저자는 유명 마커와 셀 블록의 절단 부분을 보여주는위한 크리스 차트, HT (ASCP)를 주셔서 감사합니다.

소개 : 이것은 HistoGelTM (써모 과학) (HG)를 사용하여 액체 기반 세포학 (LBC) 표본에서 셀 블록 준비 Shidham의 방법을 설명하는 동영상입니다. 다른 임의의 접근법에 비해 다음은이 프로토콜의 두 가지 중요한 기능은 단독으로 흩어져 느슨한 세포 (1-5)과 상대적으로 hypocellular 표본에서 셀 블록을 준비하고 있습니다. <ol><li> 이 프로토콜은 셀 블록의 절단 표면에 평행하게 비행기 따라 세포를 집중하는 단계를 포함한다. </li><li> 또한 다음과 같은 목적으로 두 가지를 제공 AV - 마커 (그림 1B)의 등대 같은 어두운 포함을 포함 : <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> 세포가 집중되는의 수준을 시각화합니다. 어두운 색 신호를 절단하는 동안 노출되었을 때 관심의 세포와 세포 블록의 면적은 현재 histotechnologist에 의해 시각 수 있습니다. 모니터 이러한 능력은 세포의 대부분 수준으로 절단하거나, 샘플 세포의 높은 농도와 수준에 너무 피상적인 절단하지에서 하나를 방지합니다. </li><li> 다른 슬라이드에 직렬 셀 블록 섹션에 위치 참조 지점 역할을합니다. 이 기준점은 스키피오 접근 (6,7)와 좌표 immunoreactivity 패턴의 평가를위한 세포의 특정 세포 또는 그룹을 찾을 수 있도록 신호기 역할을합니다. </li></ol></li></ol> 프로토콜 (그림 2) 샘플 준비. <ol><li> 평평한 바닥 유리관 (15mm 직경 X 45mm) (2.4를 통해 그림 2.1)에 잔여 LBC 자궁 경부의 세포학 표본을 전송합니다. 큰 플라스틱 캐리어 튜브 (28 X 85mm)과 원심 분리기에 유리 튜브를 놓습니다. 캐리어 튜브에서 유리 바닥 튜브를 제거하고 표면에 뜨는를 부어. </li><li> 유리관은 다음 뒤덮힌 (다음 단계에서 가열 물을 spillage을 방지하기 위해)와 큰 평면 바닥 캐리어 플라스틱 튜브 안으로 배치됩니다 </li><li> 유리 튜브를 포함하는 캐리어 플라스틱 튜브 그러면, 덮인 원심 분리기에 배치 (세포가 유리관의 평평한 바닥에 수직으로 떨어질 수 있도록 선회 컵 아닌 고정 각도 컵을 함께), 그리고 1805에서 G (3000 RPM으로 늘인입니다 로터 반경 - 17cm) 오분 (그림 2.5)에 대한. </li><li> 튜브는 다음 원심에서 수직으로 제거하고 작은 유리관은 세포와 sedimented 펠렛을 방해하지 않고 더 큰 캐리어 플라스틱 튜브에서 집게로 제거됩니다. </li><li> 표본있는 유리관이 uncapped되고 뜨는은 하단에있는 침전물 세포의 평면 계층 (그림 2.6) 방해하지 않도록 돌봐 해제 붓고있다. </li></ol> 참조 좌표 AV - 마커의 포함과 더불어 젤 <ol><li> 어두운 신호를 AV - 마커 (약 2mm X 2mm 크기, 평면은 어두운 색, sectionable 소재 조각, 표면) (그림 3)은 유리관에 푯말 (그림 2.7)로 추가됩니다. </li><li> 중간 전력 10 초 동안 전자 레인지에 용해하여 HG의 나누어지는을 녹일. </li><li> 빨리 퇴적물과 튜브, 믹스로 용융 HG 0.5 ML를 추가하고 (HG는 응고 시작 수 있도록하지 않고 신속하게 다음 단계로 진행) (그림 2.8)을 해드리겠습니다. </li><li> 의 약 2.5 ML를 추가 따뜻한 (45 ° C) 캐리어 플라스틱 튜브에 물 (그림 2.9). </li><li> 작은 덮인 유리 튜브는 따뜻한 물로 플라스틱 튜브 안에 저장됩니다. (이 단계는 다음 단계 동안 응고의 HG를 유지하는 데 필요한 것입니다) (그림 2.9). </li><li> 캐리어 플라스틱 튜브 (세포가 유리관의 평평한 바닥에 수직으로 떨어질 수 있도록 선회 컵 아닌 고정 각도 컵 포함) 원심 분리기에 배치하고, 다섯을위한 1805에서 G를 (3000 RPM으로, 로터 반경 - 17cm) 늘인입니다 분. 