괴사 장염의 신생아 BALB/c 마우스 모델

괴사 장염 (NEC)은 미숙아, 특히 매우 낮은 출생 체중 유아에서 자주 발생하는 가장 심각한 위장 (GI) 질병이며 사망률이 높고 불분명한 병인. NEC의 원인은 염증성 면역 규제 시스템 이상과 관련이 있을 수 있습니다. NEC 동물 모델은 NEC 질병 면역 연구를 위한 필수 도구입니다. NEC 동물 모델은 일반적으로 C57BL/6J 신생아 마우스를 사용; BALB/c 신생아 마우스는 거의 사용되지 않습니다. 관련 연구는 마우스가 감염될 때, Th2 세포 분화는 C57BL/6J 마우스에 비해 BALB/c 마우스에서 우세하다는 것을 보여주었습니다. 연구 결과는 NEC의 발생 그리고 발달이 T 도우미 타입 2 (Th2) 세포의 증가와 연관되고 일반적으로 감염을 동반한다는 것을 건의했습니다. 따라서, 본 연구는 신생아 BALB/c 마우스를 사용하여 NEC를 가진 아이들에서 관찰된 것과 유사한 임상 적 특성 및 장 병병리학적 변화를 가진 NEC 모델을 유도하였다. 추가 연구는 이 동물 모형이 NEC에 있는 Th2 세포 반응을 공부하기 위하여 이용될 수 있었다는 것을 결정하기 위하여 보증됩니다.

괴사 장염 (NEC)은 미숙아, 특히 매우 낮은 출생 체중 유아에서 자주 발생하는 가장 심각한 위장 (GI) 질병이며 사망률이 높고 불분명한 병인. NEC의 원인은 염증성 면역 규제 시스템 이상과 관련이 있을 수 있습니다. NEC 동물 모델은 NEC 질병 면역 연구를 위한 필수 도구입니다. NEC 동물 모델은 일반적으로 C57BL/6J 신생아 마우스를 사용; BALB/c 신생아 마우스는 거의 사용되지 않습니다. 관련 연구는 마우스가 감염될 때, Th2 세포 분화는 C57BL/6J 마우스에 비해 BALB/c 마우스에서 우세하다는 것을 보여주었습니다. 연구 결과는 NEC의 발생 그리고 발달이 T 도우미 타입 2 (Th2) 세포의 증가와 연관되고 일반적으로 감염을 동반한다는 것을 건의했습니다. 따라서, 본 연구는 신생아 BALB/c 마우스를 사용하여 NEC를 가진 아이들에서 관찰된 것과 유사한 임상 적 특성 및 장 병병리학적 변화를 가진 NEC 모델을 유도하였다. 추가 연구는 이 동물 모형이 NEC에 있는 Th2 세포 반응을 공부하기 위하여 이용될 수 있었다는 것을 결정하기 위하여 보증됩니다.

가장 심한 위장(GI) 질환인 괴사 장염(NEC)은 대부분의 미숙아(>90%)에서 발생하며, 특히 출생체중(VLBW)¹이 매우 낮은 것으로 발생합니다. VLBW 유아에서는 질병의 부각이 10%에서 12%까지 다양하며 NEC로 진단된 어린이의 사망률은 20%에서 30%^2,3사이입니다. NEC의 원인은 점막 손상, 병원성 박테리아에 의한 침입 및 장 수유와 관련이 있을 수 있으며, 이는 염증 반응및 민감성 호스트에서 장 손상의 유도로 이어질 수 있습니다³. 선관위의 병기는 불분명하다. 관련 연구는 영향을받는 유아의 면역 반응이 비정상이며 유전 적 감수성, 미세 혈관 긴장 및 장 세균 변화가 질병에 중요한 역할을 할 수 있음을 보여줍니다³.

