사육 및 이유의 기초

Overview

출처: 케이 스튜어트, RVT, RLATG, CMAR; 발레리 A. 슈뢰더, RVT, RLATG. 노틀담 대학교, IN

매년 수백만 마리의 쥐와 쥐가 생의학 연구에 사용하기 위해 사육됩니다. 전 세계적으로 실험실을 연구하기 위해 쥐를 공급하는 여러 대형 상업 사육 시설이 있지만 많은 시설은 비용을 절감하고 연구 옵션을 늘리기 위해 사내에서 쥐와 쥐를 사육하기로 결정합니다. 동물 시설에서 사육할 때, 연구원은 동물의 유전학을 조작할 수 있고, 연구의 필요를 충족시키기 위하여 임신시간을, 필요에 따라 태아 및 신생아와 함께 일할 수 있습니다.

마우스와 쥐는 다양한 계획과 방법으로 사육될 수 있다. 질 세포학의 사용, 질 영역의 시각화 및 copulatory 플러그의 관찰과 같은 기술적 절차는 연구 요구 사항에 상응하는 번식의 동기화를 돕기 위해 개발되었습니다. 이 원고는 마우스와 쥐 사육 및 사용되는 기술 절차의 기본 기본에 대한 개요입니다. 복잡한 번식 계획에 대한 자세한 설명과 질 세포학 방법에 대한 전체 설명은 참조 목록에서 사용할 수 있습니다.

Principles

균주와 주식의 일반적인 유형

쥐와 쥐는 일반적으로 근친 주식으로 사육, 근친 긴장, 그리고 하이브리드 긴장. 자란 동물은 비슷한 특성을 가지고 있지만 유전적으로 동일하지 않습니다. 그(것)들은 이종화 또는 유전적 차이를 유지하기 위하여 무작위로 사육됩니다. 대조적으로, 근친 근친 동물은 적어도 20 세대의 형제 자매 또는 부모 자손 짝짓기와 교배되어 유전적으로 동질적입니다. 마지막으로, 하이브리드 동물은 두 근친 균주의 짝짓기의 자손입니다.

번식 행동에 영향을 미치는 요인

쥐와 쥐의 번식 성능에 영향을 미칠 수 있는 많은 요인이 있다. 여성 육종가의 활력은 주로 근친 교배의 수준에 따라 달라집니다. 근친인의 동물은 훨씬 더 단단하고 활발하기 때문에 더 크고 강한 쓰레기를 생산합니다. C57BL/6 마우스와 같이 일반적으로 사용되는 균주는 번식을 방해할 수 있는 공격적인 동작을 표시합니다. 공격적인 긴장을 사육 할 때, 모든 쓰레기는 밀접하게 지켜봐야한다. 공격적인 새끼를 포함하는 쓰레기에서 동물은 번식에 사용되어서는 안된다. 온도, 습도 및 조명 변동으로 인해 번식 효율이 저하될 수 있습니다. 사육실 내의 소음과 진동도 해로운 영향을 미치는 것으로 나타났습니다. 사육 시설 내에서 이러한 변수를 제어하면 일부 효과를 최소화할 수 있습니다. ¹ 유전자 변형을 가진 동물은 덜 강건하고 비옥한 경향이 있고, 돌연변이의 몇몇은 출생 의 전후 또는 곧 새끼의 치사귀 귀착될 수 있습니다.

생식 계획은 마우스와 쥐에 대해 유사합니다. 일반적으로 사용되는 시스템은 한 명의 남성에게 사육된 두 개 이상의 암컷의 남성 또는 일부다처 결합으로 자란 한 여성의 일부일처 결합입니다. 암컷 마우스와 쥐 는 모두 다각형이며 산후 약 20-24 h의 산후 를 겪습니다. 산후 에스트라루스 동안 여성은 쓰레기를 임신할 수 있습니다. 유전 돌연변이로 인해 짧은 번식 수명이 있는 쥐 또는 쥐의 변종의 경우, 수컷을 암컷과 함께 케이지에 두는 것이 일반적이어서 즉시 다른 쓰레기를 잉태할 수 있습니다. 이 집중적인 번식 계획은 여성에게 스트레스를 받을 수 있습니다, 그녀는 지속적으로 수유하고 제스처로. 비 집중적 인 계획은 그녀가 눈에 띄게 임신한 후 여성의 분리를 포함한다; 그녀는 쓰레기가 짜기 전까지는 남성의 케이지로 돌아오지 않습니다. 이 시스템은 여성에 훨씬 덜 까다롭습니다.

