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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren. Der Autor, Witold Szymanski ist ein Mitarbeiter des Max-Planck-Institut für Molekulare Pflanzenphysiologie. Der Autor, ist Waltraud Schulze Mitarbeiter an der Universität Hohenheim, Deutschland.

Die in diesem Papier Protokoll enthält viele Schritte und alle von ihnen entscheidend für reine und Vertreter Fraktionierung der Plasmamembran Anlage in Waschmittel beständig Membranen und Reinigungsmittel lösliche Fraktionen zu erhalten sind. Daher ist es wichtig, jeden Schritt zu folgen, wie angewiesen. Behandlung der Plasmamembranfraktion mit nicht-ionischen Detergens (Schritt 3.2) den stärksten Einfluss auf die Qualität der Membran Mikrodomänen Fraktionierung. Um reproduzierbare Ergebnisse zwischen verschiedenen Präparationen zu erhalten, und um verschiedene Proben aus dem gleichen Experiment vergleichen zu können, ist es sehr wichtig, genau zu ermitteln, die Konzentration der Proteine ​​in der Plasmamembran und das Reinigungsmittel immer in der gleichen Verhältnis in Bezug auf Proteingehalts und immer auf die gleiche Endkonzentration. Praktisch bedeutet dies, daß es manchmal notwendig ist, um Proben mit einem hohen Proteinkonzentration zu verdünnen oder unterschiedlicher Konzentration verwendet BeständeTriton X-100. In biochemischen Untersuchungen, vor kurzem gab es eine Tendenz unter den Forschern, ein Reinigungsmittel-freie Methode zur Isolierung von Membranmikrodomänen 28-30 zu verwenden. Diese Verfahren beruhen auf einer mechanischen Störung der Plasmamembran durch Scherung durch einen sehr kleinen Nadel in Analogie zu der Druckzelle Französisch Maschine zu schaffen. Diese Verfahren wurden erfolgreich in Säugerzellkulturen, die reich an Mikrodomänen angewendet, aber Anwendung auf Zellwand enthaltenden Organismen (Hefe, Pflanzenzellen) wurde nicht berichtet. Verwendung der quantitativen Proteomik mit Sterol-störenden Mittel, wie Methyl-beta-cyclodextrin wurde gezeigt, dass die DRM-Fraktionen von Pflanzenplasmamembran hergestellt enthalten Proteine, die Marker für die Membran-Mikrodomänen 11. Die endgültigen Ergebnisse der massenspektrometrischen Quantifizierung, die in Fig. 6 gezeigte typische Ergebnisse stellen die ideale Situation, indie die Ionenintensität für die Mehrzahl der markierten und unmarkierten Peptiden nahe identisch. Jedoch kann in einigen Fällen ein gewisses Maß an biologischer Unterschiede zwischen den Sets von markierten und unmarkierten Zellkulturen beobachtet werden. Somit werden vor der biologischen Behandlung von entweder markiert oder unmarkiert Zellkultur durchgeführt wird, die Analyse eines Gemisches von markierten und unmarkierten Kontrollzellen, sowohl ohne jegliche Behandlung, ermöglicht die Identifizierung von Peptiden mit einem divergierenden Verhältnissen von der idealen 0.59 Situationen. Diese Proteine ​​mit divergierenden Verhältnisse gibt Hinweise für die biologische Variante. Um die Herausforderung der Scheidungsbehandlungseffekte aus biologischen Variation zu überwinden, deshalb schlagen wir vor, um die wechselseitige Etikettierung in gepaarten Experimenten 20 zu verwenden. Im reziproken Versuchsaufbau sind beide Varianten des Experiments durchgeführt, wie in Fig. 1 vorgeschlagen, und die Schritte des Protokolls sind, wie beschrieben, gefolgt. Dann Vergleichen der Ionenintensitätsverhältnis von proteins von beiden reziproken Experimenten kann man unterscheiden, ob die Unterschiede zwischen den Ionenintensitätsverhältnisse aufgrund biologischer Variation oder als eine Wirkung der Behandlung angewendet werden. Ein weiteres Verfahren zur Lösung des Problems Differenzierung Behandlungswirkungen und biologischen Variation ist die Verwendung eines internen markierten Standards als Referenz für alle Behandlungen 31. In diesem Ansatz werden unmarkierte Kontrolle und unmarkierten Zellen, die biologische Behandlung zu unterziehen mit der gleichen Menge von Schwer markierten Kontroll-Zellen vermischt, die aus der gleichen Charge. Es ermöglicht, den Einfluß von biologischen Variation Peptidverhältnis, denn Proteine ​​werden als signifikant angesehen, wenn Ionenintensitätsverhältnis von 14 N-Kontrolle / 15 N-Kontroll-und 14 N-Behandlung / 15 N-Kontrolle signifikant unterschiedlich sind. Dies ist möglich, da die markierten Standards ist genau das gleiche in allen Fällen. Einer der drawbacks der hier beschriebenen DRM Anreicherungsverfahren sind die Co-Reinigung von Proteinen, die in der Waschmittelbeständigen Membranfraktion identifiziert werden können. In der Liste der Proteine ​​aus dem Low-Density-Detergenz-resistenten Membranfraktion identifiziert, können wir beobachten, regelmäßig eine Vielzahl von ribosomalen Proteinen. Aufgrund der relativ geringen Dichte der ribosomalen Proteine ​​wandern sie in der gleichen Fraktion als Sterol abhängige Membranproteine ​​im Saccharosegradienten. Es war ohne Zweifel, dass die ribosomale Proteine ​​sind eindeutig nicht Bestandteile der Membranmikrodomänen 11 gezeigt. Um diese und andere Co-Reinigung von Proteinen und nicht wirklich mit der detergensbeständige niedriger Dichte Membranfraktionen ausgeschlossen wird, schlagen wir vor, die Proteom-Analyse auch die Zusammensetzung der intrazellulären Membranen (IM), die von der unteren Phase aus dem Dextran-Zwei extrahiert werden kann, Phasensystem und die Häufigkeitsverhältnisse von mutmaßlichen Verunreinigungen zwischen der inneren Membran und der DRM vergleichenFraktion (siehe Beispiele in Abb. 5). DRM-co-Reinigung von Proteinen sollten ähnliche Häufigkeiten haben in beiden Fraktionen (IM-und DRM). Fraktionierung von Zellextrakten und Membranmikrodomänen ist eine gemeinsame Strategie, um die Komplexität in einer Probe für Proteomanalyse 32 zu reduzieren. Daher ist die hier beschriebene Protokoll nützlich für alle Studien von Signalprozessen in der Plasmamembran von Pflanzenzellen. Biologische Anwendungen sind bei der Untersuchung Stressreaktionen sowie Pathogen-Infektionen, die alle zu einem großen Teil Veränderungen in der Plasmamembranzusammensetzung und Modifikation von Membranproteinen 14,15 induzieren. Neben dem Studium Stressreaktionen kann die Quantifizierung von Proteinhäufigkeiten in verschiedenen Membranfraktionen große Hilfe Annotation von noch unbekannten Proteinen 33 34,35.

