백질 나누기 파트너의 식별

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

identification-protein-interacting-partners-using-tandem-affinity

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

37.4K 조회수.  Imperial College London. 탠덤 친화 정화 단백질 바인딩 파트너의 식별을위한 강력한 접근이다. 개념 증명으로서,이 방법론은 숙주 세포의 요인 번역 개시에 관여 공동 침전물에 잘 특성화 번역 개시 인자의 eIF4E에 적용되었다. 이 방법은 쉽게 다른 세포 또는 바이러스성 단백질에 적응하고 있습니다.

비디오: Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

유기 용매 및 초산없이 쿠매시 G - 250로 젤의 단백질 염색법

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

연구

생물학

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

액상 복구와 분자량 기반 분류에 대한 GELFREE 8100 분획화 시스템을 사용하여

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key selective advantages. First, renaturation of disordered aggregates by Hsp104 empowers yeast survival after various protein-misfolding stresses, including heat shock3,5,11,12. Second, remodeling of cross-beta amyloid fibrils by Hsp104 enables yeast to exploit myriad prions (infectious amyloids) as a reservoir of beneficial and heritable phenotypic variation13-22. Remarkably, Hsp104 directly remodels preamyloid oligomers and amyloid fibrils, including those comprised of the yeast prion proteins Sup35 and Ure223-30. This amyloid-remodeling functionality is a specialized facet of yeast Hsp104. The E. coli orthologue, ClpB, fails to remodel preamyloid oligomers or amyloid fibrils26,31,32.
Hsp104 orthologues are found in all kingdoms of life except, perplexingly, animals. Indeed, whether animal cells possess any enzymatic system that couples protein disaggregation to renaturation (rather than degradation) remains unknown33-35. Thus, we and others have proposed that Hsp104 might be developed as a therapeutic agent for various neurodegenerative diseases connected with the misfolding of specific proteins into toxic preamyloid oligomers and amyloid fibrils4,7,23,36-38. There are no treatments that directly target the aggregated species associated with these diseases. Yet, Hsp104 dissolves toxic oligomers and amyloid fibrils composed of alpha-synuclein, which are connected with Parkinson's Disease23 as well as amyloid forms of PrP39. Importantly, Hsp104 reduces protein aggregation and ameliorates neurodegeneration in rodent models of Parkinson's Disease23 and Huntington's disease38. Ideally, to optimize therapy and minimize side effects, Hsp104 would be engineered and potentiated to selectively remodel specific aggregates central to the disease in question4,7. However, the limited structural and mechanistic understanding of how Hsp104 disaggregates such a diverse repertoire of aggregated structures and unrelated proteins frustrates these endeavors30,40-42.
To understand the structure and mechanism of Hsp104, it is essential to study the pure protein and reconstitute its disaggregase activity with minimal components. Hsp104 is a 102kDa protein with a pI of ~5.3, which hexamerizes in the presence of ADP or ATP, or at high protein concentrations in the absence of nucleotide43-46. Here, we describe an optimized protocol for the purification of highly active, stable Hsp104 from E. coli. The use of E. coli allows simplified large-scale production and our method can be performed quickly and reliably for numerous Hsp104 variants. Our protocol increases Hsp104 purity and simplifies His6-tag removal compared to a previous purification method from E. coli47. Moreover, our protocol is more facile and convenient than two more recent protocols26,48.

Here, we describe a protocol for the purification of highly active Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation. This scheme exploits a His6-tagged construct for affinity purification from E. coli followed by anion-exchange chromatography, His6-tag removal with TEV protease, and size-exclusion chromatography.

