Die Autoren danken Chris Chartrand, HT (VKS) für den Nachweis der Abschnitt Schneiden der Zellenblock mit AV-Marker.

Einleitung: Dies ist ein Video beschreibt Shidham Methode für Zellenblock Vorbereitung von flüssigen Zytologie (LBC) Probe mit HistoGelTM (Thermo Scientific) (HG). Im Gegensatz zu anderen zufälligen Ansätze verglichen, die folgenden sind die beiden kritischen Merkmale dieses Protokoll für die Vorbereitung Zellblöcke von relativ hypozellulären Proben mit einzeln verstreuten lose Zellen (1-5). <ol><li> Dieses Protokoll umfasst die Schritte, um die Zellen entlang der Ebene parallel zur Schnittfläche der Zelle blockieren konzentrieren. </li><li> Es enthält auch ein Leuchtturm-wie dunkle Aufnahme von AV-Markierung (Abbildung 1b), die zwei der folgenden Zwecken dient: <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Zur Visualisierung der Ebene, auf der die Zellen konzentriert. Die Fläche der Zelle blockieren mit den Zellen von Interesse konnte nun durch die histotechnologist visualisiert werden, wenn die dunkle Leuchtturm während des Schneidens ausgesetzt ist. Diese Fähigkeit zur Überwachung würde man beim Schneiden durch die Ebene mit den meisten der Zellen, oder schneidet nicht zu oberflächlich in die Ebene mit der höchsten Konzentration von Probe-Zellen zu verhindern. </li><li> Um als Locator Bezugspunkt in serielle Zellenblock Abschnitt über verschiedene Folien dienen. Dieser Referenzpunkt fungiert als ein Leuchtfeuer zum Auffinden bestimmter Zellen oder Gruppen von Zellen für die Auswertung eines Koordinatensystems Immunreaktivität Muster mit dem SCIP-Ansatz (6,7). </li></ol></li></ol> PROTOKOLL (Abbildung 2) Vorbereitung der Probe. <ol><li> Übertragen Sie die verbleibende LBC Zervixzytologie Probe einen flachen Boden Glasrohr (Durchmesser 15mm x 45mm) (Abb. 2.1 bis 2.4). Legen Sie das Glasrohr in ein größeres Kunststoff Trägerrohr (28 x 85mm) und Zentrifuge. Entfernen Sie den Glasboden Rohr aus dem Trägerrohr und giesst die überstehende. </li><li> Das Glasrohr wird dann verschlossen (um das Auslaufen von Heizungswasser in den nächsten Schritt zu verhindern) und wieder in eine größere Wohnung unteren Träger Kunststoffrohr gelegt </li><li> Der Träger Kunststoffrohr mit dem Glasrohr wird dann verschlossen, platziert in einer Zentrifuge (mit schwenkbarem Tassen und nicht festen Winkel Becher so, dass die Zellen senkrecht fallen auf den flachen Boden der Glasröhre), und drehte sich auf 1805 G (3000 rpm, Rotorradius-17cm) für 5 Minuten (Abbildung 2,5). </li><li> Die Rohre werden dann senkrecht aus der Zentrifuge entfernt und die kleinere Glasröhre ist mit einer Pinzette aus der größeren Träger Kunststoffrohr, ohne die sedimentierte Pellet mit Zellen entfernt. </li><li> Das Glasrohr mit der Probe ist nicht begrenzten und der Überstand wird dabei nicht auf die flache Schicht von Sedimenten Zellen am Boden (Abb. 2.6) stören gegossen. </li></ol> Die Einbeziehung der Bezugskoordinatensystem AV-Marker und die Zugabe von Gel- <ol><li> Ein dunkler Leuchtturm AV-Markierung (ca. 2 mm x 2 mm Größe, die Oberfläche flach, Fragment des dunkel gefärbten, sectionable Material) (Abbildung 3) ist als Wegweiser zu dem Glasrohr (Abbildung 2,7) aufgenommen. </li><li> Verflüssigen ein Aliquot von HG durch Schmelzen in der Mikrowelle für 10 Sekunden bei mittlerer Leistung. </li><li> 0,5 ml des geschmolzenen HG an das Rohr, vermischen sich mit dem Sediment schnell und rekapitulieren sie (Abb. 2.8) (Fahren Sie mit dem nächsten Schritt schnell, ohne dass die HG zu beginnen Verfestigung). </li><li> Fügen Sie ca. 2,5 ml warmem (45 ° C) Wasser an den Frachtführer Kunststoffrohr (Abbildung 2,9). </li><li> Die kleineren capped Glasröhre ist innerhalb der Kunststoffrohr mit warmem Wasser gestellt. (Dieser Schritt ist notwendig, um die HG ein Erstarren in den nächsten Schritten zu halten) (Abbildung 2,9). </li><li> Der Träger Kunststoffschlauch wird in die Zentrifuge eingesetzt (mit