이 원심 분리 단계의 목적은 AV - 마커를 밀고하고 가까이 최종 파라핀 임베디드 셀 블록 (그림 1D)의 절단 표면에 레이어로 세포를 집중하는 것입니다. </li><li> 튜브 그런 다음 하단에있는 샘플 세포와 sedimented 얇은 레이어를 방해하지 않도록 돌봐 원심에서 부드럽게 수직으로 제거됩니다. </li><li> 큰 플라스틱 튜브 uncapped되고 작은 유리관은 표본 세포의 퇴적물 층을 교란하지 않고 포셉에 의해 수직으로 제거됩니다. </li><li> 작은 유리관은 근사하고 HG (그림 2.11)을 응고 15 분 동안 수직 위치에 냉장 있습니다. </li></ol> 최종 처리를위한 시료로 젤의 버튼으로 셀 블록 제거 <ol><li> 바닥에 침전물 / 집중 시편의 레이어로 확정 H​​G 디스크는 주사기 (그림 2.12)와 23 게이지 바늘을 통해 포르말린 10 % squirting하여 평면 바닥 유리관에서 dislodged 수 있습니다. </li><li> 바늘은 표본 (그림 2.12)와 확정 H​​G 디스크의 주변에있는 튜브의 측면을 따라 삽입됩니다. </li><li> needl포르말린은 천천히 주사기를 통해 밀려있는 동안 전자는 튜브의 측면을 따라 회전합니다. 어두운 색 신호를 AV - 마커와 유리관의 평평한 바닥 (그림 2.12)에서에 집중 표본과 함께 HG 버튼의 분리에서 발생합니다. </li><li> 셀 블록 (표본 세포로 겔 버튼) 다음 표시 카세트에 위치하고 파라핀 임베디드 셀 블록 (그림 2.13)를 준비하는 조직 처리를위한 제출합니다. </li></ol> 포함하고 시편의 절단 <ol><li> 디스크 표면 가공으로 다운 어두운 비콘 마커 사이드 (그림 1)과 파라핀에 모두 담겨있다. </li><li> 신호를 노출하고 명확하게 볼 수 있습니다와 같은 블록은 어두운 색깔 마커까지 AV - sectioned입니다. </li><li> 서너 마이크론 섹션은 표본에서 단독으로 흩어져있는 세포의 대부분을 포함한다이 수준에서 절단됩니다. </li><li> 섹션이 추가로 얼룩, immunohistochemical 얼룩, 또는 표시 다른 시험은 유리 슬라이드에 저장됩니다. 섹션을 장착에 사용할 슬라이드의 유형을 포함하여이 테스트를위한 프로토콜이 다를 수 있습니다. 일반적으로 immunostaining위한 코팅 슬라이드는 immunostaining 단계 중에 부유하고 슬라이드에서 섹션의 손실을 방지하는 데 사용됩니다. </li></ol> (알파벳 순서) 사용 약어 : CISH, 원위치 하이브리드화 시험 chromogenic, 생선, 형광등 원위치 하이브리드화 시험, FFPE, 포르말린 - 고정 파라핀 - 임베디드, FNA, 괜찮 바늘 흡인, HG, HistoGel ™ (써모 과학); LBC, 액체 기반 세포학, PCR 효소의 연쇄 반응; <img src="/files/ftp_upload/1316/1382fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 셀 블록의 구조는 Shidham의 프로토콜에 의해 준비. <img src="/files/ftp_upload/1316/1382fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. Shidham의 프로토콜에 의해 LBC 표본에서 셀 블록을 준비 서로 다른 단계의 요약. <img src="/files/ftp_upload/1316/1382fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. 바나나 껍질에서 AV - 마커의 작성. <img src="/files/ftp_upload/1316/1382fig4.jpg" alt="그림 4" /> 그림 4.와 AV - 마커없이 셀 블록 및 섹션의 비교. <img src="/files/ftp_upload/1316/1382fig5.jpg" alt="그림 5" /> 그림 5. AV - 마커과 않고 셀 블록 섹션의 cellularity 비교.