유전자 조작 목적으로 사육

유전자 조작 된 동물 (GEA)은 게놈으로 추가 된 다른 종에서 유전자가 있는 그들의 게놈 또는 형질 전환 동물에서 제거된 유전자가 있던 녹아웃 동물입니다. GEA는 그 때 근친 변형으로 사육되고 수시로 아주 특정 연구 프로젝트를 위한 복잡하고 유전으로 조작된 동물을 만들기 위하여 그밖 GEA와 사육됩니다. 복잡한 번식 계획은 몇몇 유전자를 제거하고 그 외추가 추가한 긴장을 만드는 데 이용됩니다. 알츠하이머병, 암, 뇌졸중 및 기타 혈액 질환, 당뇨병 및 망막 색소를 포함하되 이에 국한되지 않는 많은 유전자 관련 질환에 대한 동물 모델은 동물의 유전 공학을 통해 개발되었습니다.

대부분의 번식 계획은 유전자형 비율에 대한 예측을 하기 위하여 Mendelian 유전학에 의지할 수 있습니다. 야생형 마우스가 하나의 수정된 유전자(이테로지고테)를 가진 마우스로 사육될 때, 예상되는 결과는 50% 야생형 동물 및 50% 이종고테스일 것입니다. 두 개의 수정 된 유전자 (homozygote)와 마우스와 교차 야생 형 마우스는 이종화되는 모든 자손이 될 것입니다. 두 개의 이종화구동물이 교차하면, 3가지 유전자형은 모두 다음 비율로 존재해야 합니다: 25% 야생형, 50% 이종고, 25% 동질고. 배아 치명적인 유전자가 검출될 수 있다는 것은 이러한 기대에서 나온것입니다(즉,균질자손이 생성되지 않은 경우).

그림 1. Mendelian 유전학에 근거를 둔 가능한 짝짓기 및 결과. 야생 동물은 유전자 변형되지 않으며 (+/+)로 지정됩니다. 이테로지구스 동물은 수정된 유전자의 한 사본을 가지고 있으며 (-/+)로 지정됩니다. 동종가동물은 유전자의 두 복사본을 모두 변형하고 (-/-)로 지정된다.

Procedure

1. 동물을 페어링할 때 필요한 정보에는 적절한 명명법, 육종가 남성과 여성의 생년월일 및 설정 날짜를 활용하는 동물의 변형/재고가 포함됩니다. 정확한 기록 보관은 식민지 를 사육하는 데 필수적입니다.

2. 쥐와 쥐의 성 결정은 무귀생식 거리를 비교하여 수행됩니다. 여성의 경우 항문과 외부 생식기 사이의 거리가 남성보다 짧습니다. 남성 동물에 음낭의 존재는 또 다른 섹스 지표.

3. 짝짓기 구성표 선택 및 설정

참고: 사용할 수 있는 두 개의 짝짓기 체계가 있습니다.

Proestrus/estrus 시간 제짓 짝짓기: 이 방법은 최대 수용성과 다산의 시점에서 남성과 여성을 paring에 의존합니다.
1. estrous 주기는 proestrus와 estrous의 표시 되는 변화에 대 한 외부 생식기의 시각적 검사에 의해 또는 질 분비물의 세포학에 의해 여성에서 모니터링 해야 합니다 (아래 참조).
2. 여성이 프로스트루스 나 에스트러스에 있다고 결정되면, 동물은 일반적으로 밤에 짝을 이루는 것처럼 하루가 끝날 때 남성과 짝을 이룹니다.
3. 다음 날 아침, 여성은 코큘라플러그검사를 받는다(아래 참조). 플러그가 없는 경우, 여성은 하루 동안 남성과 함께 남아 하루의 끝에 copulatory 플러그를 검사 할 수 있습니다. 또는, 그녀가 더 이상 프로스트루스 또는 에스트루스에 없는 것으로 판명되면, 그녀는 번식 케이지에서 제거됩니다.
랜덤 시간 단축 결합: 이 방법은 설치류의 estrous 주기가 매우 짧고 4-5 일 길이라는 사실을 기반으로합니다.
1. 이 방법의 경우, 짝짓기는 언제든지 설정할 수 있으며, 여성은 플러그가 관찰 될 때까지 매일 아침저녁과 저녁에 copulatory 플러그를 검사합니다.
2. 여성은 저녁에 남성과 짝을 이룹니다.
3. 플러그가 관찰될 때까지 매일 시작과 끝에 코뮬레이트 플러그를 검사합니다. 이 방법을 사용할 때 플러그를 볼 수 있는 데 일반적으로 3일 이상이 걸립니다.

4. 임신 예측

새끼의 심푸는 임신 도중 나중에까지 어렵기 때문에, 약 10-12, 설치류를 위한 상업적인 초음파 시스템이 개발되었습니다; 그러나, 몇몇 동물 연구 시설은 이 기술을 가지고 있습니다. 따라서, copulatory 플러그의 시각화, 질 변화의 관찰, 또는 질 세포학은 일반적으로 여성이 쓰레기를 잉태 한 때의 예측을 돕기 위해 사용된다 (아래 참조). 그러나, 이 방법의 어느 것도 임신을 확인할 수 없습니다. 일단 copulatory 플러그가 관찰되면, 여성은 체중 증가와 같은 임신의 표시를 위해 감시되어야 합니다.

