InDevR이 작품을 자금에 대한 NIH / NIAID U01AI070276 및 R43AI077112을 인정합니다.

1. RT - PCR을 사용하여 샘​​플 증폭 <ol><li> 임상 자료나 바이러스 QIAcube 자동 핵산 추출 플랫폼과 함께 Qiagen MinElute 바이러스 스핀 키트를 사용하여 분리.부터 바이러스 RNA를 추출 Extractions은 60 μl의 최종 용출 량 200 μl 표본에서 수행됩니다. -70에서 보관 추출물 ° C 또는 나중에 사용하기 위해 낮은. </li><li> 템플릿 자유 영역에서 제조 업체의 프로토콜에 따라 얼음의 RT - PCR 마스터 믹스를 준비합니다. RT - PCR 중에 비오틴을 통합하려면, dNTP 혼합 제공된 제조 업체의 자리에 biotinylated dNTP 혼합물을 사용합니다. biotinylated dNTP 혼합물을 사용하는 비용은 1 달러 미만 USD / 분석이다. biotinylated 프라이머의 사용과 같은 비오틴의 정관의 다른 방법도 사용할 수 있습니다. 추가 프라이머는 독감을위한 1.0 μm의 최종 농도로 혼합, 인플루엔자 B에 대해 1.0 μm의 및 내부 통제를위한 0.14 μm의. 독감은 프라이머 세트는 매트릭스 유전자 세그먼트 (1032 NT 제품)를 증폭하고 독감 B 프라이머 세트가 아닌 구조 유전자 세그먼트 (811 NT 제품)을 증폭. 각 FluChip 프라이머 세트는 다음과 PCR 람다 exonuclease와 효소 소화를 통해 단일 ​​좌초된 DNA의 생성을 촉진하기 위하여 5 &#39;phosphoryl 그룹과 하나 뇌관이 포함되어 있습니다. 그 결과 단일 좌초 제품은 이중 좌초 상응하는 것보다 훨씬 짧은 하이브리드화 시간을 요구하고 크게 전반적인 분석 시간을 단축. 이러한 primers의 사전 준비 혼합뿐만 아니라 내부 통제 템플릿 RNA는 InDevR에서 제한적으로 관심 연구자 사용할 수 있습니다. </li><li> 간단히 와동과 얇은 벽의 PCR 튜브에 마스터 믹스 18 μl를 배포합니다. </li><li> 템플릿 이외에 적합한 작업 영역에 얼음에 튜브를 전송하고, 각각의 반응 관 2 μl 템플릿을 추가합니다. </li><li> 열 자전거 타는 사람, 다음과 같은 열 프로파일 실행하는 전송 PCR 튜브 : 50 역방향 전송을 ° 95시 30 분, 효소 불활 성화 / 활성화를위한 C ° 15 분, 30 S 95 ° C의 40 PCR 사이클 55를위한 C ° 30에 대한 C, 72 ° C 1 분, 72에서 마지막 확장자 ° 10 분 C하십시오. </li></ol> 2. 저밀도 microarrays에 RT - PCR 제품의 하이브리드화 <ol><li> FluChip의 하이브 리다이 제이션을위한 하나의 좌초 DNA을 생성하기 위해, 1.0 μl 람다의 exonuclease 효소, 수반되는 반응 버퍼의 2.2 μl와 nuclease없는 물 0.8 μl를 결합하여 효소 소화 혼합물을 준비합니다. 이 금액은 하나의 샘플에 대한하지만, 단순히 소화하는 샘플의 총수에 대한 크기를 조정하실 수 있습니다. 열 자전거 타는 사람에서 샘플을 제거하고 PCR 제품의 phosphorylated 가닥을 소화하기 위해 각각의 반응은 준비된 혼합물 4 μl를 추가합니다. 열 자전거 타는 사람 및 프로그램 효소 소화 및 열 조각 단계를 완료하는 데 10 분 동안 섭씨 95 도까지 다음 15 분 동안 섭씨 37 도까지 온도 자전거 타는 사람에 샘플을 반환합니다. </li><li> 사용되는 사용자 정의 인플루엔자 microarrays이 적용 Microarrays 주식 회사 (템피, AZ)에 의해 알데히드 기능화 유리 슬라이드에 인쇄됩니다. 5&#39; - 아미노 종료 캡처 시퀀스는 (추가 3&#39; - 비오틴 수정을 500 nm의의 최종 농도에서 발견되는 긍정적인 제어 시퀀스 제외) 최적화된 야생 버퍼와 결합하여 20 μm의의 최종 농도에 인쇄됩니다 . 방법을 찾는 비 접촉 300 μm의와 700 μm의 중심 피치 중심의 최적의 장소 직경과 함께 사용됩니다. </li><li> 저장 상자에서 microarrays를 제거하고 보호 시트를 제거하고 잘 주위에 단단히 눌러 microarrays 주위에 단일 사용 하이브 리다이 제이션 우물을 적용합니다. </li><li> 플레이스 60-90 RPM에서 궤도 통을 사용하여 5 분 미리 하이브 리다이 제이션 세척을위한 물을 정화의 110 ML를 포함 씻어 상자에 슬라이드. 부드럽게 잘 가장자리에 조직 와이퍼를 감동 물을 떠나 사악한 수 있도록하여 배열을 건조. </li><li> 조각난 ssDNA 제품의 각 2X 하이브 리다이 제이션 버퍼 22 μl, 그리고 microarray 우물에 하이브 리다이 제이션 솔루션 pipet 40 μl를 결합합니다. </li><li> 슬라이드 60 분 폐쇄 습도 챔버의 잡종 수 있습니다. </li><li> 습도 챔버에서 슬라이드를 제거 간단히 슬라이드 선반에 배치하기 전에 씻어 병에 워시 버퍼 D와 함께 배열을 씻어. 일반적으로 와시 버퍼 D의 rinsing 볼륨 배열 당 2 ML입니다. 1 분 60-90 RPM에서 궤도 쉐이크에 110 ML 와시 버퍼 A. 플레이스 bin을 포함 씻어 상자에서 슬라이드를 포함한 플레이스 슬라이드 선반. </li><li> 와시 버퍼에서 슬라이드 선반을 제거, 간단히 씻어 버퍼 D, 와시 버퍼 B를 포함하는 빈에게 이전 슬라이드 랙와 린스, 그리고 5 분 60-90 rpm으로 흔들. </li><li> 부드럽게 각 슬라이드에 배열을 건조하고, ampliPHOX Colorimetric 감지 단계 준비 습도 챔버에서 건조 슬라이드를 놓으십시오. </li></ol> 3. ampliPHOX : ampliTAG와 hybridized 제품 및 교정 칩 라벨링 <ol><li> 컴바인<html> ampliTAG 10 μl, 2X ampliTAG 버퍼 및 처리하는 각 배열에 대해 물을 정화 10 μl 20 μl. 시약 볼륨은 단순히 샘플의 총수에 대한 크기를 조정하실 수 있습니다. 필요한 모든 샘플 배열 및 교정 배열에 대해 계정에 충분한 라벨 혼합물을 준비하십시오. 필요한 교정 칩의 개수는 전체 교정 (새로운 기기 또는 시약의 새로운 많은 경우), 또는 악기 검사를 수행하는지 여부에 따라 달라집니다. 전체 보정을위한, 3 교정 칩을 표시해야하고, 시약의 확인, 단지 하나의 보정 칩을 표시해야합니다. 보정 배열이 표시되기 전에, 그들이 이전에 독감 배열에 대해 설명한 사전 하이브 리다이 제이션 세척 단계를 통해 이동해야 유의하시기 바랍니다. </li><li> 각 배열 라벨 혼합 40 μl를 전송하고 5 분 폐쇄 습도 챔버에서 진행하는 반응을 레이블링 수 있습니다. </li><li> 즉시 슬라이드 랙에 슬라이드를 삽입하기 전에 씻어 병에 워시 버퍼 D와 함께 배열을 씻어. 와시 버퍼 C의 110 ML를 포함하는 bin에 랙를 전송하고, 5 분 60-90 rpm으로 흔들. </li><li> 정화의 물로 채워진 두 번째 세차 상자를 사용하여, 소금 성분을 제거하는 세 가지 간단한 연속 수상 저러나 수행합니다. 부드럽게 우물의 가장자리에 조직 와이퍼를 만지고하여 배열을 건조. </li><li> microarrays 이제 제대로 ampliTAG으로 표시되며, ampliPHOX 감지 절차의 나머지 수행할 수 있습니다. 분류 배열 Photoactivati​​on 및 이미징은 24 시간 이내에 완료해야하며, 추가적인 배열을 사용할 때까지 어두운 슬라이드 상자에 저장할 수 있습니다. </li></ol> 4. ampliPHOX : 교정, 신호 증폭, 및 이미징 <ol><li> 에 ampliPHOX 리더를 켜고 ampliVIEW 소프트웨어 photoactivati​​on 준비되었는지 확인하십시오. </li><li> 보정 칩을 사용하여 최적의 photoactivati​​on 시간을 확인합니다. 다음 소개하는 것 외에도,이 절차는 또한 ampliPHOX 운영 매뉴얼에 자세히 설명되어 있습니다. 보정 칩은 소프트웨어에 의해 결정 긍정적인 신호를 생성 보정 칩의 행 수를 극대화를 목표로, 분석의 감도를 최적화하기 위해 이용하는 biotinylated 제어 시퀀스 dilutions 일련의 포함되어 있습니다. </li><li> 4 ampliPHY를 제거 ° C, 상온에 따뜻한 있도록하고, 혼합을 간략하게 와동. Pipet 3 ampliPHY의 약병에 ampliPHY 향상제의 μl, 10 초 동안 철저히 와동. </li><li> 균등도 거품이 존재하지 있도록, 잘 ampliTAG - 라벨 배열을 포함하고있는 microarray에 ampliPHY 솔루션을 40 μl를 전송합니다. 각 응용 프로그램 사이의 ampliPHY 유리병을 닫습니다. ampliPHOX의 리더의 photoactivati​​on 베이에 microarray 슬라이드를 삽입합니다. </li><li> 첫 번째 보정 배열, 소프트웨어의 레프트 핸드 패널에있는 &#39;시간&#39;상자에서 기본 photoactivati​​on 시간을 사용하고 photoactivati​​on를 시작하는 녹색 &#39;시작&#39;버튼을 클릭하십시오. 마치고, 배열을 제거하고 여분의 ampliPHY를 제거하는 물 정화와 린스. 반점의 일부를 클리어 폴리머 형성은 이제 볼 수 있습니다. </li><li> 폴리머 명소 2 분 동안 건조하도록 허용, 다음 배열에 ampliRED 두 방울의 배포 및 2 분 동안 진행하는 염색법 수 있습니다. </li><li> 다음 신속하게 물을 정화하고 조직 닦아와 건조와 microarray 린스. </li><li> ampliPHOX 리더의 이미지 베이에 microarray를 삽입하고 영상 탭에서 &#39;새 이미지 캡처&#39;버튼을 클릭하십시오. 일단 몇 군데, 자르기를 조정하여 이미지를 저장합니다. </li><li> 분석 탭에서 분석을 시작 보정 칩 마스크와 &#39;자동 배치&#39;버튼을 선택합니다. 소프트웨어는 자동으로 계량 결과를 보여주는 &#39;요약 기록&#39;을 생산합니다. 이러한 결과를 바탕으로 photoactivati​​on 시간은 두 번째 보정 배열 10 초 조정이며, 절차는 반복됩니다. </li><li> 최적의 photoactivati​​on 시간이 결정되면, 샘플 배열은 보정 배열에 사용된 것과 같은 신호 증폭 및 이미징 프로토콜을 사용하여 처리할 수 있습니다. </li><li> 일단 이미지가 샘플 배열에 대한 캡처이며, 등 인플루엔자 배열 레이아웃 여기 설명된대로 특정 배열 레이아웃을위한 마스크는 created.The ampliVIEW 소프트웨어가 자동 이미지 분석을 수행하여 각 샘플에 대한 독감 subtyping 결과를 생성할 수 수있다. </li></ol> 5. 대표 결과 : <img src="/files/ftp_upload/2682/2682fig1.jpg" alt="그림 1"/> 그림 1. ampliPHOX colorimetric 탐지 방법의 도식 그림. (A) Biotinylated 대상 DNA는 배열의 각 자리에 hybridized이며, (B) ampliTAG으로 표시. (C) ampliPHY 솔루션은 다음 추가되며, (D) 표시 폴리머의 명소를 형성하기 위해 빛에 노출. (E) 형성 폴리머의 명소는 이후 명암을 향상시킬 수있는 무독성 염료로 얼룩이 있습니다. ontent &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/2682/2682fig2.jpg" alt="그림 2"/> 그림 2. (A) 인플루엔자 저밀도 microarray 레이아웃. 시퀀스 1-7 및 10-13 대상 독감, 그리고 시퀀스 8, 9 대상 인플루엔자 B. (B) ampliPHOX 같은 검색 패턴을 보여주는 2009 소설 H1N1 ( &#39;돼지 독감&#39;) 시편의 (C) 형광 이미지 모두에 의해 방법. <img src="/files/ftp_upload/2682/2682fig3.jpg" alt="그림 3"/> 그림 3. 왼쪽부터 인플루엔자 H3N2, H1N1 인간 기원 2009 년 소설 H1N1 (돼지 - 원점), 그리고 부정적인 표본에 대한 권리, 대표 ampliPHOX 이미지 수 있습니다. 모든 3 subtypes는 배열에 대한 시각 뚜렷한 패턴을 보여줍니다. 오직 MS2 내부 통제가 본 것을 부정의 공지 사항은 RT - PCR의 증폭을 나타내는 것은 저해되지 않았습니다.

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저자의 모든 InDevR, 주식 회사, 비영리 법인의 직원입니다. InDevR는 여기에 설명된 ampliPHOX 기술을 상용화입니다.

여기에 제시 ampliPHOX colorimetric 감지 기술은 낮은 밀도 microarray 애플 리케이션을위한 단일 색상 형광 검출에 대한 신속하고 저렴한 대안입니다. 그림 1에 간략하게 구조와 같이 검출 원리는 photoinitiator 라벨 (1B)의 사용에 따라 달라집니다. 단량체 함유 용액 (1C)의 존재에 빛이 노출 photoinitiator (ampl​​iTAG)가에만 표시 지역의 중합 반응 (1D) 실행하도록합니다. 인플루엔자 식별 및 subtyping을위한 DNA 배열에 여기 보여주지만,이 기술은 microarray에서 캡처한 모든 biotinylated 제품을 감지하는 확장할 수 있습니다. 예를 들어, 다른 시약 화학을 사용하는 photopolymerization 기반 감지에 대한 이전의 작품은 핵산과 항체 기반 배열 모두에서 증명되었습니다. 12 기타 또한 photopolymerization 기반 시스템의 항체와 단백질 기반의 애플 리케이션을위한 개념의 증거를 보여주 . 이러한 경우에는 불활성 가스로 정화가 필요한 다른 시약의 화학이 이용되었다. 13,14가 인플루엔자 낮은 밀도 microarray 대표 이미지의 구조는 그림 2에서 볼 수 있습니다. 그림 2A에 표시된 배열 공간 마커 / 야생 컨트롤 (빨간색) 14 독특한 캡처 시퀀스 (파란색), 세중의에서 발견 각각 포함되어 있습니다. 캡처 시퀀스는 특정 유형이나 인플루엔자의 subtypes의 유전자 대표하는 독감 목표를 캡처하기위한 아미노 종료 합성 단기 (~ 25 메르) oligonucleotides 있습니다. 캡처 시퀀스는 여러 독감 subtypes에 대한 칩 엄연히 다른 패턴을 생산하도록 설계되었습니다. 그림 2B와 2C는 ampliPHOX 전통적인 형광에 의해 2009 소설 H1N1 표본, 각각의 검출을 직접 비교를 보여줍니다. 형광 결과는 공촛점 형광 microarray 스캐너 (Genetix aQuire)를 사용하여 생성되었습니다. 같은 전반적인 검색 패턴이 쉽게 두 가지 방법에 대해 볼 수 있지만, ampliPHOX 결과는 육안으로 볼 수 있습니다. 세 대표 독감 긍정적인 표본 및 프로토콜 여기에서 설명한 처리로 하나 부정적인 표본에서 ampliPHOX 결과입니다 그림 3. 인물 3A, 3B, 그리고 인간 기원 각각 H3N2, 인간 기원 H1N1 및 H1N1 돼지 - 기원 (2009 소설 H1N1)에 대한 3C 결과 표시. 전체 검색 패턴에 뚜렷한 차이는 쉽게이 세 이미지를 볼 수 있습니다. 예를 들어, 그것은 볼 수 시퀀스 2, 3 생산의 subtypes가 표시된 인플루엔자 (3A - 3C)의 모든 신호를하지만, 그 시퀀스 10, 12, 13은 돼지 - 기원에 대한 H1N1의 표본 신호를 생산 (3C) . 이러한 접근법이 성공적으로 microarray에 대한 유형과 subtype의 독감 바이러스에 이전에 사용되고 있습니다. 6,8,10가 중요한 것은, 그림 3D에 표시된 부정적인 표본은 RT - PCR 반응에 대한 억제 또는 실패를 나타내는도, 내부 제어 시퀀스에서 신호를 보여줍니다. 이러한 이미지의 해석은 쉽게 ampliVIEW 소프트웨어 자동으로 진행됩니다. 사용자는 먼저 대상이 레이아웃에 대한 특정 &quot;답변&quot;을 생성하기 위해 존재해야하는 설명하기 위해 다음 microarray 레이아웃을 정의하는 소프트웨어를 사용합니다. 예를 들어, 그림 2A에 표시된 인플루엔자 레이아웃에 따라, 예 : &quot;독감 양성&quot;, &quot;독감 B 긍정적인&quot;, &quot;비 - 계절 인플루엔자&quot;, &quot;계절 인플루엔자&quot;및 &quot;부정적&quot;으로 논리적 결과를 생성 수 결과를 원하는. 이러한 논리적 할당 만들어 저장되면, 소프트웨어가 자동으로 약간의 사용자 입력과 결과를 제공하기 위해 이미지를 해석하실 수 있습니다. ampliPHOX 감지 기술은 분만에 형광와 비슷한 감도와 낮은 밀도 microarrays에 대한 시각, colorimetric 결과를 생성합니다. 우리는 생각의 조합 사용하기 쉬운, 저비 용의 기기와 함께 저렴한 시약 더 타겟 특히 같은 전통적인 microarray 검출 방법에 매력적인 대안을 제공, 낮은 밀도 진단 / 게놈 microarrays 점점 더 다양한 어플 리케이션에 사용된다.

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약 / 장비 </th><th> 제조 업체 </th><th> 카탈로그 # </th><th> 댓글 </th></tr><tr><td> Qiagen MinElute 바이러스 스핀 키트 </td><td> Qiagen </td><td> 57,704 </td><td> 싱글 60 μl 용리 </td></tr><tr><td> QIAcube </td><td> Qiagen </td><td> 9,001,292 </td><td> 옵션 </td></tr><tr><td> ABI 9800 빠른 열전달 자전거 타는 사람 </td><td> 응용 Biosystems </td><td> 4,441,166 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen RT - PCR OneStep 키트 </td><td> Qiagen </td><td> 210210 </td><td> 키트는 사용하지 dNTPs </td></tr><tr><td> 2X 구경 버퍼 </td><td> InDevR 주식 회사 </td><td> MI - 5007 </td><td></td></tr><tr><td> Biotinylated dNTP 믹스 </td><td> InDevR 주식 회사 </td><td> MI - 5009 </td><td></td></tr><tr><td> 람다의 exonuclease </td><td> Epicentre의 Biotechnologies </td><td> LE032K </td><td> 2500 U, 10U/μl </td></tr><tr><td> FluChip 프라이머 믹스 </td><td> InDevR </td><td> N / A </td><td> 판매 아직 없습니다 </td></tr><tr><td> 올비털 쉐이크 </td><td> Madell 기술 </td><td> ZD - 9556 - A </td><td></td></tr><tr><td> 방식 와시 </td><td> InDevR 주식 회사 </td><td> MI - 4002 </td><td></td></tr><tr><td> 랙 와시 </td><td> InDevR 주식 회사 </td><td> MI - 4003 </td><td></td></tr><tr><td> 2X 하이브리드화 버퍼 </td><td> InDevR 주식 회사 </td><td> MI - 5004 </td><td></td></tr><tr><td> 보정 칩 </td><td> InDevR 주식 회사 </td><td> AP - 5006 </td><td></td></tr><tr><td> 버퍼에게 광고를 와시 </td><td> InDevR 주식 회사 </td><td> MI - 5005 </td><td></td></tr><tr><td> ampliRED </td><td> InDevR 주식 회사 </td><td> AP - 5004 </td><td></td></tr><tr><td> ampliTAG </td><td> InDevR 주식 회사 </td><td> AP - 5001 </td><td></td></tr><tr><td> 2X ampliTAG 버퍼 </td><td> InDevR 주식 회사 </td><td> AP - 5002 </td><td></td></tr><tr><td> ampliPHY, ampliPHY 향상제 </td><td> InDevR 주식 회사 </td><td> AP - 5003 </td><td></td></tr></tbody></table>

ampliphox colorimetric detection on a dna microarray for influenza

의 DNA microarrays은 병원균 검출을위한 강력한 도구로 부상했습니다. 예를 들어 1-5를 입력하고, subtype의 독감 바이러스에 대한 능력의 많은 사례가 증명하고 있습니다.의 DNA microarrays에 독감의 6-11 식별 및 subtyping은 모두 공개 응용 프로그램을 가지고 건강과 조기 발견, 신속한 개입, 그리고 인플루엔자 유행의 영향을 최소화를위한 병원. 전통적인 형광 현재 가장 일반적으로 사용되는 microarray 검색 방법입니다. microarray 기술은 임상 사용을 향해 진행 그러나, 1 저비용 탐지 기술은 형광과 비슷한 성능 특성을 전시와 함께 고가의 장비를 대체하는 것은 microarray assays 더 매력적이고 비용 효율적인 것입니다. ampliPHOX colorimetric 탐지 기술 연구 애플 리케이션을위한, 그리고 형광 microarray에 필요한 공촛점 microarray 스캐너에 비해 대략 10 배로 낮은 악기 비용중인 주요 장점과 함께, 전통적인 형광 11 크기 중 하나를 순서 내에서 감지 한계를 가지고있다 감지. 또 다른 장점은 기존의 형광 악기와는 달리, 이동성과 유연성 수있는 악기의 컴팩트 사이즈입니다. 중합 기술 형광 감지만큼 본질적으로 선형되지 않기 때문에, 그러나, 그것은 최고의 같은 병원체 검출 배열에 관해서는 특정 순서의 존재에 대한 예 / 아니오 대답이 원하는되는 낮은 밀도 microarray 어플 리케이션에 적합합니다. 현재 ampliPHOX 감지와 호환 최대 현장 밀도 ~ 1800 장소 / 배열입니다. 때문에 현장 밀도 제한의 높은 밀도 microarrays은 ampliPHOX 감지에 적합하지 않습니다. 여기, 우리는 인플루엔자 바이러스의 검출 및 특성 (FluChip)에 대한 개발 저밀도 microarray에 신호 증폭의 방법으로 ampliPHOX colorimetric 탐지 기술을 제시한다. 이 프로토콜은 ampliPHOX 감지, 비슷한 방식으로 표시하고 감지할 수 biotinylated 목표를 통합하는 microarray 중 하나가 특정 응용 프로그램으로 FluChip을 (DNA microarray)를 사용하지만. 캡쳐하는 대상의 microarray 디자인과 biotinylation은 사용자의 책임입니다. biotinylated 대상이 배열에 캡처되면 ampliPHOX 감지가 먼저 태그에 의해 streptavidin - 라벨 공액 (ampl​​iTAG)로 배열을 수행할 수 있습니다. 단량체 솔루션의 ampliPHOX 리더 악기, 중합을 사용하여 빛의 노출시 (ampl​​iPHY) ampliTAG - 표시 대상을 포함하는 지역에서만 발생합니다. 형성된 고분자는 연속적 간단한 소프트웨어 패키지 (ampl​​iVIEW)을 사용하여 이미징 및 분석 다음 영상 대비를 향상시킬 수있는 무독성 솔루션을 물들일 수 있습니다. 결과 해제 추출 샘플에서 전체 FluChip 분석은 약 6 시간 수행할 수 있으며, 위에서 설명한 ampliPHOX 탐지 단계는 약 30 분 안에 완료할 수 있습니다.

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ampliPHOX Colorimetric Detection on a DNA Microarray for Influenza

ampliPHOX colorimetric 감지 기술은 microarrays에 대한 형광 검출하는 저렴한 대안으로 제공됩니다. photopolymerization에 따라 ampliPHOX 단지 몇 분 이내에 육안으로 보이는 고체 고분자 명소를 생산하고 있습니다. 결과는 간단하면서도 강력한 소프트웨어 패키지로 다음 몇 군데 자동으로 해석됩니다.

인플루엔자에의 DNA Microarray에 ampliPHOX Colorimetric 검색

DNA microarrays have emerged as a powerful tool for pathogen detection.1-5  For instance, many examples of the ability to type and subtype influenza virus ...

ampliphox-colorimetric-detection-on-a-dna-microarray-for-influenza

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.9K 조회수.  InDevR Inc.. ampliPHOX colorimetric 감지 기술은 microarrays에 대한 형광 검출하는 저렴한 대안으로 제공됩니다. photopolymerization에 따라 ampliPHOX 단지 몇 분 이내에 육안으로 보이는 고체 고분자 명소를 생산하고 있습니다. 결과는 간단하면서도 강력한 소프트웨어 패키지로 다음 몇 군데 자동으로 해석됩니다.

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Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

플라스미드 DNA의 재조합 독감 바이러스의 생성

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

연구

면역학 및 감염병학

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

접착제 테이프 기반의 샘플링 및 형광의 조합 현장에서</em의 신속한 감지를 위해> 하이브 리다이 제이션 살모넬라균 신선한 농산물에 대한

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

사이 Synergism을 맡은 이후로 발광 생물 이미징을 사용하여 연쇄상 구균 pneumoniae</em유아 마우스에서>와 인플루엔자 바이러스

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

바이러스성 병원균에 대한 임상 샘플을 화면에 판 - 바이러스성 Microarray 분석 (Virochip)를 사용

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

인플루엔자 바이러스에 대한 높은 처리량 검출 방법

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and new strains are continually emerging. Swine are able to be infected by diverse lineages of influenza A virus making them important hosts for the emergence and maintenance of novel influenza A virus strains. Sampling pigs in diverse settings such as commercial swine farms, agricultural fairs, and live animal markets is important to provide a comprehensive view of currently circulating IAV strains. The current gold-standard ante-mortem sampling technique (i.e. collection of nasal swabs) is labor intensive because it requires physical restraint of the pigs. Nasal wipes involve rubbing a piece of fabric across the snout of the pig with minimal to no restraint of the animal. The nasal wipe procedure is simple to perform and does not require personnel with professional veterinary or animal handling training. While slightly less sensitive than nasal swabs, virus detection and isolation rates are adequate to make nasal wipes a viable alternative for sampling individual pigs when low stress sampling methods are required. The proceeding protocol outlines the steps needed to collect a viable nasal wipe from an individual pig.

The authors present a protocol to collect swine nasal wipes to detect and isolate influenza A viruses.

돼지에서 인플루엔자 바이러스 탐지 및 격리를위한 코 닦음

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the natural reservoir for IAV, but IAV can cross the species barrier to poultry, swine, horses and humans. Avian viruses recognize sialic acid attached to a penultimate galactose by a &#945;2-3 linkage (avian-type receptors) whereas human viruses preferentially recognize sialic acid with a &#945;2-6 linkage (human-type receptors). To monitor if avian viruses are adapting to human type receptors, several methods can be used. Glycan microarrays with diverse libraries of synthetic sialosides are increasingly used to evaluate receptor specificity. However, this technique is not used for measuring avidities. Measurement of avidity is typically achieved by evaluating the binding of serially diluted hemagglutinin or virus to glycans adsorbed to conventional polypropylene 96-well plates. In this assay, glycans with &#945;2-3 or &#945;2-6 sialic acids are coupled to biotin and adsorbed to streptavidin plates, or are coupled to polyacrylamide (PAA) which directly adsorb to the plastic. We have significantly miniaturized this assay by directly printing PAA-linked sialosides and their non PAA-linked counterparts on micro-well glass slides. This set-up, with 48 arrays on a single slide, enables simultaneous assays of 6 glycan binding proteins at 8 dilutions, interrogating 6 different glycans, including two non-sialylated controls. This is equivalent to 18x 96-well plates in the traditional plate assay. The glycan array format decreases consumption of compounds and biologicals and thus greatly enhances efficiency.

Using a printed glycan microarray strategy, a conventional 96-well plate assay was miniaturized for analysis of influenza A virus hemagglutinin avidity and specificity for sialic acid containing receptors.

인플루엔자 바이러스 Hemagglutinins의 결합력 및 특이도를 평가하기위한 소형화 글리 칸 마이크로 어레이 분석

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

그라데이션 원심 분리에 의해 인플루엔자 A 바이러스 캡시드의 생체 외 분해에

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Rapid Molecular Detection and Differentiation of Influenza Viruses A and B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality every year. The Influenza A and B assay was the first CLIA-waived molecular rapid flu test available. The Influenza A and B test works by employing isothermal amplification with influenza-specific primers followed by target detection with molecular beacon probes. Here, the performance of the Influenza A and B assay on frozen, archived nasopharyngeal swab (NPS) specimens stored in viral transport medium (VTM) were compared to a respiratory panel assay.
The performance of the Influenza A and B assay was evaluated by comparing the results to the respiratory panel reference method. The sensitivity for total influenza virus A was 67.5% (95% CI (CI), 56.6-78.5) and the specificity was 86.9% (CI, 71.0-100). For influenza virus B testing, the sensitivity and specificity were 90.2% (CI, 68.5-100) and 98.8% (CI, 68.5-100), respectively.
This system has the advantage of a significantly shorter test time than any other currently available molecular assay and the simple, pipette-free procedure runs on a fully integrated, closed, small-footprint system. Overall, the Influenza A and B assay evaluated in this study has the potential to serve as a point-of-care rapid influenza diagnostic test.

We describe a rapid, molecular-based Influenza A and B assay. The Influenza assay detects each target within 15 min by employing isothermal amplification with influenza-specific primers followed by target detection with molecular beacon probes. The Influenza A and B assay is user-friendly and required minimal hands-on time to perform.

빠른 분자 탐지 및 인플루엔자 바이러스 A와 B의 차별화

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the person-to-person route or indirectly through environmental surfaces or food, contaminated fomites and inanimate surfaces are important vehicles for the spread of the virus during norovirus outbreaks.
We developed and evaluated a protocol using macrofoam swabs for the detection and typing of human noroviruses from hard surfaces. Compared with fiber-tipped swabs or antistatic wipes, macrofoam swabs allow virus recovery (range 1.2-33.6%) from toilet seat surfaces of up to 700 cm2. The protocol includes steps for the extraction of the virus from the swabs and further concentration of the viral RNA using spin columns. In total, 127 (58.5%) of 217 swab samples that had been collected from surfaces in cruise ships and long-term care facilities where norovirus gastroenteritis had been reported tested positive for GII norovirus by RT-qPCR. Of these 29 (22.8%) could be successfully genotyped. In conclusion, detection of norovirus on environmental surfaces using the protocol we developed may assist in determining the level of environmental contamination during outbreaks as well as detection of virus when clinical samples are not available; it may also facilitate monitoring of effectiveness of remediation strategies.

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

표면에 인간의 노로 바이러스의 검출을위한 면봉 표본 추출 방법

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...