Hsp104의 정화, 단백질 Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a demand for general methods that do not require target protein specific optimization1 . To achieve this, purification tags that genetically can be fused to the gene of interest are commonly used2 . The most widely used affinity handle is the hexa-histidine tag, which is suitable for purification under both native and denaturing conditions3 . The metabolic burden for producing the tag is low, but it does not provide as high specificity as competing affinity chromatography based strategies1,2.
Here, a bispecific purification tag with two different binding sites on a 46 amino acid, small protein domain has been developed. The albumin-binding domain is derived from Streptococcal protein G and has a strong inherent affinity to human serum albumin (HSA). Eleven surface-exposed amino acids, not involved in albumin-binding4 , were genetically randomized to produce a combinatorial library. The protein library with the novel randomly arranged binding surface (Figure 1) was expressed on phage particles to facilitate selection of binders by phage display technology. Through several rounds of biopanning against a dimeric Z-domain derived from Staphylococcal protein A5, a small, bispecific molecule with affinity for both HSA and the novel target was identified6 .
The novel protein domain, referred to as ABDz1, was evaluated as a purification tag for a selection of target proteins with different molecular weight, solubility and isoelectric point. Three target proteins were expressed in Escherishia coli with the novel tag fused to their N-termini and thereafter affinity purified. Initial purification on either a column with immobilized HSA or Z-domain resulted in relatively pure products. Two-step affinity purification with the bispecific tag resulted in substantial improvement of protein purity. Chromatographic media with the Z-domain immobilized, for example MabSelect SuRe, are readily available for purification of antibodies and HSA can easily be chemically coupled to media to provide the second matrix.
This method is especially advantageous when there is a high demand on purity of the recovered target protein. The bifunctionality of the tag allows two different chromatographic steps to be used while the metabolic burden on the expression host is limited due to the small size of the tag. It provides a competitive alternative to so called combinatorial tagging where multiple tags are used in combination1,7.

A novel and highly efficient two-step affinity chromatography protocol has been developed and is described in detail. The method is based on a small purification tag with two inherent affinities and is applicable to a wide range of target proteins with different properties.

작은 Bispecific 선호도 태그에 의해 용이 직교 단백질 정제

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

Identification and Characterization of Protein Glycosylation using Specific Endo- and Exoglycosidases

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes such as cell adhesion, molecular trafficking, clearance, and signal transduction1-4. In eukaryotes, the most common glycosylation modifications in the secretory pathway are additions at consensus asparagine residues (N-linked); or at serine or threonine residues (O-linked) (Figure 1). Initiation of N-glycan synthesis is highly conserved in eukaryotes, while the end products can vary greatly among different species, tissues, or proteins. Some glycans remain unmodified ("high mannose N-glycans") or are further processed in the Golgi ("complex N-glycans"). Greater diversity is found for O-glycans, which start with a common N-Acetylgalactosamine (GalNAc) residue in animal cells but differ in lower organisms1.
The detailed analysis of the glycosylation of proteins is a field unto itself and requires extensive resources and expertise to execute properly. However a variety of available enzymes that remove sugars (glycosidases) makes possible to have a general idea of the glycosylation status of a protein in a standard laboratory setting. Here we illustrate the use of glycosidases for the analysis of a model glycoprotein: recombinant human chorionic gonadotropin beta (hCG&beta;), which carries two N-glycans and four O-glycans 5. The technique requires only simple instrumentation and typical consumables, and it can be readily adapted to the analysis of multiple glycoprotein samples.
Several enzymes can be used in parallel to study a glycoprotein. PNGase F is able to remove almost all types of N-linked glycans6,7. For O-glycans, there is no available enzyme that can cleave an intact oligosaccharide from the protein backbone. Instead, O-glycans are trimmed by exoglycosidases to a short core, which is then easily removed by O-Glycosidase. The Protein Deglycosylation Mix contains PNGase F, O-Glycosidase, Neuraminidase (sialidase), &beta;1-4 Galactosidase, and &beta;-N-Acetylglucosaminidase. It is used to simultaneously remove N-glycans and some O-glycans8 . Finally, the Deglycosylation Mix was supplemented with a mixture of other exoglycosidases (&alpha;-N-Acetylgalactosaminidase, &alpha;1-2 Fucosidase, &alpha;1-3,6 Galactosidase, and &beta;1-3 Galactosidase ), which help remove otherwise resistant monosaccharides that could be present in certain O-glycans.
SDS-PAGE/Coomasie blue is used to visualize differences in protein migration before and after glycosidase treatment. In addition, a sugar-specific staining method, ProQ Emerald-300, shows diminished signal as glycans are successively removed. This protocol is designed for the analysis of small amounts of glycoprotein (0.5 to 2 &mu;g), although enzymatic deglycosylation can be scaled up to accommodate larger quantities of protein as needed.

Using specific glycosidases to remove sugars from glycoproteins followed by SDS-PAGE is a valuable method to detect glycan modifications on protein samples and is a good choice for initial glycobiology studies. Changes following deglycosylation can be detected as shifts in gel mobility or by staining with glycan sensitive reagents.