NEC 동물 모델은 NEC의 발병기에 대한 연구를 위한 필수 도구입니다. NEC 모델에 사용되는 동물 종은 돼지, 쥐 및 마우스입니다. 그러나, 긴 임신 기간, 성장 주기 및 높은 비용으로 인해, 최근 몇 년 동안, 돼지는 NEC 모델에 대한 첫 번째 선택이 되지 않았으며 쥐 또는 마우스⁴로 대체되었습니다. 다른 마우스 균주의 면역 배경에 차이가 있기 때문에⁵, 다른 연구는 NEC 동물 모델을 확립하기 위해 마우스의 다른 긴장을 사용할 필요가있다. BALB/c 마우스는 중요한 특징을 가지고 있습니다. 그(것)들이 감염되거나 외부 손상에 대처할 때, 마우스에 있는 감염 도중 TH2 세포의 편광은 마우스의 그밖 긴장에서 보다는 현저하게 더 강하다^6,7,8. T 도우미 세포는 NEC의 발생 및 진행, 특히 TH2 세포의 발달에 중요한 역할을 ^한다3,9,10,11. 따라서, 이 연구는 BALB/c 마우스를 사용하여 NEC 모델을 확립했으며, 이는 T 세포에 대한 NEC 질병 연구에 도움이 될 수 있습니다.

이 연구는 광저우 여성 및 아동 의료 센터의 의료 윤리위원회 (NO. 174A01)와 광저우 포에버겐 생명 과학 실험실 동물 센터 (IACUC-G160100)의 동물 윤리위원회에 의해 승인되었습니다. 모든 동물은 특정 병원체없는 (SPF) 환경에서 같은 방에서 사육되었고, 실험은 기존의 환경에서 수행되었다. 사육에 사용되는 마우스는 7-8 주 오래되었습니다. NEC(n=72)를 유도하기 위한 마우스는 4일째 댐에서 분리되었고, 댐(n=14)은 원래 케이지에 보관되어 대조군(Cont.) 그룹 마우스(n=24)를 간호하였다.

1. 시약 및 장치 준비

1. 해당 비율로 BALB/c 마우스용 우유 대용품을 준비합니다(미숙아 분유: 염소 분유 = 2:1).
   참고: 분유¹² 의 최종 영양 조성물은 표 1에 표시됩니다.
2. LPS 용액 (2.5 mg/mL)
   1. 총 10 mg의 LPS 분말을 멸균 된 이중 증류수 4mL에 녹이고 잘 섞고 알리 쿼팅 후 -20 °C의 냉장고에 보관하십시오.
      참고: LPS 용액은 2-8°C의 어둠 속에서 즉시 사용하거나 장기 저장을 위해 -20°C에 저장됩니다.

2. 신생아 BALB/c 마우스에서 괴사성 장염 유도

1. 신생아 쥐에게 먹이를 주면 됩니다.
   1. 신생아 쥐를 댐과 같은 케이지에 보관하고, 0-4일에 댐에서 간호한다.
   2. 4일 밤(신생아마우스의 무게2.5-3g) 황선군에서 신생아마우스를 댐에서 분리하여 NEC를 유도하고, 동물 인큐베이터에 보관하고, 수식으로 공급한다. 그러나 Cont. 그룹은 댐에 머물면서 먹이를 받을 수 있습니다.
      참고: 댐에서 분리된 신생아 마우스는 체온 조절이 약하기 때문에 인큐베이터에서 기르는 것으로 나타났습니다.
2. 75% 알코올 용기에 1-2분 간 담그고 두 번 씻어 내고, 깨끗한 이중 증류수로 두 번 씻습니다.
   참고: 마우스 간의 교차 오염을 피하려면 각 마우스를 공급한 후 위의 과정을 수행해야 합니다.
3. NEC 모델을 유도합니다.
   1. 4일째에 댐에서 신생아 쥐를 데리고 하룻밤을 보내십시오.
   2. LPS(한 번에 20-30 μL)를 가진 마우스를 가리게 하고 5일째(한 번에 40-50 μL)에 수식으로 먹이를 주도록 한다.
   3. 5일째부터 마우스를 저산소증-산소-감기 충격 주기로 5일 동안 하루에 두 번 받습니다. 90 s에 대 한 5% _O2 에 저산소증 장치에 마우스를 배치 하 고 3 분 동안 그들을 재산소; 이 프로세스를 다섯 번 반복합니다. 다음으로, 마우스를 4°C 환경에 15분 동안 배치한 다음 인큐베이터로 옮기습니다. 유도 프로세스의 경우 그림 1A, B 를 참조하십시오.
      참고: 저산소환-재산소-감기 자극의 주기는 아침에 한 번, 오후에 한 번 수행되었다. 5% _O2 의 혼합물과 95% _N2 를 용기에 제조하였고, 농도는 산소 검출기로 측정하였다.
4. 밀접하게 모든 마우스를 관찰, 매일 그들을 무게, 유도 기간 동안 마우스의 생존을 기록하고, 대변 특성을 기록 (또는 끈적 끈적한 발판 / 피 묻은 발판없이).
   참고: 기존 NEC 모델은 5일간 지속됩니다.
5. 10일 또는 그 이전에, 마우스가 NEC 증상(ileus, hematochezia, 설사)¹³을 보일 때, 이소플루란으로 흡입 마취에 의해 마우스를 안락사시키고 즉시 장 조직을 수집한다. 자발적으로 죽은 쥐에서 조직을 수집하지 마십시오.
   참고 : 이 연구에서, 마우스가 전신의 혈토체치아와 치아노증을 표시 할 때 마우스 우테나아의 끝점이 적응되었다.