5. 에스트라스트 사이클 스테이지 결정

육각 검사
참고: 쥐와 쥐의 적시 결합의 경우, 프로스트루스와 에스트루러스를 나타내는 변화에 대한 질의 시각적 관찰은 estrous 사이클 스테이지를 결정하는 가장 빠른 방법이며 특별한 장비가 필요하지 않습니다.
1. 시각 방법을 사용하여 에스트라스트 사이클을 평가할 때, 광원이 질 조직의 인식된 색을 변경하고 평가를 어렵게 만들 수 있기 때문에, 방 조명과 관련하여 동일한 영역에서 육안 검사를 수행하는 것이 중요하다. 예를 들어 LED 조명에 의해 투사되는 보라색 색조는 시각적 감지를 더 어렵게 만듭니다.
2. 시각적 관찰에 의해 estrous 주기의 단계를 평가하기 위해 각 마우스는 케이지 뚜껑에 앞포가 놓여있는 꼬리에 의해 수동으로 억제되어야합니다.
3. 각 여성의 질 개구부는 질 영역을 둘러싼 조직의 상태와 질 개구부의 크기에 따라 평가된다. ²
  1. proestrus 동안, 질 개구부는 넓고 주변 조직의 팽윤을 특징으로합니다. 조직은 분홍색으로 색이 있고 매우 촉촉합니다. 종종 개구부의 등쪽 및 복부 가장자리를 따라 주름이나 조각이 있습니다.
  2. estrus 동안, 질 개구부를 둘러싼 조직의 팽윤이 감소하고, 조직은 촉촉하고 분홍색이 아닙니다.
  3. metestrus 동안 질 개구부는 최소화 하 고 무시할 수 있는 붓기가 있다.
  4. diestrus 도중, 질 지역 의 주위에 조직의 팽윤이 없고, 질 개구부는 작고 닫힙니다.
질 세포학
마우스와 쥐 모두 다각형이기 때문에, estrus 주기 길이는 4-5 일에 구역 수색하는 아주 짧습니다. 프로스트루스, 에스트루스, 자궁경, 다스트루의 네 단계를 모두 식별할 필요가 있습니다. 질 세포학은 이 단계를 결정하는 아주 정확한 방법입니다. 또한 두 가지 샘플 수집 방법이 있습니다: 질 용암의 비침습적 방법, 및 질 운하 면봉의 침습적 방법.
1. 질 용암
  1. 필요한 재료는 멸균 200 μl 파이펫 팁, 라텍스 전구, 멸균 이중 증류수 (ddH₂0), 깨끗한 유리 슬라이드입니다.
  2. 멸균 200 μl 팁 끝에 라텍스 전구를 놓습니다. 약 100 μl의 멸균 ddH₂O를 파이펫에 넣습니다.
  3. 마우스를 케이지에서 들어 올리고 꼬리가 있는 와이어 바 케이지 위에 놓습니다.
  4. 꼬리를 단단히 잡고 마우스의 뒷분기를 상승시킵니다. 이제 마우스에 뚜껑을 잡고 있는 앞발만 있습니다.
  5. 마우스가 소변을 보는 경우 배뇨가 멈출 때까지 기다립니다. 질 운하 입구에 소변이 남아 있는 경우, ddH_2O의작은 분출로 개구부가 헹구는 데 사용되었던 팁을 바꿀 수 있습니다.
  6. ddH₂O-채워진 팁의 끝을 오리피스를 관통하지 않고 질 운하의 개구부에 놓습니다.
  7. 질 운하의 개통시 물 부피(~25-50 μl)의 절반까지 전구를 부드럽게 내보냅니다. 액체는 팁 삽입없이 운하에 자발적으로 흡입됩니다. 전구에 가해지는 압력을 천천히 방출합니다. 유체가 다시 팁으로 다시 들어갑니다.
  8. 전구에 유체의 포부를 방지하기 위해 너무 빨리 압력을 방출하지 마십시오. 필터링된 팁은 이 용도에 유용할 수 있습니다.
  9. 동일한 팁, 전구 및 유체를 사용하여 이전 단계를 4-5회 반복하여 단일 샘플에서 충분한 수의 세포를 얻습니다.
  10. 유리 슬라이드에 액체를 놓고 실온에서 얼룩이 완전히 건조되도록합니다.
  11. 각 마우스에 새 파이펫을 사용합니다.
  12. 일단 건조되면, 이 estrous 얼룩은 즉시 염색하거나 저장하고 나중에 염색할 수 있습니다. 라이트-지름사 염색은 슬라이드를 염색하는 데 가장 일반적으로 사용됩니다. 이러한 얼룩은 스테인링 과정에서 세포가 세척되는 것을 방지하기 위해 슬라이드의 고정을 필요로 하지 않는 1단계 얼룩으로서 상업적으로 사용할 수 있습니다. 슬라이드는 제조업체의 지침에 따라 45-60초 동안 얼룩에 배치됩니다.
  13. 슬라이드는 현미경의 밑에 그 때 검사되고, 보인 세포는 주기의 단계에 해당합니다: 1) 여성이 proestrus에 있는 경우에, 세포는 세포질보다는 더 어둡게 얼룩진 핵을 가진 둥근, 잘 형성된 핵상피세포의 클러스터로 보입니다; 2) 여성이 estrus에있는 경우, 세포의 대부분은 핵이 부족한 상피 세포, 외관에 각이며, 조밀하게 포장 된 클러스터에서 발생; 3) 여성이 자궁경상에 있는 경우에, 세포는 전형적으로 백혈구 (특히 일부 옥수수 상피 상피 세포가 존재하는 호중구)와 함께 연결된 두 개의 소시지 같이 형성되는 어둡게 얼룩진 핵을 가진; 4) diestrus 도중, 존재하는 세포는 몇몇 핵상피 세포의 발생을 가진 일반적으로 백혈구입니다..
2. 질 면봉
  1. 필요한 재료는 직경 2mm 팁, 깨끗한 유리 현미경 슬라이드 및 멸균 생리식염수와 멸균 면 팁 어플리케이터입니다.
  2. 면에 기울어진 어플리케이터를 식염수로 적시다.
  3. 절제된 마우스의 질에 어플리케이터의 끝을 삽입합니다.
  4. 부드럽게 돌리고 질 벽에 팁을 굴립니다. 면봉을 조심스럽게 제거합니다.
  5. 셀은 슬라이드를 가로 질러 면봉을 굴려 건조 유리 슬라이드로 전달됩니다.
  6. 슬라이드가 건조되면 라이트-기임사 얼룩으로 얼룩질 수 있습니다.
    스와빙은 스트레스가 많은 절차로 간주되며 스트레스를 받은 마우스가 스트라스트 사이클을 방해할 수 있습니다. 스와빙에 의한 질 및 자궁 경부 자극은 의사 임신을 유도할 수 있습니다. 질 점막의 반복된 면봉은 적당한 구속으로, 그리고 올바른 크기의 면봉으로 부드럽게 수행되지 않으면 손상을 일으킬 수 있습니다. ^3,4