schwenkbarem Tassen und nicht festen Winkel Becher so, dass die Zellen senkrecht fallen auf den flachen Boden der Glasröhre), und drehte sich auf 1805 G (3000 rpm, Rotor-Radius-17cm) für fünf Minuten. Der Zweck dieser Zentrifugation wird der AV-Markierung zu schieben und die Zellen in einer Schicht näher an der Schnittfläche der endgültigen Paraffin eingebetteten Zellen blockieren (Abbildung 1d) zu konzentrieren. </li><li> Die Rohre werden dann sanft und vertikal aus der Zentrifuge dabei nicht um die sedimentierten dünne Schicht mit der Probe Zellen am Boden stören entfernt. </li><li> Je größer Kunststoffrohr ist unverschlossen und die kleineren Glasröhre ist vertikal mit einer Pinzette, ohne die Sedimentschicht der Probe Zellen entfernt. </li><li> Das Glasröhrchen wird gekühlt in vertikaler Position für 15 Minuten zu kühlen und zu verfestigen sich die HG (Abbildung 2.11). </li></ol> Entfernung von der Zelle blockieren, wie eine Taste des Gels mit Proben für die Endbearbeitung <ol><li> Die verfestigte HG Festplatte, mit der Schicht aus konzentrierten / Sediment Probe an der Unterseite ist aus dem flachen Boden Glasröhre durch spritzende 10% Formalin durch eine 23-Gauge-Nadel mit der Spritze (Abb. 2,12) verdrängt. </li><li> Die Nadel wird an der Seite des Rohres an der Peripherie des erstarrten HG Scheibe mit Probe (Abbildung 2.12) eingesetzt. </li><li> Die needle ist an der Seite der Röhre gedreht, während Formalin wird langsam durch die Spritze geschoben. Daraus ergibt sich die Trennung der HG-Taste zusammen mit dunkel gefärbten Beacon AV-Marker und die konzentrierte Probe in sie aus dem flachen Boden des Glasrohres (Abbildung 2.12). </li><li> Der Zellenblock (Gel-Taste mit Probe-Zellen) wird dann in eine markierte Kassette gelegt und legte für die Gewebe-Verarbeitung in Paraffin eingebetteten Zellen blockiert (Abbildung 2.13) vorzubereiten. </li></ol> Einbetten und Schneiden der Probe <ol><li> Die Scheibe ist in Paraffin mit dem dunklen Leuchtturm Marker nach unten als Schnittfläche (Abb. 1) eingebettet. </li><li> Der Block wird bis zum dunklen AV-Markierung geschnitten wie ein Leuchtfeuer ausgesetzt ist und deutlich sichtbar sein. </li><li> Drei bis vier Mikrometer Abschnitte sind von dieser Ebene die meisten der einzeln verstreuten Zellen aus der Probe enthalten sollte geschnitten. </li><li> Die Abschnitte werden auf dem Objektträger zur weiteren Färbung, immunhistochemische Färbung oder andere Tests wie angegeben gesammelt. Die Protokolle für diese Tests einschließlich der Art der Folien für die Montage der Teile verwenden können variieren. Generell gilt für Immunfärbung werden beschichtete Folien verwendet werden, um Schwimm-und Verlust von Abschnitten aus den Folien während der Immunfärbung Schritte zu verhindern. </li></ol> Abkürzungen verwendet werden (in alphabetischer Reihenfolge): CISH, chromogene in situ Hybridisierung Tests; FISH, Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung Tests; FFPE, Formalin-fixierten Paraffin eingebetteten, FNA, Feinnadelpunktion; HG, HistoGel ™ (Thermo Scientific); LBC, flüssige Zytologie, PCR Polymerase-Kettenreaktion; <img src="/files/ftp_upload/1316/1382fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Die Struktur der Zelle blockieren, indem Shidham-Protokoll vorbereitet. <img src="/files/ftp_upload/1316/1382fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Die Zusammenfassung der verschiedenen Schritte zur Vorbereitung Zellenblock von LBC Probe durch Shidham-Protokoll. <img src="/files/ftp_upload/1316/1382fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Erstellung von AV-Marker aus Bananenschalen. <img src="/files/ftp_upload/1316/1382fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Vergleich der Zell-Blöcke und Sektionen mit und ohne AV-Marker. <img src="/files/ftp_upload/1316/1382fig5.jpg" alt="Abbildung 5" /> Abbildung 5. Vergleich der Zellstruktur von Teilen der Zelle blockieren mit und ohne AV-Marker.