3. 마우스를 가바게

1. 마우스 머리를 고정하고 위관을 오른손에 고정합니다. 마우스 입의 왼쪽 모서리에서 위관을 삽입합니다.
   참고: 머리는 마우스의 머리에 검지 손가락으로 고정하고 부드럽게 수술 중에 마우스가 앞으로 구부러지고 위관의 삽입에 영향을 미치지 않도록 앞뒤로 그리고 아래쪽으로 눌렀다.
2. 천천히 입의 중심으로 튜브를 이동합니다. 튜브를 약 2-3cm 삽입한 후 40-50 μL의 포뮬러 또는 LPS20-30 μL을 소화관에 밀어 넣습니다. 그림 2A, B 를 참조하십시오.
   참고: 정상적인 상황에서 는 위관이 소화관에 부드럽게 삽입됩니다. 마우스에 강한 구토 반사가있는 경우, 위관은 실수로 기관체에 삽입되었습니다. 위관은 부드럽게 꺼내야 하며 마우스는 다시 gavage를 시도하기 전에 잠시 동안 휴식을 취할 수 있습니다. 또한, 개간 절차는 마우스의 안락사 이전에 NEC의 모델을 유도하는 데 사용된다.

4. 헤마톡시린과 에신(H&E) 염색을 위한 신선한 장 조직 표본 수집

1. 마우스에서 신선한 일루 조직을 10% 포르말린으로 24시간 동안 담가 두는 다.
2. 파라핀에 조직을 삽입하고 4 μm 섹션으로 슬라이스.
3. 절렌의 섹션을 분리하고 절대 에탄올 95%, 에탄올 80%, 에탄올 70%, 증류수로 연속적으로 수분을 공급하여 각 단계에서 5분 동안 담가 둡니다. 혈소클린 용액으로 5분 동안 단면을 염색하고 5초 동안 75%의 알코올로 1% 염산으로 분화합니다. 마지막으로, 1 분 동안 eosin 용액으로 얼룩.
   참고: 헤마톡슬린 용액으로 염색한 후, 지나치게 바운드된 헤마톡시린 용액과 세포질 헤마톡시린 염료를 제거하기 위해 에탄올의 1% 염산으로 분화해야 합니다. 1% 염산의 농도는 장 조직에 적합합니다.
4. 40배율에서 장 조직의 조직 병리학을 검사합니다.

