이 작품은 H. Fölsch에 건강 (GM070736)의 국립 연구소에서 교부금에 의해 투자되었다. SF 앙은 A * STAR 대학원 장학금 수상에 의해 지원되었고, RS 캉은 질병 교육 프로그램의 세포 및 분자 기초 (GM8061)에 의해 지원되었다

1. 플라스미드 DNA의 분리 <ol><li> 제조 업체의 프로토콜에 따라 내독소 무료로 DNA를 준비하는 시그마 - 알드리치 내독소 무료 maxiprep 키트를 사용하십시오. 그것이 안정적으로 DNA의 준비로부터 endotoxins를 제거하기 때문에이 키트는 우리를 위해 작동합니다. 세포 핵에 DNA을 주사 Endotoxins는 세포 죽음을 초래합니다. </li><li> 분리된 DNA, 소용돌이 및 Eppendorf의 microcentrifuge에서 13,000 rpm으로 1 분 스핀 100 μl 페놀 / chlorofom / isoamylalcohol (25:24:1)을 추가합니다. 새로운 튜브로 상부 급수 단계를 전송 100 μl 클로로포름 / isoamylalcohol (24:1), 위와 같이 소용돌이와 스핀을 추가합니다. 새로운 튜브로 DNA를 포함하는 상부 물 위상을 전송합니다. 이 단계는 microinjection 바늘의 막히는 것을 방지 DNA에서 어떤 단백질을 제거하는 필요합니다. </li><li> 300 MM X 2 권 100 % 에탄올의 최종 농도 나 아세테이트 (산도 6.0)을 추가하여 DNA를 침전. 하룻밤 -20 ° C에서 알을 품다. Eppendorf의 microcentrifuge에서 13,000 rpm으로 20 분에 대한 DNA를 스핀, 70 % 에탄올로 한 번 씻어, 300 μl 내독소 - 무료 물 (시그마 - 알드리치)에 resuspend. </li><li> DNA 농도를 결정합니다. 일반적인 DNA의 농도는 1에서 5 μg / μl 범위. </li></ol> 2. MDCK 세포의 문화 <ol><li> MDCK 세포를 분리. 세포 및 종자 4 카운트 취소 12 mm 트랜 스웰 필터 (0.4 μm의 기공 크기, 코닝 코스타, 3460)로 X 10 5 세포. 모의 분사 제어 및 종자 세 필터를 필요 두 개의 서로 다른 돌연변이 RAB의 단백질을 포함하는 실험. </li><li> 이 MM L - 글루타민, 37에서 0.1 MG / ML 페니실린 / 스트렙토 마이신 7 % (권 / 권) 태아 소 혈청 (= 멤 성장 미디어) ° C와 5% CO 2. 함께 멤 매체 문화 MDCK 세포 </li><li> 매일 basolateral 챔버에서 미디어를 변경합니다. 그것이 동물의 상피 세포의 상황을 모방하기 때문에 이것은 편광 과정을 보조. </li><li> 세포가 닫힌 monolayer에 성장하고 있는지 여부를 현미경 2 일 이후 시딩 체크. 당신이 monolayer에 구멍을 검색할 수없는 경우, 3 일에 실험을 수행합니다. 구멍이 아직있다면, 하루 4 실험을 수행합니다. </li></ol> 3. Microinjection 절차 및 사후 분사 Incubations <ol><li> 실험 당일 39 ° C 배양기에 5 ML의 멤 성장 미디어 플러스 각 필터 및 장소에 대해 하나 60 X 15mm 판 50 MM HEPES를 준비합니다. 또한, 1 ML 멤 성장 미디어 플러스 50 MM HEPES 및 0.1 MG / ML cycloheximide 당 필터, 그리고 31 ° C 배양기에 장소 12 잘 플레이트 잘 하나가 설정할 수 있습니다. </li><li> 귀하의 microinjection 현미경의 전원을 켜고 39의 가열 무대 ° C. 우리는 열띤 무대로 바뀌 현미경 (Axiovert 200, 칼 자이스 혈구 MicroImaging 주식 회사), 10X 32X과 목표, 그리고 Eppendorf Femtojet (Injectman NI2)를 사용합니다. 마지막으로, 질소와 공기 테이블을 공급 질소 가스 탱크를 엽니다. </li><li> 100 μl - 10의 총 볼륨의 0.2 MG / ML의 최종 농도 필터링된 물 (0.2 μm의 필터를 사용하여)와 DNA를 희석. 그 후, 30 분 13,000 rpm으로 Eppendorf의 microcentrifuge에서 DNA를 스핀. 새로운 튜브에 최고 부분과 장소를 제거합니다. 이 단계는 microinjection 바늘로 희석 DNA를 로드할 때 정확하게 &quot;깨끗한&quot;DNA를 로드할 수있는 처​​리됩니다. 당신의 DNA는 지금 microinjection 준비가되었습니다. </li><li> 문화 요리의 첫 번째 필터 밖으로 복용하여 세포를 준비합니다. 외과 블레이드 (깃털 외과 블레이드, 스테인레스 스틸, 아니 11), 5 ML, 39 ° C 따뜻한 멤 성장 미디어 플러스 50 MM HEPES (60 X 15mm 판)에 필터 홀더와 장소에서 필터를 잘라 함께. 당신이 그것을 밖으로 절단에 사용되는 수술 칼날과 문화 접시에있는 필터를 아래로 무게. 수술 칼날의 구멍이 필터의 중앙을 둘러싸는 것을 필터 등에 놓으십시오. 현미경의 온수 무대에 여러분의 문화 접시를 놓습니다. </li><li> microinjection 니들 (Femtotip II, Eppendorf, 930,000,043)에 희석 DNA (이 경우 plasmids 인코딩 VSVGts045 - GFP에서 = 모의 분사 제어)로부터 2-3 μl를로드, 바늘의 보호 커버를 비틀어하고 바닥에 떨어뜨 리다 . 이제 바늘의 소유자로 실수를 할 준비가되어 있습니다. 이렇게하려면 injectman의 메뉴 키를 눌러하여 밸브가 종료되었는지 확인하십시오. 의 홀더에 바늘 나사, 그 파손을 초래할 수 있으므로 너무 단단히 바늘에 나사하지 조심하십시오. 이제 다시 메뉴 키를 적용 P C는 microinjeciton 절차 동안 바늘로 빨려에서 미디어를 방지할 수 있습니다. 마지막으로 저장된 유도를 삭제하여 조이스틱을 누릅니다. </li><li> 세포에 바늘을 줄이려면 10X 목적을 사용하여 액체 위의 광선에 바늘을 가지고. 지금 세포에 초점 휠에게 180 선회 최대로 다시 포커스를 가지고 집중하고, 바늘을 찾으십시오. 그 후, 천천히 (다시 초점으로 세포를 데리고 나갈 수) 다시 초점 밖으로 내보일 후, 초점에 바늘을 이동에 대한에 바늘을 가지고다시 cus. 니들이 언론의 표면을 건드리면 때까지 반복하는 지점이 표시됩니다 모든 후광입니다. 당신이 세포가 초점에되는 지점에 도달하지만 바늘이 (초점 비행기 즉, 밖으로) 여전히 32X 목표 및 고급 설정 변경 굵은 퍼지 경우. </li><li> 바늘 끝과 혀끝의 멤브레인를 감동 핵으로 10 μm의 약 공제한 혀끝의 막 아래에 약 10 μm의를 누워하여 Z - 한도를 설정합니다. </li><li> 당신이 Z - 한도를 설정한 후, 오른쪽 사출 압력을 찾으십시오. 95 PSI에서 시작합니다. 압력이 너무 높은 경우, 전지가 폭발합니다. 귀하의 압력이 너무 낮으면, 당신은 유지 흰 점이 표시되지만 다른 아무것도 나타나지 않습니다. 성공적인 주사로, 당신은 셀 크기를 변경하지 않고 위상 변화를 볼 수 있습니다. 사출 들어, 최대한 빨리 초점 비행기의 바늘에게 미크론의 몇을 가지고. 핵 위에 바늘 (즉, 개별 세포의 중간)와 조이스틱의 사출 버튼을 누르면 목표로하지만, 버튼을 길게하지 않습니다. </li><li> 당신의 세포에 자리잡고하여 수술 블레이드의 구멍 내에 100-500 세포를 주사. 작업이 완료되면, 2 H.위한 문화 요리와 수술 칼날 39 ° C 배양기로하고, 부화하여 세포를 배치 이 기간 동안 VSVGts045 - GFP가 표현되고 응급실에 분비. 그러나, 39 ° C에서, VSVGts045 - GFP가 제대로 배 수없고 따라서 응급실을 떠날 수 없습니다. 한편, 관심의 작은 GTPase는 공동 분사 실험에서 cytosol에 축적됩니다. </li><li> 2 H 후, 31 ° C. 2 H 위해 12 잘 플레이트와 부화 1 ML 멤 성장 미디어 플러스 50 MM HEPES 및 0.1 MG / ML cycloheximide에 세포를 배치 이 추적 기간 동안, VSVGts045 - GFP가 제대로 배 응급실에두고 세포 표면에 전달됩니다. </li><li> (plasmids 인코딩 VSVGts045 - GFP를 삽입하고 예를 들어 Rab13Q67L를 V5 - 태그) 필터를 두 (plasmids 인코딩 VSVGts045 - GFP를 삽입하고 예를 들어 Rab13T22N를 V5 - 태그) 세에 대한 3.10 - 3.1 단계를 반복합니다. 각 분사가 20 정도 걸릴 거예요 - 60 분. 당신이 세포를 수정하기 전까지 그러나, 그것은 온도 변화의 incubations와 표면 얼룩을 통해 모든 필터도 동일한 방식으로 처리하기 위해 절대적으로 중요합니다. 고정 후, 당신은 동시에 모든 필터에 대한 얼룩 프로토콜의 나머지 부분을 수행할 수 있습니다. </li></ol> 4. Immunofluorescence 분석을위한 표면 스테 이닝 참고 VSVGts045 - GFP의 GFP 신호의 표백 방지하기 위해, 이후의 모든 절차 중에 알루미늄 호일로 덮고하여 빛으로부터 표본을 보호합니다. <ol><li> 당신이 표면 얼룩을 수행하고자하는 경우, 얼음에 금속 접시에 문화 접시에서 세포를 넣고 얼음 차가운 PBS 2 + (PBS [0.2 g / 리터 KCl, 0.2 g / 리터 KH 2 PO 4 1X 너의 세포를 씻어 8g / 리터 NaCl, 그리고 2.17는 g / 리터 나 2 HPO 4 X 7 H 2 O] 플러스 0.1 g / 리터 CaCl 2 0.1 g / 리터 MgCl 2 X 6 H 2 O). 그 후, 장소이 경우에는 단백질의 ectodomain을 인식 항체의 30 μl 마우스 단클론 항체 TK1 (IgG 1, 후반 토마스 크라 이스에서 얻은), 얼음에 금속 플레이트에 위치 깨끗한 parafilm에. 거꾸로 드롭에 귀하의 세포와 필터를 배치하여 필터의 뒷면에 항체의 몇 방울을 추가합니다. 얼음 1 H에 대해 품어. </li><li> 12 잘 판에 플레이스 세포는, 얼음 차가운 PBS 2 배 세척 + (또는 RT 따뜻한 PBS 2 + 전에 표면의 얼룩없이), 그리고 RT 15 분 3 % paraformaldehyde로 수정. </li><li> PBS 2 +로 한번 세포를 씻고 + 5 분 PBS 2 둡니다. </li><li> / permeabilization 버퍼 (BPB) (2 % [WT / 권] BSA, 0.4 % [WT / 권] PBS 2 사포닌 +) 10 % [권 / 권] 염소 혈청을 차단에서 세포를 품어. RT 1 H를 품어. </li><li> 이 예제 BPB의 안티 - V5 (마우스 단클론 항체 IgG 2A, Invitrogen), 1:200에서 표현 RAB GTPase를 감지하는 기본 항체를 희석. 13,000 RPM 10 분 Eppendorf의 microcentrifuge에 희석 항체를 스핀. 깨끗한 parafilm에 항체 솔루션의 장소 30 μl가 젖은 챔버에 배치. 거꾸로 항체 드롭에 필터 세포를 놓고 RT 1 H에 대해 숙고하다. </li><li> 12 잘 플레이트와 RT에서 BPB 30 분 이상 5 배 세척에 다시 플레이스 셀 (오른쪽까지). </li><li> 이 경우에는 염소 안티 - 마우스 IgG 1 알렉사 (표면에 탐지 VSVG 들어, Invitrogen) 594 - 라벨 및 Cy5 - 라벨 이차 항체가이 예제의 염소에 당신의 RAB의 GTPase를 인식 안티 - 마우스 IgG 2A에서 적절한 보조 항체를 희석 BPB로 1:200 (잭슨 ImmunoResearch) Cy5 - 표시 및 상기 스핀. 다운 항체 드롭에 필터를 거꾸로에 젖은 챔버 및 장소 세포에서 깨끗한 parafilm에 플레이스 30 μl 항체 솔루션입니다. RT 1 H를 품어. </li><li> 4.6 단계를 반복합니다. </li><li> 탈이온수 및 장소 R로 배 필터 딥 세포microslides에 항공 측면까지. 세포의 상단에 10-15 μl 마운트 (10 % 증류수에 [WT / 권] DABCO 50 % [WT / 권] 글리세롤) 추가합니다. 상단과 얼굴 조직을 사용하여 플레이스 18X18 mm 마이크로 커버 유리 부드럽게 세포에 마이크로 덮개 유리를 누르십시오. 매니큐어로 밀봉합니다. </li><li> 공촛점 현미경으로 표본을 분석할 수 있습니다. 우리는 63X 물 침지 렌즈를 갖춘되었다 Microsystem LSM 510, 칼 자이스 혈구 MicroImaging 주식 회사를 사용합니다. </li><li> 그림의 준비를 위해, 조정 등 어도비 포토샵과 어도비 일러스트 레이터와 같은 프로그램을 사용하여 이미지를 결합하여. </li></ol> 5. 대표 결과 작은 GTPases의 공동 표현은 정렬을 VSVG을 방해하는 방법에 대한 예제를 보려면 친절하게 혀끝의 missorting 3, 4 또는 표면 전달 7 억제 하나에 대해 게시된 기사를 참조하십시오. <img src="/files/ftp_upload/2645/2645fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 표면 얼룩 (빨강, 그림 1에있는)에 의해 판단으로 모의 분사에서 단지 인코딩 플라스미드 VSVGts045 - GFP의 주사를 즉, 단백질은 잘 편광 MDCK 세포의 basolateral 표면에 배달됩니다. 모든 VSVGts045 - GFP의가 31 추적하는 동안 basolateral 멤브레인 전달됩니다 ° C로 전체 단백질에 대한 광범위한 세포 신호에 의해 입증 (녹색 1, A와 B에게 피규어). 잘 편광되지 않은 세포 VSVGts045 - GFP는 혀끝의 멤브레인 (그림 1 B) 또한 전달됩니다. 컨트롤의 표본은 그림 1에서 B 세포처럼 보인다면, 당신은 귀하의 데이터를 신뢰하고 ​​더 나은 - 양극 세포와 실험을 반복 수 없습니다. 스케일 바 5 μm의 수 있습니다.

<ol>
	<li>Mellman, I., Nelson, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature reviews. 9 (11), 833-833 (2008).</li><li>Rodriguez-Boulan, E., Kreitzer, G., Musch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature reviews. 6 (3), 233-233 (2005).</li><li>Ang, A. L., F&#246;lsch, H., Koivisto, U. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Journal of cell biology. 163 (2), 339-339 (2003).</li><li>Kroschewski, R., Hall, A., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature cell biology. 1 (1), 8-8 (1999).</li><li>Moskalenko, S., Henry, D. O., Rosse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature cell biology. 4 (1), 66-66 (2002).</li><li>Schuck, S., Gerl, M. J., Ang, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Traffic (Copenhagen, Denmark). 8 (1), 47-47 (2007).</li><li>Nokes, R. L., Fields, I. C., Collins, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Journal of cell biology. 182 (5), 845-845 (2008).</li><li>Collins, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cell.">Molecular cell.</a> 12, 1064-1064 (2003).</li><li>Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Science (New York, N.Y. 279 (5350), 509-509 (1998).</li><li>Scales, S. J., Pepperkok, R., Kreis, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell. 90 (6), 1137-1137 (1997).</li><li>Keller, P., Toomre, D., Diaz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature cell biology. 3 (2), 140-140 (2001).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

성공 microinjection 실험을위한 가장 중요한 단계는 DNA와 세포의 극성의 품질과 순도 있습니다. 양극 세포없이 사출 제어 이미 VSVG을 mistargeted가되며 실험은 사용할 수 없습니다. DNA는 질이 나쁜 경우, DNA가 가난한 사람들에게 최고의 사출 바늘 또는 모두에 원하는 단백질없이 표현을 방해할 수 있습니다. 또한, 같은 pRKV 같은 높은 표현 수준으로 이어질 것으로 알려진 표현 plasmids를 사용하는 것이 좋습니다입니다. 다른화물 단백질의 분류에 대한 테스트를 원하는 경우, 온도 변화 프로토콜을 수정할 수 있습니다. 예를 들어, 낮은 밀도 지단 백질 수용체를 표현하기 위해, 우리는 37 microinjection을 수행 ° 37 1 H 보육 다음 C ° C, 20 4 H ° C (TGN에서화물을 체포하기 위해) 37 2 H ° 0.1 MG / ML cycloheximide의 존재에 C는 표면에 단백질을 추적합니다. 이러한 FC 수용체 같은 단백질의 경우, 20에서 배양 시간 ° C는화물 단백질을 합성하는 방법 빠른에 따라 2 H로 낮추어 수 있으며 분비 경로를 통해 여행. 들어 우리가 다른화물 단백질에 사용되는 incubations에 대한 자세한 설명은 2008 년 7 녹스 외 있습니다. 참조하십시오. 마지막으로,이 프로토콜은 작은 GTPases의 분석뿐만 아니라 사용할 수 있지만 의심되는 모든 단백질이나 단백질 조각에 대한 이론 (편광) 표면 배달의 기능을 할 수 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> 온수 단계 200 현미경 Axiovert </td><td> 칼 자이스 혈구 부동산 </td><td> 맞춤 주문 </td></tr><tr><td> Injectman NI2 Femtojet의 micromanipulator </td><td> Eppendorf </td><td> 맞춤 주문 </td></tr><tr><td> Femtotips II (Microinjection의 바늘) </td><td> Eppendorf </td><td> 930000043 </td></tr><tr><td> Microloader 팁 </td><td> Eppendorf </td><td> 930001007 </td></tr><tr><td> 클리어 12 - mm 트랜 스웰 필터 지원 </td><td> 코닝 코스타 </td><td> 3460 </td></tr><tr><td> 내독소없는 플라스미드 maxiprep 키트 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> NA0400 </td></tr></tbody></table>

analyzing the function of small gtpases by microinjection of plasmids into polarized epithelial cells

혀끝의 도메인이 &#39;무료&#39;표면을 얼굴 basolateral 세포막이 기판과 이웃 세포와 접촉에 화학적 및 기능 뚜렷한 혀끝의과 basolateral 도메인으로 자신의 플라즈마 막 분극 상피 세포. 두 멤브레인 도메인은 확산 장벽을 형성 꽉 분기점에 의해 구분됩니다. 이러한 마딘 - 다비 케이 나인 신장 (MDCK) 세포로 상피 세포가 폴리 카보 네이트 필터에서 높은 밀도의 씨앗을 품고 여러 일 1 2 양식 때 혀끝의 - basolateral 분극은 문화에 성공적으로 recapitulated 수 있습니다. 세포 극성의 구축 및 유지 보수는 그러한 RalA, Cdc42, Rab8, Rab10 및 Rab13 3 4 5 6 7로 라스의 superfamily의 작은 GTPases의 배열에 의해 규제됩니다. 비활성 GDP - 바운드 상태와 활성 GTP - 바운드 주 사이의 모든 GTPases와 마찬가지로 이들 단백질은 사이클. 뉴클레오 티드 바인딩 지역의 특정 돌연변이 자전거 8 방해. 예를 들어, Rab13T22N는 영구적으로 GDP - 형태로 고정하기 때문에 &#39;부정적인 지배&#39;로 명명됨, Rab13Q67L 더 이상 GTP를 hydrolyze 수없는 반면에 있으므로 &#39;지배 운영중&#39;상태 7 잠겨입니다. 그들의 기능을 분석하는 셀에 GTPases 모두 지배적인 부정과 지배 적극적인 대립 유전자는 일반적으로 내생 단백질 구의 기능을 방해하는 높은 수준에서 표현됩니다. 짧은 시간 금액에 overexpression 높은 수준을 달성하기 우아한 방법은 필터 microinjection 기술을 사용하여 지원에 성장 양극 세포의 핵에 직접 관련 단백질을 인코딩 plasmids을 소개하는 것입니다. 이것은 종종 특히 혀끝의 또는 basolateral 도메인에 정렬됩니다 플라즈마 막 수용체를 인코딩 기자 plasmids의 공동 주사와 결합됩니다. 자주 basolateral 도메인에 정렬화물을 분석하는 데 사용되는화물은 기공을 갖는 구염 바이러스 당단백질 (VSVGts045) 10 이상의 온도에 민감한 allele입니다. 이 단백질은 39 ° C에서 제대로 접을 수 없어 관심의 규제 단백질이 cytosol에서 조립하는 동안 따라서 endoplasmic reticulum (ER)에 유지됩니다. 31 이동 ° C 다음 VSVGts045는 플라즈마 막 11 응급실에 여행을 제대로 접어 떠날 수 있습니다. 이 추적은 일반적으로 청소기 결과를 선도하는 추가의 단백질 합성을 방지하기 위해 cycloheximide의 존재에서 수행됩니다. 여기 상세 basolateral 정렬에 관련된 규제 단백질의 포괄적인 분석을 허용 온도 교대를 포함하여 편광 세포와 후속 incubations에 plasmids를 microinjecting의 절차를 설명합니다.

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Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

이 문서는 자세한 microinjection 기술을 사용하여 편광 상피 세포의 작은 GTPases의 overexpression 및 분석에 관련된 절차를.

편광 상피 세포에 Plasmids의 Microinjection에 의해 작은 GTPases의 기능을 분석

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces ...

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Nanyang Technological University

Research

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Biology

11.3K 조회수.  Northwestern University. 이 문서는 자세한 microinjection 기술을 사용하여 편광 상피 세포의 작은 GTPases의 overexpression 및 분석에 관련된 절차를.

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Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

유전자 기능을 분석 Zebrafish 배아들 중 Microinjection

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

연구

생물학

Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of dome shaped cell structures referred to as mammospheres 1. The HC11 cell line has been employed as a model system for the study of regulation of mammary lactogenic differentiation both in vitro and in vivo 2. The HC11 cells differentiate and synthesize milk proteins in response to treatment with lactogenic hormones. Following the growth of HC11 mouse mammary epithelial cells to confluence, lactogenic differentiation was induced by the addition of a combination of lactogenic hormones including dexamethasone, insulin, and prolactin, referred to as DIP. The HC11 cells induced to differentiate were photographed at times up to 120 hours post induction of differentiation and the number of mammospheres that appeared in each culture was enumerated. The size of the individual mammospheres correlates with the degree of differentiation and this is depicted in the images of the differentiating cells.

HC11 lactogenic differentiation can be characterized by the formation of domed structures referred to as mammospheres. The structures can be enumerated by phase contrast microscopy to aid in quantifying lactogenic differentiation.

마우스 내유 상피 세포는 Lactogenic 차별 동안 Mammospheres를 형성

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of ...

Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to immortalized cell lines. However, the post-mitotic nature of primary neurons prevents effective heterologous protein expression using common procedures such as electroporation or chemically-mediated transfection. Thus, other techniques must be employed in order to effectively express proteins in these non-dividing cells.
In this article, we describe the steps required to perform intranuclear injections of cDNA constructs into dissociated adult sympathetic neurons. This technique, which has been applied to different types of neurons, can successfully induce heterologous protein expression. The equipment essential for the microinjection procedure includes an inverted microscope to visualize cells, a glass injection pipet filled with cDNA solution that is connected to a N2(g) pressure delivery system, and a micromanipulator. The micromanipulator coordinates the injection motion of microinjection pipet with a brief pulse of pressurized N2 to eject cDNA solution from the pipet tip. 
This technique does not have the toxicity associated with many other transfection methods and enables multiple DNA constructs to be expressed at a consistent ratio. The low number of injected cells makes the microinjection procedure well suited for single cell studies such as electrophysiological recordings and optical imaging, but may not be ideal for biochemical assays that require a larger number of cells and higher transfection efficiencies. Although intranuclear microinjections require an investment of equipment and time, the ability to achieve high levels of heterologous protein expression in a physiologically relevant environment makes this technique a very useful tool to investigate protein function.

Direct intranuclear injection of cDNA is an effective transfection technique for post-mitotic cells. This method provides high levels of heterologous protein expression from single or multiple cDNA constructs and enables protein function to be studied in a physiologically relevant environment with a variety of single cell assays.

Dissociated 성인 포유류의 뉴런으로 DNA의 Microinjection Intranuclear

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

Microinjection하여 포유 동물 세포에서 mRNA 원자력 수출 속도론 분석

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

시토크롬의 세포질 Microinjection 의한 Apoptosis의 활성화 C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

RNA 정제에 의한 염색질 절연 (처프)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

간엽 전환을 유도하고 상피의 분석

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

In vitro models using human primary epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory epithelium in the context of microbial infections or inhaled agents. Direct comparisons of cells obtained from diseased populations allow us to characterize different phenotypes and dissect the underlying mechanisms mediating changes in epithelial cell function. Culturing epithelial cells from the human tracheobronchial region has been well documented, but is limited by the availability of human lung tissue or invasiveness associated with obtaining the bronchial brushes biopsies. Nasal epithelial cells are obtained through much less invasive superficial nasal scrape biopsies and subjects can be biopsied multiple times with no significant side effects. Additionally, the nose is the entry point to the respiratory system and therefore one of the first sites to be exposed to any kind of air-borne stressor, such as microbial agents, pollutants, or allergens. 
Briefly, nasal epithelial cells obtained from human volunteers are expanded on coated tissue culture plates, and then transferred onto cell culture inserts. Upon reaching confluency, cells continue to be cultured at the air-liquid interface (ALI), for several weeks, which creates more physiologically relevant conditions. The ALI culture condition uses defined media leading to a differentiated epithelium that exhibits morphological and functional characteristics similar to the human nasal epithelium, with both ciliated and mucus producing cells. Tissue culture inserts with differentiated nasal epithelial cells can be manipulated in a variety of ways depending on the research questions (treatment with pharmacological agents, transduction with lentiviral vectors, exposure to gases, or infection with microbial agents) and analyzed for numerous different endpoints ranging from cellular and molecular pathways, functional changes, morphology, etc. 
In vitro models of differentiated human nasal epithelial cells will enable investigators to address novel and important research questions by using organotypic experimental models that largely mimic the nasal epithelium in vivo.

Nasal epithelial cells, obtained through superficial scrape biopsy of human volunteers, are expanded and transferred onto tissue culture inserts. Upon reaching confluency, cells are grown at air liquid interface, yielding cultures of ciliated and non-ciliated cells. Differentiated nasal epithelial cell cultures provide viable experimental models for studying the respiratory mucosa.

에어 리퀴드 인터페이스에서 인간의 비강 상피 세포의 배양

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

Calcium is involved in numerous physiological and pathophysiological signaling pathways. Live cell imaging requires specialized equipment and can be time consuming. A quick, simple method using a flow cytometer to determine relative changes in cytosolic calcium in adherent epithelial cells brought into suspension was optimized.

유동 세포 계측법에 의한 신장 상피 세포에서 세포 내 칼슘 측정

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.