Im Jahr 1972, Jonathan Singer und Garth Nicolson schlug die Flüssig-Mosaik-Modell ein Strukturmodell von Zellmembranen, anstelle der Protein-Lipid-Protein-Sandwich-Modell, das in der Regel in den frühen 1960er Jahren angenommen wurde. Singer und Nicolson postuliert, dass die biologische Membran kann als eine zweidimensionale Flüssigkeit in dem alle Lipid-und Protein-Moleküle frei und leicht diffundieren 5 betrachtet werden. Seit dieser Zeit Strukturmodell der Plasmamembran und der Kenntnis der Membranzusammensetzung wurde noch komplexer. Insbesondere in der Plasmamembran-Strukturen, wie Protein-und Lipidkomplexe / Sterol basierend strukturell ungeordnete Mikrodomänen beobachtet werden. In künstlichen Modellmembranen 6,7 kann Sterole und Sphingolipide seitlich von anderen Lipidarten zu trennen, um Bereiche mit veränderten physikalischen Eigenschaften bilden. Diese Trennung innerhalb der Zellmembran wird hauptsächlich durch die Eigen Zuordnen Eigenschaften zwischen Sterole und einen hoch verursachtturated Kohlenwasserstoffketten phopsho-und Sphingolipide 8. Insbesondere die starren Sterin Ringe begünstigen Wechselwirkungen mit steifer und gerader gesättigten Lipidspezies und diese Wechselwirkungen zwingen benachbarten Kohlenwasserstoffketten in mehr verlängert Konformationen, die Erhöhung der Membrandicke und Härte. Eine der häufigsten beobachteten Merkmale Terinmembrandomänen war ihrer Unlöslichkeit bei Behandlung mit nicht-ionischen Detergenzien, wie Triton X-100 und Brij 35. Diese Fraktionen wurden vermutlich identisch mit Membran-Mikrodomänen und wurden Reinigungsmittel resistente Membranen (DRM) genannt auf der Grundlage ihrer biochemischen Herstellungsverfahren 2. Die Verwendung von nichtionischen Reinigungsmitteln während der DRM-Extraktion erhielt einige Kritik als die biochemische DRM Zubereitung kann nicht direkt an spezifische Membranraum innerhalb der lebenden Zelle 9 entsprechen. Insbesondere scheint das Detergens zu Protein-Verhältnis von entscheidender Bedeutung in solchen Zubereitungen eins verschiedene Reinigungsmittel, sowie verschiedene Reinigungs Mengen können unterschiedliche Zusammensetzung der Reinigungsmittel beständig Membranfraktion 10 ergeben. Es gibt jedoch Hinweise darauf, dass bestimmte Proteinspezies spezifisch zu assoziieren mit diesen zellulären sterolreichen Membrandomänen, und daß diese Proteine ​​auch in der biochemischen Präparaten von Detergenz-resistenten Membranfraktionen 11 angereichert. Der Kern von Proteinen, die in Pflanzen DRM-Fraktion gefunden wurden, und bei denen die Anwesenheit in DRM war Sterol abhängig waren besonders GPI-verankerte Proteine, wie Fasciclin artigen Arabinogalactan-Proteine ​​(FLA) und Mitglieder der SKU-Proteinfamilie. Auch einige Signalproteine, wie Rezeptor-like Kinasen oder Phospholipasen gefunden 11. Diese Ergebnisse sind konsistent mit vielen proteomischen Untersuchungen an Säugermembrandomänen 12,13. Auch bei Pflanzen gibt es immer mehr Hinweise auf die Rolle von Membran-Mikrodomänen in Zusammenhang mit Stress-Reaktion 14 -16. Das hier beschriebene Protokoll bietet ein robustes Verfahren zur Fraktionierung von Plasmamembran-Mikrodomänen und insbesondere ein Protein verwendet, um Reinigungsmittelkonzentration, die uns Stress induzierte Veränderungen des sterolreichen Membrankompartiment 4,11,14 darstellen kann.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals were ordered from Sigma-Aldrich unless noted otherwise</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonia (stock 25 % solution)</td>
			<td>WAKO</td>
			<td>010-03166</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TiO2 10 &mu;m</td>
			<td>GL-Science</td>
			<td>5020-75010</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empore Disk C18</td>
			<td>Varian</td>
			<td>12145004</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol(PEG 3350)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>88276</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran T500</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9219.2</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5113</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail (PIC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9599</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K15NO3</td>
			<td>Cambridge Isotope Laboratories</td>
			<td>NLM-765-PK</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima L-80 XP Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASY-nLC II nano-Liquid Chromatograph</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LTQ-Orbitrap mass spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5417R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speed Vac RVC 2-25</td>
			<td>Christ</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker Unimax 2010</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