BALB/c 마우스 NEC 모델은 수식 공급, LPS 공급, 저산소증 및 감기 자극에 의해 유도되었다. 유도 기간 동안, 마우스는 장 병리학, 대변 특성, 체중 변화 및 일일 생존을 위해 관찰되었다. NEC 유도 중 소장의 대표적인 이미지; 그림의 숫자는 0(정상 상피)에서 4(가장 심한) 장 병리 점수를 나타낸다(그림 3A). 장 병리학 점수는 CONt. 그룹(그림 3B)보다 NEC 그룹에서 상당히 높았다. 그림의 숫자는 0(잘 형성된 펠릿)에서 3(액체 의자)(그림 3C)의 대변 점수를 나타냅니다. 10일 선관위 그룹의 대변 점수는 NEC 그룹에서 현저히 높았으며, 이는 NEC 그룹의 장기능 장애가 더 심각하다는 것을 나타낸다(그림 3D). NEC 모델 의 유도 첫날인 5일째에는 두 그룹 간의 신체 크기에 큰 차이가 없었습니다. 그러나, 10일째에, NEC 군의 마우스는 Cont. group에서 마우스보다 머리에서 꼬리까지 현저하게 얇고 작아졌다(도 4A).

모델이 확립된 5일 동안 NEC 군내 마우스의 중량이 서서히 증가하거나 심지어 음의 성장을 보였으며, NEC 군내 마우스의 생존율은 Cont. 군에 비해 점차 감소하였다(도 4B,C). 또한, 또 다른 마우스 배치는 NEC 모델을 유도하기 위해 사용되었지만 조직을 수집하지 않고; 13일까지, 이 NEC 군의 모든 마우스가 정지하고, 생존 곡선은 현저하게 감소하였다(보충 도서 S1). 도 5A는 본 병원에서 NEC 환자로부터 장 조직의 절제된 일레오세칼 영역의 형태 및 병리학 적 결과 (장 점막 조직의 괴사)를 나타낸다. 이 연구에서는 NEC 군(1/13)의 마우스가 일레오세칼 출혈 및 괴사를 개발하였다(도 5B).

도 1: BALB/c NEC 모델 과정의 유도. (A) NEC 그룹의 마우스는 출생 시 댐에서 분리되어 4일(4일째) 그 날 밤 금식하였다. NEC 모델은 출생 후 5일째부터 유도되어 5일간 지속되었습니다. 장 조직 표본은 10일 또는 그 이전에 수집되었다. Cont. 그룹에 있는 마우스는 댐에 의해 보관되고 간호되었습니다. (B) NEC 모델을 유도한 후 매일 의 작업 순서입니다. 약어: Cont. = 제어; NEC = 괴사 장염; LPS = 리포폴리사카라이드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 2: 위 개비. (A) 플라스틱 튜브 및 주사기와 결합된 이 연구에서 특수 게이지 장치가 사용되었습니다. (B) 개비지 튜브는 입 구석에서 수직 선까지 45° 각도로 들어갔다. (C) 튜브는 위관과 식도가 동일한 수직 수준에 있는지 확인하기 위해 마우스 입의 중심으로 천천히 이동하였다. 약어: D= 직경. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 3: BALB/c 마우스 NEC 모델. (A) 두 그룹에서 장 병리학 점수의 사진 현미경 사진, 예를 들어, Cont. Group(Score 0), 순증 부막 또는 라미나 프로프리아 부종 분리를 두 그룹(점수 1), NEC 그룹에서 중간 부막 및/또는 라미나 프로프리아 분리(점수 2), NEC 그룹에서 중증 부막 및/또는 라미나 프로피아 분리(3점)에서 나타내고 있습니다. NEC 그룹에서 장 괴사와 장 사악 실종 (점수 4). (B) NEC 유도 후 마우스의 장 병리학 점수는 Cont. group의 장 병리학 점수보다 높았다(n = 9 내, NEC 그룹에서 n = 35, 학생의 t-test를 가진 ***p < 0.001). (C) 두 그룹에서 대변 점수의 사진 마이크로그래프, 예를 들어, Cont. 그룹에서 잘 형성된 펠릿(점수 0), 형성된 의자를 두 그룹으로 형성(점수 1), NEC 그룹에서 반형성 의자(점수 2), NEC 그룹의 액체 의자(점수 3). (D) NEC 그룹의 대변 점수는 Cont. group(Cont. group의 n = 6, NEC 그룹에서 n = 13, 학생의 t-test를 통해 0.001로 0.001로 <)보다 훨씬 높았습니다. 빨간색 삼각형은 점막과 라미나 프로프리아의 분리를 나타내고 검은 색 화살표는 마우스 대변을 가리킵니다. 스케일 바 = 50 μm. 약어: Cont. = 제어; NEC = 괴사 장염; HE = 헤마톡슬린과 에신. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 4: Cont. 그룹과 NEC 그룹 사이의 마우스의 체형 및 생존의 비교. (A) 5일째와 10일째에 마우스의 두 그룹의 출현. (b) 이 섹션은 시간이 지남에 따라 두 그룹에서 마우스의 체중 변화를 보여줍니다. x축은 마우스가 태어난 후일수를 나타내며, y축은 마우스의 체중 변화를 나타낸다. **P < 0.01, ***P < 0.001 을 학생의 t-시험으로 콘트 그룹(n=10)과 NEC 그룹(n =27)(C)을 비교하는 이 섹션에서는 대조군(n=10)과 NEC 그룹(n=25)에서 마우스의 생존 곡선을 나타낸다. 약어: Cont. = 제어; NEC = 괴사 장염. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: NEC를 가진 아이들에 있는 일레오세칼 출혈 및 NEC를 가진 마우스. (A) NEC를 가진 아이들에 있는 일레오세칼 지역의 출혈 및 괴사. (B) NEC를 가진 마우스의 일레오세칼 영역에서 출혈과 괴사 (1/13); 그러나, Cont. 군에 있는 마우스의 창자, 출혈 및 괴사 없이 정상이었습니다. 검은 삼각형은 장 출혈과 괴사를 말하며, 붉은 화살표는 일레오세칼 영역의 출혈과 괴사를 보여줍니다. 스케일 바 = 50 μm. 약어: Cont. = 제어; NEC = 괴사 장염. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 유제품 분유 성분.

보충 그림 S1: 생존 곡선은 NEC 그룹에서 현저히 감소되어 모든 마우스가 자발적으로 사망하였다(n = 5는 Cont. 그룹에서, n = 10 NEC 그룹에서). 약어: Cont. = 제어; NEC = 괴사 장염. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

NEC는 신생아를 위한 일반적인 위장 시스템 비상사태입니다, 높은 부각및 사망, 특히 미숙아^1,2,3에서. 그러나, 그것의 병인은 아직도 불분명합니다. 현재 점막 손상, 병원균 침범 및 장내 수유가 ^NEC3의 고위험 요인이라고 여겨지고 있습니다. 현재까지 NEC 모델에 사용되는 동물은 주로 돼지, 쥐 및 마우스입니다. 대부분의 연구는 NEC13,14,15,16을 유도하기 위해 신생아 C57BL/6 마우스를 사용했으며, 아주 소수의 연구가 NEC를 유도하기 위해 BALB/c 신생아 마우스를 사용한 적이 거의 없다. 그러나 BALB/c 마우스는 Th ^{세포 편광6,7,8}의 장점을 가지고 있으며, 이는 질병의 Th 세포 연구를 위한 좋은 NEC 모델이 될 수 있는지 여부를 결정하기 위한 추가 연구를 보증합니다.

우리는 NEC ^model17의 Nadler 병리학 점수 표준을 언급하고 NEC 그룹의 점수가 대조군보다 훨씬 높다는 것을 발견했습니다. ≥ 2점수는 NEC를 나타내며, NEC를 유도하는 성공률은 38~50%로, Caplan 외(DOI:10.3109/15513819409037698)가 실시한 연구에서 NEC 모델링의 성공률이 77%보다 낮습니다. 또한 두 그룹의 대변 점수¹⁸을 평가하고 NEC 그룹의 점수가 대조군의 점수보다 높다는 것을 발견했습니다. 점수가 높을수록 장 기능 장애가 더 심각합니다. 이 모든 데이터는 NEC 모델의 설립이 성공적이었다는 것을 보여줍니다. 또한 NEC의 신생아 BALB/c 마우스 모델이 어느 정도 인간 NEC를 시뮬레이션할 수 있다는 것이 고무적입니다. 출혈과 괴사는 ^NEC3,19를 가진 아이들의 창자에서 생깁니^다; 이 모델에서 유사한 병리학적 조건이 관찰되었다.

Gavage는 마우스 모델에서 NEC를 유도하는 핵심 단계입니다. 개간 조작이 능숙하게 마스터되지 않은 경우, 실수로 기관체에 위관을 배치하고 마우스가 죽게하는 것이 쉬웠다. 위 가이대 동안 왼쪽 엄지 손가락, 가운데 손가락 및 링 핑거는 마우스 몸통의 양면을 고정하는 데 사용되었으며, 검지 손가락은 마우스를 제자리에 고정시키기 위해 머리에 배치되었습니다. 이것은 마우스가 주위를 움직이고 식도를 손상시키는 위관을 일으키는 원인이 되는 것을 방지하기 위한 것이었습니다. 위관은 마우스의 입왼쪽 모서리에서 삽입되었습니다. 위관이 저항없이 원활하게 식도에 들어갈 때만 계속 삽입 할 수 있습니다. LPS 또는 분유는 마우스의 하부 입술에서 2-3cm의 위관을 삽입한 후에만 주입되어야 합니다.

저산소증의 길이는 주의 깊게 모니터링해야합니다. 이 연구에서저산소증은 매번 90초 동안 지속되었습니다. 저산소증이 너무 길면 마우스가 견딜 수 없으며 죽을 것입니다. 본 모델은 NEC 관련 면역 세포, 특히 TH1 및 TH2 세포3,9,10,11,20을 연구하는 데 사용될 수 있다. 앞으로선에서는 이 모델이 NEC에서 Th2 세포 반응을 연구하는 데 유용한지 조사할 계획입니다. 또한, 본 연구는 ^NEC18을 가진 마우스에 있는 장 기능 장애를 평가하기 위하여 발판 득점의 새로운 방법을 소개했습니다. 그러나 이 연구에는 몇 가지 제한이 있습니다. 예를 들어 모델의 성공률은 그리 높지 않았습니다. ^{앞서 설명}한 바와 같이 저산소증 수준을 5% _O2에서 1% _O2로 조정하여 성공률을 높이기 위한 BALB/c NEC 모델링 방법을 개선하기 위한 노력이 진행 중이다.

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

저자는 광저우 여성 및 어린이 의료 센터의 임상 생물 자원 은행과 쥐를 제공하기위한 광저우 포에버겐 생물 과학 실험실 동물 센터를 제공한 것에 대해 감사드립니다. 이 연구는 중국 보조금 81770510 (R.Z.)의 국립 자연 과학 재단에 의해 지원되었다.

An erratum was issued for: A Neonatal BALB/c Mouse Model of Necrotizing Enterocolitis. The Representative Results section was updated.

Figure 1 was updated from:

Figure 1: Induction of the BALB/c NEC model process. (A) The mice in the NEC group were separated from the dam at birth until they were 4 days old (on Day 4) and fasted that night. The NEC model was induced from Day 5 onwards after birth and lasted for 5 days. Intestinal tissue specimens were collected on Day 10 or earlier. The mice in the Cont. group were housed with and nursed by the dam. (B) The sequence of operations for each day after inducing the NEC model. Abbreviations: Cont. = control; NEC = necrotizing enterocolitis; LPS = lipopolysaccharide. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Figure 1: Induction of the BALB/c NEC model process. (A) The mice in the NEC group were separated from the dam at birth until they were 4 days old (on Day 4) and fasted that night. The NEC model was induced from Day 5 onwards after birth and lasted for 5 days. Intestinal tissue specimens were collected on Day 10 or earlier. The mice in the Cont. group were housed with and nursed by the dam. (B) The sequence of operations for each day after inducing the NEC model. Abbreviations: Cont. = control; NEC = necrotizing enterocolitis; LPS = lipopolysaccharide. Please click here to view a larger version of this figure.