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	<li>Shidham, V. B., Epple, J., Shidham, V. B., Atkinson, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+14,+Appendix+I:+Collection+and+processing+of+effusion+fluids+for+cytopathologic+evaluation.">Chapter 14, Appendix I: Collection and processing of effusion fluids for cytopathologic evaluation.</a> Cytopathologic Diagnosis of Serous Fluids. , .</li><li>Varsegi, G., D'Amore, K., Shidham, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p16INK4a+Immunocytochemistry+as+an+Adjunct+to+Cervical+Cytology+-+Potential+Reflex+Testing+on+Specially+Prepared+Cellblocks+from+Residual+Liquid+Based+Cytology+(LBC)+Specimens.">p16INK4a Immunocytochemistry as an Adjunct to Cervical Cytology - Potential Reflex Testing on Specially Prepared Cellblocks from Residual Liquid Based Cytology (LBC) Specimens.</a> Modern Pathology 22: 98th Annual Meeting of United States and Canadian Academy of Pathology. , 97a-97a (2009).</li><li>Nigro, K., Tynski, Z., Wasman, J., Abdul-Karim, F., Wang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+cell+block+preparation+methods+for+nongynecologic+ThinPrep+specimens.">Comparison of cell block preparation methods for nongynecologic ThinPrep specimens.</a> Diagn Cytopathol. 35, 640-643 (2007).</li><li>Saleh, H. A., Hammoud, J., Zakaria, R., Khan, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Thin-Prep+and+cell+block+preparation+for+the+evaluation+of+Thyroid+epithelial+lesions+on+fine+needle+aspiration+biopsy.">Comparison of Thin-Prep and cell block preparation for the evaluation of Thyroid epithelial lesions on fine needle aspiration biopsy.</a> CytoJournal. 5, 3-3 (2008).</li><li>Kyroudi, A., Paefthimiou, M., Symiakaki, H., Mentzelopoulou, P., Voulgaris, Z., Karakitsos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+diagnostic+accuracy+with+a+cell+block+preparation+from+thin-layer+endometrial+cytology:+a+feasibility+study.">Increasing diagnostic accuracy with a cell block preparation from thin-layer endometrial cytology: a feasibility study.</a> Acta Cytol. 50, 63-69 (2006).</li><li>Atkinson, B. F., Shidham, V. B., Atkinson, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+5:+Immunocytochemistry+of+effusion+fluids:+introduction+to+SCIP+approach+(Chapter+5.">Chapter 5: Immunocytochemistry of effusion fluids: introduction to SCIP approach (Chapter 5.</a> Cytopathologic Diagnosis of Serous Fluids. , (2007).</li><li>Shidham, V. B., Shidham, V. B., Atkinson, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+15,+Appendix+II:+Immunocytochemistry+of+effusions+processing+and+commonly+used+immunomarkers.">Chapter 15, Appendix II: Immunocytochemistry of effusions processing and commonly used immunomarkers.</a> Cytopathologic Diagnosis of Serous Fluids. , (2007).</li></ol>

셀 블록은 다양한 세포학의 표본 (1) 평가를위한 유용한 도구입니다. 가장 중요한 표본의 구조물 세부 정보 이외에, 셀 블록은 immunocytochemistry과 같은 부수적인 연구, chromogenic / 형광등 원위치 하이브리드화 시험 (물고기 / CISH) 및 - 현장 PCR의 평가를 위해 수 있습니다. 셀 블록의 준비를위한 다양한 방법이 설명되어 있습니다. 그러나 이러한 대부분은 상대적으로 많은 세포를 포함하고 조직 FNA aspirates에서 같은 microfragments와 같은 effusions (1,3,4,5) 같은 묽은 유체와 비 gynecologic 세포학의 표본에 적합합니다. 셀 블록 주로 immunocytochemical 평가를위한 기회를 제공하기 때문에, 그들의 처리되도록이면 포르말린 고정 파라핀 - - 임베디드 (FFPE) 조직의와 유사해야합니다. 결국 셀 블록 섹션의 immunocytochemical 평가 후 얻은 결과는 FFPE 조직 섹션에서 주로 수행 출판 문학 가진 사람에 비해입니다. 프로토콜의 모든 변경은 잠재적으로 손상시키고 다른 fixatives 및 일상 FFPE에 사용되는 이외의 시약 시퀀스를 통해 처리 세포 블록에서 얻어진 결과의 유효성을 파기할. 일부 상업적인 기술은 다른 정착액 - 시약에 노출 노출의 프로토콜을 통해 처리 단점을 가지고 있습니다. 셀 블록 준비 다양한 방법 침전물 및 조직 조각의 상당 수량 표본 사용할 수 있습니다. 주로, 집중 퇴적물은 어떤 젤 또는 응고 원리에 의해 지원됩니다. 기동성 버튼은 다음 수술 병리 표본 / biopsies 같은 처리 후 파라핀에 모두 담겨있다. 사용하는 젤은 젤라틴, 한천, 피브리노겐 / 플라즈마 - 트롬빈과 같은 HG 같은 다른 상업 젤이 포함되어 있습니다. 집중의 방법은 원심 분리하여 침전물의 단순한 pelleting에서 세포막을 따라 다양한 종류의 세포의 농도에 따라 다릅니다. 예는 다음과 같습니다 Milipore, collodin (Celloidin) 가방이나 유리 슬라이드 (1)에 세포학 얼룩으로부터 세포를 근근이 살아가고 있습니다. 또한 한천과 젤라틴의 다른 조합을 시도하여 젤 다양한 평가했다. 조합 중 누구 한 조각의 시편에서 포함된 세포로 확정 젤의 쉽게 기동성 디스크를 얻기 위해 회사 충분한 일관성을 달성하지 않습니다. HG 적절한 일관성을 보여주 우리의 경험 HG 셀 블록 섹션에 immunostaining 결과는 우수했다. 상기와 같은 cervicovaginal 세포학에 대한 액체 기반 세포학 (LBC) 표본이 아닌 gynecologic 표본보다 일반적으로 더 적은 세포 수 있습니다. 또한, gynecologic LBC의 표본이 주로 cervicovaginal 점막에서 각각 흩어져있는 피부 박피 피상적인 세포가 포함되어 있습니다. 이것 때문에, 셀 블록 섹션 내에서 해당 cellularity는 특별한 방법없이는 달성되지 않을 수 있습니다. 이들은 단독으로 블록의 세포 구성 요소를 분산과 같은 섹션 절단 동안 histotechnologist에서 볼 수없는, 세포 부분에 나타나는 시작되는 수준은 중 대부분의 세포와 수준 과거 절단이나하지, 평가 수 없으며, 놓칠 수 있습니다 샘플 세포의 높은 농도 (그림 4)와 수준에 깊은만큼 절단. Shidham의 프로토콜은 매체 및 일반 실험실 장비 (2) (그림 2)를 포함으로 HG를 사용하여 이러한 문제를 모두 해결할 수 있습니다. 이 프로토콜은 두 가지 주요 기능 (그림 1) 다음 포함 : <ol><li> 농도와 인접하고 셀 블록 (그림 5)의 절단 표면에 평행하게 좁은 비행기에서 단독으로 흩어져있는 세포의 정렬. </li><li> 푯말로 등대처럼 어둠 AV - 마커의 포함. 이것은 다음과 같은 기능 달성을위한 중요 : <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> 식별 및 세포가 세포 블록에 집중되어있는의 수준을 모니터링. 어두운 색깔 정작의 노출은 셀 블록에 단독으로 흩어져있는 세포의 대부분은 (그림 4)에 위치한 것으로 예상되는의 수준을 강조 표시합니다.이 방지 overcutting (대부분의 세포와 레벨 지난 커팅) 또는 (샘플 세포의 높은 농도와 수준에 깊은만큼 절단되지 않음) undercutting 셀 블록에서 높은 농도로 해당 셀 블록 수준에서 섹션의 선택을 허용 세포. </li><li> 섹션에있는 어두운 색 푯말도 다른 슬라이드에있는 셀 블록 (그림 4)의 다양한 시리얼 섹션에 똑같은 세포를 조사하고 식별하는 참조 지점 역할을합니다. 통역과 스키피오 방식으로 특정 세포의 이러한 immunoprofile 다른 섹션 (6,7)에서 동일한 세포를 따라 좌표 속성을 평가하면서이 중요합니다. </li></ol></li></ol> 하지만 OUR 프로토콜 표준화 및 액체 기반의 자궁 경부 세포학의 표본에 대한보고, 그것도 또한 같은 유출 유체, FNA, brushings, 낭종 컨텐츠 등 다른 많은 비 gynecologic 표본의 진단 수율을 향상시키는 데 사용할 수있는 AV 마커 향상 촉진 것입니다 이러한 표본의 셀 블록 섹션의 immunohistochemical 평가하는 동안 스키피오 방식의 응용 프로그램을 만듭니다. 퍼가기 매체는 관련 절차에 적절한 수정을 다른 시약에 의해 바뀔 수 있습니다. HG는 실온 (1)에서 트롬빈에 의해 gelled 수 플라즈마 (피브리노겐)에 의해 대체될 수 있습니다.

