이 논문에서 설명하는 작업은 패트릭 F. 테일러 재단의 자금에 의해 가능하게되었다.

1. 자기편 세포의 염색체 수확 <ol><li> 표준 프로토콜 <ol><li> 특정 세포 배양 조건에 따라 세포를 성장. 세포가 로그 단계 (80 % 컨 플루)에 도달 한 경우, 세포 배양 플라스크에 Colcemid의 10 μL / ㎖를 추가합니다. 2 × 10 6 세포의 최소 권장합니다. </li><li> 45 분 동안 5 % CO 2 배양기에서 37 ° C에서 세포를 품어. 멸균 피펫을 사용하여, 15 ML 원뿔 튜브에 세포에서 미디어를 전송할 수 있습니다. 옆으로 설정합니다. </li><li> 조심스럽게 플라스크에 HBSS 버퍼 2 ㎖를 추가하여 세포를 씻으십시오. 소용돌이 버퍼링 한 후 피펫을 사용하여 제거합니다. 폐기하십시오. </li><li> 이 플라스크의 전체 표면을 커버 것을 보장, 트립신 1 ML을 추가합니다. 약 2 분 동안 트립신의 세포를 둡니다. 세포의 대다수가 분리 한 후에 다시 셀에 원추형 튜브 미디어 피펫. </li><li> 15 ML 원뿔 튜브에 10 ㎖ 분량 씩에 세포 현탁액을 전송합니다.10 분 200 XG에 원심 분리기. 상층 액을 제거하고 펠렛을 재현 탁. </li><li> 원뿔 튜브에 남아있는 펠릿에 37 ° C에 데워진 된 0.075 M의 KCl 10 ㎖를 추가합니다. 의 KCl과 세포를 혼합하는 중간 속도의 소용돌이 관. </li><li> 10 분 동안 37 ° C에서 세포를 품어. 25 ℃에서 5 분 200 XG에 원심 분리기 과에 resuspend 펠렛 (약 0.5 ml의 유적까지) 뜨는을 제거합니다. </li><li> 소용돌이로 교반하면서 세포 : 조심스럽게 신선한 Carnoy의 정착액 5 ㎖ (빙초산, 메탄올의 비율은 3:1)를 추가합니다. 그런 다음 10 ㎖의 총 텍싱없이 정착보다 5 ㎖를 추가합니다. </li><li> 5 분 200 XG에 원심 분리기. 뜨는에 resuspend 세포를 제거합니다. 각 튜브에 정착의 5 ML을 추가합니다. </li><li> 5 분 200 XG에 원심 분리기. 뜨는에 resuspend 세포를 제거합니다. 각 튜브에 정착의 5 ML을 추가합니다. 세포는 지금까지 1 년에 4 ° C에 저장할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 의정서 수정 : 염색체 harvesti임파 세포 라인의 NG <ol><li> 특정 세포 배양 조건에 따라 세포를 성장. (사용은 세포가 배양되는 금액에 대해 적절한 플라스크). 세포가 로그 단계 (세포가 분할되어 대략 2 일 후)에 도달하면, 세포 배양 플라스크에 Colcemid의 10 μL / ㎖를 추가합니다. </li></ol></li><li> 의정서 수정 : 전체 혈액에서 염색체 수확 피토 헤 마글 루티 닌 (PHA)는 빨간색 신장 콩에서 유래 된 렉틴은, 인간 T-세포 (16)에 대한 강력한 유사 분열 물질이다. 72 시간 배양에 PHA의 첨가 후, 세포의 약 45 %는 S 단계에있다. 이 피크 유사 분열 활동을 대표하는, 염색체 연구에 수확하는 최적의 지점입니다. B 세포에게 17,18 분석시 등의 pokeweed (1-10 ㎍ / ㎖)와 같은 다른 유사 분열 물질이 사용될 수있다. <ol><li> 녹색 정상 나트륨 헤파린 튜브에 전체 혈액의 적어도 1 ㎖를 수집합니다. 수집 후 3 일 이내에 사용하십시오. RT UN에서 보관 혈액사용할 준비가 나타나기 전까지는. </li><li> 분취 L-글루타민 (20 % 소 태아 혈청, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신, 1 % fungizone 및 1 % PHA)를 함유하는 완전 RPMI 매체 10ml에 전혈 0.25 밀리리터. 5 % CO 2와 37 ° C에서 문화. </li></ol></li><li> 의정서 수정 : 골수에서 염색체 수확 염색체 이상 클론의 관찰이 백혈병의 특정 유형에 대한 진단 할 수 있으므로 골수에서 세포 유전 학적 분석은 많은 악성 혈액 질환에 도움이됩니다. 염색체 연구는 또한 폭발의 위기와 치료에 대한 반응의 증상으로 질병의 진행을 평가하는 데 사용됩니다. 골수 세포는 활발하게 분열하고 있기 때문에, 어떠한 미토 겐 자극 9,19 필요 없다. 급성 백혈병의 경우 24, 48 시간 배양도 설정되어 있습니다. <ol><li> 녹색 정상 나트륨 헤파린 관에서 골수의 최소 1 ㎖를 수집합니다. L-글루타민 (2을 함유하는 완전 RPMI 매체 10ml에 골수의 분취 0.25 밀리리터0 % 소 태아 혈청, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신, 1 % fungizone). 5 % CO 2와 37 ° C에서 문화. </li></ol></li></ol> 2. 슬라이드 준비 및 고체 염색 한 대표 슬라이드의 신속한 평가는 G-밴딩, FISH, CGH, 또는 SKY로 추가 절차를 계속하기 전에 수확의 품질에 대한 정보를 제공합니다. 일부 연구소는 고체 얼룩에 빠른 수확 및 염색체 평가를위한 세포를 선호합니다. 대안 적으로, 위상차 현미경은이 분석을 위해 사용될 수있다. 슬라이드는 유용한 습도가 약 50 % 일 때 제조 및 주위 온도 (20-25 ℃)된다. <ol><li> 25 ℃에서 5 분 200 XG에서 세포를 원심 분리기 만 0.3 ~ 0.5 ㎖의 유적까지 뜨는을 제거합니다. </li><li> 야간 부드럽게 약 45 °의 각도로 기울어 및 현탁액이 허용되는 슬라이드에 대해 2의 거리에서 세포 현탁액의 펠릿, 피펫 세 방울을 재현 탁슬라이드 가로 질러. 슬라이드에 신선한 Carnoy의 정착액의 하나의 큰 방울을 추가합니다. </li><li> 종이 타월에 슬라이드 뒷면을 건조 후 적어도 10 분 동안 건조 밖으로 슬라이드를 앉아. 슬라이드가 완전히 건조해야한다. </li><li> 신선한 지엠 사 (Giemsa) 염색 솔루션 (Gurr 버퍼와 지엠 사 (Giemsa) 얼룩의 비율은 3:1)를 준비합니다. 염색 랙에 슬라이드를 놓습니다. 지엠 사 (Giemsa) 염색 용액에 슬라이드 전체를 커버. 슬라이드가 5 분 동안 염색 용액에 남아 보자. 증류수로 슬라이드를 씻어 흘려 공기 건조 할 수 있습니다. </li><li> 4 글라스를 덮고 퍼 마운트로 봉입 방울과 슬라이드 커버 슬립을 추가합니다. 확실히 커버 슬립 아래에 기포가 없는지 확인합니다. 초과 글라스를 덮고 퍼 마운트로 봉입는 종이 타월로 제거 할 수 있습니다. </li><li> 10X 및 100X 확대에 따라 광학 현미경으로 세포를 분석 할 수 있습니다. 중기 세포가 풍부하고 잘 확산되는 경우에, 나머지 슬라이드는 다른 실험 절차를 위해 사용될 수있다. </li></ol> 3. G-밴딩 트립신과 지엠 사 (Giemsa) (GTG)를 사용하여 &lt;P&gt; 트립신 높은 전사 활동의 결과로 DNA의 지역에서 실 염색질 (euchromatin) 히스톤을 변성 단백질 분해 효소이다. 지엠 사 (Giemsa) 염색 후,이 지역은 빛 밴드로 나타납니다. 거의 또는 전혀 전사 활동 (이질)와 매우 응축 된 염색질은 트립신 보호의 히스톤의 큰 부분이있을 것이다, 따라서 지엠 사 (Giemsa) 염색 다음 어둡게 얼룩 것입니다. 그것은 처음에 G-밴드 하나의 슬라이드에 조건을 모니터링하고 필요한 경우 후속 슬라이드의 트립신의 타이밍을 조절하는 것이 필수적입니다. <ol><li> 4 코 플린 단지에 다음과 같은 솔루션을 추가합니다. 항아리 # 1 1X HBSS의 = 30 ㎖ 및 10 배 트립신 4 ㎖ (0.5 %) 1X HBSS의 항아리 # 2 = 50 ㎖ 항아리 # 3 = 1X HBSS 45 ㎖ 및 소 태아 혈청 5 ㎖ 1X HBSS의 항아리 # 4 = 50 ㎖ </li><li> 5 초 동안 단지 1 위의 각 슬라이드, 항아리 # 2의 빠른 헹굼을 담가, 적어도 30 초 동안 항아리 # 3 항아리 # 4 빠른 헹굼을 각 슬라이드를 떠나 다음 슬라이드를 건조 할 수 있습니다. </li><li> 청정제를 준비H 지엠 사 (Giemsa) 염색 솔루션 (Gurr 버퍼와 지엠 사 (Giemsa) 얼룩의 비율은 3:1). 염색 랙에 슬라이드를 놓습니다. 지엠 사 (Giemsa) 염색 용액에 슬라이드 전체를 커버. 슬라이드가 5 분 동안 염색 용액에 남아 보자. </li><li> 그들은 더러워졌다 동일한 순서로 증류수에 슬라이드를 헹군다. 슬라이드를 약 10 분 동안 건조하도록 허용합니다. 슬라이드가 완전히 건조해야한다. </li><li> 4 글라스를 덮고 퍼 마운트로 봉입 방울과 슬라이드 커버 슬립을 추가합니다. 확실히 커버 슬립 아래에 기포가 없는지 확인합니다. 초과 글라스를 덮고 퍼 마운트로 봉입는 종이 타월로 제거 할 수 있습니다. </li><li> 10X 및 100X 확대에 따라 광학 현미경으로 세포를 분석 할 수 있습니다. 첫 번째 슬라이드의 결과에 기초하여 슬라이드의 나머지의 트립신 타이밍을 조정한다. </li></ol>

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우리는 다양한 인간에서 얻은 세포 유형, 붉은 털 원숭이, 쥐, 생쥐 11,20-22 등 다양한 생물의 세포에서 염색체 분리를위한 본 절차를 이용했다. 표준 프로토콜은 제공되지만, 특정 주요 단계와 변수는 세포의 이러한 다양한 유형의 조정해야 할 수도 있습니다. 몇몇 특정 단계 염색체 제제 및 결과의 최상의 품질을 보장​​하기 위해 G-밴딩 모두에 중요하다. 분석에 영향을 미칠 수있는 변?...

염색체 분석은 염색체 불안정성과 유전 질환 및 악성 종양의 1,2,8,9로 이어지는 재 배열을 진단하기 위해 전 세계적으로 이용되는 기존의 기술입니다. 또한, 헌법과 암 획득 유전자 이상을 진단 및 연구에 대한 높은 해상도는 형광 제자리 교잡 (FISH)와 같은 고전적인 세포 유전 학적 절차 및 분자 유전 학적 방법의 조합, 비교 게놈 교잡 (CGH)을 달성 할 수 있습니다 그리고 스펙트럼의 핵형 분석 (SKY) 14, 15. 더 최근에, 이러한 기술은 줄기 세포 연구와 관련된 염색체 불안정성의 평가에 이용되어왔다. 이러한 장기 배양 된 배아 세포 (ES)와 다양한 생물의 성체 줄기 세포의 이수성으로 핵형 이상은 여러 실험실에서보고되었다. 최근의 증거는 어떤 세포주가 본질적으로 염색체 instabi하는 경향 것을 지원에 관계없이 배양 조건의 품 질. 확립 및 / 또는 인간, 마우스 또는 히말라야 줄기 세포주를 유지하면 이러한 이유로, 염색체 분석 품질 관리 프로세스의 일부로서 추천. 많은 보고서 배양 10-13 줄기 세포 및 악성 세포 또는 다양한 유기체의 염색체 안정성을 모니터링 루틴 세포 유전학 및 분자의 사용에 대한 관심의 증가를 설명한다. 이러한 프로토콜은 점점 그 배양 세포 (13)의 급속한 염색체 평가에 비유 전적 연구소에서 사용되고있다. 우리는 다양한 유기체에서 파생 된 임상 및 연구 목적으로 세포 모두에 적용 할 수있는 다양한 종류의 세포에서 염색체 준비를위한 우리의 기본적인 절차를 제시한다.

<table><tbody><tr><td>KaryoMAX Colcemid</td><td>Gibco</td><td>15212-012</td><td></td></tr><tr><td>HBSS Buffer</td><td>Gibco</td><td>24020-117</td><td></td></tr><tr><td>0.5% Trypsin EDTA 10x</td><td>Gibco</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>Buffer Tablets &quot;GURR&quot;</td><td>Gibco</td><td>10580-013</td><td></td></tr><tr><td>Geimsa Stain</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>3250-16</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Caledon Laboratory Chemicals</td><td>6700130</td><td></td></tr><tr><td>Glacial Acetic Acid</td><td>Krackeler Scientific Inc.</td><td>11-9508-05</td><td></td></tr></tbody></table>

chromosome preparation from cultured cells

염색체 (염색체) 분석에 널리 염색체 불안정성의 검출에 사용된다. G-밴딩과 같은 현장 하이브리드 화 (물고기)의 형광 등의 분자 기술에 의해 다음 경우,이 분석은 하나 이상의 염색체를 포함하는 게놈 재 배열 부분의 이익 또는 손실을 포함 수차에 대한 개별 세포를 분석 할 수있는 강력한 기능을 가지고 있습니다. 인간의 염색체 이상이 약 1 160 명당 1, 2, 모든 유산 60 ~ 80 %가 발생하는 3,4, 사산의 10 % 2,5, 선천성 심장 질환 6 3-6 %를 개인의 13 % 불임의 경우 2, 발달 지연과 출생 결함 (7)을 가진 많은 환자에서. 클론 염색체 이상을 관찰 모두 진단 및 예후 중요성 8,9이 표시되었습니다로 악성 종양의 세포 유전 학적 분석은 정기적으로, 연구자와 임상의에 의해 사용된다.60, 염색체 분리는 유전자 치료에 대한 소중하고 인간이 아닌 영장류와 설치류 10-13를 포함하여 생물의 줄기 세포 연구. 염색체는 혈액 림프구, 피부 섬유 아세포, amniocytes, 태반, 골수, 종양 표본을 포함한 살아있는 조직의 세포로부터 단리 할 수​​있다. 그들이 가장 응축 때문에 더 명확하게 볼 수 있습니다 때 염색체는 유사 분열의 중기 단계에서 분석된다. 염색체 분리 기술의 첫번째 단계는 후속 anaphase 단계로 진행하는 세포를 방지하기 Colcemid 함께 인큐베이션 스핀들 섬유의 파괴를 수반한다. 세포는 그 다음 저장성 용액으로 처리하고 Carnoy의 고착성과의 팽윤 상태로 보존된다. 세포는 그 다음 슬라이드에 떨어 된 후 다양한 절차에 이용 될 수있다. G-밴딩이 특징 빛과 어둠 밴드를 만들 지엠 사 (Giemsa)로 염색 한 다음 트립신 처리를 포함한다. 같은 홍보염색체를 분리 ocedure는 원위치 혼성화 (FISH) 형광, 비교 게놈 혼성화 (CGH) 및 스펙트럼 핵형 (SKY) 14,15 같은 절차에 대한 세포의 제조에 사용될 수있다.

고품질 중기 스프레드 염색체 분석을 위해 필수적입니다. 성공적인 분석이 잘 확산 적합한 염색체 형태의있다 염색체를 얻을 수 있습니다. 제대로 G-밴드 염색체는 특성 밝은 부분과 어두운 줄무늬 패턴이 포함되어 있습니다. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50203/50203fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50203/50203fig1.jpg" /> 그...

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Chromosome Preparation From Cultured Cells

염색체는 림프구 나 피부 섬유 아 세포 등 살아있는 세포에서 분리하고, 인간이나 쥐 등의 유기체에서 할 수있다. 이러한 염색체의 준비는 더 일상 G 밴딩과 같은 현장 하이브리드 화 (물고기)의 형광, 비교 게놈 교잡 (CGH) 및 스펙트럼 핵형 분석 (SKY) 등의 분자 세포 유전 학적 과정에 활용 될 수있다.

배양 세포에서 염색체 준비

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as ...

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80.8K 조회수.  Louisiana State University Health Science Center.  염색체는 림프구 나 피부 섬유 아 세포 등 살아있는 세포에서 분리하고, 인간이나 쥐 등의 유기체에서 할 수있다. 이러한 염색체의 준비는 더 일상 G 밴딩과 같은 현장 하이브리드 화 (물고기)의 형광, 비교 게놈 교잡 (CGH) 및 스펙트럼 핵형 분석 (SKY) 등의 분자 세포 유전 학적 과정에 활용 될 수있다. 

비디오: Chromosome Preparation From Cultured Cells

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. To assess the impact of PM on nuclear genetic integrity, structural chromosomal aberrations are scored in the metaphase spreads of mouse RAW264.7 macrophage cells. PM is collected from ambient air with a high volume total suspended particles sampler. The collected material is solubilized and filtered to retain the water-soluble, fine portion. The particles are characterized for chemical composition by nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. Different concentrations of particle suspension are added onto an in vitro culture of RAW264.7 mouse macrophages for a total exposure time of 72 hr, along with untreated control cells. At the end of exposure, the culture is treated with colcemid to arrest cells in metaphase. Cells are then harvested, treated with hypotonic solution, fixed in acetomethanol, dropped onto glass slides and finally stained with Giemsa solution. Slides are examined to assess the structural chromosomal aberrations (CAs) in metaphase spreads at 1,000X magnification using a bright-field microscope. 50 to 100 metaphase spread are scored for each treatment group. This technique is adapted for the detection of structural chromosomal aberrations (CAs), such as chromatid-type breaks, chromatid-type exchanges, acentric fragments, dicentric and ring chromosomes, double minutes, endoreduplication, and Robertsonian translocations in vitro after exposure to PM. It is a powerful method to associate a well-established cytogenetic endpoint to epigenetic alterations.

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

This protocol describes techniques for the quantification and characterization of chromosomal aberrations in vitro in RAW264.7 mouse macrophages after treatment with ambient air particulate matter.

를 사용하여 주변 입자상 물질에 의한 염색체 수차 분석<em&gt; 체외</em&gt; 시스템

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. ...

연구

유전학

Adaptation of Hybridization Capture of Chromatin-associated Proteins for Proteomics to Mammalian Cells

The hybridization capture of chromatin-associated proteins for proteomics (HyCCAPP) technology was initially developed to uncover novel DNA-protein interactions in yeast. It allows analysis of a target region of interest without the need for prior knowledge about likely proteins bound to the target region. This, in theory, allows HyCCAPP to be used to analyze any genomic region of interest, and it provides sufficient flexibility to work in different cell systems. This method is not meant to study binding sites of known transcription factors, a task better suited for Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) and ChIP-like methods. The strength of HyCCAPP lies in its ability to explore DNA regions for which there is limited or no knowledge about the proteins bound to it. It can also be a convenient method to avoid biases (present in ChIP-like methods) introduced by protein-based chromatin enrichment using antibodies. Potentially, HyCCAPP can be a powerful tool to uncover truly novel DNA-protein interactions. To date, the technology has been predominantly applied to yeast cells or to high copy repeat sequences in mammalian cells. In order to become the powerful tool we envision, HyCCAPP approaches need to be optimized to efficiently capture single-copy loci in mammalian cells. Here, we present our adaptation of the initial yeast HyCCAPP capture protocol to human cell lines, and show that single-copy chromatin regions can be efficiently isolated with this modified protocol.

This is a method to identify novel DNA-interacting proteins at specific target loci, relying on sequence-specific capture of crosslinked chromatin for subsequent proteomic analyses. No prior knowledge about potential binding proteins, nor cell modifications are required. Initially developed for yeast, the technology has now been adapted for mammalian cells.

교 잡의 적응 포유류 세포 단백질 Chromatin 관련 단백질의 캡처

The hybridization capture of chromatin-associated proteins for proteomics (HyCCAPP) technology was initially developed to uncover novel DNA-protein ...

Establishment of Proliferative Tetraploid Cells from Nontransformed Human Fibroblasts

Polyploid (mostly tetraploid) cells are often observed in preneoplastic lesions of human tissues and their chromosomal instability has been considered to be responsible for carcinogenesis in such tissues. Although proliferative polyploid cells are requisite for analyzing chromosomal instability of polyploid cells, creating such cells from nontransformed human cells is rather challenging. Induction of tetraploidy by chemical agents usually results in a mixture of diploid and tetraploid populations, and most studies employed fluorescence-activated cell sorting or cloning by limiting dilution to separate tetraploid from diploid cells. However, these procedures are time-consuming and laborious. The present report describes a relatively simple protocol to induce proliferative tetraploid cells from normal human fibroblasts with minimum contamination by diploid cells. Briefly, the protocol is comprised of the following steps: arresting cells in mitosis by demecolcine (DC), collecting mitotic cells after shaking off, incubating collected cells with DC for an additional 3 days, and incubating cells in drug-free medium (They resume proliferation as tetraploid cells within several days). Depending on cell type, the collection of mitotic cells by shaking off might be omitted. This protocol provides a simple and feasible method to establish proliferative tetraploid cells from normal human fibroblasts. Tetraploid cells established by this method could be a useful model for studying chromosome instability and the oncogenic potential of polyploid human cells.

Although proliferative polyploid cells are necessary to analyze chromosomal instability of polyploid cells, creating such cells from nontransformed human cells is not easy. The present report describes relatively simple procedures to establish proliferative tetraploid cells free of a diploid population from normal human fibroblasts.

비 형질 인간 섬유 아세포의 증식 배체 세포의 수립

Polyploid (mostly tetraploid) cells are often observed in preneoplastic lesions of human tissues and their chromosomal instability has been considered to ...

발생학

Capturing Chromosome Conformation Across Length Scales

Chromosome conformation capture (3C) is used to detect three-dimensional chromatin interactions. Typically, chemical crosslinking with formaldehyde (FA) is used to fix chromatin interactions. Then, chromatin digestion with a restriction enzyme and subsequent religation of fragment ends converts three-dimensional (3D) proximity into unique ligation products. Finally, after reversal of crosslinks, protein removal, and DNA isolation, DNA is sheared and prepared for high-throughput sequencing. The frequency of proximity ligation of pairs of loci is a measure of the frequency of their colocalization in three-dimensional space in a cell population.
A sequenced Hi-C library provides genome-wide information on interaction frequencies between all pairs of loci. The resolution and precision of Hi-C relies on efficient crosslinking that maintains chromatin contacts and frequent and uniform fragmentation of the chromatin. This paper describes an improved in situ Hi-C protocol, Hi-C 3.0, that increases the efficiency of crosslinking by combining two crosslinkers (formaldehyde [FA] and disuccinimidyl glutarate [DSG]), followed by finer digestion using two restriction enzymes (DpnII and DdeI). Hi-C 3.0 is a single protocol for the accurate quantification of genome folding features at smaller scales such as loops and topologically associating domains (TADs), as well as features at larger nucleus-wide scales such as compartments.

Hi-C 3.0 is an improved Hi-C protocol that combines formaldehyde and disuccinimidyl glutarate crosslinkers with a cocktail of DpnII and DdeI restriction enzymes to increase the signal-to-noise ratio and the resolution of chromatin interaction detection.

길이 척도에 걸친 염색체 형태 포착

Chromosome conformation capture (3C) is used to detect three-dimensional chromatin interactions. Typically, chemical crosslinking with formaldehyde (FA) ...

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency and type of chromosome aberrations in different cell types allows defects in DNA repair pathways to be elucidated. Understanding mammalian DNA repair biology has been greatly helped by the production of mice with knockouts in specific genes. The goal of this protocol is to quantify genomic instability in mouse B lymphocytes. Labeling of the telomeres using PNA-FISH probes (peptide nucleic acid - fluorescent in situ hybridization) facilitates the rapid analysis of genomic instability in metaphase chromosome spreads. B cells have specific advantages relative to fibroblasts, because they have normal ploidy and a higher mitotic index. Short-term culture of B cells therefore enables precise measurement of genomic instability in a primary cell population which is likely to have fewer secondary genetic mutations than what is typically found in transformed fibroblasts or patient cell lines.

DNA repair pathways are essential for maintenance of genomic integrity and preventing mutation and cancer. The goal of this protocol is to quantify genomic instability by direct observation of chromosome aberrations in metaphase spreads from mouse B cells using fluorescent in situ hybridization (FISH) for telomeric DNA repeats.

PNA-FISH에 의해 마우스 B 림프구에서 염색체 이상을 신속하게 분석

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

면역학 및 감염병학

Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture conditions they become prone to acquire chromosomal anomalies such as addition of whole or parts of chromosomes. Indeed, during long-term culture, karyotypic alterations are observed when enzymatic or chemical dissociation are used 2,3,4, while manual dissection of colonies for passaging retains a stable karyotype 5. Besides, changes in the environment such as the removal of feeder cells also seem to compromise the genetic integrity of hESC 3,6. Once chromosomal alterations could affect cellular physiology, the characterization of the genetic integrity of hESC in vitro is crucial considering hESC as an essential tool in embryogenesis studies and drug testing. Furthermore, for future therapeutic purposes chromosomal changes are a real concern as it is frequently associated to carcinogenesis.
Here we show a simple and useful method to obtain high quality chromosome spreads for subsequent analysis of chromosome set by G-banding, FISH, SKY or CGH techniques 7,8. We recommend checking the chromosomal status routinely with intervals of 5 passages in order to monitor the appearance of translocations and aneuploidies
Priscila Britto and Rafaela Sartore contributed equally to the paper.

Karyotyping is a simple and useful technique widely used for detecting genetic alterations. Here we describe a step by step protocol for chromosome spread preparation of human embryonic stem cells for monitoring the chromosomal status of these cells maintained in culture.

Karyotyping를위한 인간 배아 줄기 세포의 염색체 확산 준비

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture ...

생물학

Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological advantages provided by the giant salivary gland polytene chromosomes of third instar larvae.  In this tissue the chromosomes undergo many rounds of replication in the absence of cell division giving rise to approximately 1000 copies.  The DNA remains aligned after each replicative cycle resulting in greatly enlarged chromosomes that provide a unique opportunity to correlate chromatin morphology with the localization of specific proteins.  Consequently, there has been a high level of interest in defining the epigenetic modifications present at different genes and at different stages of the transcription process. An important tool for such studies is the labeling of polytene chromosomes with antibodies to the enzyme, transcription factor, or histone modification of interest. This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

항체 라벨링에 대한 Drosophila Polytene의 염색체 Squashes의 준비

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological ...

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The specification of replication timing is thought to be a dynamic process regulated by tissue-specific and developmental cues that are responsive to epigenetic modifications. However, the mechanisms regulating where and when DNA replication initiates along chromosomes remains poorly understood. Homologous chromosomes usually replicate synchronously, however there are notable exceptions to this rule. For example, in female mammalian cells one of the two X chromosomes becomes late replicating through a process known as X inactivation1. Along with this delay in replication timing, estimated to be 2-3 hr, the majority of genes become transcriptionally silenced on one X chromosome. In addition, a discrete cis-acting locus, known as the X inactivation center, regulates this X inactivation process, including the induction of delayed replication timing on the entire inactive X chromosome. In addition, certain chromosome rearrangements found in cancer cells and in cells exposed to ionizing radiation display a significant delay in replication timing of &gt;3 hours that affects the entire chromosome2,3. Recent work from our lab indicates that disruption of discrete cis-acting autosomal loci result in an extremely late replicating phenotype that affects the entire chromosome4. Additional 'chromosome engineering' studies indicate that certain chromosome rearrangements affecting many different chromosomes result in this abnormal replication-timing phenotype, suggesting that all mammalian chromosomes contain discrete cis-acting loci that control proper replication timing of individual chromosomes5.
Here, we present a method for the quantitative analysis of chromosome replication timing combined with fluorescent in situ hybridization. This method allows for a direct comparison of replication timing between homologous chromosomes within the same cell, and was adapted from6. In addition, this method allows for the unambiguous identification of chromosomal rearrangements that correlate with changes in replication timing that affect the entire chromosome. This method has advantages over recently developed high throughput micro-array or sequencing protocols that cannot distinguish between homologous alleles present on rearranged and un-rearranged chromosomes. In addition, because the method described here evaluates single cells, it can detect changes in chromosome replication timing on chromosomal rearrangements that are present in only a fraction of the cells in a population.

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

A quantitative method for the analysis of chromosome replication timing is described. The method utilizes BrdU incorporation in combination with fluorescent in situ hybridization (FISH) to assess replication timing of mammalian chromosomes. This technique allows for the direct comparison of rearranged and un-rearranged chromosomes within the same cell.

형광등과 결합 염색체 복제 타이밍<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

A Cell Free Assay to Study Chromatin Decondensation at the End of Mitosis

During the vertebrate cell cycle chromatin undergoes extensive structural and functional changes. Upon mitotic entry, it massively condenses into rod shaped chromosomes which are moved individually by the mitotic spindle apparatus. Mitotic chromatin condensation yields chromosomes compacted fifty-fold denser as in interphase. During exit from mitosis, chromosomes have to re-establish their functional interphase state, which is enclosed by a nuclear envelope and is competent for replication and transcription. The decondensation process is morphologically well described, but in molecular terms poorly understood: We lack knowledge about the underlying molecular events and to a large extent the factors involved as well as their regulation. We describe here a cell-free system that faithfully recapitulates chromatin decondensation in vitro, based on mitotic chromatin clusters purified from synchronized HeLa cells and X. laevis egg extract. Our cell-free system provides an important tool for further molecular characterization of chromatin decondensation and its co-ordination with processes simultaneously occurring during mitotic exit such as nuclear envelope and pore complex re-assembly.

The molecular mechanisms of the decondensation of highly compacted mitotic chromatin are ill-defined. We present a cell-free assay based on mitotic chromatin clusters isolated from HeLa cells and Xenopus laevis egg extract that faithfully reconstitutes the decondensation process in vitro.

셀 무료 분석은 유사 분열의 끝에서 염색질 Decondensation을 공부하기

During the vertebrate cell cycle chromatin undergoes extensive structural and functional changes. Upon mitotic entry, it massively condenses into rod ...

A Fast Air-dry Dropping Chromosome Preparation Method Suitable for FISH in Plants

Preparation of chromosome spreads is a prerequisite for the successful performance of fluorescence in situ hybridization (FISH). Preparation of high quality plant chromosome spreads is challenging due to the rigid cell wall. One of the approved methods for the preparation of plant chromosomes is a so-called drop preparation, also known as drop-spreading or air-drying technique. Here, we present a protocol for the fast preparation of mitotic chromosome spreads suitable for the FISH detection of single and high copy DNA probes. This method is an improved variant of the air-dry drop method performed under a relative humidity of 50%-55%. This protocol comprises a reduced number of washing steps making its application easy, efficient and reproducible. Obvious benefits of this approach are well-spread, undamaged and numerous metaphase chromosomes serving as a perfect prerequisite for successful FISH analysis. Using this protocol we obtained high-quality chromosome spreads and reproducible FISH results for Hordeum vulgare, H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum and Secale cereale.

A protocol is described for the preparation of high-quality mitotic plant chromosome spreads by a fast air-dry dropping method suitable for the FISH detection of single and high copy DNA probes.

식물에서 물고기에 적합한 빠른 공기 건조 떨어 뜨리 염색체 제조 방법

Preparation of chromosome spreads is a prerequisite for the successful performance of fluorescence in situ hybridization (FISH). Preparation of high ...

배양 세포에서 염색체 준비

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