그림 2. 질 세포학 -- 설치류 estrus 주기의 다른 단계

6. 코뮬레이토리 플러그 시각화

이 플러그는 질 액과 정액으로 구성되며 12-24 h 후응성동안 질에서 지속됩니다. 플러그의 존재는 짝짓기를 확인하지만, 여성이 임신을 보장하지 않습니다. 연결된 여성이 임신한 경우 임신 첫날은 플러그가 발견된 다음 날로 간주됩니다.

마우스를 케이지에서 들어 올려 꼬리가 있는 와이어 바 케이지 위에 놓습니다.
꼬리 바로 위에 압력을 가하여 마우스를 배치하여 뒤쪽을 아치화하여 질 개구부의 더 나은 프리젠 테이션을 허용합니다.
그녀의 질 개구부를 관찰하여 희끄무레한 덩어리를 만드시다. 코큘라토리 플러그는 시각적으로 명확하지 않을 수 있지만 무딘 프로브를 사용하여 확인할 수 있습니다.
프로브의 끝을 사용하여 질 개구부에 부드럽게 삽입하십시오. 코큘리 플러그의 존재는 질 개구부의 0.5cm 내의 프로브의 발전을 방해할 것입니다.
프로브는 알코올에 감염되고 각 사용 전에 완전히 건조해야합니다.

암컷은 쓰레기, 생년월일, 쓰레기 크기, 태어난 숫자, 수제, 수컷:암컷 새끼의 비율, 유전자형의 비율이 모두 기록되어야 한다. 쓰레기 내의 유전자형이 부모의 유전자형에 해당하지 않는 경우, 진정한 유전자형을 확인하기 위해 재검사를 수행해야 합니다.

7화 위닝

쥐와 쥐에 대한 임신은 약 21 일입니다. 젊은 나이의 21-28 일에 짜인다. 쥐와 쥐 모두 이른 8 주 까지 번식 할 수 있으므로 새끼는 어린 나이에 성별에 의해 분리되는 것이 필수적입니다. 집중적인 번식은 다음 쓰레기가 태어날 때 오래된 새끼가 존재하지 않도록 하기 위해 20일째에 각 쓰레기의 새끼를 사육해야 합니다. 비집중적 번식을 위해 새끼는 20 일 의 나이를 지나서 어머니와 함께 남겨질 수 있으며, 종종 28 일까지. 이것은 새끼가 비 엔지니어링 또는 야생 형 동물만큼 활발하지 않을 수 있기 때문에 많은 유전자 변형 균주에 매우 도움이 될 수 있습니다.

남성과 여성 새끼는 짜기에서 분리됩니다. 가능하면 새로 새끼를 노래해서는 안됩니다. 쓰레기가 주어진 성별의 한 새끼만 포함하는 경우, 시도는 같은 성별의 다른 사람과이 강아지를 수용할 수 있어야합니다. 가능한 주택 옵션은 : 1) 단일 여성 강아지는 집중 번식 케이지에없는 경우 어머니와 함께 남아있을 수 있습니다; 2) 단일 여성 또는 남성 새끼는 같은 나이의 다른 쓰레기에서 다른 동성 새끼와 함께 배치 될 수있다; 3) 부모가 일부일처 쌍인 경우, 여성은 하나의 남성 새끼가 아버지와 함께 수용 될 수 있도록 케이지에서 제거 할 수 있습니다; 그리고 4) 단일 남성 강아지는 5 주까지 여성 형제자매와 함께 수용 될 수있다. 새끼의 성별은 원치 않는 쓰레기가 부적절하게 분리 된 새끼를 방지하기 위해 일주일 후 확인되어야한다.

쥐와 쥐는 번성 하는 것을 보장 하기 위해 매일 검사 해야 합니다. 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드⁵ 는 음식이 대변과 소변에 의해 더럽히는 것을 방지하기 위해 동물에게 제시되어야한다고 명시하고 있지만, 새로 짜여진 마우스는 케이지 바닥에 유리 접시 (페트리 접시)에 배치 된 소량의 음식 (마우스 당 1 펠릿)을 제공해야합니다. 이것은 동물이 유일한 음식 근원으로 설치류 차우를 갖는 전환하도록 격려할 것입니다. 자동 급수 시스템을 통해 케이지에 물을 공급하는 랙에 보관되어 있는 동물의 경우에도 마우스가 탈수된 것처럼 보이는 경우 물병을 케이지에 추가할 수 있습니다.

이름	콜로니 타입	묘사
ICR	아웃레드	흰둥이
스위스 웹스터	아웃레드	흰둥이
발브/c	인브레드	흰둥이
FVB	인브레드	흰둥이
C57BL/6	인브레드	블랙 코트 칼라
C₃H	인브레드	브라운 코트 칼라
DBA/2	인브레드	브라운/그레이 코트 칼라
아티믹 누드 (nu/nu)	인브레드	사나이
SCID	인브레드	심한 결합 면역 절제 마우스 -다양한 코트 색상

표 1. 일반적으로 사용되는 마우스 얼룩과 주식.

이름	콜로니 타입	묘사
스프라그-다울리	아웃레드	흰둥이
위스타 (주)	아웃레드	흰둥이
피셔 344	인브레드	흰둥이
루이스	인브레드	흰둥이
롱 에반스	인브레드	후드, 블랙, 화이트

표 2. 일반적으로 사용되는 쥐 균주와 주식.

Application and Summary

사내 사육 식민지는 연구에 유연성을 제공, 특히 배아 또는 신생아를 활용하는 프로젝트와 함께. copulatory 플러그 및 질 세포학과 시간 제매 결합과 같은 기술을 사용하여, 개념작용및 임신의 날짜를 더 정확하게 예측할 수 있습니다. 이를 통해 연구자들은 실험을 보다 신중하게 계획할 수 있습니다. 광 사이클, 온도, 습도 및 진동과 같은 환경 요인을 제어하면 번식 결과를 최적화합니다.

References

Breeding Strategies for Maintaining Colonies of Laboratory Mice. A Jackson Laboratory Resource Manual. http://ko.cwru.edu/info/breeding_strategies_manual.pdf.
Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., and Taft, R. A. 2012. Mouse estrous cycle identification tool and images. PloS One. 7, 1-5.
McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. L. 2012. Performing vaginal lavage, crystal violet staining, and vaginal cytological evaluation for mouse estrous cycle staging identification. J. Vis. Exp. 67, e4389. doi:10.3791/4389.
Mamrot, J., Pangestu, M., Walker, D., Gardner, D. K., and Dickerson, H. 2015. Confirmed dioestrus in pseudopregnant mice using vaginal exfoliative cytology improves embryo transfer implantation rate. Reproductive BioMedicine Online. 31. 538-543.
Institute for the Laboratory Animal Research. 2011. Guide for the care and use of laboratory animals, 8^th ed. Washington (DC): National Academies Press.

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1. 동물을 페어링할 때 필요한 정보에는 적절한 명명법, 육종가 남성과 여성의 생년월일 및 설정 날짜를 활용하는 동물의 변형/재고가 포함됩니다. 정확한 기록 보관은 식민지 를 사육하는 데 필수적입니다.

2. 쥐와 쥐의 성 결정은 무귀생식 거리를 비교하여 수행됩니다. 여성의 경우 항문과 외부 생식기 사이의 거리가 남성보다 짧습니다. 남성 동물에 음낭의 존재는 또 다른 섹스 지표.

3. 짝짓기 구성표 선택 및 설정

참고: 사용할 수 있는 두 개의 짝짓기 체계가 있습니다.

Proestrus/estrus 시간 제짓 짝짓기: 이 방법은 최대 수용성과 다산의 시점에서 남성과 여성을 paring에 의존합니다.
1. estrous 주기는 proestrus와 estrous의 표시 되는 변화에 대 한 외부 생식기의 시각적 검사에 의해 또는 질 분비물의 세포학에 의해 여성에서 모니터링 해야 합니다 (아래 참조).
2. 여성이 프로스트루스 나 에스트러스에 있다고 결정되면, 동물은 일반적으로 밤에 짝을 이루는 것처럼 하루가 끝날 때 남성과 짝을 이룹니다.
3. 다음 날 아침, 여성은 코큘라플러그검사를 받는다(아래 참조). 플러그가 없는 경우, 여성은 하루 동안 남성과 함께 남아 하루의 끝에 copulatory 플러그를 검사 할 수 있습니다. 또는, 그녀가 더 이상 프로스트루스 또는 에스트루스에 없는 것으로 판명되면, 그녀는 번식 케이지에서 제거됩니다.
랜덤 시간 단축 결합: 이 방법은 설치류의 estrous 주기가 매우 짧고 4-5 일 길이라는 사실을 기반으로합니다.
1. 이 방법의 경우, 짝짓기는 언제든지 설정할 수 있으며, 여성은 플러그가 관찰 될 때까지 매일 아침저녁과 저녁에 copulatory 플러그를 검사합니다.
2. 여성은 저녁에 남성과 짝을 이룹니다.
3. 플러그가 관찰될 때까지 매일 시작과 끝에 코뮬레이트 플러그를 검사합니다. 이 방법을 사용할 때 플러그를 볼 수 있는 데 일반적으로 3일 이상이 걸립니다.

4. 임신 예측

새끼의 심푸는 임신 도중 나중에까지 어렵기 때문에, 약 10-12, 설치류를 위한 상업적인 초음파 시스템이 개발되었습니다; 그러나, 몇몇 동물 연구 시설은 이 기술을 가지고 있습니다. 따라서, copulatory 플러그의 시각화, 질 변화의 관찰, 또는 질 세포학은 일반적으로 여성이 쓰레기를 잉태 한 때의 예측을 돕기 위해 사용된다 (아래 참조). 그러나, 이 방법의 어느 것도 임신을 확인할 수 없습니다. 일단 copulatory 플러그가 관찰되면, 여성은 체중 증가와 같은 임신의 표시를 위해 감시되어야 합니다.

5. 에스트라스트 사이클 스테이지 결정

육각 검사
참고: 쥐와 쥐의 적시 결합의 경우, 프로스트루스와 에스트루러스를 나타내는 변화에 대한 질의 시각적 관찰은 estrous 사이클 스테이지를 결정하는 가장 빠른 방법이며 특별한 장비가 필요하지 않습니다.
1. 시각 방법을 사용하여 에스트라스트 사이클을 평가할 때, 광원이 질 조직의 인식된 색을 변경하고 평가를 어렵게 만들 수 있기 때문에, 방 조명과 관련하여 동일한 영역에서 육안 검사를 수행하는 것이 중요하다. 예를 들어 LED 조명에 의해 투사되는 보라색 색조는 시각적 감지를 더 어렵게 만듭니다.
2. 시각적 관찰에 의해 estrous 주기의 단계를 평가하기 위해 각 마우스는 케이지 뚜껑에 앞포가 놓여있는 꼬리에 의해 수동으로 억제되어야합니다.
3. 각 여성의 질 개구부는 질 영역을 둘러싼 조직의 상태와 질 개구부의 크기에 따라 평가된다. ²
  1. proestrus 동안, 질 개구부는 넓고 주변 조직의 팽윤을 특징으로합니다. 조직은 분홍색으로 색이 있고 매우 촉촉합니다. 종종 개구부의 등쪽 및 복부 가장자리를 따라 주름이나 조각이 있습니다.
  2. estrus 동안, 질 개구부를 둘러싼 조직의 팽윤이 감소하고, 조직은 촉촉하고 분홍색이 아닙니다.
  3. metestrus 동안 질 개구부는 최소화 하 고 무시할 수 있는 붓기가 있다.
  4. diestrus 도중, 질 지역 의 주위에 조직의 팽윤이 없고, 질 개구부는 작고 닫힙니다.
질 세포학
마우스와 쥐 모두 다각형이기 때문에, estrus 주기 길이는 4-5 일에 구역 수색하는 아주 짧습니다. 프로스트루스, 에스트루스, 자궁경, 다스트루의 네 단계를 모두 식별할 필요가 있습니다. 질 세포학은 이 단계를 결정하는 아주 정확한 방법입니다. 또한 두 가지 샘플 수집 방법이 있습니다: 질 용암의 비침습적 방법, 및 질 운하 면봉의 침습적 방법.
1. 질 용암
  1. 필요한 재료는 멸균 200 μl 파이펫 팁, 라텍스 전구, 멸균 이중 증류수 (ddH₂0), 깨끗한 유리 슬라이드입니다.
  2. 멸균 200 μl 팁 끝에 라텍스 전구를 놓습니다. 약 100 μl의 멸균 ddH₂O를 파이펫에 넣습니다.
  3. 마우스를 케이지에서 들어 올리고 꼬리가 있는 와이어 바 케이지 위에 놓습니다.
  4. 꼬리를 단단히 잡고 마우스의 뒷분기를 상승시킵니다. 이제 마우스에 뚜껑을 잡고 있는 앞발만 있습니다.
  5. 마우스가 소변을 보는 경우 배뇨가 멈출 때까지 기다립니다. 질 운하 입구에 소변이 남아 있는 경우, ddH_2O의작은 분출로 개구부가 헹구는 데 사용되었던 팁을 바꿀 수 있습니다.
  6. ddH₂O-채워진 팁의 끝을 오리피스를 관통하지 않고 질 운하의 개구부에 놓습니다.
  7. 질 운하의 개통시 물 부피(~25-50 μl)의 절반까지 전구를 부드럽게 내보냅니다. 액체는 팁 삽입없이 운하에 자발적으로 흡입됩니다. 전구에 가해지는 압력을 천천히 방출합니다. 유체가 다시 팁으로 다시 들어갑니다.
  8. 전구에 유체의 포부를 방지하기 위해 너무 빨리 압력을 방출하지 마십시오. 필터링된 팁은 이 용도에 유용할 수 있습니다.
  9. 동일한 팁, 전구 및 유체를 사용하여 이전 단계를 4-5회 반복하여 단일 샘플에서 충분한 수의 세포를 얻습니다.
  10. 유리 슬라이드에 액체를 놓고 실온에서 얼룩이 완전히 건조되도록합니다.
  11. 각 마우스에 새 파이펫을 사용합니다.
  12. 일단 건조되면, 이 estrous 얼룩은 즉시 염색하거나 저장하고 나중에 염색할 수 있습니다. 라이트-지름사 염색은 슬라이드를 염색하는 데 가장 일반적으로 사용됩니다. 이러한 얼룩은 스테인링 과정에서 세포가 세척되는 것을 방지하기 위해 슬라이드의 고정을 필요로 하지 않는 1단계 얼룩으로서 상업적으로 사용할 수 있습니다. 슬라이드는 제조업체의 지침에 따라 45-60초 동안 얼룩에 배치됩니다.
  13. 슬라이드는 현미경의 밑에 그 때 검사되고, 보인 세포는 주기의 단계에 해당합니다: 1) 여성이 proestrus에 있는 경우에, 세포는 세포질보다는 더 어둡게 얼룩진 핵을 가진 둥근, 잘 형성된 핵상피세포의 클러스터로 보입니다; 2) 여성이 estrus에있는 경우, 세포의 대부분은 핵이 부족한 상피 세포, 외관에 각이며, 조밀하게 포장 된 클러스터에서 발생; 3) 여성이 자궁경상에 있는 경우에, 세포는 전형적으로 백혈구 (특히 일부 옥수수 상피 상피 세포가 존재하는 호중구)와 함께 연결된 두 개의 소시지 같이 형성되는 어둡게 얼룩진 핵을 가진; 4) diestrus 도중, 존재하는 세포는 몇몇 핵상피 세포의 발생을 가진 일반적으로 백혈구입니다..
2. 질 면봉
  1. 필요한 재료는 직경 2mm 팁, 깨끗한 유리 현미경 슬라이드 및 멸균 생리식염수와 멸균 면 팁 어플리케이터입니다.
  2. 면에 기울어진 어플리케이터를 식염수로 적시다.
  3. 절제된 마우스의 질에 어플리케이터의 끝을 삽입합니다.
  4. 부드럽게 돌리고 질 벽에 팁을 굴립니다. 면봉을 조심스럽게 제거합니다.
  5. 셀은 슬라이드를 가로 질러 면봉을 굴려 건조 유리 슬라이드로 전달됩니다.
  6. 슬라이드가 건조되면 라이트-기임사 얼룩으로 얼룩질 수 있습니다.
    스와빙은 스트레스가 많은 절차로 간주되며 스트레스를 받은 마우스가 스트라스트 사이클을 방해할 수 있습니다. 스와빙에 의한 질 및 자궁 경부 자극은 의사 임신을 유도할 수 있습니다. 질 점막의 반복된 면봉은 적당한 구속으로, 그리고 올바른 크기의 면봉으로 부드럽게 수행되지 않으면 손상을 일으킬 수 있습니다. ^3,4

그림 2. 질 세포학 -- 설치류 estrus 주기의 다른 단계

6. 코뮬레이토리 플러그 시각화

이 플러그는 질 액과 정액으로 구성되며 12-24 h 후응성동안 질에서 지속됩니다. 플러그의 존재는 짝짓기를 확인하지만, 여성이 임신을 보장하지 않습니다. 연결된 여성이 임신한 경우 임신 첫날은 플러그가 발견된 다음 날로 간주됩니다.

마우스를 케이지에서 들어 올려 꼬리가 있는 와이어 바 케이지 위에 놓습니다.
꼬리 바로 위에 압력을 가하여 마우스를 배치하여 뒤쪽을 아치화하여 질 개구부의 더 나은 프리젠 테이션을 허용합니다.
그녀의 질 개구부를 관찰하여 희끄무레한 덩어리를 만드시다. 코큘라토리 플러그는 시각적으로 명확하지 않을 수 있지만 무딘 프로브를 사용하여 확인할 수 있습니다.
프로브의 끝을 사용하여 질 개구부에 부드럽게 삽입하십시오. 코큘리 플러그의 존재는 질 개구부의 0.5cm 내의 프로브의 발전을 방해할 것입니다.
프로브는 알코올에 감염되고 각 사용 전에 완전히 건조해야합니다.

암컷은 쓰레기, 생년월일, 쓰레기 크기, 태어난 숫자, 수제, 수컷:암컷 새끼의 비율, 유전자형의 비율이 모두 기록되어야 한다. 쓰레기 내의 유전자형이 부모의 유전자형에 해당하지 않는 경우, 진정한 유전자형을 확인하기 위해 재검사를 수행해야 합니다.

7화 위닝

쥐와 쥐에 대한 임신은 약 21 일입니다. 젊은 나이의 21-28 일에 짜인다. 쥐와 쥐 모두 이른 8 주 까지 번식 할 수 있으므로 새끼는 어린 나이에 성별에 의해 분리되는 것이 필수적입니다. 집중적인 번식은 다음 쓰레기가 태어날 때 오래된 새끼가 존재하지 않도록 하기 위해 20일째에 각 쓰레기의 새끼를 사육해야 합니다. 비집중적 번식을 위해 새끼는 20 일 의 나이를 지나서 어머니와 함께 남겨질 수 있으며, 종종 28 일까지. 이것은 새끼가 비 엔지니어링 또는 야생 형 동물만큼 활발하지 않을 수 있기 때문에 많은 유전자 변형 균주에 매우 도움이 될 수 있습니다.

남성과 여성 새끼는 짜기에서 분리됩니다. 가능하면 새로 새끼를 노래해서는 안됩니다. 쓰레기가 주어진 성별의 한 새끼만 포함하는 경우, 시도는 같은 성별의 다른 사람과이 강아지를 수용할 수 있어야합니다. 가능한 주택 옵션은 : 1) 단일 여성 강아지는 집중 번식 케이지에없는 경우 어머니와 함께 남아있을 수 있습니다; 2) 단일 여성 또는 남성 새끼는 같은 나이의 다른 쓰레기에서 다른 동성 새끼와 함께 배치 될 수있다; 3) 부모가 일부일처 쌍인 경우, 여성은 하나의 남성 새끼가 아버지와 함께 수용 될 수 있도록 케이지에서 제거 할 수 있습니다; 그리고 4) 단일 남성 강아지는 5 주까지 여성 형제자매와 함께 수용 될 수있다. 새끼의 성별은 원치 않는 쓰레기가 부적절하게 분리 된 새끼를 방지하기 위해 일주일 후 확인되어야한다.

쥐와 쥐는 번성 하는 것을 보장 하기 위해 매일 검사 해야 합니다. 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드⁵ 는 음식이 대변과 소변에 의해 더럽히는 것을 방지하기 위해 동물에게 제시되어야한다고 명시하고 있지만, 새로 짜여진 마우스는 케이지 바닥에 유리 접시 (페트리 접시)에 배치 된 소량의 음식 (마우스 당 1 펠릿)을 제공해야합니다. 이것은 동물이 유일한 음식 근원으로 설치류 차우를 갖는 전환하도록 격려할 것입니다. 자동 급수 시스템을 통해 케이지에 물을 공급하는 랙에 보관되어 있는 동물의 경우에도 마우스가 탈수된 것처럼 보이는 경우 물병을 케이지에 추가할 수 있습니다.

이름	콜로니 타입	묘사
ICR	아웃레드	흰둥이
스위스 웹스터	아웃레드	흰둥이
발브/c	인브레드	흰둥이
FVB	인브레드	흰둥이
C57BL/6	인브레드	블랙 코트 칼라
C₃H	인브레드	브라운 코트 칼라
DBA/2	인브레드	브라운/그레이 코트 칼라
아티믹 누드 (nu/nu)	인브레드	사나이
SCID	인브레드	심한 결합 면역 절제 마우스 -다양한 코트 색상

표 1. 일반적으로 사용되는 마우스 얼룩과 주식.

이름	콜로니 타입	묘사
스프라그-다울리	아웃레드	흰둥이
위스타 (주)	아웃레드	흰둥이
피셔 344	인브레드	흰둥이
루이스	인브레드	흰둥이
롱 에반스	인브레드	후드, 블랙, 화이트

표 2. 일반적으로 사용되는 쥐 균주와 주식.

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Overview

1:05

Rodent Estrous Cycle

5:29

Mating Schemes

8:29

Factors Affecting Breeding

9:42

Weaning

11:10

Applications

13:14

Summary

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