cell block preparation from cytology specimen with predominance of individually scattered cells

이 동영상은 개별적으로 흩어져 세포와 작은 세포 그룹을 포함하는 액체 기반 cervicovaginal 세포학의 표본에서 셀 블록의 준비 Shidham의 방법을 보여줍니다. 이 기술은 기존의 실험실 장비 HistoGel (써모 과학)를 사용합니다. 셀 블록 섹션의 사용이 아닌 gynecologic 세포학 평가를위한 가치있는 부수적인 도구입니다. 그들은 병변의 아키텍처를 포함한 추가 morphologic 표본 세부 공부를 cytopathologist을 가능하게합니다. 가장 중요한 것은, 그들은 원위치 하이브리드화 시험 (물고기 / CISH) 및 원위치 중합 효소의 연쇄 반응 (PCR)은 같은 immunocytochemistry 같은 부수적인 연구의 평가를 위해 수 있습니다. 전통적인 셀 블록 준비 기술은 대부분 일반적으로 신체 유체 effusions 및 미세 바늘 흡인의 biopsies위한 비 gynecologic 세포학의 표본에 적용되었습니다. 액체 기반 cervicovaginal 표본은 많은 개인 흩어져 세포와의 비 gynecologic 대응보다 상대적으로 적은 세포 수 있습니다. 이 때문에, 셀 블록 섹션 내에 적절한 cellularity는 달성하기 어렵습니다. 또한, 블록을 sectioning histotechnologist은 세포가 가장 높은 농도에있는의 수준을 시각화 수 없습니다. 따라서 섹션이 테스트를 위해 유리 슬라이드로 전송하기 위해 선택할 수있는의 적절한 수준을 모니터링하기가 어렵습니다. 그 결과, 관심의 세포와 세포 블록의 지역 중 과거의 절단이나 깊이만큼 절단하지 않음으로써, 놓칠 수 있습니다. Shidham의 방법 현재 프로토콜은 이러한 문제를 해결합니다. 이 프로토콜은 표준화와 gynecologic 액체 기반 세포학의 표본에 대해보고 있지만, 그것은 이러한 세포 블록 섹션에 진단 자료의 품질 향상을위한 유출의 체액, FNA, brushings, 낭종 내용 등 비 gynecologic 표본에도 적용할 수 있습니다.

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Cell Block Preparation from Cytology Specimen with Predominance of Individually Scattered Cells

개별적으로 흩어져 세포와 작은 세포 그룹을 포함하는 세포학의 표본에서 AV - 마커와 셀 블록의 준비 Shidham의 방법.

개별적으로 흩어져 셀의 우위와 세포학 표본에서 셀 블록 준비

This video demonstrates Shidham's method for preparation of cell blocks from liquid based cervicovaginal cytology specimens containing individually ...

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Nanyang Technological University

Research

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Biology

73.2K 조회수.  University of Wisconsin - Milwaukee. 개별적으로 흩어져 세포와 작은 세포 그룹을 포함하는 세포학의 표본에서 AV - 마커와 셀 블록의 준비 Shidham의 방법.

비디오: Cell Block Preparation from Cytology Specimen with Predominance of Individually Scattered Cells

Human ES cells: Starting Culture from Frozen Cells

Here we demonstrate how our lab begins a HuES human embryonic stem cell line culture from a frozen stock.  First, a one to two day old ten cm plate of  approximately one (to two) million irradiated mouse embryonic fibroblast feeder cells is rinsed with HuES media to remove residual serum and cell debris, and then HuES media added and left to equilibrate in the cell culture incubator.  A frozen vial of cells from long term liquid nitrogen storage or a -80C freezer is sourced and quickly submerged in a 37C water bath for quick thawing.  Cells in freezing media are then removed from the vial and placed in a large volume of HuES media.  The large volume of HuES media facilitates removal of excess serum and DMSO, which can cause HuES human embryonic stem cells to differentiate.  Cells are gently spun out of suspension, and then re-suspended in a small volume of fresh HuES media that is then used to seed the MEF plate.  It is considered important to seed the MEF plate by gently adding the HuES cells in a drop wise fashion to evenly disperse them throughout the plate.  The newly established HuES culture plate is returned to the incubator for 48 hrs before media is replaced, then is fed every 24 hours thereafter.

Here we demonstrate how our lab begins a HuES human embryonic stem cell line culture from a frozen stock.

냉동 세포에서 시작 문화 : 인간 ES 세포

Here we demonstrate how our lab begins a HuES human embryonic stem cell line culture from a frozen stock.  First, a one to two day old ten cm plate of  ...

연구

생물학

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

Murine 배아 줄기 세포로부터 조혈 줄기 세포의 유도

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

Midgastrula 스테이지 Drosophila의 태아에서 문화의 연결 준비

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator

Single-cell suspensions are a prerequisite for experiments in cell separation, cell analysis and cell culture.  To avoid tedious and often painful manual dissociations the gentleMACS Dissociator allows one to dissociate tissue very efficiently under controlled and reproducible conditions.  The gentleMACS Dissociator can optimally dissociate mouse spleen, combining timesaving and standardization with user-safety.

This video describes how to dissociate mouse spleens using the gentleMACS Dissociator, an automated bench-top device that can mechanically disrupt tissues using special tubes to produce viable cell suspensions. Following dissociation, spleens are filtered, centrifuged, and resuspended for further applications.

This video describes a simple, time-saving technique for automated tissue dissociation using the gentleMACS Dissociator to prepare single-cell suspensions of mouse splenocytes.

gentleMACS Dissociator과 마우스 비장에서 단일 셀 Suspensions의 준비

Single-cell suspensions are a prerequisite for experiments in cell separation, cell analysis and cell culture.  To avoid tedious and often painful manual ...

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature and genome sequence database. Cultured Drosophila S2 cells, the product of disassociated 20-24 hour old embryos1, possess all these properties. Consequently, S2 cells are extremely well-suited for the analysis of cellular processes, including the discovery of the genes encoding the molecular components of the process or mechanism of interest. The features of S2 cells that are most responsible for their utility are the ease with which they are maintained, their exquisite sensitivity to double-stranded (ds)RNA-mediated interference (RNAi), and their tractability to fluorescence microscopy as either live or fixed cells.
S2 cells can be grown in a variety of media, including a number of inexpensive, commercially-available, fully-defined, serum-free media2. In addition, they grow optimally and quickly at 21-24&deg;C and can be cultured in a variety of containers. Unlike mammalian cells, S2 cells do not require a regulated atmosphere, but instead do well with normal air and can even be maintained in sealed flasks.
Complementing the ease of RNAi in S2 cells is the ability to readily analyze experimentally-induced phenotypes by phase or fluorescence microscopy of fixed or live cells. S2 cells grow in culture as a single monolayer but do not display contact inhibition. Instead, cells tend to grow in colonies in dense cultures. At low density, S2 cultures grown on glass or tissue culture-treated plastic are round and loosely-attached. However, the cytology of S2 cells can be greatly improved by inducing them to flatten extensively by briefly culturing them on a surface coated with the lectin, concanavalin A (ConA)3. S2 cells can also be stably transfected with fluorescently-tagged markers to label structures or organelles of interest in live or fixed cells. Therefore, the usual scenario for the microscopic analysis of cells is this: first, S2 cells (which can possess transgenes to express tagged markers) are treated by RNAi to eliminate a target protein(s). RNAi treatment time can be adjusted to allow for differences in protein turn-over kinetics and to minimize cell trauma/death if the target protein is important for viability. Next, the treated cells are transferred to a dish containing a coverslip pre-coated with conA to induce cells to spread and tightly adhere to the glass. Finally, cells are imaged with the researcher's choice of microscopy modes. S2 cells are particularly good for studies requiring extended visualization of live cells since these cells stay healthy at room temperature and normal atmosphere.

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

Drosophila Schneider (S2) cells are an increasingly popular system for the discovery and functional analysis of genes. Our goal is to describe some of the microscopic techniques that make S2 cells such an increasingly important experimental system.

의 준비 Drosophila</em라이트 현미경을 위해> S2 세포

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature ...

Preparation of Quality Inositol Pyrophosphates

Myo-inositol is present in nature either unmodified or in more complex phosphorylated derivates. Of the latest, the two most abundant in eukaryotic cells are inositol pentakisphosphate (IP5) and inositol hexakisphosphate (phytic acid or IP6). IP5 and IP6 are the precursors of inositol pyrophosphate molecules that contain one or more pyrophosphate bonds1. Phosphorylation of IP6 generates diphoshoinositolpentakisphosphate (IP7 or PP-IP5) and bisdiphoshoinositoltetrakisphosphate (IP8 or (PP)2-IP4). Inositol pyrophosphates have been isolated from all eukaryotic organisms so far studied. In addition, the two distinct classes of enzymes responsible for inositol pyrophosphate synthesis are highly conserved throughout evolution2-4.
The IP6 kinases (IP6Ks) posses an enormous catalytic flexibility, converting IP5 and IP6 to PP-IP4 and IP7 respectively and subsequently, by using these products as substrates, promote the generation of more complex molecules5,6. Recently, a second class of pyrophosphate generating enzymes was identified in the form of the yeast protein VIP1 (also referred as PP-IP5K), which is able to convert IP6 to IP7 and IP87,8.
Inositol pyrophosphates regulate many disparate cellular processes such as insulin secretion9, telomere length10,11, chemotaxis12, vesicular trafficking13, phosphate homeostasis14 and HIV-1 gag release15. Two mechanisms of actions have been proposed for this class of molecules. They can affect cellular function by allosterically interacting with specific proteins like AKT16. Alternatively, the pyrophosphate group can donate a phosphate to pre-phosphorylated proteins17. The enormous potential of this research field is hampered by the absence of a commercial source of inositol pyrophosphates, which is preventing many scientists from studying these molecules and this new post-translational modification. The methods currently available to isolate inositol pyrophosphates require sophisticated chromatographic apparatus18,19. These procedures use acidic conditions that might lead to inositol pyrophosphate degradation20 and thus to poor recovery. Furthermore, the cumbersome post-column desalting procedures restrict their use to specialized laboratories.
In this study we describe an undemanding method for the generation, isolation and purification of the products of the IP6-kinase and PP-IP5-kinases reactions. This method was possible by the ability of polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) to resolve highly phosphorylated inositol polyphosphates20. Following IP6K1 and PP-IP5K enzymatic reactions using IP6 as the substrate, PAGE was used to separate the generated inositol pyrophosphates that were subsequently eluted in water.

Inositol pyrophosphates play an important role in human pathologies such cancer, diabetes and obesity; however, the exact mechanism of action is a matter of dispute. The lack of commercially available inositol pyrophosphates renders detailed studies problematic. Here we describe a simple protocol to produce and isolate milligrams of inositol pyrophosphates.

품질 이노시톨 Pyrophosphates의 준비

Myo-inositol is present in nature either unmodified or in more complex phosphorylated derivates. Of the latest, the two most abundant in eukaryotic cells ...

Chromosome Preparation From Cultured Cells

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as fluorescence in situ hybridization (FISH), this assay has the powerful ability to analyze individual cells for aberrations that involve gains or losses of portions of the genome&#160;and rearrangements involving one or more chromosomes. In humans, chromosome abnormalities occur in approximately 1 per 160 live births1,2, 60-80% of all miscarriages3,4, 10% of stillbirths2,5, 13% of individuals with congenital heart disease6, 3-6% of infertility cases2, and in many patients with developmental delay&#160;and birth defects7. Cytogenetic analysis of malignancy is routinely used by researchers and clinicians, as observations of clonal chromosomal abnormalities have been shown to have both diagnostic and prognostic significance8,9.&#160; Chromosome isolation is invaluable for gene therapy and stem cell research of organisms including nonhuman primates and rodents10-13.
Chromosomes can be isolated from cells of live tissues, including blood lymphocytes, skin fibroblasts, amniocytes, placenta, bone marrow, and tumor specimens. Chromosomes are analyzed at the metaphase stage of mitosis, when they are most condensed and therefore more clearly visible. The first step of the chromosome isolation technique involves the disruption of the spindle fibers by incubation with Colcemid, to prevent the cells from proceeding to the subsequent anaphase stage. The cells are then treated with a hypotonic solution and preserved in their swollen state with Carnoy&#39;s fixative. The cells are then dropped on to slides and can then be utilized for a variety of procedures. G-banding involves trypsin treatment followed by staining with Giemsa to create characteristic light and dark bands. The same procedure to isolate chromosomes can be used for the preparation of cells for procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY)14,15.

Chromosomes can be isolated from live cells such as lymphocytes or skin fibroblasts, and from organisms including humans or mice. These chromosome preparations can be further utilized for routine G-banding and molecular cytogenetic procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY).

배양 세포에서 염색체 준비

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as ...

Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem cells of skeletal muscle, the myogenic precursor cells (MPCs), have proven indispensible to our understanding of mammalian skeletal muscle development and growth. Particularly among the basal taxa of Vertebrata, however, data are limited describing the molecular mechanisms controlling the self-renewal, proliferation, and differentiation of MPCs. Of particular interest are potential mechanisms that underlie the ability of basal vertebrates to undergo considerable postlarval skeletal myofiber hyperplasia (i.e.&#160;teleost fish) and full regeneration following appendage loss (i.e.&#160;urodele amphibians). Additionally, the use of cultured myoblasts could aid in the understanding of regeneration and the recapitulation of the myogenic program and the differences between them. To this end, we describe in detail a robust and efficient protocol (and variations therein) for isolating and maintaining MPCs and their progeny, myoblasts and immature myotubes, in cell culture as a platform for understanding the evolution of the myogenic program, beginning with the more basal vertebrates. Capitalizing on the model organism status of the zebrafish (Danio rerio), we report on the application of this protocol to small fishes of the cyprinid clade Danioninae. In tandem, this protocol can be utilized to realize a broader comparative approach by isolating MPCs from the Mexican axolotl (Ambystomamexicanum) and even laboratory rodents. This protocol is now widely used in studying myogenesis in several fish species, including rainbow trout, salmon, and sea bream1-4.

In vitro culture systems have proven indispensible to our understanding of vertebrate myogenesis. However, much remains to be learned about nonmammalian skeletal muscle development and growth, particularly in basal taxa. An efficient and robust protocol for isolating the adult stem cells of this tissue, the myogenic precursor cells (MPCs), and maintaining their self-renewal, proliferation, and differentiation in a primary culture setting allows for the identification of conserved and divergent regulatory mechanisms throughout the vertebrate lineages.

기초 척추 계통의 주요 근원 성 전구 세포 / 근원 세포 배양의 준비

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

센다이 바이러스와 인간의 체세포의 효율적인 생성 인간 유도 만능 줄기 세포

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms or solutions. We make use of a custom built cryo-transfer station and a modified cryo-SEM preparation chamber2. The spores are taken from a culture, plunge-frozen in a liquid nitrogen slush and observed in the cryo-SEM to select a region of interest. A thin lamella is then extracted using the FIB, attached to a TEM grid and subsequently thinned to electron transparency. The grid is transferred to a cryo-TEM holder and into a TEM for high resolution studies. Thanks to the introduction of a cooled nanomanipulator tip and a cryo-transfer station, this protocol is a straightforward adaptation to cryogenic temperature of the routinely used FIB preparation of TEM samples. As such it has the advantages of requiring a small amount of modifications to existing instruments, setups and procedures; it is easy to implement; it has a broad range of applications, in principle the same as for cryo-TEM sample preparation. One limitation is that it requires skillful handling of the specimens at critical steps to avoid or minimize contaminations.

Cryo Electron Microscopes, either Scanning (SEM) or Transmission (TEM), are widely used for characterization of biological samples or other materials with a high water content1. A SEM/Focused Ion Beam (FIB) is used to identify features of interest in samples and extract a thin, electron-transparent lamella for transfer to a cryo-TEM.

집중 이온 빔의 극저온 전자 현미경 표본 준비하여 의미

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms ...