ברצוננו להודות Iwan נהר הסכי וסבסטיאן וקסמן-Hogiu על תרומתם בפיתוח טכניקה DR-מכוניות. השבועות טיילר מודה תמיכה על ידי תוכנית Scholar לורנס מן המעבדה הלאומית לורנס ליברמור. תומאס Huser הוא אסיר תודה על התמיכה של איגוד הלב האמריקני באמצעות תוכנית גרנט-in-Aid. עבודה זו נתמכה גם על ידי מימון הקרן הלאומית למדע בחלקו. המרכז Biophotonics, מדע וטכנולוגיה NSF המרכז, המנוהל על ידי אוניברסיטת קליפורניה, דייוויס, על פי הסכם שיתופית מס &#39;0120999 PHY. תמיכה הוא הודה גם מהמרכז UCD המדע קלינית Translational תחת מספר מענק UL1 RR024146 מן המרכז הלאומי למשאבי מחקר (NCRR).

1. דור של מכוניות DR-CARS איתותי על מנת לייצר מכוניות DR-CARS אותות בעת ובעונה אחת, שלושה מקורות מתכונן מסונכרן קצר לייזר פעמו נדרשים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקבל שלוש פעימות מסונכרן נתחיל עם אחת 10 W לייזר (PicoTrain, HighQ לייזר, Inc). לייזר זה אורך גל קבוע של 1064 ננומטר, אורך פולס קבוע של 7 ps, ושיעור החזרה קבוע של 76 MHz. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות סדרה של חצי גל צלחות מקטב קרן splitter קוביות קרן מחולק לשלושה חלקים. צלחת חצי גל בשילוב עם קובייה מקטב קרן splitter מאפשר לנו להתאים את כמות כוח כל רכיב של הקורה מבלי לשנות את הכיוון שלו. בדרך כלל, שתי אלומות מותאמים ~ 4.5 ואט כל אחת, את קרן third מכיל את הנותרים 1 וו </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שתי אלומות בהספק גבוה מופנים אז לשתי מתנדים עצמאי פרמטרי אופטי (OPO של, Avante, APE GmbH, ברלין, גרמניה). ההבדל להשתמש OPO של תדר הדור להמיר פוטון אנרגיה גבוהה יותר לשני פוטונים עם אנרגיה נמוכה יותר באורכי גל שונים. על ידי שליטה על הטמפרטורה של גביש המשמש להשיג את האפקט הזה, אורכי הגל של הפוטונים וכתוצאה מכך ניתן לשלוט בתוך 0.1 ננומטר. על ידי הכפלת תדר האותות הללו, לייזר עם אורך גל קבוע של 1064 ננומטר כעת ניתן להפוך קרן לייזר כי יכול להיות מכוון מקום בין 780 ננומטר עד 910 ננומטר. על ידי שאיבה של שני נפרד OPO עם מקור זהה 1064 ננומטר, נקבל שני מקורות לייזר מתכונן באופן עצמאי כי מסונכרנים באופן אוטומטי לייזר המשאבה המקורית שלנו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקרן השלישית (ההספק הנמוכה ביותר) של לייזר 1064 ננומטר משאבת מכוונת סביב זה OPO על ידי שילוב של מראות dichroic כך כל שלוש אלומות (2 מ OPOs, 1 מ לייזר המשאבה) ניתן recombined מאוחר יותר. על מנת לייצר ביעילות קוהרנטית פוטונים אות ראמאן קטניות recombined חייבת להיות חפיפה הן temporally מרחבית. בגלל זה OPO מכילים חללים הטבעת, המאפשר לכל הדופק לייזר לעבור דרך מספר רב של פעמים קריסטל, קורות שנשלח באמצעות נסיעה של OPO המרחק הנוסף וכתוצאה מכך עיכוב ניכר ביחס הקורה משאבה מקורית. מרחק זה חייב להיות מתוגמל עבור עם קרן השלישי ידי הצגת מראות כי תוספת כוח קרן זה לנסוע את אותו המרחק כמו השניים האחרים לפני שהם recombined שימוש במראות dichroic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת לספק התאמה קנס של אורך השביל הקורה כל נוסע בשלבים עיכוב מתכווננת, באמצעות retroreflectors פריזמה, מוכנסים כל נתיב קרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבוצה נוספת של חצי גל צלחות מקטב קרן קוביות ספליטר מתווספים כל הקורה כדי לאפשר לנו להתאים את העוצמה של כל קרן באופן עצמאי מבלי להשפיע על הקלט של OPO של. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מראות dichroic משמשים קודם לשלב את קורות משתי של OPO ולאחר מכן עם קרן 1064 ננומטר. יש להקפיד על מנת להבטיח כי הקורות הם חפפו במדויק (כלומר הם קוליניארי יש סטייה דומה). זה יכול להיבדק על ידי השוואת חפיפה של קורות קרוב (בתוך כמה סנטימטרים) ורחוק במראה (~ 1 מ &#39;) dichroic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היתרון של שימוש בלייזרים פעמו היא הדופק כל יכול להיות שיא אנרגיה גבוהה המדגם, המאפשר לדור יעיל של אותות ראמאן קוהרנטית, תוך שמירה על עוצמת הממוצע נמוך. עוצמת ממוצע גבוה יכול לגרום נזק המדגם. לכן על מנת להמשיך לשלוט על עוצמת הממוצע מבלי להקריב אנרגיה שיא, שלוש קורות בשילוב נשלחים דרך אפנן אלקטרו אופטיים (תא של Pockel, ConOptics) מתפקד בורר דופק, אשר מאפשר לנו להתאים את קצב החזרה של פולסים כי מגיעים המדגם שלנו ולכן עוצמת הממוצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרני לייזר משולב הם מצמידים מכן לתוך מיקרוסקופ הפוכה עם מטרה NA גבוה. המטרה היא בדרך כלל 60 X אובייקטיבי מים עדשה עם צמצם מספרית (NA) של 1.2 כי תוקנה על סטייה כרומטית על פני טווח של tunability של OPO שלנו הקורה 1064 ננומטר. חזק התמקדות שנוצר על ידי העדשה NA גבוה אובייקטיבי מאפשרת לדור היעילה ביותר של אותות ראמאן קוהרנטית בסולם מיקרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קורות בשילוב מורחבות כדי overfill האחורי יציאת המטרה מיקרוסקופ. עד שגדשו את החלק האחורי של המטרה מיקרוסקופ אנו יכולים להשיג את התנאים הטובים ביותר התמקדות ולכן ברזולוציה מרחבית הטובה ביותר במערכת מיקרוסקופ שלנו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העדשה אובייקטיבי מיקרוסקופ שלנו הוא רכוב על הבמה XYZ piezo שמאפשר לנו לקבל תמונות על ידי סריקה לסריקת הקורות על פני המדגם, בדומה הקורה סריקת מיקרוסקופ מסחרי confocal. </li></ol> 2. השימוש שלושה לייזרים קצר פעמו שימוש של שלושה לייזרים קצר פעמו תוצאות בייצור של אותות כמה מכוניות, החל ג השונותombinations של שני לייזרים, כמו גם 3-Color מכוניות DR-FWM אותות משילוב של כל שלושת לייזרים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אורכי הגל של האותות יכול לשקר spectrally קרובים זה לזה. כאשר אותות קרובים זה יכול להיות קשה להפריד ביניהם לניתוח שימוש קבוע bandpass גל מסננים ומראות dichroic. מסיבה זו האותות שלנו מועברים לתוך ספקטרומטר ההדמיה (SpectraPro 2300i, אקטון Research), אשר משמש גם monochromator יעילה במרחב נפרד אותות באורכי גל שונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המראה להעיף actuated אלקטרונית בתוך הספקטרומטר בעמדה הוריד שולח את האות בחזרה מואר דלדול עמוק מצלמה תשלום מצמידים מכשיר (CCD) המספק מידע ספקטרוסקופיות על פני טווח האות כולו מאפשר לנו לזהות לייעל את קוהרנטית שונים ראמאן אותות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבחור את האות שבה אנו רוצים תמונה אנחנו פשוט לסובב את הסורג בתוך הספקטרומטר, באמצעות המסופקים מלאה רכישת נתונים תוכנה (WinSpec, פרינסטון מכשירים), למרכז השיא של הריבית על מצלמת CCD ולאחר מכן לשנות את המיקום של המראה להעיף להפנות את האות ליציאת היציאה השנייה שבה מפולת פוטון יחיד לספור צילום דיודה (APD) חובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העדשה היא המטרה אז raster-שנסרקו את האותות נרשמות על APD הם השתמשו כדי ליצור תמונה על ידי הצגת פוטון לספור שער עבור כל פיקסל באמצעות תוכנה רכישת נתונים (SymPhoTime, Picoquant GmbH, ברלין, גרמניה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנו חוזרים על הליך זה עבור הדמיה האות הרצויה בכל ראמאן קוהרנטי אשר מאפשר לנו להשוות את האותות במהלך שלאחר עיבוד. </li></ol> 3. לדוגמא הכנה על מנת לקבל ברורה, תמונות לשחזור טיפול כלשהו חייב להילקח בהכנת המדגם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דוגמאות מוכנים בדרך כלל על 150 ~ coverslips מיקרון זכוכית עבה. Coverslips אלה הם דקים מספיק כדי לאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה עם 1.2 מטרות NA המשמשים בדרך כלל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכידה אופטית של עצמים דיאלקטרי יכול להתרחש כאשר אור הלייזר הוא diffracted דרך עצמים שקופים קטנים. השימוש כוח, ממוקדת היטב שיא גבוהה, קצר קרני לייזר פעמו מכן ניתן לגרור תאים קטנים או חיידקים יחד, וכתוצאה מכך תמונות מטושטשות או מרוחות. כדי למנוע זאת זה עשוי להיות נחוץ כדי לשתק את המדגם על פני השטח של coverslip הזכוכית על ידי הראשון מריחת שכבה דקה של פולי-L-ליזין ידי ציפוי ספין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור תאים בתרבית תחתית זכוכית מנות התרבות יכול להיות מנוצל המאפשרים הדמיה ללא צורך לנתק את התאים מן התרבות התא שלהם מנות צמיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הפגנה תרומה זו אנו הראשון פיקדון פורמלדהיד-קבוע C. elegans תולעת נמטודות על פיסת כיסוי זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ואז להוסיף טיפה 20 μL של פתרון M 5 גלוקוז deuterated על התולעת. הפתרון מספק גלוקוז deuterated חתימה ייחודית וחזקה רקע ראמאן. </li></ol> 4. לדוגמא ניתוח כדי לנצל כראוי אפקט שיפור כפליים-התהודה הספקטרום של שני ראמאן ראמאן-התהודה חומרים חייב להיות ידוע. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר המדגם הוא מוכן על coverslip הוא ניתח באמצעות מיקרוסקופ ראמאן confocal לקבל את ספקטרום ראמאן רלוונטי ספונטנית לזהות פסגות מתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבצע DR-CARS לנו לזהות את מיקומי הרפאים של מצב למתוח CH, הקשורות בדרך כלל שומנים, ואת מצב למתוח CD, הקשורים גלוקוז deuterated, כי 2845 ו - 2121 ס&quot;מ -1 ס&quot;מ -1 בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיזור ראמאן קוהירנט מושגת כאשר ההבדל בין שני לייזרים תדר תואם את תדירות הרטט מולקולרית. על ידי כוונון OPO אחד 817 ננומטר זה יהיה לחקור את 2845 -1 ס&quot;מ מצב CH בשילוב עם אלומת לייזר 1064 ננומטר ידי כוונון OPO אחרים 868 ננומטר זה יהיה לחקור את השיא 2,121 -1 ס&quot;מ בשילוב עם קרן 1064 ננומטר . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על ידי סריקה לסריקת המדגם על מיקרוסקופ המכוניות עכשיו אנחנו יכולים להתבונן three אותות ראמאן קוהרנטית של עניין. מכוניות אות לחקור את CH מתיחה רטט, מכוניות אות לחקור את מצב המתיחה CD, ואת אות DR-CARS חיטוט שניהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנו בוחרים כל שיא כמתואר בסעיף 2.3 ולקחת תמונה כפי שתואר לעיל. </li></ol> 5. עיבוד תמונה מחלץ מידע נוסף על שלושת התמונות כעת דורש עיבוד תמונה פשוטה למדי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית תמונות חייב להיות תקין. ב נורמליזציה התיאוריה יכולה להיות מושגת על ידי החשבונאי עוצמת הלייזר כל המעורבים בתהליך כל דור האות. אולם בפועל זה לא תמיד עובד, בעיקר עקב תגובה לא אחידה רפאיםמראות, גלאי dichroic, ומסבכות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיטה מעשית נורמליזציה מסתמך על העובדה כי באזורים בהם שומנים טהור להשתלט על האות, את התהודה CD לא צריך לתרום כל האות. כמו כן, באזורים של פתרון גלוקוז טהור התהודה CH לא צריך לתרום כל האות. לאור זאת, אנו לנרמל את התמונה DR-מכוניות התמונה מכוניות מתקבל על תהודה את התקליטור של הפתרון גלוקוז deuterated לאזור גם מחוץ C. elegans תולעת צריך להפגין אין תהודה CH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אז אנחנו לזיהוי אזור בתוך התולעת בתמונה מכוניות CH-התהודה כי הוא עשיר שומנים לנרמל אותו לאזור המתאים בתוך התמונה DR-CARS מנורמל. בשיטה זו כדי לעבוד כמו שצריך אנו מניחים כי עמוק בתוך האזור הזה לא הגלוקוז deuterated הוא ההווה. זוהי הנחה בטוחה מאז שומנים הם הידרופובי ולא לערבב עם הפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כעת, על ידי הפחתת תמונה מנורמל CH-התהודה מכוניות מהתמונה DR-CARS מנורמל נותרנו רק עם האות CD-התהודה מוגבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן דומה על ידי הפחתת תמונה מנורמל CD-התהודה מכוניות מהתמונה DR-FWM מנורמל אנחנו נשארים עם CH-מהדהד רק אות מוגבר. </li></ol> 6. נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/2085/2085fig1.jpg" alt="איור 1" /> איור 1: תרשים של מערכת DR-CARS מיקרוסקופיה כמתואר לעיל. <img src="/files/ftp_upload/2085/2085fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2: תמונה האור הלבן של ג תולעת elegans בפתרון גלוקוז deuterated מוכן על coverslip כוס ומוכן הדמיה. <img src="/files/ftp_upload/2085/2085fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3:. ספקטרום ראמאן של חומצה אולאית שונה (חומצת שומן בלתי רוויות) הכולל שינוי alkyne (משולשת הקשר פחמן פחמן קבוצה) תהודות CH חזק ב 2845 ו -1 ס&quot;מ תהודה alkyne ב -1 ס&quot;מ 2100 הן מבודד היטב מאזור טביעת אצבע (האזור של פסגות בצפיפות), מה שהופך אותם סמנים אידיאלי עבור הדמיה ראמאן קוהרנטית. <img src="/files/ftp_upload/2085/2085fig4.jpg" alt="איור 4" /> איור 4:. ספקטרום אופייני של אותות ראמאן קוהרנטית שנוצר כאשר שלושה קצר פעמו לייזרים הם חופפים בתוך המדגם החיצים מצביעים על תהליך (ES) אחראי על כל אות כמו מיוצג על ידי דיאגרמות אנרגיה. ב דיאגרמות המוצג כאן החצים מצביעים מקווקו פוטונים מקרינת הלייזר ואת OPO של וחצים מוצק לציין את האות שהתקבל. קווים אופקיים מוצק לציין את האנרגיה של הרטט ראמאן ולתת ייצוג חזותי, כי DR-CARS, ערבוב אותו 3 פוטונים קלט בו זמנית בדיקות two תנודות ראמאן שונים. <img src="/files/ftp_upload/2085/2085fig5.jpg" alt="איור 5" /> איור 5: תוצאות אופייניות של הדמיה ג elegans תולעים באמצעות DR-מכוניות מכוניות. השורה העליונה השתמשו בשלושת האותות המצוין באיור 4 לתמונה תולעת בתמיסה של גלוקוז deuterated. בשורה השנייה התמונות היו מנורמל הולם בשורה השלישית את התמונות ההבדל הופקו על ידי הפחתת כל התמונות מכוניות תמונה DR-המכוניות.

<ol>
	<li>Cheng, J. X., Volkmer, A., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theoretical+and+experimental+characterization+of+coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+microscopy.">Theoretical and experimental characterization of coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy.</a> J Opt Soc Am B. 19 (9), (2002).</li><li>Tolles, W. M., Nibler, J. W., McDonald, J. R., Harvey, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Review+of+the+Theory+and+Application+of+Coherent+Anti-Stokes+Raman+Spectroscopy+(CARS).">A Review of the Theory and Application of Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy (CARS).</a> Appl Spectrosc. , (1977).</li><li>Weeks, T., Schie, I. W., Wachsmann-Hogiu, S., Huser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+generation+and+Raman-resonant+imaging+by+non-degenerate+four-wave+mixing+under+tight+focusing+conditions.">Signal generation and Raman-resonant imaging by non-degenerate four-wave mixing under tight focusing conditions.</a> J Biophoton. 3 (3), 169-175 (2010).</li><li>Weeks, T., Wachsmann-Hogiu, S., Huser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raman+Microscopy+based+on+Doubly-Resonant+Four-Wave+Mixing+(DR-FWM).">Raman Microscopy based on Doubly-Resonant Four-Wave Mixing (DR-FWM).</a> Opt Express. 17 (19), 17044-17051 (2009).</li><li>Schie, I. W., Weeks, T., McNerney, G. P., Fore, S., Sampson, J. K., Wachsmann-Hogiu, S., Rutledge, J. C., Huser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+forward+and+epi-CARS+microscopy+with+a+single+detector+by+time-correlated+single+photon+counting.">Simultaneous forward and epi-CARS microscopy with a single detector by time-correlated single photon counting.</a> Optics Express. 16 (3), 2168-2175 (2008).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

ספקטרוסקופיית ראמאן ראמאן מבוססות הדמיה הם כלים חדשים רבי עוצמה בתחום מדעי ביו. נכון לעכשיו, זה נכון במיוחד עבור in vivo ו במחקר במבחנה של חילוף החומרים התאי והפרעות מטבוליות עיבוד ואחסון של שומנים. רוב ביו מקרומולקולות מכילים כמות גדולה של איגרות חוב דומות מולקולרית בעיקר מבוססי פחמן, כך ספקטרום ראמאן המתקבל תאים ואורגניזמים הם בדרך כלל פיתול של תרומות שומנים, חלבונים, חומצות גרעין, סוכרים, שומנים וכו &#39;קל יחסית כדי לבודד מן הספקטרום הללו מורכבים, בשל נטייתם טופס טיפות צפופה או bilayers ובגלל שהם מכילים שרשראות מורחבת עם מספר רב של אג&quot;ח CH aliphatic. היכולת שלנו כדי לבודד חלבונים ספציפיים, חומצות אמינו, RNA או DNA בתוך הסביבה התאית מורכבת, עם זאת, מוגבלת מאוד. זה נכון במיוחד אם אלה מולקולות של עניין קיימים רק בריכוזים מיקרומטר ומטה. הנה, את היכולת לחקור תהודות ראמאן חלש ניצול הציג את החדשות שלנו DR-CARS הדמיה טכניקה ההבדל מספק גישה רב עוצמה פוטנציאלי עבור microanalysis הכימי שלהם הדמיה. אמנם, את החלק המסובך ביותר של פרוטוקול זה הוא יישור וסינכרון של מערכת לייזר. כאשר מתחיל מאפס, את הסנכרון של קטניות, כלומר להבטיח כי קטניות הן חופפות בזמן למרות מסלולים שונים שהם לוקחים ניתן להקל על ידי שימוש autocorrelator דופק. חפיפה מרחבית לאחר ובזמן מושגת, מכוניות DR-CARS אותות צריכה להתגלות בקלות. עם זאת, יישור הראשון הוא בדרך כלל בוטה, וכתוצאה מכך אותות חלשים. התרגול הטוב ביותר עבור יישור מערכת זו גם היא תחילה לייצר אותות חלשים ולאחר מכן על מנת לשפר את עוצמת האות על ידי tweaking בעדינות את המראות לאורך כל נתיב והתאמת חפיפה הזמני באמצעות בשלבים דיחוי. למרות ספקטרומטר / monochromator משמש לבלבל יעיל מאוד אור בחדר תוצאות הנקייה יכולה להיות מושגת על ידי מערכת ההפעלה עם האורות בחדר כבוי וילונות או צינורות העדשה כדי למזער רקע שהוצגו על ידי אור ממקורות שונים אחרים (כגון מסכי מחשב, חיווי אורות, נוריות וכו &#39;). ההגדרה שלנו בפרט מנצל פוטון יחיד מפולת צילום דיודה הספירה (APD) גלאי זמן בקורלציה ספירת חומרה פוטון יחיד (TCSPC) לאיתור 5. זה מאפשר לנו לזהות אותות חלשים מאוד עם רעש נמוך יחסית, אבל קבוצות רבות מצאו צילום מכפיל צינורות (PMT של) עם רווח משתנה יתרון בעת ​​ביצוע מדידות דומות. היתרון של PMT היא שהם מציעים רווח משתנה ויש להם שטח זיהוי הרבה יותר גדול אשר יכול לפשט את היישור של הגלאי. בנוסף, ההגדרה שלנו מנצל בשלבים piezo לתרגם את המטרה על מנת להשיג סריקה הקורה. היתרון של זה היא שיש לנו את היכולת לחזור למקום כלשהו בתוך התמונה הסרוקה בעבר עם רמה גבוהה של דיוק לבצע מדידות נוספות כולל ספקטרום ראמאן ספונטנית. קבוצות אחרות הצליחו ניצול אסיפות ראי סריקה, או כל עוד יחידות סריקה confocal כגון מערכת אולימפוס FluoView, אשר מציע הדמיה הרבה יותר מהר, אך היא מוגבלת ביכולתה לחזור דווקא למקומות שרירותי בתוך תמונה. כוונון לייזרים כדי להתאים את התהודה ראמאן גם שלב קריטי אשר יחייבו כמה אופטימיזציה. למרות הפסגות ראמאן יכול להיות ידוע את עוצמת מקסימום שיא הספקטרום המתקבל DR-מכוניות מכוניות לא בהכרח מתאימות לכל היותר הפסגה ראמאן ספונטנית. זאת בשל התערבות מהותית של אותות שנוצר על ידי ארבע גל ערבוב המוביל האות הלא מהדהד ברקע ומכוניות, אשר מעוות מכוניות ספקטרה יחסית ספקטרום ראמאן ספונטנית. המיקום הרפאים של השיא של האות המכוניות ניתן לחשב, אך גישה מעשית יותר היא לכוון את OPOs ב, כמה צעדים קטנים על פני הספקטרום המיקום הצפוי של התהודה ראמאן. תהליך זה אמור להניב מקסימום ברור. למעשה, על הרגישות הגדולה של DR-FWM תהודות הן חייב להיות מכוון למקסימום זה. אחת הבעיות פוטנציאל האחרון הגישה DR-המכוניות יש גם לדון, כלומר את האות DR-CARS יהיה תלוי הפצה הומוגנית של המולקולה ראמאן פעיל הגברה. עבור אובייקטים ביולוגיים ביותר, זה יכול בהחלט להיות תהודה רחבה OH מן המים, שהוא בשפע בכל מקום כמעט. מים, לעומת זאת, מחוץ לאזורים הידרופובי עם תא, כגון טיפות השומנים, המוביל עיוות של האותות המתקבלים כאשר ניצול תהודה מים כדי להגביר מצבי השומנים. בדוגמה שלנו, השתמשנו פתרון של גלוקוז deuterated לייצר אות לזיהוי בקלות ובשפע למדגם הביולוגי שלנו. באופן דומה, deuterated מים או deuterated buffe ביולוגיrs, כגון d-HEPES יכול לשמש. בדוגמה שלנו, שומנים טיפות בתוך ג תולעת elegans היו קטנים מספיק כדי להכיל תמיד, הפתרון deuterated גלוקוז ושומנים בתוך המקום לייזר ממוקדת של המערכת שלנו. עם זאת, הוא בדרך כלל לא נכון. דוגמה מסוים יהיה adipocytes, אשר יוצרים טיפות השומנים די גדול בתוך הציטופלסמה שלהם. זאת אומרת, כל ניסוי שנערך עם טכניקה DR-המכוניות מצריכה הכנה קפדנית וניסיונות לשלוט כדי לאמת את התוצאות.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>60X water immersion objective</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>UPLSAPO 60XW</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Inverted Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>IX-71SIF-3</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pockels Cell</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ConOptics</td>
<td>350-160</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Picotrain pump Laser</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>HighQ</td>
<td>IC-1064-10000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Optical Parametric Oscillator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>APE</td>
<td>Levante IR</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1.5 Glass cover slips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>12-545-102 25cm-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Half-wave plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thor Labs</td>
<td>AHWP05M-980</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polarizing Beam Splitter Cubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thor Labs</td>
<td>PBS052 or PBS053</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spectrometer/Monochromator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PI Acton</td>
<td>Spectra Pro 2300i</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CCD Camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PI Acton</td>
<td>PIXIS: 100B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Avalanche Photo Diode</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Perkin Elmer</td>
<td>SPCM-AGR-14-12691</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>XYZ Piezo Stage</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Physik Instruments</td>
<td>P 733-2CL P 721.CDQ</td>
<td>This is a combination of an XY stage and a Z objective holder</td>
</tr>
<tr>
<td>Dichroic Mirrors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Semrock</td>
<td>Ff01-720/SP-25 LPD01-633RS-25</td>
<td>These specific dichroics are not critical, any set with the appropriate transmission/reflection characteristics will be sufficient.</td>
</tr>
<tr>
<td>Dichroic Mirror</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chroma</td>
<td>Z830rdc</td>
<td>To combine the different near-infrared laser beams</td>
</tr>
<tr>
<td>TCSPC board</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PicoQuant</td>
<td>Timeharp 200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Symphotime Imaging Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PicoQuant</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Matlab</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mathworks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

differential imaging of biological structures with doubly-resonant coherent anti-stokes raman scattering (cars)

קוהירנט שיטות הדמיה ראמאן ראינו עלייה דרמטית בפעילות בעשור האחרון, בשל הבטחתם לאפשר ללא תווית הדמיה אופטית עם סגוליות גבוהה מולקולרית 1. הרגישות של טכניקות אלה, לעומת זאת, הזמנות רבות של עוצמת הקרינה חלשה יותר, המחייב מילי טוחנת מולקולרית 1,2 ריכוזי. כאן אנו מתארים טכניקה שיכולה לאפשר גילוי ריכוזים חלש או נמוך של ראמאן פעיל מולקולות על ידי הגברה האות שלהם עם זה המתקבל scatterers ראמאן חזק או עשיר. האינטראקציה של לייזרים של פולסים קצרים מדגם הביולוגי מייצר מגוון רחב של קוהרנטית אותות פיזור ראמאן, שכל אחד מהם לשאת מידע כימי ייחודי על המדגם. בדרך כלל, רק אחד האותות הללו, למשל פיזור קוהרנטית אנטי סטוקס ראמאן (CARS), משמש ליצירת תמונה בעוד אחרים מבוטלים. עם זאת, כאשר האותות הללו אחרים, כולל 3-צבע מכוניות ארבעה גל ערבוב (FWM), נאספים לעומת האות המכוניות, אחרת קשה לזהות מידע ניתן לחלץ 3. לדוגמה, מכוניות כפליים-התהודה (DR-CARS) הוא תוצאה של התערבות בונה בין שני אותות התהודה 4. אנו מדגימים כיצד כוונון של שלוש לייזרים הנדרש כדי לייצר מכוניות DR-אותות 2845 הרטט -1 ס&quot;מ למתוח CH שומנים לבין 2,120 -1 ס&quot;מ תקליטור רטט מתיחה של מולקולה deuterated (סוכרים deuterated למשל, חומצות שומן, וכו &#39;) יכול להיות מנוצל כדי בדיקה גם תהודות ראמאן בו זמנית. בתנאים אלה, בנוסף אותות מכוניות תהודה כל אות משולב DR-CARS חיטוט הן מופק גם. אנו מדגימים כיצד לזהות את ההבדל בין אות DR-המכוניות ואת האות הגברה של רעידות מולקולה של שפע יכול לשמש כדי לשפר את הרגישות לאות החלש. בנוסף, אנו מראים כי גישה זו אף מרחיב את יישומים בהם הן אותות נוצרות ממולקולות שונות, כך למשל באמצעות האות ראמאן חזקה של ממס יכול לשפר את האות ראמאן חלש של המומס לדלל.

Watch this Scientific Journal Video about Differential Imaging of Biological Structures with Doubly-resonant Coherent Anti-stokes Raman Scattering CARS at JoVE.com

Differential Imaging of Biological Structures with Doubly-resonant Coherent Anti-stokes Raman Scattering CARS

שילוב של שלוש קצר פעמו לייזר באורך גל יחיד משמש ליצור פיזור קוהרנטית אנטי סטוקס ראמאן (CARS) ומכוניות כפליים-התהודה (DR-CARS). ההבדל בין אותות אלה מספק רגישות משופרת אחרת קשה לזהות אותות ראמאן קוהרנטית, המאפשר הדמיה של scatterers ראמאן חלש.

דיפרנציאל הדמיה של מבנים ביולוגיים עם פיזור כפליים-התהודה אנטי סטוקס קוהירנט ראמאן (CARS)

Coherent Raman imaging techniques have seen a dramatic increase in activity over the past decade due to their promise to enable label-free optical imaging ...

differential-imaging-biological-structures-with-doubly-resonant

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Differential Imaging of Biological Structures with Doubly-resonant Coherent Anti-stokes Raman Scattering (CARS)

13.6K Views.  University of California, Davis. שילוב של שלוש קצר פעמו לייזר באורך גל יחיד משמש ליצור פיזור קוהרנטית אנטי סטוקס ראמאן (CARS) ומכוניות כפליים-התהודה (DR-CARS). ההבדל בין אותות אלה מספק רגישות משופרת אחרת קשה לזהות אותות ראמאן קוהרנטית, המאפשר הדמיה של scatterers ראמאן חלש.

Video: Differential Imaging of Biological Structures with Doubly-resonant Coherent Anti-stokes Raman Scattering CARS

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by Zernike, in 1942, who received the Nobel prize for his achievement. DIC microscopy, introduced in the late 1960s, has been popular in biomedical research because it highlights edges of specimen structural detail, provides high-resolution optical sections of thick specimens including tissue cells, eggs, and embryos and does not suffer from the  phase halos  typical of phase-contrast images. This protocol highlights the principles and practical applications of these microscopy techniques.

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

This protocol highlights the principles and practical applications of Phase and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

שלב ניגודיות הפרעות דיפרנציאלי ניגודיות (DIC) מיקרוסקופית

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

Synthesis and Calibration of Phosphorescent Nanoprobes for Oxygen Imaging in Biological Systems

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood or interstitial fluid); 2) the object is illuminated with light of appropriate wavelength in order to excite the probe into its triplet state; 3) the emitted phosphorescence is collected, and its time course is analyzed to yield the phosphorescence lifetime, which is converted into the oxygen concentration (or partial pressure, pO2). The probe must not interact with the biological environment and in some cases to be 4) excreted from the medium upon the measurement completion. Each of these steps imposes requirements on the molecular design of the phosphorescent probes, which constitute the only invasive component of the measurement protocol. Here we review the design of dendritic phosphorescent nanosensors for oxygen measurements in biological systems. The probes consist of Pt or Pd porphyrin-based polyarylglycine (AG) dendrimers, modified peripherally with polyethylene glycol (PEG's) residues. For effective two-photon excitation, termini of the dendrimers may be modified with two-photon antenna chromophores, which capture the excitation energy and channel it to the triplet cores of the probes via intramolecular FRET (F&ouml;rster Resonance Energy Transfer). We describe the key photophysical properties of the probes and present detailed calibration protocols.

We present principles of oxygen measurements by phosphorescence quenching and review design of porphyrin-based dendritic nanosensors for oxygen imaging in biological systems.

סינתזה כיול nanoprobes זרחני עבור הדמיה חמצן במערכות ביולוגיות

Oxygen measurement by phosphorescence quenching [1, 2] consists of the following steps: 1) the probe is delivered into the medium of interest (e.g. blood ...

Analyzing and Building Nucleic Acid Structures with 3DNA

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic acid structures. This article presents detailed protocols for a subset of new and popular features available in 3DNA, applicable to both individual structures and ensembles of related structures. Protocol 1 lists the set of instructions needed to download and install the software. This is followed, in Protocol 2, by the analysis of a nucleic acid structure, including the assignment of base pairs and the determination of rigid-body parameters that describe the structure and, in Protocol 3, by a description of the reconstruction of an atomic model of a structure from its rigid-body parameters. The most recent version of 3DNA, version 2.1, has new features for the analysis and manipulation of ensembles of structures, such as those deduced from nuclear magnetic resonance (NMR) measurements and molecular dynamic (MD) simulations; these features are presented in Protocols 4 and 5. In addition to the 3DNA stand-alone software package, the w3DNA web server, located at <a href="http://w3dna.rutgers.edu" target="_blank">http://w3dna.rutgers.edu</a>, provides a user-friendly interface to selected features of the software. Protocol 6 demonstrates a novel feature of the site for building models of long DNA molecules decorated with bound proteins at user-specified locations.

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic acid structures. This article presents detailed protocols for a subset of new and popular features available in 3DNA, applicable to both individual structures and ensembles of related structures.

ניתוח ובניית מבני חומצות גרעין עם 3DNA

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic ...

Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo. The small size and relative transparency of zebrafish embryos make them particularly useful for the visual examination of processes such as heart and vascular development. In several recent studies transgenic zebrafish that express EGFP in vascular endothelial cells were used to image and analyze complex vascular networks in the brain and retina, using confocal microscopy. Descriptions are provided to prepare, treat and image zebrafish embryos that express enhanced green fluorescent protein (EGFP), and then generate comprehensive 3D renderings of the cerebrovascular system. Protocols include the treatment of embryos, confocal imaging, and fixation protocols that preserve EGFP fluorescence. Further, useful tips on obtaining high-quality images of cerebrovascular structures, such as removal the eye without damaging nearby neural tissue are provided. Potential pitfalls with confocal imaging are discussed, along with the steps necessary to generate 3D reconstructions from confocal image stacks using freely available open source software.

Imaging of cerebrovascular development in larval zebrafish is described. Techniques to facilitate 3D imaging and modify cerebrovascular development using chemical treatments are also provided.

הדמיה ו3D שחזור של מבני כלי דם במוח בעוברי דג הזברה

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo.  The small size and relative transparency of zebrafish embryos make ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled single molecules within a sample with a spatial resolution of tens of nanometers. Using either photoactivatable (PAFP) or&#160;photoswitchable (PSFP) fluorescent proteins fused to proteins of interest, or organic dyes conjugated to antibodies or other molecules of interest, fluorescence photoactivation localization microscopy (FPALM) can simultaneously image multiple species of molecules within single cells. By using the following approach, populations of large numbers (thousands to hundreds of thousands) of individual molecules are imaged in single cells and localized with a precision of ~10-30 nm. Data obtained can be applied to understanding the nanoscale spatial distributions of multiple protein types within a cell. One primary advantage of this technique is the dramatic increase in spatial resolution: while diffraction limits resolution to ~200-250 nm in conventional light microscopy, FPALM can image length scales more than an order of magnitude smaller. As many biological hypotheses concern the spatial relationships among different biomolecules, the improved resolution of FPALM can provide insight into questions of cellular organization which have previously been inaccessible to conventional fluorescence microscopy. In addition to detailing the methods for sample preparation and data acquisition, we here describe the optical setup for FPALM. One additional consideration for researchers wishing to do super-resolution microscopy is cost: in-house setups are significantly cheaper than most commercially available imaging machines. Limitations of this technique include the need for optimizing the labeling of molecules of interest within cell samples, and the need for post-processing software to visualize results. We here describe the use of PAFP and PSFP expression to image two protein species in fixed cells. Extension of the technique to living cells is also described.

We demonstrate the use of fluorescence photo activation localization microscopy (FPALM) to simultaneously image multiple types of fluorescently labeled molecules&#160;within cells. The techniques described yield the localization of thousands to hundreds of thousands of individual fluorescent labeled proteins, with a precision of tens of nanometers&#160;within single cells.

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during the fusion of vesicle and plasma membranes. These rapid and localized changes are achieved by dynamic interactions between lipids and specialized proteins that control membrane curvature. The absence of such interactions would not only have devastating consequences for vesicle fusion, but a host of other cellular functions that involve control of membrane shape. In recent years, the identity of a number of proteins with membrane-shaping properties has been determined. What remains missing is a roadmap of when, where, and how they act as fusion and content release progress.
Our understanding of the molecular events that enable membrane remodeling has historically been limited by a lack of analytical methods that are sensitive to membrane curvature or have the temporal resolution to track rapid changes. PTIRFM satisfies both of these criteria. We discuss how pTIRFM is implemented to visualize and interpret rapid, submicron changes in the orientation of chromaffin cell membranes during dense core vesicle (DCV) fusion. The chromaffin cells we use are isolated from bovine adrenal glands. The membrane is stained with a lipophilic carbocyanine dye,1,1&#39;-dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindodicarbocyanine, 4-chlorobenzenesulfonate, or&#160;diD. DiD intercalates in the membrane plane with a &#34;fixed&#34; orientation and is therefore sensitive to the polarization of the evanescent field. The diD-stained cell membrane is sequentially excited with orthogonal polarizations of a 561&#160;nm laser (p-pol, s-pol). A 488&#160;nm laser is used to visualize vesicle constituents and time the moment of fusion. Exocytosis is triggered by locally perfusing cells with a depolarizing KCl solution. Analysis is performed offline using custom-written software to understand how diD emission intensity changes relate to fusion pore dilation.

Polarization-based Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (pTIRFM) enables real-time detection of cell membrane dynamics. This article describes the implementation of pTIRFM for the study of membrane remodeling during regulated exocytosis. The technique is generalizable to other processes in cell biology that directly or indirectly involve changes in membrane shape.

הדמיה פלזמה ממברנה עיוותים עם pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Implementation of a Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) System on a Ti:Sapphire and OPO Laser Based Standard Laser Scanning Microscope

Laser scanning microscopes combining a femtosecond Ti:sapphire laser and an optical parametric oscillator (OPO) to duplicate the laser line have become available for biologists. These systems are primarily designed for multi-channel two-photon fluorescence microscopy. However, without any modification, complementary non-linear optical microscopy such as second-harmonic generation (SHG) or third harmonic generation (THG) can also be performed with this set-up, allowing label-free imaging of structured molecules or aqueous medium-lipid interfaces. These techniques are well suited for in-vivo observation, but are limited in chemical specificity. Chemically selective imaging can be obtained from inherent vibration signals based on Raman scattering. Confocal Raman microscopy provides 3D spatial resolution, but it requires high average power and long acquisition time. To overcome these difficulties, recent advances in laser technology have permitted the development of nonlinear optical vibrational microscopy, in particular coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS). CARS microscopy has therefore emerged as a powerful tool for biological and live cell imaging, by chemically mapping lipids (via C-H stretch vibration), water (via O-H stretch vibrations), proteins or DNA. In this work, we describe the implementation of the CARS technique on a standard OPO-coupled multiphoton laser scanning microscope. It is based on the in-time synchronization of the two laser lines by adjusting the length of one of the laser beam path. We present a step-by-step implementation of this technique on an existing multiphoton system. A basic background in experimental optics is helpful and the presented system does not require expensive supplementary equipment. We also illustrate CARS imaging obtained on myelin sheaths of sciatic nerve of rodent, and we show that this imaging can be performed simultaneously with other nonlinear optical imaging, such as standard two-photon fluorescence technique and second-harmonic generation.

Implementation of a Coherent Anti-Stokes Raman Scattering CARS System on a Ti:Sapphire and OPO Laser Based Standard Laser Scanning Microscope

Coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy based on inherent vibration of molecule bonds permits label-free chemically selective live cell imaging. This work presents the implementation of a complementary microscopy technique on a standard multiphoton laser scanning microscope based on a femtosecond Ti:sapphire laser and an OPO laser.

יישום של מערכת קוהרנטית אנטי סטוקס פיזור ראמאן (CARS) על טי: ספיר OPO לייזר מבוסס תקן לייזר מיקרוסקופ סריקה

Laser scanning microscopes combining a femtosecond Ti:sapphire laser and an optical parametric oscillator (OPO) to duplicate the laser line have become ...

ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging

The identification and exploration of the detailed organization of organs or of the whole body at the cellular level are fundamental challenges in biology. Transitional methods require a substantial amount of time and effort to obtain a 3D image and including sectioning the intact tissue, immunolabeling, and imaging serially-sectioned tissue, which produces a loss of information at each step of the process. In recently developed approaches for high-resolution imaging within intact tissue, molecular characterization has been restricted to the labeling of proteins. However, currently available protocols for organ clearing require a considerably long process time, making it difficult to implement tissue clearing techniques in the lab. We recently established a rapid and highly-reproducible protocol termed ACT-PRESTO (active clarity technique&#8211;pressure related efficient and stable transfer of macromolecules into organs), which allows for tissue clearance within several hours. Moreover, ACT-PRESTO enables rapid immunolabeling with conventional methods and accelerates antibody penetration into the deep layer of densely-formed, thick specimens by applying pressure or convection flow. We describe how to prepare tissues, how to clear by lipid removal using electrophoresis, and how to immuno-stain by a pressure-assisted delivery. The rapidity and consistency of the protocol will expedite the performance of 3D histological research and volume-based diagnoses.

ACT-PRESTO (active clarity technique&#8211;pressure related efficient and stable transfer of macromolecules into organs) enables rapid, efficient, but inexpensive tissue clearing and rapid antibody penetration into cleared tissues by passive diffusion or pressure-assisted delivery. Using this method, a wide range of tissues can be cleared, immunolabeled by multiple antibodies, and volume-imaged.

ACT-Presto: סליקה רקמות ביולוגיות ושיטות immunolabeling הדמיה נפח

The identification and exploration of the detailed organization of organs or of the whole body at the cellular level are fundamental challenges in ...

Fluorescence Recovery after Photobleaching of Yellow Fluorescent Protein Tagged p62 in Aggresome-like Induced Structures

Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)&#160;is a microscopy technique that can be used to quantify protein mobility in live cells. In a typical FRAP experiment, steady-state fluorescence is observed by repeated imaging with low-intensity laser light. Subsequently, the fluorescent molecules are rapidly and irreversibly impaired via brief exposure to high-intensity laser light. Information about protein mobility is obtained by monitoring the recovery of fluorescence. We used FRAP to determine the mobility of p62 in aggresome-like induced structures (ALIS) in murine macrophages after stimulation with lipopolysaccharide (LPS). Because many existing FRAP protocols are either incomplete or complex, our goal was to provide a comprehensive, practical, and straightforward step-by-step protocol for FRAP experiments with live cells. Here, we describe RAW264.7 macrophage transfection with yellow fluorescent protein-p62 (YFP-p62), induction of ALIS by exposing the cells to LPS, and a step-by-step method for collecting prebleach and postbleach FRAP images and data analysis. Finally, we discuss important factors to consider when conducting a FRAP experiment.

We describe a comprehensive and practical protocol for fluorescence recovery after photobleaching experiments with live cells. Although the protocol was used to measure the mobility of yellow fluorescent protein-tagged p62 in aggresome-like induced structures, it can be applied to a variety of microscopy systems and fluorescent proteins.

קרינה פלואורסצנטית התאוששות לאחר Photobleaching של צהוב הניאון חלבון מתויג p62 במבנים המושרה כמו Aggresome

Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)&#160;is a microscopy technique that can be used to quantify protein mobility in live cells. In a typical ...

Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally been restricted to be used only on fixed samples or live cells outside of tissue labeled with strong fluorescent signal. Current super-resolution live cell imaging techniques require the use of special fluorescence probes, high illumination, multiple image acquisitions with post-acquisition processing, or often a combination of these processes. These prerequisites significantly limit the biological samples and contexts that this technique can be applied to.
Here we describe a method to perform super-resolution (~140 nm XY-resolution) time-lapse fluorescence live cell imaging in situ. This technique is also compatible with low fluorescent intensity, for example, EGFP or mCherry endogenously tagged at lowly expressed genes. As a proof-of-principle, we have used this method to visualize multiple subcellular structures in the Drosophila testis. During tissue preparation, both the cellular structure and tissue morphology are maintained within the dissected testis. Here, we use this technique to image microtubule dynamics, the interactions between microtubules and the nuclear membrane, as well as the attachment of microtubules to centromeres.
This technique requires special procedures in sample preparation, sample mounting and immobilizing of specimens. Additionally, the specimens must be maintained for several hours after dissection without compromising cellular function and activity. While we have optimized the conditions for live super-resolution imaging specifically in Drosophila male germline stem cells (GSCs) and progenitor germ cells in dissected testis tissue, this technique is broadly applicable to a variety of different cell types. The ability to observe cells under their physiological conditions without sacrificing either spatial or temporal resolution will serve as an invaluable tool to researchers seeking to address crucial questions in cell biology.

Presented here is a protocol for super-resolution live-cell imaging in intact tissue. We have standardized the conditions for imaging a highly sensitive adult stem cell population in its native tissue environment. This technique involves balancing temporal and spatial resolution to allow for the direct observation of biological phenomena in live tissue.

הדמיית תאים חיים ברזולוציה סופר-רזולוציה של מבנים תת-תאיים

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...