특정 엔도와 exoglycosidases를 사용하여 단백질 글리코 실화의 식별 및 특성

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

의 단백질 단지의 식별<em&gt; 대장균</em&gt; 직렬 질량 분석법과 함께 순차적 펩타이드의 동질 정화를 사용하여

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in current research and a plethora of methods for their investigation is available1. Protein-protein interactions often are highly dynamic and may depend on subcellular localization, post-translational modifications and the local protein environment2. Therefore, they should be investigated in their natural environment, for which co-immunoprecipitation approaches are the method of choice3. Co-precipitated interaction partners are identified either by immunoblotting in a targeted approach, or by mass spectrometry (LC-MS/MS) in an untargeted way. The latter strategy often is adversely affected by a large number of false positive discoveries, mainly derived from the high sensitivity of modern mass spectrometers that confidently detect traces of unspecifically precipitating proteins. A recent approach to overcome this problem is based on the idea that reduced amounts of specific interaction partners will co-precipitate with a given target protein whose cellular concentration is reduced by RNAi, while the amounts of unspecifically precipitating proteins should be unaffected. This approach, termed QUICK for QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown4, employs Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC)5 and MS to quantify the amounts of proteins immunoprecipitated from wild-type and knock-down strains. Proteins found in a 1:1 ratio can be considered as contaminants, those enriched in precipitates from the wild type as specific interaction partners of the target protein. Although innovative, QUICK bears some limitations: first, SILAC is cost-intensive and limited to organisms that ideally are auxotrophic for arginine and/or lysine. Moreover, when heavy arginine is fed, arginine-to-proline interconversion results in additional mass shifts for each proline in a peptide and slightly dilutes heavy with light arginine, which makes quantification more tedious and less accurate5,6. Second, QUICK requires that antibodies are titrated such that they do not become saturated with target protein in extracts from knock-down mutants.
Here we introduce a modified QUICK protocol which overcomes the abovementioned limitations of QUICK by replacing SILAC for 15N metabolic labeling and by replacing RNAi-mediated knock-down for affinity modulation of protein-protein interactions. We demonstrate the applicability of this protocol using the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii as model organism and the chloroplast HSP70B chaperone as target protein7 (Figure 1). HSP70s are known to interact with specific co-chaperones and substrates only in the ADP state8. We exploit this property as a means to verify the specific interaction of HSP70B with its nucleotide exchange factor CGE19.

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

We present a variation of the QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown) approach that was introduced previously to distinguish between true and false protein-protein interactions. Our approach is based on 15N metabolic labeling, the modulation of affinities of protein-protein interactions by the presence/absence of ATP, immunoprecipitation, and quantitative mass spectrometry.

을 바탕으로 단백질 - 단백질 상호 작용의 확인에 프로토콜<sup&gt; 15</sup&gt; N 신진 대사 라벨링, Immunoprecipitation, 수량 질량 분석법 및 선호도 변조

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

선호도 태그 재조합 단백질의 높은 처리량 정화

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. Protein purification protocols should combine efficiency, simplicity and cost effectiveness1. Here, we describe the GST-His method as a new small-scale affinity purification system for recombinant proteins, based on a N-terminal Glutathione Sepharose Tag (GST)2,3 and a C-terminal 10xHis tag4, which are both fused to the protein of interest. The latter construct is used to generate baculoviruses, for infection of Sf9 infected cells for protein expression5. GST is a rather long tag (29 kDa) which serves to ensure purification efficiency. However, it might influence physiological properties of the protein. Hence, it is subsequently cleaved off the protein using the PreScission enzyme6. In order to ensure maximum purity and to remove the cleaved GST, we added a second affinity purification step based on the comparatively small His-Tag. Importantly, our technique is based on two different tags flanking the two ends of the protein, which is an efficient tool to remove degraded proteins and, therefore, enriches full-length proteins. The method presented here does not require an expensive instrumental setup, such as FPLC. Additionally, we incorporated MgCl2 and ATP washes to remove heat shock protein impurities and nuclease treatment to abolish contaminating nucleic acids. In summary, the combination of two different tags flanking the N- and the C-terminal and the capability to cleave off one of the tags, guaranties the recovery of a highly purified and full-length protein of interest.

In the present protocol, we demonstrate a highly efficient and cost-effective small-scale protein purification method, which allows purification of recombinant proteins by uniquely combining a cleavable GST-tag and a small His-tag.

GST - 그의 정화 : 전체 길이 정제 된 단백질을 항복 2 단계 친화력 정화 프로토콜

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

미세 규모 Thermophoresis에 의한 결합력 결정 단백질 정제 - 무료 방법

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...