<ol>
	<li>Shidham, V. B., Epple, J., Shidham, V. B., Atkinson, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+14,+Appendix+I:+Collection+and+processing+of+effusion+fluids+for+cytopathologic+evaluation.">Chapter 14, Appendix I: Collection and processing of effusion fluids for cytopathologic evaluation.</a> Cytopathologic Diagnosis of Serous Fluids. , .</li><li>Varsegi, G., D'Amore, K., Shidham, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p16INK4a+Immunocytochemistry+as+an+Adjunct+to+Cervical+Cytology+-+Potential+Reflex+Testing+on+Specially+Prepared+Cellblocks+from+Residual+Liquid+Based+Cytology+(LBC)+Specimens.">p16INK4a Immunocytochemistry as an Adjunct to Cervical Cytology - Potential Reflex Testing on Specially Prepared Cellblocks from Residual Liquid Based Cytology (LBC) Specimens.</a> Modern Pathology 22: 98th Annual Meeting of United States and Canadian Academy of Pathology. , 97a-97a (2009).</li><li>Nigro, K., Tynski, Z., Wasman, J., Abdul-Karim, F., Wang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+cell+block+preparation+methods+for+nongynecologic+ThinPrep+specimens.">Comparison of cell block preparation methods for nongynecologic ThinPrep specimens.</a> Diagn Cytopathol. 35, 640-643 (2007).</li><li>Saleh, H. A., Hammoud, J., Zakaria, R., Khan, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Thin-Prep+and+cell+block+preparation+for+the+evaluation+of+Thyroid+epithelial+lesions+on+fine+needle+aspiration+biopsy.">Comparison of Thin-Prep and cell block preparation for the evaluation of Thyroid epithelial lesions on fine needle aspiration biopsy.</a> CytoJournal. 5, 3-3 (2008).</li><li>Kyroudi, A., Paefthimiou, M., Symiakaki, H., Mentzelopoulou, P., Voulgaris, Z., Karakitsos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+diagnostic+accuracy+with+a+cell+block+preparation+from+thin-layer+endometrial+cytology:+a+feasibility+study.">Increasing diagnostic accuracy with a cell block preparation from thin-layer endometrial cytology: a feasibility study.</a> Acta Cytol. 50, 63-69 (2006).</li><li>Atkinson, B. F., Shidham, V. B., Atkinson, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+5:+Immunocytochemistry+of+effusion+fluids:+introduction+to+SCIP+approach+(Chapter+5.">Chapter 5: Immunocytochemistry of effusion fluids: introduction to SCIP approach (Chapter 5.</a> Cytopathologic Diagnosis of Serous Fluids. , (2007).</li><li>Shidham, V. B., Shidham, V. B., Atkinson, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+15,+Appendix+II:+Immunocytochemistry+of+effusions+processing+and+commonly+used+immunomarkers.">Chapter 15, Appendix II: Immunocytochemistry of effusions processing and commonly used immunomarkers.</a> Cytopathologic Diagnosis of Serous Fluids. , (2007).</li></ol>

Zell-Blöcke sind ein wertvolles Instrument zur Bewertung der verschiedenen zytologischen Proben (1). Am wichtigsten ist, zusätzlich zu den architektonischen Details der Probe erlauben Zellblöcke für die Auswertung der ergänzenden Studien wie Immunzytochemie, fluoreszierend / chromogene in situ Hybridisierung Tests (FISH / CISH) und in-situ PCR. Eine Vielzahl von Methoden für die Herstellung von Zell-Block beschrieben. Allerdings sind die meisten dieser für Nicht-gynäkologischen Zytologie Proben, die relativ viele Zellen enthalten und mit dem Gewebe Mikrofragmente wie in FNA saugt und einige seröse Flüssigkeiten wie Ergüsse (1,3,4,5). Da Zellblöcke vor allem die Möglichkeit für immunzytochemische Auswertung zu gewährleisten, sollte die Verarbeitung vorzugsweise ähnlich zu sein, dass der Formalin-fixierten Paraffin eingebetteten (FFPE) Gewebe. Letztlich sind die Ergebnisse nach immunzytochemische Auswertung der Zelle blockieren Abschnitte gewonnen werden, die mit der veröffentlichten Literatur überwiegend auf FFPE Gewebeschnitten durchgeführt verglichen. Etwaige Änderungen im Protokoll potenziell beeinträchtigen und bewirken die Gültigkeit der Ergebnisse auf Zellblöcke durch verschiedene Fixiermittel und Reagenz-Sequenzen eine andere als die Routine FFPE verwendet verarbeitet wird. Einige kommerzielle Techniken haben den Nachteil, der Verarbeitung durch ein Protokoll der Exposition gegenüber anderen Fixateur-Reagenz Exposition. Verschiedene Methoden der Zell Satzaufbereitung sind für Proben mit einer signifikanten Menge an Sediment-und Gewebeteile zur Verfügung. Grundsätzlich sind die konzentrierte Ablagerungen von einigen Gel oder Koagulation grundsätzlich unterstützt. Das wendige Taste wird dann in Paraffin nach der Verarbeitung wie der chirurgischen Pathologie Proben / Biopsien eingebettet. Die Gele verwendet werden, umfassen Gelatine, Agar, Fibrinogen / Plasma-Thrombin und andere kommerzielle Gele, wie HG. Die Methoden der Konzentration variieren von einfachen Pelletierung des Sediments durch Zentrifugation zur Konzentration der Zellen auf verschiedenen Arten von Membranen. Beispiele hierfür sind: Milipore, Collodin (Celloidin) Taschen oder Abschaben der Zellen von der zytologische Abstriche auf Glasplättchen (1). Wir haben auch eine Vielzahl von Gelen, indem Sie versuchen verschiedene Kombinationen von Agar und Gelatine ausgewertet. Keine der Kombinationen erzielten die eine feste Konsistenz genug, um eine leicht manövrierbar Scheibe aus erstarrten Gel mit eingebetteten Zellen aus der Probe in einem Stück zu erhalten. HG zeigten entsprechende Konsistenz und nach unserer Erfahrung die Immunfärbung Ergebnisse auf HG Zellenblock Abschnitte wurden ausgezeichnet. Flüssige Zytologie (LBC) Proben für zervikovaginalen Zytologie sind im Allgemeinen weniger zelluläre als nicht-gynäkologische Proben wie oben erwähnt. Neben der gynäkologischen LBC Proben enthalten überwiegend einzelne verstreute exfoliated oberflächlichen Zellen aus zervikovaginalen Schleimhaut. Aus diesem Grund können geeignete Zellstruktur innerhalb der Zelle blockieren Abschnitte nicht ohne einen besonderen Ansatz erreicht werden. Da diese einzeln zellulären Komponenten in der den Block verstreut kann nicht durch den histotechnologist während Abschnitt Schneiden gesehen werden kann, auf welchem ​​Niveau die Zellen beginnen, die in der Abschnitte nicht geschätzt und können übersehen werden, entweder durch Schneiden über das Niveau bei den meisten Zellen oder nicht Schneiden tief genug in die Höhe mit der höchsten Konzentration von Probe-Zellen (Abbildung 4). Shidham-Protokoll-Adressen diese beiden Fragen mit HG als Einbettmedium und konventioneller Laborausstattung (2) (Abbildung 2). Dieses Protokoll umfasst die folgenden zwei wichtigen Funktionen (Abbildung 1): <ol><li> Konzentration und Ausrichtung der einzeln verstreuten Zellen in einem engen Flugzeug benachbart und parallel zu der Schnittfläche der Zelle blockieren (Abbildung 5). </li><li> Aufnahme eines Beacon-wie dunkle AV-Marker als Wegweiser. Dies ist entscheidend für das Erreichen folgenden Features: <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Identifizierung und Überwachung der Ebene, auf der die Zellen in der Zelle blockieren konzentriert sind. Die Belichtung der dunklen Wegweiser zeigt die Ebene, auf der die meisten der einzeln verstreuten Zellen in der Zelle blockieren erwartet, dass sich (Abbildung 4) werden sollen. Damit wird verhindert, der Überschneidung (Schneiden über das Niveau bei den meisten Zellen) oder unterboten (nicht schneiden tief genug in die Höhe mit der höchsten Konzentration von Probe-Zellen) in der Zelle blockieren und ermöglichen die Auswahl der Abschnitte aus der Ebene in der Zelle blockieren Korrespondenz mit höchster Konzentration von Zellen. </li><li> Die dunkel gefärbten Wegweiser in den Abschnitten dient auch als Bezugspunkt zu überblicken und zu identifizieren genau die gleichen Zellen in verschiedenen Schnittserien der Zelle blockieren auf verschiedenen Folien (Abbildung 4). Dies ist kritisch, während die Interpretation und Bewertung des Koordinatensystems Eigenschaften wie immunoprofile von bestimmten Zellen der SCIP-Ansatz auf die gleichen Zellen in verschiedenen Abschnitten (6,7) folgen. </li></ol></li></ol> Obwohl our-Protokoll standardisiert ist und berichtet für flüssige Zervixzytologie Proben, es kann auch verwendet werden, um diagnostische Ausbeute von vielen anderen nicht-gynäkologische Proben wie Erguss Flüssigkeiten, FNA, Bürsten, Zysteninhalts etc. Darüber hinaus verbessern die AV-Marker erleichtern würde verbessert Anwendung der SCIP-Ansatz bei der immunhistochemischen Auswertung der Zelle blockieren Abschnitten dieser Proben. Die Einbettung Medium kann durch andere Reagenzien mit entsprechenden Modifikationen an relevanten Schritte ersetzt werden. HG kann durch Plasma (Fibrinogen), die von Thrombin bei Raumtemperatur (1) geliert werden ersetzt werden.

cell block preparation from cytology specimen with predominance of individually scattered cells

Dieses Video zeigt Shidham die Verfahren zur Herstellung von Zell-Blocks von Flüssigkeit basiert zervikovaginalen Zytologie Proben, die einzeln verstreuten Zellen und kleine Zellgruppen. Diese Technik verwendet HistoGel (Thermo Scientific) mit konventionellen Laborgeräten. Die Verwendung von Zellen blockieren Abschnitten ist ein wertvolles Hilfswerkzeug für die Bewertung von nicht-gynäkologischen Zytologie. Sie ermöglichen die Zytopathologen zusätzliche morphologische Muster Detail, einschließlich der Architektur der Läsion zu studieren. Vor allem sorgen sie für die Auswertung der ergänzenden Studien wie Immunzytochemie, in-situ-Hybridisierung Tests (FISH / CISH) und in-situ-Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Traditionelle Zellenblock Vorbereitung Techniken meist nicht-gynäkologischen Zytologie Proben angewendet wurde, in der Regel für Körperflüssigkeit Ergüssen und Feinnadelpunktion Biopsie. Flüssiges Basis zervikovaginalen Exemplare sind relativ weniger zelluläre als ihre nicht-gynäkologischen Kollegen mit vielen einzelnen verstreuten Zellen. Aus diesem Grund ist eine ausreichende Zelldichte innerhalb der Zelle blockieren Abschnitte schwer zu erreichen. Darüber hinaus können die histotechnologist Schneiden des Blocks nicht vorstellen, auf welcher Ebene werden die Zellen bei der höchsten Konzentration. Daher ist es schwierig, die geeignete Ebene, welche Abschnitte ausgewählt, um den Glasträger für die Prüfung übertragen werden können, werden überwacht. Als Ergebnis kann die Fläche der Zelle Block mit den Zellen von Interesse verpasst haben, entweder durch Schneiden Vergangenheit oder schneidet nicht tief genug sein. Aktuelle Protokoll für Shidham Methode behebt diese Probleme. Obwohl dieses Protokoll standardisiert ist und berichtet für gynäkologische flüssige Zytologie Proben kann es auch zu nicht-gynäkologische Proben wie Erguss Flüssigkeiten, FNA, Bürsten, Zysteninhalts etc für eine verbesserte Diagnose-Material in der Zelle blockieren Abschnitte angewendet werden.

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Cell Block Preparation from Cytology Specimen with Predominance of Individually Scattered Cells

Shidham das Verfahren zur Herstellung von Zell-Blöcke mit AV-Markierung von Zellproben, die einzeln verstreuten Zellen und kleine Zellgruppen.

Cell Block Vorbereitung von Zytologie Probe mit Vorherrschaft von Individuell verstreuten Zellen

This video demonstrates Shidham's method for preparation of cell blocks from liquid based cervicovaginal cytology specimens containing individually ...

cell-block-preparation-from-cytology-specimen-with-predominance

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

73.2K Aufrufe.  University of Wisconsin - Milwaukee. Shidham das Verfahren zur Herstellung von Zell-Blöcke mit AV-Markierung von Zellproben, die einzeln verstreuten Zellen und kleine Zellgruppen.

Serie: Cell Block Preparation from Cytology Specimen with Predominance of Individually Scattered Cells

Human ES cells: Starting Culture from Frozen Cells

Here we demonstrate how our lab begins a HuES human embryonic stem cell line culture from a frozen stock.  First, a one to two day old ten cm plate of  approximately one (to two) million irradiated mouse embryonic fibroblast feeder cells is rinsed with HuES media to remove residual serum and cell debris, and then HuES media added and left to equilibrate in the cell culture incubator.  A frozen vial of cells from long term liquid nitrogen storage or a -80C freezer is sourced and quickly submerged in a 37C water bath for quick thawing.  Cells in freezing media are then removed from the vial and placed in a large volume of HuES media.  The large volume of HuES media facilitates removal of excess serum and DMSO, which can cause HuES human embryonic stem cells to differentiate.  Cells are gently spun out of suspension, and then re-suspended in a small volume of fresh HuES media that is then used to seed the MEF plate.  It is considered important to seed the MEF plate by gently adding the HuES cells in a drop wise fashion to evenly disperse them throughout the plate.  The newly established HuES culture plate is returned to the incubator for 48 hrs before media is replaced, then is fed every 24 hours thereafter.

Here we demonstrate how our lab begins a HuES human embryonic stem cell line culture from a frozen stock.

Humane ES-Zellen: Starting Kultur aus eingefrorenen Zellen

Here we demonstrate how our lab begins a HuES human embryonic stem cell line culture from a frozen stock.  First, a one to two day old ten cm plate of  ...

Forschung

Biologie

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

Ableitung von hämatopoetischen Stammzellen aus embryonalen Stammzellen der Maus

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

Vorbereitung der neuronalen Kulturen aus Midgastrula Bühne Drosophila Embryonen

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator

Single-cell suspensions are a prerequisite for experiments in cell separation, cell analysis and cell culture.  To avoid tedious and often painful manual dissociations the gentleMACS Dissociator allows one to dissociate tissue very efficiently under controlled and reproducible conditions.  The gentleMACS Dissociator can optimally dissociate mouse spleen, combining timesaving and standardization with user-safety.

This video describes how to dissociate mouse spleens using the gentleMACS Dissociator, an automated bench-top device that can mechanically disrupt tissues using special tubes to produce viable cell suspensions. Following dissociation, spleens are filtered, centrifuged, and resuspended for further applications.

This video describes a simple, time-saving technique for automated tissue dissociation using the gentleMACS Dissociator to prepare single-cell suspensions of mouse splenocytes.

Erstellung von Einzel-Zellsuspensionen aus Maus-Milz mit dem gentleMACS Dissociator

Single-cell suspensions are a prerequisite for experiments in cell separation, cell analysis and cell culture.  To avoid tedious and often painful manual ...

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature and genome sequence database. Cultured Drosophila S2 cells, the product of disassociated 20-24 hour old embryos1, possess all these properties. Consequently, S2 cells are extremely well-suited for the analysis of cellular processes, including the discovery of the genes encoding the molecular components of the process or mechanism of interest. The features of S2 cells that are most responsible for their utility are the ease with which they are maintained, their exquisite sensitivity to double-stranded (ds)RNA-mediated interference (RNAi), and their tractability to fluorescence microscopy as either live or fixed cells.
S2 cells can be grown in a variety of media, including a number of inexpensive, commercially-available, fully-defined, serum-free media2. In addition, they grow optimally and quickly at 21-24&deg;C and can be cultured in a variety of containers. Unlike mammalian cells, S2 cells do not require a regulated atmosphere, but instead do well with normal air and can even be maintained in sealed flasks.
Complementing the ease of RNAi in S2 cells is the ability to readily analyze experimentally-induced phenotypes by phase or fluorescence microscopy of fixed or live cells. S2 cells grow in culture as a single monolayer but do not display contact inhibition. Instead, cells tend to grow in colonies in dense cultures. At low density, S2 cultures grown on glass or tissue culture-treated plastic are round and loosely-attached. However, the cytology of S2 cells can be greatly improved by inducing them to flatten extensively by briefly culturing them on a surface coated with the lectin, concanavalin A (ConA)3. S2 cells can also be stably transfected with fluorescently-tagged markers to label structures or organelles of interest in live or fixed cells. Therefore, the usual scenario for the microscopic analysis of cells is this: first, S2 cells (which can possess transgenes to express tagged markers) are treated by RNAi to eliminate a target protein(s). RNAi treatment time can be adjusted to allow for differences in protein turn-over kinetics and to minimize cell trauma/death if the target protein is important for viability. Next, the treated cells are transferred to a dish containing a coverslip pre-coated with conA to induce cells to spread and tightly adhere to the glass. Finally, cells are imaged with the researcher's choice of microscopy modes. S2 cells are particularly good for studies requiring extended visualization of live cells since these cells stay healthy at room temperature and normal atmosphere.

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

Drosophila Schneider (S2) cells are an increasingly popular system for the discovery and functional analysis of genes. Our goal is to describe some of the microscopic techniques that make S2 cells such an increasingly important experimental system.

Vorbereitung der Drosophila S2-Zellen für Lichtmikroskopie

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature ...

Preparation of Quality Inositol Pyrophosphates

Myo-inositol is present in nature either unmodified or in more complex phosphorylated derivates. Of the latest, the two most abundant in eukaryotic cells are inositol pentakisphosphate (IP5) and inositol hexakisphosphate (phytic acid or IP6). IP5 and IP6 are the precursors of inositol pyrophosphate molecules that contain one or more pyrophosphate bonds1. Phosphorylation of IP6 generates diphoshoinositolpentakisphosphate (IP7 or PP-IP5) and bisdiphoshoinositoltetrakisphosphate (IP8 or (PP)2-IP4). Inositol pyrophosphates have been isolated from all eukaryotic organisms so far studied. In addition, the two distinct classes of enzymes responsible for inositol pyrophosphate synthesis are highly conserved throughout evolution2-4.
The IP6 kinases (IP6Ks) posses an enormous catalytic flexibility, converting IP5 and IP6 to PP-IP4 and IP7 respectively and subsequently, by using these products as substrates, promote the generation of more complex molecules5,6. Recently, a second class of pyrophosphate generating enzymes was identified in the form of the yeast protein VIP1 (also referred as PP-IP5K), which is able to convert IP6 to IP7 and IP87,8.
Inositol pyrophosphates regulate many disparate cellular processes such as insulin secretion9, telomere length10,11, chemotaxis12, vesicular trafficking13, phosphate homeostasis14 and HIV-1 gag release15. Two mechanisms of actions have been proposed for this class of molecules. They can affect cellular function by allosterically interacting with specific proteins like AKT16. Alternatively, the pyrophosphate group can donate a phosphate to pre-phosphorylated proteins17. The enormous potential of this research field is hampered by the absence of a commercial source of inositol pyrophosphates, which is preventing many scientists from studying these molecules and this new post-translational modification. The methods currently available to isolate inositol pyrophosphates require sophisticated chromatographic apparatus18,19. These procedures use acidic conditions that might lead to inositol pyrophosphate degradation20 and thus to poor recovery. Furthermore, the cumbersome post-column desalting procedures restrict their use to specialized laboratories.
In this study we describe an undemanding method for the generation, isolation and purification of the products of the IP6-kinase and PP-IP5-kinases reactions. This method was possible by the ability of polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) to resolve highly phosphorylated inositol polyphosphates20. Following IP6K1 and PP-IP5K enzymatic reactions using IP6 as the substrate, PAGE was used to separate the generated inositol pyrophosphates that were subsequently eluted in water.

Inositol pyrophosphates play an important role in human pathologies such cancer, diabetes and obesity; however, the exact mechanism of action is a matter of dispute. The lack of commercially available inositol pyrophosphates renders detailed studies problematic. Here we describe a simple protocol to produce and isolate milligrams of inositol pyrophosphates.

Erstellung von Qualitäts-Inositol Pyrophosphate

Myo-inositol is present in nature either unmodified or in more complex phosphorylated derivates. Of the latest, the two most abundant in eukaryotic cells ...

Chromosome Preparation From Cultured Cells

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as fluorescence in situ hybridization (FISH), this assay has the powerful ability to analyze individual cells for aberrations that involve gains or losses of portions of the genome&#160;and rearrangements involving one or more chromosomes. In humans, chromosome abnormalities occur in approximately 1 per 160 live births1,2, 60-80% of all miscarriages3,4, 10% of stillbirths2,5, 13% of individuals with congenital heart disease6, 3-6% of infertility cases2, and in many patients with developmental delay&#160;and birth defects7. Cytogenetic analysis of malignancy is routinely used by researchers and clinicians, as observations of clonal chromosomal abnormalities have been shown to have both diagnostic and prognostic significance8,9.&#160; Chromosome isolation is invaluable for gene therapy and stem cell research of organisms including nonhuman primates and rodents10-13.
Chromosomes can be isolated from cells of live tissues, including blood lymphocytes, skin fibroblasts, amniocytes, placenta, bone marrow, and tumor specimens. Chromosomes are analyzed at the metaphase stage of mitosis, when they are most condensed and therefore more clearly visible. The first step of the chromosome isolation technique involves the disruption of the spindle fibers by incubation with Colcemid, to prevent the cells from proceeding to the subsequent anaphase stage. The cells are then treated with a hypotonic solution and preserved in their swollen state with Carnoy&#39;s fixative. The cells are then dropped on to slides and can then be utilized for a variety of procedures. G-banding involves trypsin treatment followed by staining with Giemsa to create characteristic light and dark bands. The same procedure to isolate chromosomes can be used for the preparation of cells for procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY)14,15.

Chromosomes can be isolated from live cells such as lymphocytes or skin fibroblasts, and from organisms including humans or mice. These chromosome preparations can be further utilized for routine G-banding and molecular cytogenetic procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY).

Chromosomenpräparation aus kultivierten Zellen

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as ...

Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem cells of skeletal muscle, the myogenic precursor cells (MPCs), have proven indispensible to our understanding of mammalian skeletal muscle development and growth. Particularly among the basal taxa of Vertebrata, however, data are limited describing the molecular mechanisms controlling the self-renewal, proliferation, and differentiation of MPCs. Of particular interest are potential mechanisms that underlie the ability of basal vertebrates to undergo considerable postlarval skeletal myofiber hyperplasia (i.e.&#160;teleost fish) and full regeneration following appendage loss (i.e.&#160;urodele amphibians). Additionally, the use of cultured myoblasts could aid in the understanding of regeneration and the recapitulation of the myogenic program and the differences between them. To this end, we describe in detail a robust and efficient protocol (and variations therein) for isolating and maintaining MPCs and their progeny, myoblasts and immature myotubes, in cell culture as a platform for understanding the evolution of the myogenic program, beginning with the more basal vertebrates. Capitalizing on the model organism status of the zebrafish (Danio rerio), we report on the application of this protocol to small fishes of the cyprinid clade Danioninae. In tandem, this protocol can be utilized to realize a broader comparative approach by isolating MPCs from the Mexican axolotl (Ambystomamexicanum) and even laboratory rodents. This protocol is now widely used in studying myogenesis in several fish species, including rainbow trout, salmon, and sea bream1-4.

In vitro culture systems have proven indispensible to our understanding of vertebrate myogenesis. However, much remains to be learned about nonmammalian skeletal muscle development and growth, particularly in basal taxa. An efficient and robust protocol for isolating the adult stem cells of this tissue, the myogenic precursor cells (MPCs), and maintaining their self-renewal, proliferation, and differentiation in a primary culture setting allows for the identification of conserved and divergent regulatory mechanisms throughout the vertebrate lineages.

Herstellung von primären Myogenic Vorläuferzelle / Myoblastenkulturen von Basal Wirbelstammbaum

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

Effiziente Erzeugung Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen Körperzellen mit Sendai-Virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms or solutions. We make use of a custom built cryo-transfer station and a modified cryo-SEM preparation chamber2. The spores are taken from a culture, plunge-frozen in a liquid nitrogen slush and observed in the cryo-SEM to select a region of interest. A thin lamella is then extracted using the FIB, attached to a TEM grid and subsequently thinned to electron transparency. The grid is transferred to a cryo-TEM holder and into a TEM for high resolution studies. Thanks to the introduction of a cooled nanomanipulator tip and a cryo-transfer station, this protocol is a straightforward adaptation to cryogenic temperature of the routinely used FIB preparation of TEM samples. As such it has the advantages of requiring a small amount of modifications to existing instruments, setups and procedures; it is easy to implement; it has a broad range of applications, in principle the same as for cryo-TEM sample preparation. One limitation is that it requires skillful handling of the specimens at critical steps to avoid or minimize contaminations.

Cryo Electron Microscopes, either Scanning (SEM) or Transmission (TEM), are widely used for characterization of biological samples or other materials with a high water content1. A SEM/Focused Ion Beam (FIB) is used to identify features of interest in samples and extract a thin, electron-transparent lamella for transfer to a cryo-TEM.

Cryo-Elektronen-Mikroskopie-Probenvorbereitung mit Hilfe eines Focused Ion Beam

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms ...