1. Telomer uzunluğu Protokol 19 <ol><li> DNA izolasyonu </li></ol> En DNA izolasyon yöntemleri kullanılabilir. Bizim Lab kan kaynakları için Qiagen DNeasy Kiti (# 69506) tercih ediyor. Örneğin bukkal ya da diğer kaynaklardan gelen DNA, bir kaynağına bağlı olarak, farklı bir izolasyon yöntemi de kullanılabilir. <ol start="2"><li> Astarlar: </li></ol> Tüm primerler PCR sınıf suda 100pmoles/μl &#39;lik bir stok konsantrasyonu seyreltildi ve kullanılana kadar -20 ° C&#39;de saklanır. Primerlerin çalışma stokları kısa bir süre için taze yapılmış ve 20 ° C &#39;de muhafaza edilmektedir (bir kaç ay). Standart primerler olarak O&#39;Callaghan ve diğ, telomer ve β-globin, SCG kullanılmıştır. 20 . Primer dizileri: Telo 1: 5&#39;-CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT-TGGGTTTGGGTT-3 &#39; Telo 2: 5&#39;-GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTT-ACCCT-3 &#39; SCG 1: 5&#39;-GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC-3 &#39; SCG 2: 5&#39;-CACCAACTTCATCCACGTTC-ACC-3 &#39; Not: Primerler önce reaksiyon karışımına ilave edilmeden, 10pmoles/μl çalışan bir konsantrasyona seyreltilir. <ol start="3"><li> Genomik DNA seri seyreltme: </li></ol> Telo ve tek kopya Gene (SCG) genomik DNA seri seyreltileri tahlili için standart bir eğri oluşturmak Ct değeri oluşturulur. Kullanılan genomik DNA kan örneklerinden lenfositlerden elde edildi. Bu seyreltmeler, aynı genomik DNA kullanılarak seri seyreltme iki set vermek üzere 1.68 faktörüyle her bir konsantrasyonu için PCR sınıf H 2 0, DNA seyreltilerek oluşturulur. Başlangıç ​​konsantrasyonu deneme ve yanılma göre optimize edilmiş ve farklı reaktif madde, araçlar, diğer türler arasından, DNA, hücre tipi ve kullanılan SCG kullanılıyorsa ayarlanması gerekebilir. Not: genomik DNA kullanılarak seri seyreltme yavaşça karıştırılması ve bir saat befo en azından 15 dakika beklendikten sonra yapılırBir sonraki seyreltme için DNA alarak yeniden. Her seyreltme ayırmak için genomik DNA için zaman gerektirir. -80 Depolama için PCR şeritler ° C içine uzun süreli depolama, kısım seri dilüsyonları için Her PCR şerit çözülmüş ve DNA zarar verebilir donma çözülme döngüleri önlemek için bir kez kullanılır. <ol start="4"><li> RT-PCR için Reaksiyon kurulum </li></ol> Kullanılan alet: Roche480 Işık Cycler Reaktif: Roche Işık döngü SYBR-yeşil 10 ng / ml arasında bir nihai konsantrasyona testi DNA örnekleri seyreltilir. Biz Nanodrop veya Qubit kullanarak konsantrasyonu test edin. Biz daha 10ng/μl nihai 5ng/μl için DNA sulandırmak. Biz yine konsantrasyon test yok. Reaksiyon bileşenleri: <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="1.5in"> TELO </td><td fo:width="1.5in"> 1x </td><td fo:width=".25in" rowspan="6"></td><td fo:width="1.5in"> SCG </td><td fo:width="1.5in"> 1x </td></tr><tr><td> Y 2 0 &lt;/ Td&gt; <td> 6 ul </td><td> H20 </td><td> 6 ul </td></tr><tr><td> Telo 1 </td><td> 0.2 ul </td><td> 1 SCG </td><td> 0.6 ul </td></tr><tr><td> Telo 2 </td><td> 1.8 ul </td><td> 2 SCG </td><td> 1.4 ul </td></tr><tr><td> Rxn karışımı </td><td> 10 ul </td><td> Rxn karışımı </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td> DNA ya da seri seyreltme </td><td> 2 ul </td><td> DNA ya da seri seyreltme </td><td> 2 ul </td></tr></tbody></table> Not: Ana Karışım DNA olmadan ve% 5 ila% 10 arasında bir fazlalığı ile yapılır. Telo ve SCG ikisi de aşağıdaki programı kullanarak aynı plaka üzerinde birlikte işletilmektedir. , Hassas test etmek için en az üç her numunenin çoğaltır ve kontrol çalıştırılmalıdır. Kullanılan primerler değişimler sonuçlarını etkileyebilir. Bizim protokol Roche480 Işık Cycler ve astar üzerinde aşağıdaki gibi çalışmak üzere optimize edilmiştir. Içindeitial denatüre 10 dakika 95 ° C denatüre Bisiklete binme 95 ° C 10 saniye tutun 60 ° C 5 saniye tutun 72 ° C 11 saniye tutun ve tek satın alma Gerektiği gibi 45-55 kez tekrarlayın 2. Kantitatif Telomeraz Algılama (QTD) Protokolü (Müttefik Biyoteknoloji, Inc Kat. No MT3012 tarafından QTD Seti dayanarak) Hazırlık Özü <ol><li> Pelet hücre veya doku. </li><li> 1x bir kez PBS ile yıkayın. </li><li> Repellet ve kaldır 1x PBS. * </li><li> Her 10 5 -10 6 hücre veya doku 40-100 mg 1 x Lizis Tampon 200 ul hücre pelletini. </li><li> 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. </li><li> 4 ° C&#39;de 30 dakika boyunca 12,000 x g&#39;de örnek dönerler </li><li> Yeni bir tüp içine 160 ul süpernatan aktarın ve protein konsantrasyonu belirlenir. </li><li> Kısım ve -80 kuru buz / etanol hızlı dondurma kalan özü, mağaza ° C </li></ol> * T içindeonun durumu, dondurulmuş hücre veya dokularda telomeraz en az bir yıl boyunca stabildir. Kullanım için içine yerleştirildiği zaman, 1 x Liziz Tamponu içinde hücrelerin hemen tekrar süspansiyon. 2.1. Testi Kontroller Isı inaktivasyonu kontrolü: her bir numune için, önceden telomeraz aktivitesi deneyi için 10 dakika boyunca 85 ° C&#39;de inkübe ederek ek kontrol özü tedavi ısı. TSR denetimi şablon için standart eğri: standart bir eğri oluşturmak için kiti ile birlikte telomer astar benzer bir dizi ile TSR, bir oligonükleotid dilüsyonları kullanarak Kantitatif Real-Time PCR gerçekleştirin. <ol><li> Lizis Tampon ile stok TSR konsantrasyon 01:05 seri dilüsyonları (0.5 amoles / ml) hazırlayın </li><li> Stok konsantrasyonu da dahil olmak üzere, her TSR seyreltme 1 ul kullanarak telomeraz algılama standart tahlil gerçekleştirin. Bu seyreltiler, en az 2 hafta boyunca 4 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. </li></ol> 2.2. Telomeraz Aktivitesi TestiQTD Real-Time PCR kullanarak <ol><li> Her numune için, bir PCR tüp veya ince duvar PCR plate (toplam hacim 25.0 ul) için aşağıdakileri ekleyin: <ul><li> 2 x QTD Premix 12.5 ul </li><li> Hücre veya Doku Extract 1.0 ul </li><li> PCR Nitelikli Su 11.5 ul </li></ul></li><li> Iyice karıştırın </li><li> Aşağıdaki programa göre Programı Real-Time PCR Tespit Sistemleri: - 25 ° C&#39;de 20 dakika (telomeraz reaksiyonu) için - 95 10 dakika (PCR ilk aktivasyon adım) ° C 35-40 döngüleri: - 95 ° C 30 saniye (denatürasyon) - 60 ° C&#39;de 30 saniye boyunca (tavlama) - 72 ° C 30 saniye (uzatma) </li><li> Termal döngü içinde PCR tüpleri yerleştirin ve bisiklet programını başlatın. </li><li> Döngüleri bitirmek sonra eşik döngüsü veya C T değeri toplayın. Eşik döngüsü ΔRn bir istatistiksel olarak anlamlı artış ilk tespit edildiği döngüdür. </li></ol> 2.3. Veri Analizi <ol><li> Generatadet standart eğri C T okuma kullanarak ve telomeraz aktivitelerini karşılaştırmak. </li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Telomer uzunluğu stresli ve yaşlanma hücre incelemek için eşsiz bir hücresel işaretleyici sağlar ve yaşlanma mekanizmaları irdeliyoruz. Yaşlanma rolü ilk önerilmiştir olmadığından, çalışmalar çok sayıda yaşı telomer uzunluğu ile yapılmıştır, uzun ömürlü, yaş ile ilgili hastalık, kanser ve stres. On yıllardır, telomer uzunluğu ölçümleri altın standart Güney melezleme kullanarak terminal kısıtlama parçası analizi oldu. Ancak, son zamanlarda Cawthon tarafından, ekonomik, hızlı ve gerçekleştirmek için kolay bir yöntem gelişti. Kantitatif Real-Time PCR kullanarak, Cawthon olası büyük örneklem büyüklüğü için çalışmalar yapmak, telomer uzunluğunu ölçmek için bir alternatif sundu. Mah-PCR kullanarak, birçok çalışma telomer uzunluğu ve sonuçlar, çeşitli özellikle yaşa bağlı hastalıklar arasındaki ilişkiyi araştırmak için yapılmıştır. Daha spesifik olarak, bu yöntem, araştırmacılar büyük epidemiyolojik Stu gerçekleştirmek için izin verditelomer uzunluğu ve çeşitli hastalıklara arasında anlamlı bir ilişki ya da inkar nüfus ölür. Birkaç, iskemik kalp hastalığı 7, Alzheimer Hastalığı 22, kadın 23, sigara içen 24 arasında akciğer kanseri, ailesel tiroid kanseri 25 osteocarcoma isim, diyabet 5, kan 27 yaşlanma basıncı 26, ve demans 28 daha kısa telomer uzunluğu ile ilişkili olan , yaşla ilgili maküler dejenerasyon 7, kolorektal kanser 43 ve enfeksiyöz hastalık, kanser, kalp veya serebrovasküler hastalık 44 ölüm telomer süresini anlamlı bir ilişki olduğu gösterilmiştir varken. Ayrıca, belirli bir gerilme örneğin kısa telomer uzunluğu, inflamatuvar belirteçleri artış miktarı, TNF-α ve IL-6 ile aynı olduğu gösterilmiştir, lökositler 29 kısa telomer uzunlukları ile ilişkili olmuştur. Ayrıca, stresli lifzaman alıcı çalışma programları, vardiyalı çalışma, ya da işin doğası gereği estyles, bir kronik hasta çocuk için özel bir bakıcı konumda, telomer uzunluğunda farklılıklar ile ilişkili bulunmuştur. Bu stres yeterli kurtarma 30, 31 olmadan telomer kısalması yoluyla erken yaşlanmaya neden olabilir göstermektedir. Yeni bir çalışmada, daha az sosyal ilişkileri olan aynı zamanda daha kısa telomer 32 ile ilişkilidir. Telomer uzunluğu kısalması önlenmesi aynı zamanda bir günlük multivitamin ve sigara içmeme 24, 33 alarak sağlıklı yaşam seçenekleri, ile ilişkili olduğu gösterilmiştir. Buna ek olarak, bu çalışmalar, siroz 34 olası gelişimi için invazif olmayan bir tarama testi, örneğin, ölçme telomer olası klinik kullanımları ortaya çıkardı. Diğer durumlarda, nerede benzer çalışmalar bir hastalık telomer uzunluğu arasında anlamlı bir ilişki (ya da mütevazı bir korelasyon) göstermiştir, araştırmacılar st için teşvik edilmiştirhücresel düşüş ve hastalıklı devlet 7 udy diğer yeni mekanizmalar. Bu çalışmalar sayıda gücü ve yaşlanma sürecini deşifre ilk adımlardan biri olarak telomer uzunluğu ölçme programı göstermiştir. Cawthon en Mah-PCR yöntemi çok sayıda insanın karşılaştırabilirsiniz çünkü, bu amaç için yararlı oldu az DNA gerektirir ve telomer uzunluğu ve hücre sağlığı arasında bir ilişki doğru güvenilir kanıt verebilir. Bu çalışmalar bazı genlerin, doku ve hücresel süreçleri gelecek yaşlanma araştırma çabalarını yönlendirmek için yardımcı olur. Telomer uzunluğu önemli bir fark olduğunu kaydetti sonra Kaçınılmaz olarak, bir açıklama sorgulanır. Cevap için bu sorulara, telomeraz çalışmaları, telomer bakım ve düzenleme ile ilgili enzim, kurulmuştur. PCR tabanlı telomeraz aktivitesi protokolleri yönelik ek bilgi vererek, teklif edilmiştir: a. devam belirlenmesitelomerlerin bozulması ve b ributions. telomeraz tarafından başarılı telomer uzunluğu bakım yetersizliği, böylece belirli bir hücre yaşlılık döneminde, bir bütün olarak yaşlanma üzerinde hikaye başka bir bölüm sağlar. Mah-PCR bireysel kromozom bazda ortalama telomer uzunluğu değil, algılar da, bu yöntem yaşlanma ve stres için hücre nasıl tepki vereceğini yönelik kanıt için güçlü bir araçtır ve nasıl yaş hikayenin bir başlangıç ​​sağlar. İlginçtir, bu bilgiler zaten biyolojik yaş tahmin için klinikte telomer uzunluğu ölçümü yol açmıştır ve yaşlanma sürecinin daha iyi tanımamıza ve kaçınılmaz önlenmesi veya gecikme ve yaşlanma ve yaşa bağlı hastalık tarama yol açacaktır. <table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Kantitatif Telomeraz Algılama </td&gt; <td> Müttefik Biyoteknoloji </td><td> MT3012 </td></tr><tr><td> Qiagen DNeasy Kiti </td><td> Qiagen </td><td> 69506 </td></tr><tr><td> LightCycler 480 SYBR Green I Usta, LightCycler 480 Enstrüman kullanarak SYBR Green I-tabanlı gerçek zamanlı PCR için hazır kullanımlı sıcak başlangıç ​​reaksiyon karışımı </td><td> Roche Diagnostics </td><td> 4707516 </td></tr></tbody></table>

Telomer kromozomların uçlarında bulunan DNA hexamer (TTAGGG) dizileri tekrarlıyor. Her hücre çoğaltma, bu kromozom uçları kısalır. Onlar çok kısa kalırsanız, kromozomların telomer sonunda füzyon, anormal rekombinasyon ve bozulma tabi olabilir. Bu nedenle yeterli telomer uzunluğu bakım kromozom istikrar ve hücre koruma 38 önemli bir rol oynar. Telomer uzunluğu bakım da kromozom uçları yanında bulundu genler için çok önemlidir, çünkü DNA replikasyonu kromozom 1-2 sonuna kadar devam edemez. Sonuç olarak, telomer kısalması önlenmesi hücre istikrarı artırabilir. Çeşitli çalışmalar telomer uzunluğu, 3-4, diyabet 5 ve kalp-damar hastalıkları 6,7 kanser gibi bir organizmanın uzun ömür ve hastalıklı devlet ile ilişkili olduğunu bildirmişlerdir. Ayrıca, kısaltılmış telomer aşırı stres ya da bir ile ilişkilendirilmiştirbelki erken hücre yaşlanma ve ölüm 9 teşvik ederek sağlıksız yaşam tarzı 8,. Öte yandan, bazı çalışmalarda hastalık 39, 40, 41 ilgili telomer uzunluğu ve uzun ömür ve yaş arasında anlamlı bir fark olduğunu bulduk. Telomer kısalması korunma hücrenin doğal mekanizmalardan biri kendi enzim telomeraz ters transkriptaz (TERT) aktive gereğidir. Bu enzim ve alt birimi, telomeraz RNA (TERC), bir kodlayıcı olmayan RNA, 10 sona erer kromozom telomer tekrar eklemek için bir şablon olarak telomer kullanın. Telomeraz aktivitesi hücreleri ve diğer mekanizmalar çeşitli telomer uzunluğu bakım katılan eksik olmasına rağmen, artan telomeraz aktivitesi artmış telomer uzunluğu ile ilişkilidir. Telomeraz aktivasyonu hücre hasarına cevap ve stres ve erken yaşlanma ve ölüm önlemek hangi mekanizmalardan biri olarak kurulmuştur. Örneğin, daha uzun telomeres olağanüstü ömrü 11 ile Aşkenazi Yahudilerin bir popülasyonda gösterildi, TERC veya TERT mutasyonlar yaşa bağlı hastalık 13 üzerinde bir etkiye sahip olduğu gösterilmiştir ölümcül hastalığı 12 ve telomeraz epigenetik düzenleme katkıda gösterilmiştir. Yılında keşfedilmesinden bu yana, telomer uzunluğu çeşitli hayvan modellerinde hem de insanlarda sağlık durumu için bir belirteç olarak önerdi, ancak kullanılan yöntem, sıkıcı uzun ve pahalı olduğu için bu ilk çalışmalarda yaygın olarak çoğaltmak için zordu edilmiştir. 2002 daha 2009 yılında ayarlanmış olarak, Cawthon önerilen ve telomer uzunluğu değerlendirmek ve daha fazla yaşlanma ve hastalık 19, hücre biyolojisi çeşitli yönleri rolünü araştırmak için yeni, doğru, hızlı ve basit bir PCR tabanlı protokol gösterdi. Bir çalışma için doğru telomer ölçüm metodu seçilmesi esastır. Şu anda, telomer uzunluğunu ölçmek için kullanılan çeşitli yöntemler kendi her vardıravantaj ve dezavantajları. A: Geleneksel olarak, telomer uzunluğu içerir terminal sınırlama parçaları Southern Blot analizi (TRFs) kullanılarak ölçülür. b TRFs elde etmek için tekrar telomer kesilmiş olmayan kısıtlama enzimleri ile DNA sindirici. Bu TRFs Southern Blot bir telomerik prob 14, 37 kullanılarak ortalama TRF uzunluğunu belirleyerek yapılır. Bu yöntem, bir varyasyon katsayısı ile son derece küçük bir doğru olmasına rağmen, doğrudan bir ölçüsüdür ve uzunluk dağılımı ölçmek için avantajlı olabilir, TRF analizi, emek yoğun maliyetlidir ve DNA bölgesinin en az 3 mg gerektirir. Bu yöntem prob tarafından nedeniyle (TTAGGG) n onlar, 42 15 içeren dizileri gibi tespit edilebilir subtelomerik DNA, karmakarışık hale olabilir kısa telomer ve uzunluk tayin duyarsız. Telomer uzunluğu ölçüm başka bir derece doğru bir yöntem Tek Telomer Uzama Uzunluk Analizi (STELA), bir singl olduğusadece DNA küçük bir miktar gerektirir E molekülü PCR tabanlı bir yöntemdir. Bu yöntemde, primerler kromozom sonunda G-zengin çıkıntı tanımak için ve belirli bir kromozom telomer güçlendirir bir kromozom üzerinde eşsiz bir subtelomerik sekansına bağlanmak için yapılır. Elde edilen amplifikasyon sonra Southern Blot tarafından görüntülenmiştir. Bu yöntem son derece doğru olma avantajına sahiptir ve kısa aykırı telomerlerin 16 tespit edebiliyor. Tüm kromozomlar G-zengin uçları ve kullanılabilir bir subtelomerik dizisi yazık ki, telomer uzunluğu sadece belirli kromozom üzerinde ölçülebilir ve bu ölçümlerin hücre 15 tüm telomer uzunluğu temsil olmayabilir. Uygulanmakta olan diğer bir yöntem telomer uzunluğu tespit etmek için, peptit nükleik asit (PNA) probların kullanılmasıdır. In situ Hibridizasyon Kantitatif floresans (Q-FISH) bize st metafaz sırasında telomerlerin görüntülemenizi sağlarbüyüklüklerine orantılı olarak bir PNA prob ile telomerlerin Aining belirli kromozom arasındaki telomer karşılaştırılması izin verir. Bu yöntem aynı zamanda interfaz hücreleri için de kullanılabilir, ancak burada farklı bir kromozom için telomer uzunluğu 17 yaşlı veya seyrek bölünen hücreleri telomer uzunluğu ölçülürken bir sınırlama getirmektedir ki, tespit edilemez. Akış BALIK yerine akım sitometri kullanır ve şu anda klinik ortamda kan hücrelerinin telomer uzunluğu ölçmek için en hassas yöntemdir, ancak çok yetenekli teknisyenler 18 gerektirir. Şu anda, bizim laboratuvarda ortalama telomer uzunluğu ölçmek için standart bir yöntem hassas, duyarlılık yararlanır ve kantitatif gerçek zamanlı PCR kolaylığı. Bu yöntem, aksi olarak üretilen olurdu primer-dimer-türevi ürünlerin sentezini önlemek yeni primerler gelişimi ile telomer uzunluğu ölçme mümkün oldutelomerlerin tekrar doğası gereği tandard testi. Bu tahlil için, telomer uzunluğunun ölçülmesi tek kopyalı gen sayısı için T / S oranı, telomer tekrar kopya sayısı ile temsil edilir. Telomer uzunluğu ve PCR başlangıç ​​aşamalarında esnasında DNA bağlama telomer etiketli primerlerin sayısı arasında doğru orantılı bir ilişki olduğu için, T / S oranı telomer uzunluğu ile doğrudan orantılıdır. T / S oranı Ct fark karşılaştırılarak ölçülür, örnek floresans birikmiş hangi fraksiyonel döngü sayısı telomer astar ile örnekleri ve astar 19 SCG arasında, taban floresans yukarıda birkaç standart sapma bir eşiği geçer. Bu yöntem, kromozom mükerrer veya kopya sayısı varyasyonları 15 durumunda, yanlış ölçümlere yol açabilir telomer uzunluğu dolaylı ölçümü, örneğin için eleştirilmiştir. Ayrıca, çalışmalar arasında karşılaştırma genellikle di olanfficult, ancak standart oligomerler mutlak telomer uzunluğu 20 ölçmek için geliştirilmiştir. Bu yöntem, tek renkli çok katlı qPCR testi kullanılarak, Cawthon tarafından üzerine geliştirilmiş daha da ileriye edildi. Bu deneyde, PCR primer-dimer bağlanma önlemek için ilk birkaç devir için daha düşük sıcaklıklarda gerçekleştirilir ve telomer ve kontrol geni daha fazla hata önlemek için, aynı PCR tüpü içinde analiz edildi. Ortaya çıkan telomer uzunluğu ölçümleri güçlü TRFs Southern blot analizi ile ölçülen telomer uzunluğu ile ilişkilidir ve yüksek doğruluk 15, 19, 36 oldu. Şu anda, QRT-PCR büyük çaplı test etmek için kullanılabilen tek uygun yöntem olup tek yürütmek için DNA küçük bir miktar gerektirir. Bu yöntemin çok önemli bir bölümü, bu doğru bitince, bu yöntem telomer uzunluğu hakkında değerli karşılaştırmalı bilgi sağlayabilir, böylece kapsamlı kalite kontrol önlemleri olduğunu. Buna ek olarak, bu yöntem ölçmek için lökositlerin dışında kullanım için adapte edilmişfarklı çok çeşitli dokulardan 42 telomer uzunluğu. Ayrıca, daha da telomer boyu bakım ve iki karşıt etkileri (telomeraz enzimi tarafından çoğaltma ve uzama sırasında yani telomer kısalması) arasındaki etkileşimleri arkasındaki biyoloji anlamak için, biz telomeraz aktivitesini ölçer ek yöntemi ile telomer uzunluğu yöntemi eşlik etti. Bu amaçla, bir Telomer Tekrar amplifıkasyon protokolü, bir in vitro deney kullanılabilir. Kısaca, lize, konserve, enzimatik olarak aktif hücrelerin telomeraz kullanılarak bir oligonükleotid alt tabaka üzerine telomerik tekrar sentezlenir ve ürünlerin SYBR Green mevcudiyetinde PCR ile amplifiye edildi. Sonuçlar daha sonra örnek karşılaştırma ve kontrol Ct eşik değerleri ile analiz edildi. Telomeraz bir ısıya duyarlı enzim olduğundan, ek bir ısı kontrol tedavi her bir örnek 21 ile birlikte çalıştırılır. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; telomer uzunluğu ölçme yaşlanma ve hastalığın patofizyolojisinde telomer uzunluğu olası rolüne değerli bilgiler sağlayabilir iken, telomer uzunluğu bir statik özellik ve daha fazla bilgi değildir telomer fonksiyonu anlamak için gereklidir. Telomeraz aktivite çalışmaları telomer uzunluğu düzenleme mekanizmaları hakkında bilgiler ekleyebilirsiniz. Örneğin, telomeraz kontrollü aktivasyonu telomer uzunluğu ve hücre çoğalmasını sürdürmek olabilir, ancak telomeraz kontrol dışı bir etkinleşme kansere neden olabilir. Birlikte bu iki ucuz ve yalındır yöntemleri telomer uzunluğu ve hücre istikrar arasında bir ilişki doğru daha güçlü kanıtlar değil, aynı zamanda telomer kısalması ve kurtarma olası mekanizmaları içine daha fazla anlayış ile sadece sağladı. Bu yöntemler ile, daha da merkezi mechanis daha iyi anlaşılması nihai hedefi ile yaşlanma ve hücre çoğalması çeşitli devletlere hücrenin cevabı aydınlatmak için umuthücre biyolojisi ms.

<table><tbody><tr><td>Quantitative Telomerase Detection </td><td>Allied Biotech</td><td>MT3012</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen DNeasy Kit</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 SYBR Green I Master, Ready-to-use hot start reaction mix for SYBR Green I-based real-time PCR using the LightCycler 480 Instrument</td><td>Roche Diagnostics</td><td>4707516</td><td></td></tr></tbody></table>

telomere length and telomerase activity; a yin and yang of cell senescence

Telomer ucunda DNA dizileri tekrarlıyor uzunluğunda ve insanlarda çeşitlidir kromozom 15.000 baz çifti uzunluğunda ulaşabilirsiniz biter. Telomer her hücre bölünmesi de kromozom yıpratma Bio koruyucu mekanizması olarak hizmet vermektedir. Belirli bir süre de, telomerlerin çoğaltma, kromozom istikrarsızlık ya da hücre ölümüne yol açabilir bir süreç sağlamak için çok kısa olur. Yıpratma ve uzama: telomer uzunluğu iki karşıt mekanizmalarla düzenlenir. Her hücrenin bölünmesinden olarak yıpratma oluşur. Buna karşılık, uzama kromozomların uçlarına tekrar dizileri ekler enzim telomeraz, kısmen modüle edilir. Bu şekilde, telomeraz muhtemelen bir yaşlanma mekanizması ters ve hücre canlılığı gençleştirir olabilir. Bu hücre yaşam sürdürmek çok önemli unsurlardır ve hücresel yaşlanma değerlendirmek için kullanılır. Bu yazıda biz birden fazla dokuda telomer uzunluğu değerlendirmek için doğru, kısa, gelişmiş ve ucuz yöntem anlatacağıms ve tür. Bu yöntem, telomer dizisinin tandem tekrar ve test örneklerinin diferansiyel kopya sayıları tespit etmek için Mah-PCR duyarlılığı, iki temel unsuru yararlanır. Buna ek olarak, telomer uzunluğu için tamamlayıcı bir omurga test olarak telomeraz aktivitesini değerlendirmek için basit bir test tarif edecektir.

Telomer uzunluğu QRT-PCR bir örneği Şekil 1&#39;de gösterilmiştir. Sol üst paneli üzerinde, kırmızı ve yeşil İşaretlenmiş örnekler 96 oyuklu plaka üzerine test deneklerin yeri temsil eder. Sağ üst panelinde, kuvvetlenme eğrisinin gösterilmiştir. Her konuda triplicates yapılır iki testleri (Telomer ve Tek Kopya Gen), tarafından test edilir. Seçilen bireylerin iki tahlil içinde üretilen farklı DNA kopya sayısı nedeniyle, floresans algılama kadar çevrim sayısı ve logaritmik eğrisi tahliller arasında farklılık ulaşır. Yüksek kopya sayısı tüplerde (yani Telomer testi), floresan algılama miktarı 27 döngüleri sonra üstel eğri ulaşır. Hatları ikinci seti genom tek bir kopya sahip tek kopya Gene (SCG) temsil eder, ve böylece telomer örnekleri daha az kopyası vardır ve yalnızca 31 devir sonra üstel değerine ulaşıldığında. Kahverengi çizgiler standart temsilÖrnek bilinen konsantrasyonlarda bir seri seyreltme esas eğrisi. Sağ alt panelde standart eğri noktaları (düz bir çizgi optimal bir seri seyreltme gösteren) bir günlük konsantrasyonu temsil eder. Bu doğrusal bir eğri test tüpleri (alt sol panel) konsantrasyonunu hesaplamak için kullanılmaktadır. Başlangıçta Cawthon elleri 19, ve bize ve başkaları tarafından tekrar, terminal restriksiyon parça uzunluk yöntemi ile elde edilen ile ilişkili olduğu gösterilmiştir yılında Mah-PCR sonuçları,. Bir T / S oranı birimi (SCG çalıştırmak Mah-PCR döngüleri üzerinde telomer çalıştırmak Mah-PCR döngüleri) lökosit 42 4.270 bp bir ortalama telomer uzunluğu eşdeğerdir. Bizim örneğimizde SCG yöntemi ile Telomer testi için Mah-PCR döngüleri bölme 3.715 bp ortalama eşdeğerdir 0.87 oranında, sonuçlandı. Bu ölçüm, tek başına telomer uzunluğu oluşur ve subtelomerik bölge içermez. Mah-PCR çok az numune hazırlama dahil burada gösterdi. Bu örnekte, (Şekil 1), nitel hem de nicel farklar (seri seyreltme ve üçlü suretler halinde arasındaki uyum ile temsil edilir), iki tahliller arasında gözlenmiştir. Bu test hesaplanan sonuçları 65 yaşındaki konu için ara telomer uzunluğu gösterir. Telomeraz aktivitesi test sonuçları ve telomeraz aktivitesi ve telomer uzunluğu arasındaki olası ilişki bir örnek Şekil 2 ile gösterilmiştir. Bizim ilk sonuçlar daha uzun telomer uzunluğu artmış telomeraz aktivitesi ile ilişkili olabileceğini göstermektedir. <img src="/files/ftp_upload/50246/50246fig1.jpg" alt="Şekil 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50246/50246fig1highres.jpg"/> Şekil 1. Şekil 1 aq gelen tipik bir çıkış temsilTelomer uzunluğu için RT-PCR testi ile ölçüldü. Sol üst köşesinde üç kez, 96 oyuklu bir plaka içinde düzenlenmiş örnekleri göstermektedir. Sol alt köşesinde T / S değerleri hesaplamak için kullanılır, her numune için hesaplanan konsantrasyonu ve CT değerleri, listeler. Üst sağ sonuçları görselleştirmek için kullanılan amplifikasyon eğrisi (CYBR yeşil floresans tespit karşı devir sayısı), bir grafiğidir. Sağ alt, seri seyreltme kontrolü CT değeri karşı Oturum konsantrasyonu için standart eğri grafikle edilir. Düz bir çizgi seri seyreltme doğru ölçülüp yüklenmiş olduğunu onaylar. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50246/50246fig1large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img src="/files/ftp_upload/50246/50246fig2.jpg" alt="Şekil 2,"/> Şekil 2. , Telomeraz aktivitesi ve telomeraz uzunluğu için Mah-PCR ilk sonuçlarına kullanarak &lt;strong&gt; Şekil 2 Ct değeri ile ölçülen bir doğrudan, önemli bir T / S oranı ile ölçülen telomer uzunluğu arasında bir ilişki (p = 0.008), ve telomeraz aktivitesi, gösterir.

Watch this Scientific Journal Video about Telomere Length and Telomerase Activity; A Yin and Yang of Cell Senescence at JoVE.com

Telomere Length and Telomerase Activity; A Yin and Yang of Cell Senescence

Doğru, kısa sofistike ve ucuz bir yöntem birden fazla doku ve Mah-PCR kullanarak türlerde telomer uzunluğu değerlendirir olduğu açıklanmıştır. Buna ek olarak, telomer uzunluğu için tamamlayıcı bir omurga test olarak telomeraz aktivitesini değerlendirmek için basit bir test tarif edecektir.

Telomer uzunluğu ve Telomeraz Aktivitesi, Hücre Yaşlılık bir Yin ve Yang

Telomeres  are repeating DNA sequences at the tip ends of the chromosomes that are diverse  in length and in humans can reach a length of 15,000 base ...

telomere-length-telomerase-activity-yin-yang-cell

Nanyang Technological University

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Molecular Biology

Biology

Unit 1

DNA Replication

SCIENTISTS IN ACTION

46.4K Görüntüleme.  Albert Einstein College of Medicine. Doğru, kısa sofistike ve ucuz bir yöntem birden fazla doku ve Mah-PCR kullanarak türlerde telomer uzunluğu değerlendirir olduğu açıklanmıştır. Buna ek olarak, telomer uzunluğu için tamamlayıcı bir omurga test olarak telomeraz aktivitesini değerlendirmek için basit bir test tarif edecektir.

Video: Telomere Length and Telomerase Activity; A Yin and Yang of Cell Senescence

Modified Terminal Restriction Fragment Analysis for Quantifying Telomere Length Using In-gel Hybridization

There are several different techniques for measuring telomere length, each with their own advantages and disadvantages. The traditional approach, Telomere Restriction Fragment (TRF) analysis, utilizes a DNA hybridization technique whereby genomic DNA samples are digested with restriction enzymes, leaving behind telomere DNA repeats and some sub-telomeric DNA. These are separated by agarose gel electrophoresis, transferred to a filter membrane and hybridized to oligonucleotide probes tagged with either chemiluminescence or radioactivity to visualize telomere restriction fragments. This approach, while requiring a larger quantity of DNA than other techniques such as PCR, can measure the telomere length distribution of a population of cells and allows measurement expressed in absolute kilobases. This manuscript demonstrates a modified DNA hybridization procedure for determining telomere length. Genomic DNA is first digested with restriction enzymes (that do not cut telomeres) and separated by agarose gel electrophoresis. The gel is then dried and the DNA is denatured and hybridized in situ to a radiolabeled oligonucleotide probe. This in situ hybridization avoids loss of telomere DNA and improves signal intensity. Following hybridization, the gels are imaged utilizing phosphor screens and the telomere length is quantified using a graphing program. This procedure was developed by the laboratories of Drs. Woodring Wright and Jerry Shay at the University of Texas Southwestern1,2. Here, we present a detailed description of this procedure, with some modifications.

In this article, a detailed protocol for quantifying telomere length using a modified terminal restriction fragment analysis is discussed that provides fast and efficient direct measurement of telomere length. This technique can be applied to a variety of cell sources of DNA for quantifying telomere length.

Jel Hibridizasyonunu Kullanarak Telomer Uzunluğunu Nicellemek İçin Modifiye Terminal Restriction Fragment Analysis

There are several different techniques for measuring telomere length, each with their own advantages and disadvantages. The traditional approach, Telomere ...

Kanser Araştırmaları

Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a hallmark of various pathophysiological conditions including tumor suppression, tissue remodeling and aging. The inducers of cellular senescence in vivo are still poorly characterized. However, a number of stimuli can be used to promote cellular senescence ex vivo. Among them, most common senescence-inducers are replicative exhaustion, ionizing and non-ionizing radiation, genotoxic drugs, oxidative stress, and demethylating and acetylating agents. Here, we will provide detailed instructions on how to use these stimuli to induce fibroblasts into senescence. This protocol can easily be adapted for different types of primary cells and cell lines, including cancer cells. We also describe different methods for the validation of senescence induction. In particular, we focus on measuring the activity of the lysosomal enzyme Senescence-Associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-gal), the rate of DNA synthesis using 5-ethynyl-2&#39;-deoxyuridine (EdU) incorporation assay, the levels of expression of the cell cycle inhibitors p16 and p21, and the expression and secretion of members of the Senescence-Associated Secretory Phenotype (SASP). Finally, we provide example results and discuss further applications of these protocols.

Here, we discuss a series of protocols for induction and validation of cellular senescence in cultured cells. We focus on different senescence-inducing stimuli and describe the quantification of common senescence-associated markers. We provide technical details using fibroblasts as a model, but the protocols can be adapted to various cellular models.

İndüksiyon ve birincil insan hücrelerinde hücresel yaşlanma doğrulama

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a ...

Gelişim Biyolojisi

A Quantitative Measurement of Reactive Oxygen Species and Senescence-associated Secretory Phenotype in Normal Human Fibroblasts During Oncogene-induced Senescence

Cellular senescence has been considered a state of irreversible growth arrest upon exhaustion of proliferative capacity or exposure to various stresses. Recent studies have extended the role of cellular senescence to various physiological processes, including development, wound healing, immune surveillance, and age-related tissue dysfunction. Although cell cycle arrest is a critical hallmark of cellular senescence, an increased intracellular reactive oxygen species (ROS) production has also been demonstrated to play an important role in the induction of cellular senescence. In addition, recent studies revealed that senescent cells exhibit potent paracrine activities on neighboring cells and tissues through a senescence-associated secretory phenotype (SASP). The sharp increase in interest regarding therapeutic strategies against cellular senescence emphasizes the need for a precise understanding of senescence mechanisms, including intracellular ROS and the SASP. Here, we describe protocols for quantitatively assessing intracellular ROS levels during H-Ras-induced cellular senescence using ROS-sensitive fluorescent dye and flow cytometry. In addition, we introduce sensitive techniques for the analysis of the induction of mRNA expression and secretion of SASP factors. These protocols can be applied to various cellular senescence models.

Intracellular ROS has been shown to play an important role in the induction of cellular senescence. Here, we describe a sensitive assay for quantifying ROS levels during cellular senescence. We also provide protocols for assessing the senescence-associated secretory phenotype, which reportedly contributes to various age-related dysfunctions.

Reaktif oksijen türleri ve yaşlanma ilişkili salgı fenotip Normal insan fibroblast içinde bir nicel ölçüm onkogen kaynaklı yaşlanma sırasında

Cellular senescence has been considered a state of irreversible growth arrest upon exhaustion of proliferative capacity or exposure to various stresses. ...

<meta charset="utf8"></head><body>İnsan Popülasyonu Çalışmalarında Doğru Telomer Uzunluğu Değerlendirmesi

Monochrome Multiplex Quantitative PCR Telomere Length Measurement

Telomeres are ribonucleoprotein structures at the end of all eukaryotic chromosomes that protect DNA from damage and preserve chromosome stability. Telomere length (TL) has been associated with various exposures, biological processes, and health outcomes. This article describes the monochrome multiplex quantitative polymerase chain reaction (MMqPCR) assay protocol routinely conducted in our laboratory for measuring relative mean TL from human DNA. There are several different PCR-based TL measurement methods, but the specific protocol for the MMqPCR method presented in this publication is repeatable, efficient, cost-effective, and suitable&#160;for population-based studies. This detailed protocol outlines all information necessary for investigators to establish this assay in their laboratory. In addition, this protocol provides specific steps to increase the reproducibility of TL measurement by this assay, defined by the intraclass correlation coefficient (ICC) across repeated measurements of the same sample. The ICC is a critical factor in evaluating expected power for a specific study population; as such, reporting cohort-specific ICCs for any TL assay is a necessary step to enhance the overall rigor of population-based studies of TL. Example results utilizing DNA samples extracted from peripheral blood mononuclear cells demonstrate the feasibility of generating highly repeatable TL data using this MMqPCR protocol.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: Travmanın Hücresel Yaşlanma Üzerindeki Etkisini Keşfetmek

Here we present a protocol for the measurement of relative telomere length (TL) using the monochrome multiplex quantitative polymerase chain reaction (MMqPCR) assay. The MMqPCR assay is a repeatable, efficient, and cost-effective method for measuring TL from human DNA in population-based studies.

Monokrom Multipleks Kantitatif PCR Telomer Uzunluğu Ölçümü 

Telomeres are ribonucleoprotein structures at the end of all eukaryotic chromosomes that protect DNA from damage and preserve chromosome stability. ...

Genetik

Radyoaktif Olmayan Kemilüminesans Tespiti Kullanılarak Telomer Uzunluğunun Ölçülmesi

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening occurs due to a problem with end replication and the absence of the telomerase enzyme, which is responsible for maintaining telomere length. Interestingly, telomeres also shorten in response to various internal physiological processes, like oxidative stress and inflammation, which may be impacted due to extracellular agents like pollutants, infectious agents, nutrients, or radiation. Thus, telomere length serves as an excellent biomarker of aging and various physiological health parameters. The TAGGG telomere length assay kit is used to quantify average telomere lengths using the telomere restriction fragment (TRF) assay and is highly reproducible. However, it is an expensive method, and because of this, it is not employed routinely for large sample numbers. Here, we describe a detailed protocol for an optimized and cost-effective measurement of telomere length using Southern blots or TRF analysis and non-radioactive chemiluminescence-based detection.

Yazar Spotlight: TAGGG Telomer Uzunluk Testi'nin Performans Parametrelerinin Optimizasyonu  

Here, we describe in detail the protocol for quantifying telomere length using non-radioactive chemiluminescent detection, with a focus on the optimization of various performance parameters of the TAGGG telomere length assay kit, such as buffer quantities and probe concentrations.

TAGGG Telomer Uzunluk Testi'nin Performans Parametrelerinin Optimizasyonu

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening ...

https://cloudfront-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/CDNSource/teasers/65288.jpg

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and lifespan. In addition, telomerase protects the mitochondria from oxidative stress and confers resistance to apoptosis, suggesting its possible importance for the surviving of non-mitotic, highly active cells such as neurons. We previously demonstrated the ability of novel telomerase activators to increase telomerase activity and expression in the various mouse brain regions and to protect motor neurons cells from oxidative stress. These results strengthen the notion that telomerase is involved in the protection of neurons from various lesions. To underline the role of telomerase in the brain, we here compare the activity of telomerase in male and female mouse brain and its dependence on age. TRAP assay is a standard method for detecting telomerase activity in various tissues or cell lines. Here we demonstrate the analysis of telomerase activity in three regions of the mouse brain by non-denaturing protein extraction using CHAPS lysis buffer followed by modification of the standard TRAP assay.
In this 2-step assay, endogenous telomerase elongates a specific telomerase substrate (TS primer) by adding TTAGGG 6 bp repeats (telomerase reaction). The telomerase reaction products are amplified by PCR reaction creating a DNA ladder of 6 bp increments. The analysis of the DNA ladder is made by 4.5% high resolution agarose gel electrophoresis followed by staining with highly sensitive nucleic acid stain.
Compared to the traditional TRAP assay that utilize 32P labeled radioactive dCTP&#39;s for DNA detection and polyacrylamide gel electrophoresis for resolving the DNA ladder, this protocol offers a non-toxic time saving TRAP assay for evaluating telomerase activity in the mouse brain, demonstrating the ability to detect differences in telomerase activity in the various female and male mouse brain region.

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol TRAP Assay

Telomerase is expressed in the neonatal brain and also in distinct regions of the adult brain. We present a non-toxic time saving TRAP assay for the analysis of telomerase activity in various regions of the mouse brain and detection of differences in telomerase activity between male and female mouse brains.

Telomer uzunluğu ve Telomeraz Aktivitesi, Hücre Yaşlılık bir Yin ve Yang

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Jel Hibridizasyonunu Kullanarak Telomer Uzunluğunu Nicellemek İçin Modifiye Terminal Restriction Fragment Analysis

İndüksiyon ve birincil insan hücrelerinde hücresel yaşlanma doğrulama

Reaktif oksijen türleri ve yaşlanma ilişkili salgı fenotip Normal insan fibroblast içinde bir nicel ölçüm onkogen kaynaklı yaşlanma sırasında

Monokrom Multipleks Kantitatif PCR Telomer Uzunluğu Ölçümü

Monokrom Multipleks Kantitatif PCR Telomer Uzunluğu Ölçümü

Monokrom Multipleks Kantitatif PCR Telomer Uzunluğu Ölçümü

TAGGG Telomer Uzunluk Testi'nin Performans Parametrelerinin Optimizasyonu

TAGGG Telomer Uzunluk Testi'nin Performans Parametrelerinin Optimizasyonu

TAGGG Telomer Uzunluk Testi'nin Performans Parametrelerinin Optimizasyonu

Fare Beyin Çeşitli Bölgelerinde Telomeraz Aktivite: Radyoaktif olmayan Telomeraz Amplifikasyon Protokolü tekrarlayın (TRAP) Deneyi