metabolic labeling and membrane fractionation for comparative proteomic analysis of arabidopsis thaliana suspension cell cultures

Plasmamembran-Mikrodomänen sind Funktionen, basierend auf den physikalischen Eigenschaften der Lipid-Sterol-und Umwelt und haben bestimmte Rollen in Signalprozessen. Extrahieren Sterol angereicherte Membrandomänen von Pflanzenzellen zur Proteom-Analyse ist eine schwierige Aufgabe, vor allem aufgrund von mehreren Vorbereitungsschritte und Quellen für Verunreinigungen von anderen zellulären Kompartimenten. Die Plasmamembran bildet nur etwa 5-20% aller Membranen in einer Pflanzenzelle, und daher Trennung von hoch gereinigten Plasmamembranfraktion ist eine Herausforderung. Ein häufig verwendetes Verfahren beinhaltet wässrigen Zweiphasentrennung in Polyethylenglykol und Dextran, das Plasmamembran-Vesikel mit einer Reinheit von 95% 1 ergibt. Sterol-reichen Membranmikrodomänen in der Plasmamembran unlöslich sind bei der Behandlung mit kaltem nichtionische Detergentien bei alkalischen pH-Wert. Dieser Detergenz-resistenten Membranfraktion aus dem Großplasmamembran durch Ultrazentrifugation getrennt werden, wie inucrose Steigung 2. Anschließend kann Proteine ​​aus der geringen Dichte Band des Saccharose-Gradienten von Methanol / Chloroform Fällung extrahiert werden. Extrahierte Protein wird dann Trypsin gespalten werden, entsalzt und schließlich durch LC-MS/MS analysiert. Unsere Extraktionsprotokoll für Sterol-reiche Mikrodomänen wird zur Herstellung von sauberen Detergenz-resistenten Membranfraktionen aus Arabidopsis thaliana Zellkulturen optimiert. Wir verwenden vollständige metabolische Markierung von Arabidopsis thaliana Suspensionszellkulturen, die mit K 15 NO 3 als einzige Stickstoffquelle für die quantitative Proteomik vergleichende Studien nach der biologischen Behandlung von Zins 3. Durch Mischen gleicher Verhältnisse von markierten und unmarkierten Zellkulturen für die gemeinsame Proteinextraktion der Einfluss der Herstellungsschritte auf die endgültige quantitative Ergebnis wird auf einem Minimum gehalten. Auch Materialverlust während der Extraktion werden die beiden Kontroll-und Behandlungs Proben in der gleichen Weise einen Einflussd daher das Verhältnis von Licht und heben Peptid konstant. Bei dem vorgeschlagenen Verfahren entweder markiert oder unmarkiert Zellkultur erfährt eine biologische Behandlung, die andere dient als Steuer 4.

Mit der vorgestellten Protokoll mit metabolisch markierten Arabidopsis-Zellkulturen ist es möglich, die Plasmamembranen aus Pflanzengewebe (Schritt 2, Fig. 2 und 4) zu isolieren und anzureichern Waschmittel beständig Membranfraktionen innerhalb der Plasmamembran (Schritt 3, Fig. 3 und 5). Anschließend kann das Protokoll Extraktion von Proteinen aus diesen Waschmittel beständig Membranfraktionen (Schritt 4) und die Verdauung des Proteins für die vergleichende Proteomik-Analyse (Schritt 5). Schließlich ist die optionale Anreicherung von Phosphopeptiden (Schritt 8) besonders interessant bei der Untersuchung zellulärer Signalprozesse. Der letzte Schritt ist dann die quantitative Datenanalyse (Schritt 9, Abbildung 6) von Protein Häufigkeitsverhältnisse in Membranfraktionen von markierten und unmarkierten Zellkultur. Typische Ergebnisse nach dem Mischen der 2-Phasen-System (Schritt 2) und anschließender Zentrifugation sind eine klare gefärbte obere Phase und einegrün gefärbt untere Phase (Abbildung 2). Plasmamembranvesikel bevorzugt assoziieren mit der oberen PEG-Phase, während Vesikeln aus grünen Chloroplasten und andere Innen Membranen werden in den unteren Dextran-Phase eingearbeitet. Wenn die Farbtrennung nicht beobachtet werden kann, Schritt 2, wurde nicht korrekt durchgeführt, und die Plasmamembranen werden mit erheblichen Mengen von inneren Membranen kontaminiert werden. Anreicherung von Plasmamembran-Proteine ​​durch proteomische Analyse von kleinen Aliquots der Plasmamembranfraktionen und Proteine ​​in der unteren Phase des Zweiphasensystems angezeigt. Die untere Phase enthält die innere Membran der Zelle. Beispielsweise besonders typischen bekannten Plasmamembranproteinen, wie Rezeptor-Kinase-Proteine ​​zeigten eine hohe Häufigkeit in der Plasmamembranfraktion (PM) und geringer Häufigkeit in der unteren Phase Fraktion (4A), die die innere Membran (IM). Im Gegenzug bekannten Proteinen des endoplasmatischen Retikulum zeigen hoheFülle in der inneren Membran-Fraktion und wurden nicht in die Plasmamembranfraktion (4B) beobachtet. Die anschließende Anreicherung von detergensbeständige Membranfraktionen (Schritt 3) wird im Idealfall führen zur Bildung einer milchigen Ring von niedriger Dichte Membranvesikel bei etwa 1/5 der Rohrhöhe (Fig. 3). Wenn die Verstellung des Triton X-100-Konzentrationen oder die Waschmittel Protein-Verhältnis (Schritt 3.2) optimal für die Trennung in Waschmittel-und Reinigungsmittel beständig löslichen Fraktionen können zusätzliche Ringe in unteren Teilen des Gradienten beobachtet, und es wird auch Membran Klumpen sein in der geringen Dichte Band. In diesen Fällen ist die Reinigungsmittel auf Protein-Verhältnis oder gesamte Waschmittelmenge verschieden von der kritischen Mizellenkonzentration, die für reproduzierbare Trennung der beiden Membrandomäne Fraktionen. Mit der abschließenden Reinigungsmittel-Konzentration und Reinigungsmittel, um Protein-Verhältnis beschrieben hier, Enrichment von typischen Mikrodomänenproteine ​​wie Remorin (AT3G61260) 27 könnte durch eine vergleichende massenspektrometrische Analyse von DRM-Fraktion, Reinigungsmittel lösliche Fraktion (Schritt 3.8) sowie fraktionierten Plasmamembran und der internen Membranen bestätigt werden. Höchste Fülle von Remorin-Protein wurde in Fraktionen gefunden DRM wie erwartet (Fig. 6A). Proteine, die nicht in den Membranmikrodomänen, wie zB die ABC-Transporter AT1G59870 (6B) vorhanden, nicht eine erhöhte Häufigkeit in der DRM-Fraktion zu zeigen. Auch typische Verunreinigungen, wie eine mitochondriale Protein (AT2G07707) von der ATPase-F0-Komplex (6C) und ribosomalen Protein (At1G001100) von der 60S Ribosomen (6D) nicht eine angereicherte Hülle und Fülle in der DRM-Fraktion zeigen, wenn auch minimale Mengen können noch identifiziert werden. Nach der massenspektrometrischen Analyse-, Protein-Häufigkeiten Verhältnisse von Protein-Phosphorylierung im PlasmaMembranfraktionen von markierten und nicht markierten Zellkulturen quantitativ unterscheiden (Abbildung 6). Typische Ergebnisse aus der MSQuant ( <a href="http://msquant.sourceforge.net/" target="_blank">msquant.alwaysdata.net</a> ) Quantifizierung Fenster sollte eine Ionenintensitätsverhältnis von eins zu eins für die meisten der identifizierten Peptide (Fig. 6A) angezeigt. Diese Peptide mit Ionenintensitätsverhältnis erheblich von 1:1 abweichende gelten als Differenz zwischen dem markierten und unmarkierten Zellkultur geregelt und sind Kandidaten für die Anpassung an Proteinen, die durch die angelegte (6C)-Behandlung beeinflusst. Ein guter Qualitätskontrolle erfolgreich metabolische Markierung ist die Co-Elution von sowohl markiertem und unmarkiertem Peptid Versionen als einzelner Peak in der Nano-HPLC-Trennung (Schritt 9), wie in den 6B und D gezeigt. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/50535/50535fig1.jpg"/&gt; Fig. 1 ist. Metabolische Markierung experimentelle Strategie. Schematische Darstellung von zwei Varianten der Versuchsplanung, wenn Sie voll Stoffwechsel markierten und unmarkierten A. thaliana Zellkulturen. Der Experimentator kann entweder entscheiden, 14 N-Zellen (unbenannt) als Steuerungs-und 15 N-Zellen (metabolisch markierten), die biologische Behandlung unterziehen oder umgekehrt zu verwenden. In einem experimentellen Design gegenseitige beide Varianten werden parallel durchgeführt. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5.25in" fo:src="/files/ftp_upload/50535/50535fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50535/50535fig2.jpg" /> 2. Workflow zur Trennung von Pflanzen Membranvesikel einer wäßrigen Zweiphasensystem auf Basis von Polyethylenglykol (PEG) und Dextran. Plasmamembran-Vesikel in die obere Phase abgetrennt, während PEG Chloroplast und andere Innenmembranen mit dem zugehörigen Bottom Dextran-Phase nach dem Zentrifugieren. Mit zusätzlichen Waschen der oberen Phase besser Reinigung erreicht werden, aber auch Materialverlust erhöht. <img alt="Fig. 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50535/50535fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50535/50535fig3.jpg" /> 3. Anreicherung von Low-Density-Membranfraktionen. Darstellung der Saccharose-Gradienten für die Anreicherung von Low-Density-Reinigungsmittel beständig Membranfraktionen. Die zu erwartende Lage nach der Zentrifugation über Nacht der geringen Dichte Membranvesikels Band angezeigt. <img alt="Fig. 4" fo:content-width="4.25in" fo:src="/files/ftp_upload/50535/50535fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50535/50535fig4.jpg" /> 4. Anreicherung von Plasmamembranproteinen nach der Reinigung in Zweiphasensystem. NormalizedProteinionenintensitäten für Proteine ​​in der Plasmamembran (PM) und innere Membran (IM)-Fraktion gemessen. (A) Typische bekannte Bestandteile der Plasmamembran eine deutlich höhere Menge in PM Fraktion als IM-Fraktion. (B) Natur bekannten Komponenten der internen Membranen zeigt das entgegengesetzte Verhalten. Zur Normalisierung wurden Ionenintensität Summen für jedes Protein als ein Teil der Gesamtionenstärke pro Probe ausgedrückt und dann gemittelt zwischen Wiederholungen. Bruchteil der gesamten Ionenintensitäten wurden dann als relativ zum Mittelwert zwischen den zwei Behandlungen ausgedrückt. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung der drei Präparate aus unabhängig voneinander gewachsen Zellkulturen. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50535/50535fig4large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <img alt="Figur 5" fo:content-width="5.6in" fo:src="/files/ftp_upload/50535/50535fig5highres.jpg" src = &quot;/ files/ftp_upload/50535/50535fig5.jpg&quot; /&gt; 5. . Fülle von Standard-Proteinmarker gemessen Fraktionen innerhalb Stücke stellen die Verteilung der normalisierten Proteinionenintensitäten ausgewählter Proteinmarker auf bestimmte subzellulärer Kompartimente (DRM - sterolreichen Mikrodomänen, PM - Plasmamembran, IM - interne Membranen, SP - lösliche Proteine). Fülle-Muster von (A) Remorin als Marker für sterolreichen Membranmikrodomänen, (B) ABC-Transporter-Familie Typ-Protein als Vertreter einer nicht Sterin-abhängige Protein, (C)-Untereinheit der mitochondrialen F0-Komplex, (D) 60S -Untereinheit der Ribosomen als typische Co-Reinigung von Verunreinigungen. Zur Normalisierung wurden Ionenintensität Summen für jedes Protein als ein Teil der Gesamtionenstärke pro Probe ausgedrückt und dann gemittelt zwischen Wiederholungen. Bruchteil der gesamten Ionenintensitäten wurden dann wie in bezug auf die mittlere zwischen den beiden trea ausgedrückttments. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung der drei Präparate aus unabhängig voneinander gewachsen Zellkulturen. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50535/50535fig5large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <img alt="Fig. 6" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50535/50535fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50535/50535fig6.jpg" /> 6. Erwartete Ergebnisse der quantitativen Protein-Massenspektrometrie. Screenshot von MSQuant der die erwartete 1.01 Ionenintensitätsverhältnis eines Peptids aus einer 1:1-Mischung von Proteinextrakten aus markierten und unmarkierten Arabidopsis-Zellen. (A) Full-Scan-Spektrum von Peptid DNNLLGK deutlich Abtrennen markierter (rechte Spitze) und unmarkierten (linker Peak) Version der Peptide auf der m / z-Achse. Die monoisotopischen Masse und das erste Isotop werden durch blaue Markierungen gekennzeichnet. (B) markierte (blau) eind unmarkierten (rot) Versionen des Peptids koeluieren als einzelner Peak bei Nano-HPLC-Chromatographie. (C) Full-Scan-Spektrum eines Peptids mit Ionenintensitätsverhältnis von 1:5 als ein Kandidat für ein differentiell regulierten Proteins. (D ) Auch Proteine ​​mit unterschiedlichen Verhältnissen von 1:1 koeluieren in Reversed-Phase Chromatographie. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50535/50535fig6large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> .

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Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Hier beschreiben wir ein robustes Verfahren für die Fraktionierung von pflanzlichen Plasmamembranen in Waschmittel-und Reinigungsmittel beständig löslichen Membranen auf der Basis einer Mischung von unmarkierten und in vivo vollständig 15 N markierten Arabidopsis thaliana Zellkulturen. Das Verfahren ist für die vergleichende Proteom-Studien angewendet, um Signalprozesse zu verstehen.

Metabolische Markierung und Membran Fraktionierung für Vergleichende Proteomanalyse von<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Fahrwerk Zellkulturen

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

metabolic-labeling-membrane-fractionation-for-comparative-proteomic

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

14.0K Aufrufe.  Max Plank Institute of Molecular Plant Physiology.  Hier beschreiben wir ein robustes Verfahren für die Fraktionierung von pflanzlichen Plasmamembranen in Waschmittel-und Reinigungsmittel beständig löslichen Membranen auf der Basis einer Mischung von unmarkierten und in vivo vollständig 15 N markierten Arabidopsis thaliana Zellkulturen. Das Verfahren ist für die vergleichende Proteom-Studien angewendet, um Signalprozesse zu verstehen. 

Serie: Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Immunoblot Analysis

Immunoblotting (western blotting) is a rapid and sensitive assay for the detection and characterization of proteins that works by exploiting the specificity inherent in antigen-antibody recognition. It involves the solubilization and electrophoretic separation of proteins, glycoproteins, or lipopolysaccharides by gel electrophoresis, followed by quantitative transfer and irreversible binding to nitrocellulose, PVDF, or nylon. The immunoblotting technique has been useful in identifying specific antigens recognized by polyclonal or monoclonal antibodies and is highly sensitive (1 ng of antigen can be detected). This unit provides protocols for protein separation, blotting proteins onto membranes, immunoprobing, and visualization using chromogenic or chemiluminescent substrates.

Immunoblotting (western blotting) is a rapid and sensitive assay for the detection and characterization of proteins that works by exploiting the specificity inherent in antigen-antibody recognition. This video provides protocols for protein separation, blotting proteins onto membranes, immunoprobing, and visualization using chromogenic or chemiluminescent substrates.

Immunoblot-Analyse

Immunoblotting (western blotting) is a rapid and sensitive assay for the detection and characterization of proteins that works by exploiting the ...

Forschung

Biologie

Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane biogenesis occurs rapidly and in an inducible manner. We have found that phagocytosis of latex beads is practical for these purposes as cells rapidly synthesize membrane lipids to replenish membrane pools lost as  wrapping material  during particle engulfment. Here, we describe procedures for studying changes in phagocytosis-induced gene expression with a luciferase-based reporter gene approach using the Dual-Glo  Luciferase Assay System from Promega.

Here, we describe procedures for studying changes in phagocytosis-induced gene expression with a luciferase-based reporter gene approach using the Dual-GloTM Luciferase Assay System from Promega.

Studieren Membrane Biogenesis mit einem Luciferase-Based Reporter Gene Assay

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane ...

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, moniliformin, etc... have adverse effects on both human and animal health and some are considered as pathogenicity factors. Proteomic studies showed to be effective for deciphering toxin production mechanisms (Taylor et al., 2008) as well as for identifying potential pathogenic factors (Paper et al., 2007, Houterman et al., 2007) in Fusaria. It becomes therefore fundamental to establish reliable methods for comparing between proteomic studies in order to rely on true differences found in protein expression among experiments, strains and laboratories. The procedure that will be described should contribute to an increased level of standardization of proteomic procedures by two ways. The filmed protocol is used to increase the level of details that can be described precisely. Moreover, the availability of standardized procedures to process biological replicates should guarantee a higher robustness of data, taking into account also the human factor within the technical reproducibility of the extraction procedure.
The protocol described requires 16 days for its completion: fourteen days for cultures and two days for protein extraction (figure 1). 
Briefly, Fusarium strains are grown on solid media for 4 days; they are then manually fragmented and transferred into a modified toxin inducing media (Jiao et al., 2008) for 10 days. Mycelium is collected by filtration through a Miracloth layer. Grinding is performed in a cold chamber. Different operators performed extraction replicates (n=3) in order to take into account the bias due to technical variations (figure 2). Extraction was based on a SDS/DTT buffer as described in Taylor et al. (2008) with slight modifications. Total protein extraction required a precipitation process of the proteins using Aceton/TCA/DTT buffer overnight and Acetone /DTT washing (figure 3a,3b). Proteins were finally resolubilized in the protein-labelling buffer and quantified. Results of the extraction were visualized on a 1D gel (Figure 4, SDS-PAGE), before proceeding to 2D gels (IEF/SDS-PAGE). The same procedure can be applied for proteomic analyses on other growing media and other filamentous fungi (Miles et al., 2007).

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Protein extraction for proteomic analyses in fungal species requires high levels of standardization to be accomplished according with the minimum information about a proteomic experiment (MIAPE) guidelines. We present a video-protocol that includes a procedure for minimizing experimental bias during toxin induction and protein extraction from Fusarium spp.

Toxin Induktions-und Protein-Extraktion aus Fusarium Spp. Kulturen für Proteom-Studien

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, ...

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&beta;-glucuronidase Reporter Gene Expression

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis thaliana, the floral-dip transformation method1-2 has replaced all previous methods because of its simplicity, efficiency, and low cost. Specifically, shoots of young flowering Arabidopsis plants are dipped in a solution of Agrobacterium tumefaciens carrying specific plasmid constructs. After dipping, the plants are returned to normal growth and yield seeds, a small percentage of which are transformed with the foreign gene and can be selected for on medium containing antibiotics. This floral-dip method significantly facilitated Arabidopsis research and contributed greatly to our understanding of plant gene function. In this study, we use the floral-dip method to transform a reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), under the control of TSO2 promoter. TSO2, coding for the Ribonucleotide Reductase (RNR) small subunit3, is a cell cycle regulated gene essential for dNDP biosynthesis in the S-phase of the cell cycle. Examination of GUS expression in transgenic Arabidopsis seedlings shows that TSO2 is expressed in actively dividing tissues. The reported experimental method and materials can be easily adapted not only for research but also for education at high school and college levels.

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&#946;-glucuronidase Reporter Gene Expression

This article illustrates the floral-dip method of Agrobacterium tumefaciens -mediated transformation of Arabidopsis thaliana. By introducing a cell-cycle regulated promoter-reporter, pTSO2::&beta;-glucuronidase (GUS), into Arabidopsis, we illustrates how one detects GUS reporter expression in transgenic seedlings.

Floral-dip Transformation von Arabidopsis thaliana Zum Untersuchen PTSO2: β-Glucuronidase Reporter Gene Expression

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis ...

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating cells. Cell cycle division is an integral part of growth and reproduction and deregulation of key cell cycle components have been implicated in the precipitating events of carcinogenesis 1,2. Molecular agents in anti-cancer therapies frequently target biological pathways responsible for the regulation and coordination of cell cycle division 3. Although cell cycle kinetics tend to vary according to cell type, the distribution of cells amongst the four stages of the cell cycle is rather consistent within a particular cell line due to the consistent pattern of mitogen and growth factor expression. Genotoxic events and other cellular stressors can result in a temporary block of cell cycle progression, resulting in arrest or a temporary pause in a particular cell cycle phase to allow for instigation of the appropriate response mechanism. 
The ability to experimentally observe the behavior of a cell population with reference to their cell cycle progression stage is an important advance in cell biology. Common procedures such as mitotic shake off, differential centrifugation or flow cytometry-based sorting are used to isolate cells at specific stages of the cell cycle 4-6. These fractionated, cell cycle phase-enriched populations are then subjected to experimental treatments. Yield, purity and viability of the separated fractions can often be compromised using these physical separation methods. As well, the time lapse between separation of the cell populations and the start of experimental treatment, whereby the fractionated cells can progress from the selected cell cycle stage, can pose significant challenges in the successful implementation and interpretation of these experiments.
Other approaches to study cell cycle stages include the use of chemicals to synchronize cells. Treatment of cells with chemical inhibitors of key metabolic processes for each cell cycle stage are useful in blocking the progression of the cell cycle to the next stage. For example, the ribonucleotide reductase inhibitor hydroxyurea halts cells at the G1/S juncture by limiting the supply of deoxynucleotides, the building blocks of DNA. Other notable chemicals include treatment with aphidicolin, a polymerase alpha inhibitor for G1 arrest, treatment with colchicine and nocodazole, both of which interfere with mitotic spindle formation to halt cells in M phase and finally, treatment with the DNA chain terminator 5-fluorodeoxyridine to initiate S phase arrest 7-9. Treatment with these chemicals is an effective means of synchronizing an entire population of cells at a particular phase. With removal of the chemical, cells rejoin the cell cycle in unison. Treatment of the test agent following release from the cell cycle blocking chemical ensures that the drug response elicited is from a uniform, cell cycle stage-specific population. However, since many of the chemical synchronizers are known genotoxic compounds, teasing apart the participation of various response pathways (to the synchronizers vs. the test agents) is challenging. 
Here we describe a metabolic labeling method for following a subpopulation of actively cycling cells through their progression from the DNA replication phase, through to the division and separation of their daughter cells. Coupled with flow cytometry quantification, this protocol enables for measurement of kinetic progression of the cell cycle in the absence of either mechanically- or chemically- induced cellular stresses commonly associated with other cell cycle synchronization methodologies 10. In the following sections we will discuss the methodology, as well as some of its applications in biomedical research.

Tracking subtle changes in the progression and kinetics of cell cycle stages can be accomplished by use of a combination of metabolic labeling of nucleic acids with BrdU and total genomic DNA staining via Propidium Iodide. This method avoids the need of chemical synchronization of cycling cells, thereby preventing the introduction of non-specific DNA damage, which in turn affects cell cycle progression.

Mess-Zellzyklus-Progression Kinetics mit Metabolische Markierung und Durchflusszytometrie

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the Arabidopsis leaf is a complex organ made up of many different cell types and several structures. At the same time, the growing leaf contains cells at different stages of development, with the cells furthest from the petiole being the first to stop expanding and undergo senescence1. Different cells within the leaf are therefore dividing, elongating or differentiating; active, stressed or dead; and/or responding to stimuli in sub-sets of their cellular type at any one time. This makes genomic study of the leaf challenging: for example when analyzing expression data from whole leaves, signals from genetic networks operating in distinct cellular response zones or cell types will be confounded, resulting in an inaccurate profile being generated.
To address this, several methods have been described which enable studies of cell specific gene expression. These include laser-capture microdissection (LCM)2 or GFP expressing plants used for protoplast generation and subsequent fluorescence activated cell sorting (FACS)3,4, the recently described INTACT system for nuclear precipitation5 and immunoprecipitation of polysomes6.
FACS has been successfully used for a number of studies, including showing that the cell identity and distance from the root tip had a significant effect on the expression profiles of a large number of genes3,7. FACS of GFP lines have also been used to demonstrate cell-specific transcriptional regulation during root nitrogen responses and lateral root development8, salt stress9 auxin distribution in the root10 and to create a gene expression map of the Arabidopsis shoot apical meristem11. Although FACS has previously been used to sort Arabidopsis leaf derived protoplasts based on autofluorescence12,13, so far the use of FACS on Arabidopsis lines expressing GFP in the leaves has been very limited4. In the following protocol we describe a method for obtaining Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with FACS while minimizing the impact of the protoplast generation regime. We demonstrate the method using the KC464 Arabidopsis line, which express GFP in the adaxial epidermis14, the KC274 line, which express GFP in the vascular tissue14 and the TP382 Arabidopsis line, which express a double GFP construct linked to a nuclear localization signal in the guard cells (data not shown; Figure 2). We are currently using this method to study both cell-type specific expression during development and stress, as well as heterogeneous cell populations at various stages of senescence.

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

A method for producing Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with fluorescence activated cell sorting (FACS), allowing for studies of specific cell populations. This method is compatible with any Arabidopsis line that expresses GFP in a subset of cells.

Zellspezifische Analyse<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Blätter mit Fluorescence Activated Cell Sorting

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a consequence, the isolation of plant embryos at early stages (1 cell to globular stage) is technically challenging due to their relative inaccessibility. Efficient manual dissection at early stages is strongly impaired by the small size of young Arabidopsis seeds and the adhesiveness of the embryo to the surrounding tissues. Here, we describe a method that allows the efficient isolation of young Arabidopsis embryos, yielding up to 40 embryos in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. Embryos are released into isolation buffer by slightly crushing 250-750 seeds with a plastic pestle in an Eppendorf tube. A glass microcapillary attached to either a standard laboratory pipette (via a rubber tube) or a hydraulically controlled microinjector is used to collect embryos from droplets placed on a multi-well slide on an inverted light microscope. The technical skills required are simple and easily transferable, and the basic setup does not require costly equipment. Collected embryos are suitable for a variety of downstream applications such as RT-PCR, RNA sequencing, DNA methylation analyses, fluorescence in situ hybridization (FISH), immunostaining, and reporter gene assays.

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

We report an efficient and simple method to isolate embryos at early stages of development from Arabidopsis thaliana seeds. Up to 40 embryos can be isolated in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. The procedure is suitable for transcriptome, DNA methylation, reporter gene expression, immunostaining and fluorescence in situ hybridization analyses.

Effiziente und schnelle Isolierung von Frühphasen-Embryonen aus<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

Metabolic Labeling of Leucine Rich Repeat Kinases 1 and 2 with Radioactive Phosphate

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are paralogs which share a similar domain organization, including a serine-threonine kinase domain, a Ras of complex proteins domain (ROC), a C-terminal of ROC domain (COR), and leucine-rich and ankyrin-like repeats at the N-terminus. The precise cellular roles of LRRK1 and LRRK2 have yet to be elucidated, however LRRK1 has been implicated in tyrosine kinase receptor signaling1,2, while LRRK2 is implicated in the pathogenesis of Parkinson's disease3,4. In this report, we present a protocol to label the LRRK1 and LRRK2 proteins in cells with 32P orthophosphate, thereby providing a means to measure the overall phosphorylation levels of these 2 proteins in cells. In brief, affinity tagged LRRK proteins are expressed in HEK293T cells which are exposed to medium containing 32P-orthophosphate. The 32P-orthophosphate is assimilated by the cells after only a few hours of incubation and all molecules in the cell containing phosphates are thereby radioactively labeled. Via the affinity tag (3xflag) the LRRK proteins are isolated from other cellular components by immunoprecipitation. Immunoprecipitates are then separated via SDS-PAGE, blotted to PVDF membranes and analysis of the incorporated phosphates is performed by autoradiography (32P signal) and western detection (protein signal) of the proteins on the blots. The protocol can readily be adapted to monitor phosphorylation of any other protein that can be expressed in cells and isolated by immunoprecipitation.

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are multidomain proteins which encode both GTPase and kinase domains and which are phosphorylated in cells. Here, we present a protocol to label LRRK1 and LRRK2 in cells with 32P orthophosphate, thereby providing a means to measure their overall cellular phophorylation levels.

Metabolische Markierung von Leucin Rich-Repeat-Kinasen 1 und 2 mit radioaktivem Phosphat

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are paralogs which share a similar domain organization, including a serine-threonine kinase domain, ...

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex composition under different conditions. In this protocol the approach is demonstrated by comparing the composition of the protein complex responsible for cyclic electron flow (CEF) in Chlamydomonas reinhardtii, isolated from genetically different strains. The procedure comprises the isolation of thylakoid membranes, followed by their separation into multiprotein complexes by sucrose density gradient centrifugation, SDS-PAGE, immunodetection and comparative, quantitative mass spectrometry (MS) based on differential metabolic labeling (14N/15N) of the analyzed strains. Detergent solubilized thylakoid membranes are loaded on sucrose density gradients at equal chlorophyll concentration. After ultracentrifugation, the gradients are separated into fractions, which are analyzed by mass-spectrometry based on equal volume. This approach allows the investigation of the composition within the gradient fractions and moreover to analyze the migration behavior of different proteins, especially focusing on ANR1, CAS, and PGRL1. Furthermore, this method is demonstrated by confirming the results with immunoblotting and additionally by supporting the findings from previous studies (the identification and PSI-dependent migration of proteins that were previously described to be part of the CEF-supercomplex such as PGRL1, FNR, and cyt f). Notably, this approach is applicable to address a broad range of questions for which this protocol can be adopted and e.g. used for comparative analyses of multiprotein complex composition isolated from distinct environmental conditions.

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The described comparative, quantitative proteomic approach aims at obtaining insights into the composition of multiprotein complexes&#160;under different conditions and is demonstrated by comparing genetically different strains. For quantitative analysis equal volumes of different fractions from a sucrose density gradient are mixed and analyzed by mass spectrometry.

Ein neuer Ansatz für die vergleichende Analyse von Multiproteinkomplexen Basierend auf<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabolische Markierung und quantitative Massenspektrometrie

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex ...

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively in the study of secondary cell wall formation. Secondary cell wall deposition occurs after the primary cell wall is laid down, a process carried out exclusively by specialized cells such as those forming vessel and fiber tissues. Most secondary cell walls are composed of cellulose (40&#8211;50%), hemicellulose (25&#8211;30%), and lignin (20&#8211;30%). Several mutations affecting secondary cell wall biosynthesis have been isolated, and the corresponding mutants may or may not exhibit obvious biochemical composition changes or visual phenotypes since these mutations could be masked by compensatory responses. Staining procedures have historically been used to show differences on a cellular basis. These methods are exclusively visual means of analysis; nevertheless their role in rapid and critical analysis is of great importance. Congo red and calcofluor white are stains used to detect polysaccharides, whereas M&#228;ule and phloroglucinol are commonly used to determine differences in lignin, and toluidine blue O is used to differentially stain polysaccharides and lignin. The seemingly simple techniques of sectioning, staining, and imaging can be a challenge for beginners. Starting with sample preparation using the A. thaliana model, this study details the protocols of a variety of staining methodologies that can be easily implemented for observation of cell and tissue organization in secondary cell walls of plants.

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Plant cell wall composition varies between tissue types and can include lignin, cellulose, hemicelluloses, and pectin. Various staining techniques have been developed to visualize differences at the cell-type level. This paper is a compilation of commonly used cell wall staining techniques.

Histochemische Färbung von<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Sekundärzellwand-Elemente

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively ...