1. 텔로미어 길이 프로토콜 19 <ol><li> DNA 분리 </li></ol> 대부분의 DNA 분리 방법을 사용할 수 있습니다. 우리 실험실은 혈액 소스에 Qiagen의 DNeasy의 키트 (# 69506)를 선호한다. 같은 구강이나 다른 소스로 DNA의 소스에 따라 다른 분리 방법을 사용할 수 있습니다. <ol start="2"><li> 프라이머 : </li></ol> 모든 프라이머는 PCR 등급 물 100pmoles/μl의 재고 농도로 희석하고 필요한 때까지 -20 ° C에 저장됩니다. 프라이머 작업 주식은 시간의 짧은 기간 동안 신선한 만들어 20 ° C에 저장됩니다 (몇 개월). 표준 프라이머로 켈라 등의 설명, 텔로미어와 β-글로빈, SCG 사용 하였다. 20 . 프라이머 시퀀스 : Telo 1 : 5&#39;-CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT-TGGGTTTGGGTT-3 &#39; Telo 2 : 5&#39;-GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTT-ACCCT-3 &#39; SCG 1 : 5&#39;-GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC-3 &#39; SCG 2 : 5&#39;-CACCAACTTCATCCACGTTC-ACC-3 &#39; 참고 : 프라이머가 이전의 반응 믹스에 추가로 10pmoles/μl의 작업 농도로 희석한다. <ol start="3"><li> 게놈 DNA 용액을 희석 : </li></ol> Telo 및 단일 복사본 유전자 (SCG)에 대한 게놈 DNA의 시리얼 희석 분석에 대한 표준의 CT 값 곡선을 생성하기 위해 만들어집니다. 사용 된 게놈 DNA는 혈액 샘플에서 림프구로부터 추출 하였다. 이 희석은 동일한 게놈 DNA를 사용하여 시리얼 희석의 두 세트를 산출하기 위해 1.68의 계수로 각 농도 PCR 등급 H 2 0과 DNA를 희석하여 만들어집니다. 시작 농도는 시행 착오를 기반으로 최적화 된 다른 시약, 계기, 다른 종의 DNA, 세포 유형, 사용 SCG를 사용할 때 조정해야 할 수 있습니다. 참고 : 게놈 DNA를 사용하여 시리얼 희석 부드럽게 혼합 한 시간 befo의 적어도 15 분을 대기에 의해 만들어진다음 희석 DNA를 가지고 다시. 각 희석 해리하는 게놈 DNA의 시간이 필요합니다. -80에서 보관 PCR 스트립 ° C.에 장기 보관, 나누어지는 일련 희석에 대한 각 PCR 스트립 해동 DNA를 손상시킬 수 있습니다 동결 융해를 방지하기 위해 한 번 사용됩니다. <ol start="4"><li> RT-PCR에 대한 반응 설정 </li></ol> 사용 악기 : Roche480 라이트 자전거 타는 사람 시약 : 로슈 라이트 자전거 타는 SYBR 녹색 10 NG / μL의 최종 농도에 테스트 DNA 샘플을 희석. 우리는 Nanodrop 분광 또는 큐 비트를 사용하여 농도를 테스트합니다. 우리는 더 10ng/μl에서 최종 5ng​​/μl에 DNA를 희석. 우리는 다시 집중력을 테스트하지 않습니다. 반응 구성 요소 : <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="1.5in"> TELO </td><td fo:width="1.5in"> 1X </td><td fo:width=".25in" rowspan="6"></td><td fo:width="1.5in"> SCG </td><td fo:width="1.5in"> 1X </td></tr><tr><td> H 2 0 &lt;/ TD&gt; <td> 6 μL </td><td> H20 </td><td> 6 μL </td></tr><tr><td> Telo 1 </td><td> 0.2 μL </td><td> 1 SCG </td><td> 0.6 μL </td></tr><tr><td> Telo 2 </td><td> 1.8 μL </td><td> 2 SCG </td><td> 1.4 μL </td></tr><tr><td> RXN 혼합 </td><td> 10 μL </td><td> RXN 혼합 </td><td> 10 μL </td></tr><tr><td> DNA 또는 직렬 희석 </td><td> 2 μL </td><td> DNA 또는 직렬 희석 </td><td> 2 μL </td></tr></tbody></table> 참고 : 마스터 믹스는 DNA없이 5 % ~ 10 %의 초과로 구성되어 있습니다. Telo와 SCG는 모두 다음과 같은 프로그램을 사용하여 동일한 접시에 함께 실행됩니다. , 정밀 테스트하기 위해 세 이상에서 각 샘플의 복제 및 제어를 실행해야합니다. 사용되는 프라이머의 변화는 결과에 영향을 미칠 수 있습니다. 우리의 프로토콜은 Roche480 라이트 자전거 타는 우리 프라이머에 다음과 같이 작동하도록 최적화되었습니다. 에itial 변성 10 분 변성 95 ° C 사이클링 95 ° C 10 초 홀드 60 ° C 5 초 홀드 72 ° C 11 초 대기 및 단일 수집 필요에 따라 45-55 회 반복 2. 정량적 인 텔로 머라 제 검출 (QTD) 프로토콜 (연합 생명 공학, 주식 회사 고양이. 번호 MT3012에 의해 QTD 장비 기준) 준비를 추출 <ol><li> 펠렛 세포 나 조직. </li><li> 1X PBS로 한 번 씻으십시오. </li><li> Repellet 및 제거 1X PBS. * </li><li> 매 10 5 -10 6 세포 나 조직의 40-100 MG를위한 1 개의 x 용해 완충액 200 μL에있는 세포 펠렛을 resuspend. </li><li> 30 분 동안 얼음에 품어. </li><li> 4 ℃에서 30 분 동안 12,000 XG에서 샘플을 스핀 다운 </li><li> 새로운 튜브에 뜨는 160 μl를 전송하고 단백질 농도를 결정한다. </li><li> 나누어지는 및 -80 드라이 아이스 / 에탄올에 대한 빠른 동결 나머지 추출물, 저장 ° C. </li></ol> * T에서그의 조건은 냉동 세포 또는 조직에서 텔로 머라 제는 적어도 년 동안 안정적입니다. 사용 해동 할 때, 1 개의 x 용해 버퍼에 즉시 세포를 resuspend을. 2.1. 분석 제어 열 비활성화 제어 : 각 샘플의 경우, 이전의 텔로 머라 제 활성 분석에 10 분 동안 85 ° C에서 배양하여 추가 제어 추출물을 치료 가열한다. TSR 컨트롤 템플릿에 대한 표준 곡선 : 표준 곡선을 생성하기 위해 키트에 포함 된 텔로미어 (telomere) 프라이머와 유사한 시퀀스 TSR, 올리고 뉴클레오티드의 희석을 사용하여 정량 실시간 PCR을 수행합니다. <ol><li> 용해 버퍼 주식 TSR의 농도 1시 5분 시리얼 희석 (0.5 amoles / μL)를 준비 </li><li> 주식 농도를 포함하여 각 TSR 희석 1 μL를 사용하여 telomerase의 검출 기준 분석을 수행합니다. 이 희석은 최소 2 주 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다. </li></ol> 2.2. telomerase의 활동 분석QTD 실시간 PCR을 사용하여 <ol><li> 각 샘플은 PCR 튜브 얇은 벽 PCR 플레이트 (총 부피 25.0 μL)에 다음을 추가합니다 : <ul><li> 2 개 QTD 섞은 12.5 μL </li><li> 세포 나 조직 추출물의 1.0 μL </li><li> PCR 자격을 갖춘 워터의 11.5 μL </li></ul></li><li> 잘 혼합 </li><li> 아래의 프로그램에 따라 프로그램을 실시간 PCR 탐지 시스템 : - 25 ° C 20 분 (telomerase의 반응)에 대한 - 95 10 분 (PCR 초기 활성화 단계)에 대한 ° C 의 35-40주기 : - 95 ° C 30 초 (변성) - 60 ° C 30 초 (어닐링) - 72 ° C 30 초 (연장) </li><li> 열 자전거 타는 사람에 PCR 튜브를 삽입하고 순환 프로그램을 시작합니다. </li><li> 사이클 완료 후 임계 사이클 또는 C T 값을 수집합니다. 임계 값주기 ΔRn의 통계적으로 유의 한 증가가 처음 감지하는주기입니다. </li></ol> 2.3. 데이터 분석 <ol><li> Generat개 표준 곡선은 C T 수치를 사용하여 텔로 머라 제 활성을 비교합니다. </li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

텔로미어 길이는 스트레스와 노화 세포를 연구하는 독특한 세포 마커를 제공하고 노화의 메커니즘에 대한 통찰력을 제공합니다. 노화의 역할이 처음 제안했던 이후로, 연구의 다수가 나이 텔로미어 길이를 관련 완료되었습니다 근속 기간, 연령과 관련된 질환, 암, 스트레스. 수십 년 동안, 텔로미어 길이 측정의 황금 표준 남부 하이브리드를 사용하여 터미널 제한 조각 분석했다. 그러나 최근 Cawthon로, 저렴한 신속하고 수행하는 쉬운 방법이 진화하고있다. 정량 실시간 PCR을 사용하여 Cawthon 가능한 큰 샘플 크기에 대한 연구를하고, 텔로미어 길이를 측정하는 유용한 대안을 제공했다. QRT-PCR 이용하여 많은 연구가 텔로미어의 길이와 결과의 다양한 특히 연령과 관련된 질병 사이의 관계를 조사하기 위해 수행되었다. 더 구체적으로,이 방법은 연구자가 큰 역학 스튜를 수행 할 수있다텔로미어 길이와 질병의 다양한 사이의 상관 관계를 입증하거나 거부 인구에 죽는다. 몇 가지, 허혈성 심장 질환 7, 알츠하이머 병 22, 여성 23, 흡연자 24 중 폐암, 가족 갑상선 암 25 osteocarcoma 이름을, 당뇨병 5, 혈액 27 노화 압력을 26 일 치매 28 짧은 텔로미어의 길이와 상관있다 연령 관련 황반 변성 7, 대장 암 43, 감염성 질환, 암, 심장이나 뇌 혈관 질환 44 죽음 텔로미어의 길이가 유의 한 관계가 없음을 보여왔다 동안. 또한, 특정 응력 예를 들어, 짧은 telomere의 길이, 염증 마커의 증가 금액, TNF-α와 IL-6에 맞춰 보여왔다, 백혈구 29 짧은 telomere의 길이와 상관있다. 또한, 스트레스 난생시간이 걸리는 작업 일정, 교대 작업, 또는 작업의 특성으로 인해 estyles는 만성 질환 아동에 대한 특정 관리인 위치에 텔로미어 길이의 차이와 관련이있다. 이것은 스트레스 충분한 회복 30, 31없이 텔로미어 단축의 방법으로 조기 노화를 일으킬 수 있습니다 제안합니다. 최근의 연구에서 적은 사회적 관계를 갖는 것은 또한 짧은 텔로미어 32와 연결되어 있습니다. 텔로미어 길이 단축의 예방 또한 매일 종합 비타민이 아닌 흡연 24, 33 복용으로 건강한 삶의 선택과 상관 관계를 보여왔다. 또한 이러한 연구는 간경변 34의 가능한 개발을위한 비 침습적 선별 검사로, 예를 들어, 측정 텔로미어 가능한 임상 용도를 밝혔다. 다른 경우에는, 어디 유사한 연구는 질환과 텔로미어 (telomere) 길이 사이에 유의 한 상관 관계 (또는 완만 한 상관 관계를) 표시되지 않은, 연구자들은 성을 장려되었다세포의 감소 및 질병 상태 7 UDY 다른 새로운 메커니즘. 이러한 연구는 숫자 강도를 가지고 있으며 노화 과정을 해독의 첫 번째 단계 중 하나로서 텔로미어 길이를 측정하는 유틸리티를 증명하고있다. Cawthon의 QRT-PCR 방법은 많은 사람들을 비교할 수 있기 때문에,이 목적을 위해 유용 최소한의 DNA를 필요로하고, 텔로미어 길이와 세포의 건강 사이의 관계를 향해 신뢰할 수있는 증거를 제공 할 수 있습니다. 이러한 연구는 특정 유전자, 조직, 세포 프로세스에 미래의 노화 연구 노력을 조종하는 데 도움이됩니다. 텔로미어 길이에 상당한 차이가 지적 된 후 필연적으로, 설명은 쿼리됩니다. 답변에이 질문은 텔로 머라 제에 대한 연구는 텔로미어 유지 및 조절에 관여하는 효소가 설립되었다. PCR 기반의 텔로 머라 제 활성 프로토콜이쪽으로 추가 정보를 제공, 제공되었습니다. 연속을 결정텔로미어의 저하와 b의 ributions. 텔로 머라 제에 의해 성공적으로 telomere의 길이가 유지 보수의 실패는, 따라서 특정 세포 노화에 전반적으로 노화에 대한 이야기​​를 또 다른 장을 제공합니다. QRT-PCR은 개별 염색체 기준으로 평균 telomere의 길이, 그리고를 감지하지만,이 방법은 노화와 스트레스에 대한 세포 반응하는 방법으로 증거를위한 강력한 도구이며 어떻게 우리 시대의 이야기 프리앰블을 제공합니다. 흥미롭게도,이 정보는 이미 생물학적 연령을 추정 병원에서 텔로미어 길이 측정을 주도하고 노화 과정의 우리의 이해를 증진하고 필연적으로 예방 또는 지연 및 노화 및 노화 관련 질환의 선별 검사로 이어질 것입니다. <table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> 정량적 인 텔로 머라 제 검출 </tD&gt; <td> 연합 생명 공학 </td><td> MT3012 </td></tr><tr><td> QIAGEN DNeasy의 키트 </td><td> QIAGEN </td><td> 69506 </td></tr><tr><td> LightCycler 480 SYBR 녹색 I 석사, LightCycler 480 기기를 사용 SYBR 녹색 I-기반의 실시간 PCR을위한 준비에 사용 핫 스타트 반응 혼합 </td><td> 로슈 진단 </td><td> 4707516 </td></tr></tbody></table>

텔로미어는 염색체의 끝 부분에서 발견 DNA hexamer (TTAGGG) 시퀀스를 반복합니다. 각 세포 복제, 이러한 염색체 끝이 단축됩니다. 그들은 너무 짧은 될 경우, 염색체 telomere의 끝 융합, 탈선 재조합 및 저하를 겪을 수 있습니다. 따라서 충분한 텔로미어 길이를 유지 염색체의 안정성 및 세포 보호 38에있는 중요한 역할을한다. 텔로미어 길이를 유지 보수는 염색체의 끝 근처에서 발견 유전자 중요하다, 이후 DNA 복제는 염색체 1-2 끝까지 계속할 수 없습니다. 결과적으로, 텔로미어 단축 방지 세포의 안정성을 향상시킬 수 있습니다. 많은 연구는 telomere의 길이가 같은 3-4, 당뇨병 5 및 심혈관 질환 6,7 암과 같은 유기체의 수명과 질병 상태와 상관 관계가 있다고보고있다. 또한, 단축 telomeres는 과도한 스트레스와 관련되어아마도 조기 세포 노화와 죽음 9을 촉진하여 건강에 해로운 생활 습관 8. 반면에, 일부 연구는 질병 39, 40, 41 관련 텔로미어 길이와 수명과 연령간에 유의 한 차이가없는 것으로 나타났습니다. 텔로미어 단축에서 보호 세포의 타고난 메커니즘 중 하나는 자신의 효소 telomerase의 역전사 효소 (TERT)을 활성화하는 것입니다. 이 효소의 소단위, telomerase의 RNA (TERC), 비 코딩 RNA는 10 종료 염색체 telomere의 반복을 추가하는 템플릿으로 텔로미어 (telomere)를 사용합니다. 텔로 머라 제 활성이 세포와 다른 메커니즘의 여러 유형의 텔로미어 길이를 유지 보수에 관련된 결석이지만, 증가 텔로 머라 제 활성이 증가 텔로미어의 길이와 상관된다. telomerase의 활성화는 세포 손상에 대응하고 스트레스 및 조기 노화와 죽음을 방지하는 메커니즘 중 하나로서 설립되었습니다. 예를 들어, 더 이상 테lomeres이 뛰어난 수명 11와 아시 케 나지 유대인의 인구에 설명 된, TERC 혹은 TERT의 변이는 연령과 관련된 질병 13에 영향을 보여왔다 치명적인 질병 12와 텔로 머라 제의 성적인 조절에 기여하는 것으로 알려져있다. 그것의 발견부터, 텔로미어 길이는 다양한 동물 모델에서뿐만 아니라 인간의 건강 상태에 대한 바이오 마커로 제시하지만, 사용 방법, 지루한 긴과 비용 때문에 이러한 초기 연구는 널리 복제 할 어려웠다되었습니다. 2002 년 더 2009 년 조정에서 Cawthon는 제안 텔로미어 길이를 평가하고 더 노화와 질병 19, 세포 생물학의 다양한 측면에서의 역할을 조사하는 새로운, 정확하고, 빠르고 간단한 PCR 기반 프로토콜을 보여 주었다. 연구에 대한 올바른 telomere의 측정 방법을 선택하는 것은 필수적이다. 현재 텔로미어 길이를 측정하는 데 사용되는 다양한 방법 자체에 각각있다장점과 단점. 을 : 전통적으로, 텔로미어 길이는 포함 터미널 제한 조각 남부 얼룩 분석 (TRFs)를 사용하여 측정됩니다. B, TRFs를 얻기 위해 telomere의 반복에서 잘라하지 않는 제한 효소로 DNA를 소화. 이 TRFs 남부 오점은 말단 소립 프로브 14, 37를 사용하여 평균 TRF의 길이를 결정하여 수행됩니다. 이 방법은 변화의 작은 계수가 매우 정확하지만, 직접 측정, 길이 분포를 측정하기위한 유리한 수 있습니다, TRF 분석은 노동 집약적 비용과 DNA의 최소 3 μg을 필요로합니다. 이 방법은 프로브로 인해 (TTAGGG) N 그들이 42 15를 포함하는 시퀀스와 같은 감지 할 수 탐지되었다 DNA에 의해 혼동 될 수도 짧은 텔로미어 길이 결정에 구분하지 않습니다. 텔로미어 길이를 측정하는 또 다른 매우 정확한 방법은 단일 Telomere는 연신율 길이 분석 (STELA), Singl에 있습니다단지 DNA의 작은 금액을 필요로 전자 분자 PCR 기반 방법. 이 방법에서는, 프라이머는 염색체의 끝 부분에 G 풍부한 물량을 인식하고 특정 염색체의 텔로미어 (telomere)를 증폭 한 염색체에 독특한 탐지되었다 시퀀스에 바인딩 만들어집니다. 결과적으로 증폭 한 후 남부 오점으로 시각화됩니다. 이 방법은 매우 정확하다는 장점을 가지고 있으며, 짧은 국외자 텔로미어에게 16를 감지 할 수 있습니다. 모든 염색체 G 풍부한 끝을 가지고 사용할 수있는 탐지되었다 순서 때문에 불행하게도, 텔로미어 길이는 특정 염색체에서 측정 할 수 있으며 이러한 측정은 세포 15의 모든 텔로미어의 길이를 표시하지 않을 수 있습니다. 연습을했습니다 또 다른 방법은 telomere의 길이를 감지하는 펩티드 핵산 (PNA) 프로브를 사용하는 것입니다. 현장 하이브리드 화 양적 형광 (Q-FISH)는 우리가 성 중기, 동안 텔로미어를 시각화 할 수 있습니다의 크기에 비례하여 PNA 프로브와 텔로미어의 aining은 특정 염색체 사이의 텔로미어의 비교를 허용합니다. 이 방법은 또한 계면에서 셀에 사용할 수 있지만, 여기에 서로 다른 염색체의 텔로미어 길이는 17 노화 또는 자주 분열 세포에서 텔로미어 길이를 측정 할 때 제한을 도입하는 감지 할 수 없습니다. 흐름이 물고기 대신 유동 세포 계측법을 사용하여 현재 임상에서 혈액 세포의 텔로미어 길이를 측정하는 가장 민감한 방법이지만, 고도로 숙련 된 기술자가 18이 필요합니다. 현재, 우리 실험실에서 평균 telomere의 길이를 측정하기위한 표준 방법은 정밀도, 감도의 활용 및 정량 실시간 PCR의 용이성. 이 메소드는, 그렇지 않으면로 제작했을 프라이머 이합체 파생 제품의 합성을 방지 소설 프라이머의 개발로 텔로미어 길이를 측정 가능하게되었다텔로미어의 반복 특성으로 인해 tandard 분석. 이 분석을 위해, 텔로미어 길이의 측정은 단일 사본 유전자 수에 T / S 비율, telomere의 반복 사본 번호가 표시됩니다. 텔로미어 길이와 PCR의 시작 단계에서 DNA에 바인딩 표시 텔로미어 프라이머의 수 사이에 직접적인 비례 관계가 있기 때문에, T / S 비율은 telomere의 길이에 정비례한다. T / S 비율 코네티컷에있는 차이를 비교하여 측정, 시료가 형광을 축적 된되는 부분 사이클 수는 텔로미어 프라이머 샘플 및 프라이머 19 SCG 사이의 기본 개화 위의 몇 가지 표준 편차 인 임계 값을 교차합니다. 이 방법은 염색체 중복 또는 복사 번호 편차 15의 경우 부정확 한 측정으로 이어질 수있는 텔로미어의 길이는 간접 측정, 예를 들어 비판하고있다. 또한, 연구의 비교는 종종 디입니다fficult하지만, 표준 올리고머는 절대 텔로미어 길이 20를 측정하기 위해 개발되었습니다. 이 방법은 흑백 멀티 플렉스의 qPCR 분석을 사용하여 Cawthon에 따라 개선 발전한되었다. 이 분석에서는 PCR은 프라이머 이합체 바인딩을 방지하기 위해 처음 몇주기 낮은 온도에서 실행되고 텔로미어 및 제어 유전자는 더 이상 오류를 방지하기 위해 동일한 PCR 튜브에서 분석 하였다. 결과 텔로미어 길이를 측정 강하게 TRFs 남부 blot 분석에 의해 측정 텔로미어의 길이와 상관 더 높은 정확도를 15, 19, 36을했다. 순간, QRT-PCR 큰 샘플 크기를 테스트 사용할 수있는 유일한 편리한 방법입니다 만 수행하는 DNA의 작은 금액을 필요로합니다. 이 방법의 중요한 부분이 제대로 끝나면,이 메소드는 텔로미어의 길이에 대한 유용한 비교 정보를 제공 할 수 있도록 포괄적 인 품질 관리 대책이다. 또한이 방법은 측정 백혈구 이상 사용하기 위해 적응했다다른 조직의 다양한 42 telomere의 길이입니다. 또한, 더 텔로미어 길이를 유지 보수하고 두 반대 효과 (텔로 머라 제 효소에 의해 복제 및 신장 동안 즉, 텔로미어 단축) 사이의 상호 작용의 뒤에 생물학을 이해하기 위하여, 우리는 텔로 머라 제 활성을 측정 추가적인 분석과 텔로미어 길이 방법을 함께. 이 목적을 위해, 우리는 말단 소립 반복 증폭 프로토콜, 체외 분석을 사용 하였다. 간단히, 용해, 보존, 효소 활성 세포는 텔로 머라 제를 사용하여 올리고 뉴클레오티드 기판 상에 말단 소립 반복을 합성하고, 제품은 SYBR 녹색의 면전에서 PCR을 이용하여 증폭 하였다. 결과는 샘플을 비교하고 제어 코네티컷 임계 값에 의해 분석 하였다. 텔로 머라 제는 열에 민감한 효소이기 때문에, 추가적인 열 제어 처리는 각 시료 21와 함께 실행됩니다. <p class=&quot;jove_content&quot;&gt; 텔로미어 길이를 측정하는 것이 노화와 질병의 병태 생리에서 텔로미어 길이의 가능한 역할에 대한 귀중한 통찰력을 제공 할 수 있지만, 텔로미어 길이는 정적 속성 및 자세한 내용은 아니다는 telomere의 기능을 이해하기 위해 필요합니다. 텔로 머라 제 활성 연구는 텔로미어 길이 조절 메커니즘에 대한 정보를 추가 할 수 있습니다. 예를 들어, 텔로 머라 제의 제어 활성화는 텔로미어 길이와 세포 증식을 유지할 수 있지만, 텔로 머라 제의 억제되지 않는 활성화는 암이 발생할 수 있습니다. 결합이 두 저렴하고 곧장 앞으로 방법은 텔로미어 길이와 세포의 안정성 사이의 관계를 향해 강력한 증거뿐만 아니라, 텔로미어 단축과 복구의 가능한 메커니즘에 대한 자세한 통찰력뿐만 아니라 우리를 제공했습니다. 이러한 방법으로 우리는 더 이상 중앙 mechanis의 더 나은 이해의 궁극적 인 목표로 노화 및 세포 증식의 다양한 상태에 대한 세포의 반응을 명료하게 희망세포 생물학 석사.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Quantitative Telomerase Detection </td>
 <td>Allied Biotech </td>
 <td>MT3012 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Qiagen DNeasy Kit</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>69506</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LightCycler 480 SYBR Green I Master, Ready-to-use hot start reaction mix for SYBR Green I-based real-time PCR using the LightCycler 480 Instrument</td>
 <td>Roche Diagnostics</td>
 <td>4707516</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

telomere length and telomerase activity; a yin and yang of cell senescence

텔로미어는 끝에 DNA 시퀀스를 반복하는 것은 길이와 인간의 다양 염색체의 15,000 염기쌍의 길이에 도달 할 수 끝난다. 텔로미어 (telomere)는 각각의 세포 분열에서 염색체 감소의 바이오 보호용 장치 역할을합니다. 특정 길이에서 텔로미어 복제, 염색체 불안정성 또는 세포 사망을 초래할 수있는 프로세스를 허용하기에 너무 짧은된다. 감소 및 신장 : 텔로미어 길이는 두 개의 반대 메커니즘에 의해 조절된다. 각 셀 분할과 마찰이 발생합니다. 대조적으로, 신장은 염색체의 끝 부분에 반복 시퀀스를 추가하는 효소 telomerase에 의해 부분적으로 변조됩니다. 이러한 방법으로, 텔로 머라 가능성이 노화 메커니즘을 반대로 세포 생존을 젊어지게 할 수 있습니다. 이 세포의 수명을 유지하는 중요한 요소이며, 세포의 노화를 평가하는 데 사용됩니다. 이 논문에서 우리는 여러 조직의 텔로미어 길이를 평가하는 정확하고 짧은 정교하고 저렴한 방법을 설명합니다의 종. 이 방법은 텔로미어 시퀀스의 탠덤 반복 및 테스트 샘플의 차이 사본 번호를 검색하는 QRT-PCR의 민감도, 두 가지 핵심 요소로 활용합니다. 또한, 우리는 텔로미어 길이 보완 백본 시험으로 telomerase의 활동을 평가하는 간단한 분석을 설명합니다.

텔로미어 길이 QRT-PCR 분석의 예는 그림 1에 표시됩니다. 왼쪽 패널에서 빨간색과 녹색으로 표시된 샘플 96 - 웰 플레이트에 시험 대상의 위치를​​ 나타냅니다. 오른쪽 상단 패널에서 증폭 곡선이 설명된다. 각 과목은 triplicates에서 이루어집니다 개의 분석 (Telomere는 및 단일 복사본 유전자)에 의해 테스트됩니다. 선택한 개인의 두 분석에서 생산 된 서로 다른 DNA 카피 수에 의한, 형광 검출 될 때까지 사이클의 수는 지수 곡선 분석 사이의 차이 도달합니다. 높은 사본 번호 튜브 (즉, 텔로미어 분석), 형광 검출의 양이 27 사이클 이후의 지수 곡선에 도달합니다. 라인의 두 번째 세트는 게놈에 하나의 복사본이 단일 복사본 유전자 (SCG)를 나타내며, 따라서 텔로미어 (telomere) 샘플보다 훨씬 적은 사본을 가지고 있으며, 만 31 사이클 이후의 지수 곡선에 도달합니다. 갈색 선은 표준을 나타냅니다알려진 시료 농도의 용액을 희석 기반으로 곡선. 오른쪽 하단 패널은 표준 곡선 점 (직선 최적의 시리얼 희석을 보여줍니다)의 로그 농도를 나타냅니다. 이 선형 곡선은 테스트 튜브 (왼쪽 아래 패널)의 농도를 계산하는 데 사용하고있다. 처음 Cawthon의 손에 19, 그리고 우리와 다른 사람들에 의해 반복 터미널 제한 조각 길이 분석에 의해 얻은 상관 관계 것으로 표시되었습니다에 QRT-PCR 결과. 하나의 T / S 비율 단위 (SCG 실행의 QRT-PCR 사이클을 통해 텔로미어 실행의 QRT-PCR 사이클)은 백혈구 42 4,270 혈압의 평균 telomere의 길이에 해당합니다. 우리의 예에서 SCG 분석에 의해 Telomere는 분석을 위해 QRT-PCR 사이클을 나누면 3,715 혈압의 평균에 해당하는 0.87의 비율로 만들었습니다. 이 측정은 혼자 텔로미어의 길이로 구성되어 있으며, 모두 탐지 영역을 포함하지 않습니다. QRT-PCR은 아주 작은 샘플 준비를 포함 여기에 보여 주었다. 이 예제 (그림 1), 질적뿐만 아니라 양적 차이 (시리얼 희석 triplicates 사이의 일치로 표현) 두 분석 사이에 관찰되었다. 이 테스트에서 계산 결과는 65 세 주제에 대해 중간 텔로미어 길이를 보여줍니다. 텔로 머라 제 활성 분석 결과와 telomerase의 활동과 telomere의 길이 사이의 가능한 관계의 예는 그림 2에 의해 증명된다. 우리의 예비 결과는 긴 telomere의 길이가 증가 telomerase의 활성과 연관 될 수 있다는 것을 보여줍니다. <img src="/files/ftp_upload/50246/50246fig1.jpg" alt="그림 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50246/50246fig1highres.jpg"/> 그림 1. 그림 1은 AQ에서 일반적인 출력을 나타냅니다Telomere의 길이 RT-PCR 분석. 좌측 상단 세중에서 96 - 웰 플레이트에 배치 된 샘플을 보여줍니다. 왼쪽 하단 모서리는 T / S 값을 계산하는 데 사용되는 각 샘플에 대한 계산 된 농도와 CT 값을 나열합니다. 오른쪽은 결과를 시각화하는 데 사용되는 증폭 곡선 (CYBR 녹색에서 검출 된 형광 대 사이클의 수)의 그래프이다. 오른쪽 하단에 시리얼 희석 제어의 CT 값 비교 로그의 농도에 대한 표준 곡선 그래프입니다. 직선 직렬 희석 정확하게 측정로드되었는지 확인합니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50246/50246fig1large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img src="/files/ftp_upload/50246/50246fig2.jpg" alt="그림 2"/> 그림 2. , 텔로 머라 제 활성 및 텔로 머라 제 길이 QRT-PCR 분석에서 예비 결과를 사용하여 &lt;강해&gt; 그림 2의 CT 값으로 측정 직접적인 상당한 T / S 비율에 의해 측정 된 텔로미어 길이의 관계 (P는 = 0.008), 그리고 텔로 머라 제 활성을 보여줍니다.

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Telomere Length and Telomerase Activity; A Yin and Yang of Cell Senescence

정확하고, 짧은 정교하고 저렴한 방법은 여러 조직과 QRT-PCR을 사용하여 종 텔로미어 길이를 평가하는 것을 설명합니다. 또한, 우리는 텔로미어 길이 보완 백본 시험으로 telomerase의 활동을 평가하는 간단한 분석을 설명합니다.

텔로미어의 길이와 텔로 머라 제 활성을 세포 노화의 음과 양

Telomeres  are repeating DNA sequences at the tip ends of the chromosomes that are diverse  in length and in humans can reach a length of 15,000 base ...

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46.4K 조회수.  Albert Einstein College of Medicine. 정확하고, 짧은 정교하고 저렴한 방법은 여러 조직과 QRT-PCR을 사용하여 종 텔로미어 길이를 평가하는 것을 설명합니다. 또한, 우리는 텔로미어 길이 보완 백본 시험으로 telomerase의 활동을 평가하는 간단한 분석을 설명합니다.

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In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

활성 T.의 체외의 Reconstitution에서 castaneum의 Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

연구

생물학

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

작은 분자와 유도 Pluripotent 인간 배아 줄기 세포로부터 인간 심장 엽 성의 전구 물질과 Cardiomyocytes의 효율 유도

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis

Cellular movement in response to external stimuli is fundamental to many cellular processes including wound healing, inflammation and the response to infection. A common method to measure chemotaxis is the Boyden chamber assay, in which cells and chemoattractant are separated by a porous membrane. As cells migrate through the membrane toward the chemoattractant, they adhere to the underside of the membrane, or fall into the underlying media, and are subsequently stained and visually counted 1. In this method, cells are exposed to a steep and transient chemoattractant gradient, which is thought to be a poor representation of gradients found in tissues 2.
Another assay system, the under-agarose chemotaxis assay, 3, 4 measures cell movement across a solid substrate in a thin aqueous film that forms under the agarose layer. The gradient that develops in the agarose is shallow and is thought to be an appropriate representation of naturally occurring gradients. Chemotaxis can be evaluated by microscopic imaging of the distance traveled. Both the Boyden chamber assay and the under-agarose assay are usually configured as endpoint assays.
The automated ECIS/Taxis system combines the under-agarose approach with Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) 5, 6. In this assay, target electrodes are located in each of 8 chambers. A large counter-electrode runs through each of the 8 chambers (Figure 2). Each chamber is filled with agarose and two small wells are the cut in the agarose on either side of the target electrode. One well is filled with the test cell population, while the other holds the sources of diffusing chemoattractant (Figure 3). Current passed through the system can be used to determine the change in resistance that occurs as cells pass over the target electrode. Cells on the target electrode increase the resistance of the system 6. In addition, rapid fluctuations in the resistance represent changes in the interactions of cells with the electrode surface and are indicative of ongoing cellular shape changes. The ECIS/Taxis system can measure movement of the cell population in real-time over extended periods of time, but is also sensitive enough to detect the arrival of a single cell at the target electrode. 
Dictyostelium discoidium is known to migrate in the presence of a folate gradient 7, 8 and its chemotactic response can be accurately measured by ECIS/Taxis 9. Leukocyte chemotaxis, in response to SDF1&alpha; and to chemotaxis antagonists has also been measured with ECIS/Taxis 10, 11. An example of the leukocyte response to SDF1&alpha; is shown in Figure 1.

The ECIS/Taxis system is an automated, real-time assay that measures cellular chemotaxis. In this assay, cells move beneath a layer of agarose to arrive at a target electrode. Cellular movement is measured by the onset of resistance to AC current 0.

ECIS / 택시와 셀룰러 Chemotaxis 측정

Cellular movement in response to external stimuli is fundamental to many cellular processes including wound healing, inflammation and the response to ...

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Commonly used, highly accessible methods for examining cell migration and invasion in vitro are described. The first method is the cell wound closure assay that measures cell motility. The second method is the transwell migration and invasion assay that assesses the chemotactic and invasive capacity of cells.

체외 세포 이동 및 내습 분석 실험에서

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 (Kir4.1)

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a cytosine-guanine dinucleotide. While DNA methylation provides long-lasting and stable changes in gene expression, patterns and levels of DNA methylation are also subject to change based on a variety of signals and stimuli. As such, DNA methylation functions as a powerful and dynamic regulator of gene expression. The study of neuroepigenetics has revealed a variety of physiological and pathological states that are associated with both global and gene-specific changes in DNA methylation. Specifically, striking correlations between changes in gene expression and DNA methylation exist in neuropsychiatric and neurodegenerative disorders, during synaptic plasticity, and following CNS injury. However, as the field of neuroepigenetics continues to expand its understanding of the role of DNA methylation in CNS physiology, delineating causal relationships in regards to changes in gene expression and DNA methylation are essential. Moreover, in regards to the larger field of neuroscience, the presence of vast region and cell-specific differences requires techniques that address these variances when studying the transcriptome, proteome, and epigenome. Here we describe FACS sorting of cortical astrocytes that allows for subsequent examination of a both RNA transcription and DNA methylation. Furthermore, we detail a technique to examine DNA methylation, methylation sensitive high resolution melt analysis (MS-HRMA) as well as a luciferase promoter assay. Through the use of these combined techniques one is able to not only explore correlative changes between DNA methylation and gene expression, but also directly assess if changes in the DNA methylation status of a given gene region are sufficient to affect transcriptional activity.

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 Kir4.1

DNA methylation is capable of maintaining stable levels of gene expression as well as allowing for dynamic changes in gene expression in response to a variety of stimuli. We detail techniques that allow the study of gene-specific changes in DNA methylation and the effect of these changes on gene expression.

유전자 특이 발현과 DNA 메틸화 변화와 성상 세포의 전사 활동의 상관 관계<em&gt; KCNJ10</em&gt; (Kir4.1)

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a ...

Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great potential for the detailed mass spectrometry (MS) analysis of biomolecules from biological samples. The single-probe, a miniaturized device with integrated sampling and ionization capabilities, is capable of performing both ambient MSI and in-situ SCMS analysis. For ambient MSI, the single-probe uses surface micro-extraction to continually conduct MS analysis of the sample, and this technique allows the creation of MS images with high spatial resolution (8.5 &#181;m) from biological samples such as mouse brain and kidney sections. Ambient MSI has the advantage that little to no sample preparation is needed before the analysis, which reduces the amount of potential artifacts present in data acquisition and allows a more representative analysis of the sample to be acquired. For in-situ SCMS, the single-probe tip can be directly inserted into live eukaryotic cells such as HeLa cells, due to the small sampling tip size (&lt; 10 &#181;m), and this technique is capable of detecting a wide range of metabolites inside individual cells at near real-time. SCMS enables a greater sensitivity and accuracy of chemical information to be acquired at the single cell level, which could improve our understanding of biological processes at a more fundamental level than previously possible. The single-probe device can be potentially coupled with a variety of mass spectrometers for broad ranges of MSI and SCMS studies.

Here, we present protocols to perform both ambient mass spectrometry imaging (MSI) of tissues and in-situ live single cell MS (SCMS) analysis using the single-probe, which is a miniaturized multifunctional device for MS analysis.

단일 프로브의 응용 프로그램 : 주변 조건에서 질량 분석 이미징 및 단일 세포 분석

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great ...

Dissection and Flat-mounting of the Threespine Stickleback Branchial Skeleton

The posterior pharyngeal segments of the vertebrate head give rise to the branchial skeleton, the primary site of food processing in fish. The morphology of the fish branchial skeleton is matched to a species' diet. Threespine stickleback fish (Gasterosteus aculeatus) have emerged as a model system to study the genetic and developmental basis of evolved differences in a variety of traits. Marine populations of sticklebacks have repeatedly colonized countless new freshwater lakes and creeks. Adaptation to the new diet in these freshwater environments likely underlies a series of craniofacial changes that have evolved repeatedly in independently derived freshwater populations. These include three major patterning changes to the branchial skeleton: reductions in the number and length of gill raker bones, increases in pharyngeal tooth number, and increased branchial bone lengths. Here we describe a detailed protocol to dissect and flat-mount the internal branchial skeleton in threespine stickleback fish. Dissection of the entire three-dimensional branchial skeleton and mounting it flat into a largely two-dimensional prep allows for the easy visualization and quantification of branchial skeleton morphology. This dissection method is inexpensive, fast, relatively easy, and applicable to a wide variety of fish species. In sticklebacks, this efficient method allows the quantification of skeletal morphology in genetic crosses to map genomic regions controlling craniofacial patterning.

The branchial skeleton, including gill rakers, pharyngeal teeth, and branchial bones, serves as the primary site of food processing in most fish. Here we describe a protocol to dissect and flat-mount this internal skeleton in threespine sticklebacks. This method is also applicable to a variety of other fish species.

해부와 큰가시 고기 아가미 해골의 평면 장착

The posterior pharyngeal segments of the vertebrate head give rise to the branchial skeleton, the primary site of food processing in fish. The morphology ...

Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence

In response to cellular stress or damage, proliferating cells can induce a specific program that initiates a state of long-term cell-cycle arrest, termed cellular senescence. Accumulation of senescent cells occurs with organismal aging and through continual culturing in vitro. Senescent cells influence many biological processes, including embryonic development, tissue repair and regeneration, tumor suppression, and aging. Hallmarks of senescent cells include, but are not limited to, increased senescence-associated &#946;-galactosidase activity (SA-&#946;-gal); p16INK4A, p53, and p21 levels; higher levels of DNA damage, including &#947;-H2AX; the formation of Senescence-associated Heterochromatin Foci (SAHF); and the acquisition of a Senescence-associated Secretory Phenotype (SASP), a phenomenon characterized by the secretion of a number of pro-inflammatory cytokines and signaling molecules. Here, we describe protocols for both replicative and DNA damage-induced senescence in cultured cells. In addition, we highlight techniques to monitor the senescent phenotype using several senescence-associated markers, including SA-&#946;-gal, &#947;-H2AX and SAHF staining, and to quantify protein and mRNA levels of cell cycle regulators and SASP factors. These methods can be applied to the assessment of senescence in various models and tissues.

Cellular senescence, the irreversible state of cell-cycle arrest, can be induced by various cellular stresses. Here, we describe protocols to induce cellular senescence and methods to assess markers of senescence.

기술은 유도 및 정량화 세포 노화하기

In response to cellular stress or damage, proliferating cells can induce a specific program that initiates a state of long-term cell-cycle arrest, termed ...

In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity

Small ubiquitin-like modifier (SUMO) modification is an important post-translational modification (PTM) that mediates signal transduction primarily through modulating protein-protein interactions. Similar to ubiquitin modification, SUMOylation is directed by a sequential enzyme cascade including E1-activating enzyme (SAE1/SAE2), E2-conjugation enzyme (Ubc9), and E3-ligase (i.e., PIAS family, RanBP2, and Pc2). However, different from ubiquitination, an E3 ligase is non-essential for the reaction but does provide precision and efficacy for SUMO conjugation. Proteins modified by SUMOylation can be identified by in vivo assay via immunoprecipitation with substrate-specific antibodies and immunoblotting with SUMO-specific antibodies. However, the demonstration of protein SUMO E3 ligase activity requires in vitro reconstitution of SUMOylation assays using purified enzymes, substrate, and SUMO proteins. Since in the in vitro reactions, usually SAE1/SAE2 and Ubc9, alone are sufficient for SUMO conjugation, enhancement of SUMOylation by a putative E3 ligase is not always easy to detect. Here, we describe a modified in vitro SUMOylation protocol that consistently identifies SUMO modification using an in vitro reconstituted system. A step-by-step protocol to purify catalytically active K-bZIP, a viral SUMO-2/3 E3 ligase, is also presented. The SUMOylation activities of the purified K-bZIP are shown on p53, a well-known target of SUMO. This protocol can not only be employed for elucidating novel SUMO E3 ligases, but also for revealing their SUMO paralog specificity.

In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity

Unlike ubiquitin ligases, few E3 SUMO ligases have been identified. This modified in vitro SUMOylation protocol is able to identify novel SUMO E3 ligases by an in vitro reconstitution assay.

생체 외에서 스모 E3 리가 활동 공부 SUMOylation 분석 결과

Small ubiquitin-like modifier (SUMO) modification is an important post-translational modification (PTM) that mediates signal transduction primarily ...

Anaerobic Growth and Maintenance of Mammalian Cell Lines

Most mucosal surfaces along with the midpoints in tumors and stem cell niches are geographic areas of the body that are anoxic. Previous studies show that the incubation in normoxic (5% CO2 in air) or hypoxic (low oxygen levels) conditions followed by an anoxic incubation (an absence of free oxygen) results in limited viability (2&#8211;3 days). A novel methodology was developed that enables an anoxic cell cultivation (for at least 17 days; the maximum time tested). The most critical aspect of this methodology is to ensure that no oxygen is introduced into the system. This is obtained by the degassing of media, and by flushing tubes, dishes, flasks, and pipettes with an anaerobic gas mixture (H2, CO2, N2) followed by permitting the materials to equilibrate to the anoxic (non-oxygen) environment prior to usage.&#160;Additional care must be exercised when acquiring photomicrographs to ensure that the micrographs obtained do not contain artifacts. In the absence of oxygen, cell morphology is significantly altered. Two distinct morphotypes are noted for all anaerobically-grown cells. The ability to grow and maintain mammalian cells in the absence of oxygen can be applied to the analysis of cell physiology, polymicrobial interactions, and the characterization of biosynthetic pathways for novel cancer drug development.

Here, we describe a new method that enables the anaerobic long-term cultivation of established cell lines. The maximum survival time that was tested is 17 days. This method is suitable for the testing of cytotoxic agents and exploring the physiology of anoxically replicating cells.

혐 기성 성장 및 포유류 세포의 유지 보수

Most mucosal surfaces along with the midpoints in tumors and stem cell niches are geographic areas of the body that are anoxic. Previous studies show that ...